專利名稱：白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開的是一種具有明顯抗癌性能，增加血小板的生物細(xì)胞因子的生產(chǎn)方法，特別是使該生物活性蛋白通過工程菌種發(fā)酵提取的方法及其相關(guān)提純步驟。
白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6)是一種生物學(xué)活性非常廣泛的細(xì)胞因子，許多細(xì)胞可產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(即IL-6)，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、圓錐母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。分裂素和抗原可刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。IL-6具有明顯抗癌活性，增加血小板的生物免疫調(diào)節(jié)，可用于腫瘤和造血功能障礙的治療。通常的利用培養(yǎng)人體細(xì)胞或者細(xì)胞株生產(chǎn)IL-6的方法產(chǎn)量很低，無法滿足臨床試驗或作為治療藥物的需要，本發(fā)明是隨著基因工程的突起和發(fā)展而發(fā)明的。使生物活性蛋白能通過菌種的發(fā)酵提取，使該菌種具有IL-6插入結(jié)構(gòu)基因。
本發(fā)明的目的是提供一種從菌種的前期構(gòu)建、培養(yǎng)，到蛋白純化的生產(chǎn)工藝過程，即一種符合工業(yè)化要求，成本低，而有高收率，可用于人體的IL-6的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的工藝過程包括a利用PCR技術(shù)，構(gòu)建高效表達(dá)的白細(xì)胞介素-6的工程菌種;
b對上述菌種5′末端功能基因段中的堿基進(jìn)行修飾，并插入第二個SD序列，即構(gòu)建其表達(dá)載體;
c發(fā)酵，大腸桿菌高效表達(dá)該菌種。
該工藝過程還包括用分子篩凝膠過濾及高效液相層析的提純過程。
前述工藝過程a可以改為(1)從培養(yǎng)U937細(xì)胞株中，抽取MRNA，轉(zhuǎn)錄成CDNA;(2)設(shè)計、合成寡核苷酸引物，包括五末端引出物中HindⅢ和Ndel酶切位置和三末端引物的Xbal的酶切位置;(3)以U937CDNA為模板，PCR擴增，得到白細(xì)胞介素-6基因片段;(4)用凝膠電泳將該片段分離回收;(5)將該片段克隆到PCR2000載體中轉(zhuǎn)入DH25受菌體;(6)進(jìn)行篩選白斑菌落，酶切。
前述工藝過程b中的對上述菌種5′末端動能基因段中的堿基進(jìn)行修飾可包括(1)將通過轉(zhuǎn)譯理論合成的6個DNA片段經(jīng)T4磷酸化酶、連接酶、電泳進(jìn)行分離，得到143堿基對的DNA片段;(2)從PCR白細(xì)胞介素-6載體中，經(jīng)TaqⅠ/XbaⅠ酶切、分離，得到454堿基對的DNA片段;(3)將454堿基對片段與上述143堿基對的DNA片段連接，得到597堿基對片段。
前述工藝過程中，構(gòu)建的白細(xì)胞介素-6的表達(dá)體為(1)載體PEX-2經(jīng)BsrBI/SspI酶切、分離，得到DNA大片段；(2)除去Amp基因，與Kan基因片段連接得到PKEX-2；(3)PKEX-2經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ酶切，再與597堿基對的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化到DH25受菌體中，經(jīng)酶切和DNA序列鑒定，得到陽性克隆PKEXIL-6;(4)將PKEXIL-6載體DNA轉(zhuǎn)到N4830-1大腸桿菌中，得到白細(xì)胞介素-6的工業(yè)菌種。
前述工藝過程中所述的發(fā)酵用大腸桿菌高效表達(dá)該菌種可改為(1)將陽性克隆PKEXIL-6在100mlLB培養(yǎng)基接種過夜;(2)以1∶50稀釋到發(fā)酵培養(yǎng)液中，在25-35℃振搖過夜，溫度達(dá)42℃時，誘導(dǎo)3-6小時，收菌，用SDS-PAGE電泳，染色;(3)將菌種破碎細(xì)胞、離心、分離，將沉淀物洗滌、離心、得到包涵體。
前述工藝過程中所述的提純過程可改為(1)將用大腸桿菌高效表達(dá)的白細(xì)胞介素-6的包涵體溶解于鹽酸胍溶液，攪拌0.8-1.2小時，用分子凝膠過濾，SDS蛋白電泳、收集主峰;(2)在緩沖溶液中稀釋，使復(fù)性;(3)經(jīng)超濃縮后用凝膠柱層析，收集主峰，高效液相純化。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、用該方法進(jìn)行生產(chǎn)，產(chǎn)量明顯提高，用大腸桿菌高效表達(dá)的白細(xì)胞介素-6中，IL-6蛋白占菌體總蛋白不低于20%。
2、用該方法生產(chǎn)的IL-6純度高，經(jīng)純化的IL-6純度不小于97%，可直接臨床應(yīng)用于人體。
3、構(gòu)建出高效表達(dá)IL-6的工程菌種，使IL-6能夠工業(yè)化生產(chǎn)，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用開辟了道路。
4、用本方法生產(chǎn)的IL-6成本遠(yuǎn)低于原有的實驗方法。
5、活性高，最終純品的比活性不低于1×108單位/ml。


圖1為IL-6DNA序列圖;
圖2為PKEX-2 IL-6表達(dá)構(gòu)造圖。
下面結(jié)合附圖作進(jìn)一步綜合說明圖1 IL-6DNA序列，由合成的IL-6五末端基因片段(1-101堿基)，與天然IL-6基因片段(102-558堿基)組成。所得IL-6蛋白結(jié)構(gòu)與天然IL-6蛋白結(jié)構(gòu)相同。
一、IL-6功能區(qū)基因的克隆從培養(yǎng)U937細(xì)胞株中，抽取mPNA，然后轉(zhuǎn)錄成CDNA設(shè)計合成寡核苷酸引物五末端引物CCA AGC TTC ATA TGC CAG TAC CCC CAG GA包括HindⅢ和NdeⅠ酶切位置三末端引物CTC TAG ACT ACA TTT GCC GAA G包括XbaⅠ酶切位置以U937CDNA為模板，PCR擴增，獲得IL-6基因片段，將上述PCR擴增DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離、回收后，直接克隆到PCR2000載體中，轉(zhuǎn)入DH25受體菌，篩選白斑菌落，酶切和DNA序列檢定，獲得陽性克隆的PCRIL-6。
二、半合成的IL-6基因片段通過計算機分析，并運用最優(yōu)化轉(zhuǎn)譯理論，本發(fā)明設(shè)計、合成了下面六段DNA片段(1)AGC TTG GGT ATT AAT AAT GTA TCG ATT AAA TAA GGA GGA ATA ACA(2)TAT GTT ATT CCT CCT TAT TTA ATC GAT ACA TTA TTA ATA CCC A(3)TAT GCC GGT TCC GCC TGG TGA AGA TTC TAA AGA CGT TGC TGC T(4)GGT GCG GAG CAG CAA CGT CTT TAG AAT CTT CAC CAG GCG GAA CCG GCA(5)CCG CAC CGT CAG CCG TTA ACC TCT TCC GAA CGT ATC GAC AAA CAG ATC CGT TAC ATC CT(6)CGA GGA TGT AAC GGA TCT TTG TCG ATA CGT TCG GAA GAG GTT AAC GGC TGA C上述DNA片段，經(jīng)T4磷化酶、連接酶、電泳分離后，得到143堿基對的DNA片段。從PCRIL-6載體中，經(jīng)TaqⅠ/XbaⅠ酶切，分離得到454堿基對的DNA片段。然后，與上述143堿基對的DNA片段連接，進(jìn)而得到597堿基對的DNA片段。
三、構(gòu)建IL-6的表達(dá)載體載體PEX-2經(jīng)BsrBI/SspⅠ酶切，分離得到DNA大片段，除去Amp基因，然后與Kan基因片段連接，得到PKEX-2，PKEX-2經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ酶切，與上述597堿基對的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化到DH25受菌體中，經(jīng)酶切和DNA序列分析鑒定，得到陽性克隆PKEXIL-6，最后，使PKEXIL-6載體DNA轉(zhuǎn)到N4830-1大腸桿菌中，進(jìn)而得到IL-6工程菌種。
四、大腸桿菌高效表達(dá)IL-6將上述陽性克隆，在100毫升LB培養(yǎng)基(10g/L Peptone，5g/L Yeast Extract 5g/L Nacl，20mg/L卡那霉素)接種過夜后，以1∶50稀釋到發(fā)酵培養(yǎng)液中(5g/L Yeast Extract 5g/L葡萄糖7g/L K2HPO4，8g/L KH2PO4，5g/L(NH4)2SO4，1g/L mgSO47H2O，3ml/L微金屬液，3ml/L維生素混合液，20mg/L卡那霉素)。在30℃下振搖過夜，當(dāng)OD600達(dá)到10-50時，將溫度增高至42℃，誘導(dǎo)3-6小時，常規(guī)收菌后，用SDS-PAGE電泳、染色。薄層掃描儀分析表明。IL-6蛋白占體總蛋白不低于20%。
收到的菌種，經(jīng)French Pressarer在5MPa下，破碎細(xì)胞或用超聲破碎儀破碎細(xì)胞、離心、分離，其沉淀物經(jīng)2M脲素液洗滌后，離心，得到包涵體。
五、IL-6的變性和純化將上述包涵體容解于6M鹽酸胍溶液(0.1M Tris-HCL5mMEDTA/1mm DTT PH8.0)在室溫攪拌1小時，經(jīng)分子凝膠過濾，SDS蛋白電泳鑒定后，收集主峰，然后，1∶10稀釋在(0.1MTris-HCL PH8.0)緩沖溶液中，復(fù)性。此稀釋液經(jīng)超濾濃縮后，上樣到另一凝膠柱中層析，收集主峰，最后經(jīng)高效液相純化，得到純品，純品由SDS-PAGE電泳和HPLC檢定，純度不小于97%。
六、活性測定所有樣品的活性測定，是用7TD1雜交細(xì)胞株進(jìn)行測定的(Van Snick et al 1986 Proc Natl Aead Sci U S A 83∶9678-9683)最終純品的CL活性不低于1×108單位/毫克。
權(quán)利要求
1.一種白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，其工藝過程包括a利用PCR技術(shù)，構(gòu)建高效表達(dá)的白細(xì)胞介素-6的工程菌種；b對上述菌種5′末端功能基因段中的堿基進(jìn)行修飾，并插入第二個SD序列，即構(gòu)建其表達(dá)載體；c發(fā)酵用大腸桿菌高效表達(dá)該菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，還包括用分子篩凝膠過濾及高效液相層析的提純過程。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，所述工藝過程a可改為(1)從培養(yǎng)U937細(xì)胞株中，抽取MRNA，轉(zhuǎn)錄成CDNA;(2)設(shè)計、合成寡核苷酸引物，包括五末端引出物中HindⅢ和Ndel酶切位置和三末端引物的Xbal的酶切位置;(3)以U937CDNA為模板，PCR擴增，得到白細(xì)胞介素-6，基因片段;(4)用凝膠電泳將該片段分離回收;(5)將該片段克隆到PCR2000載體中轉(zhuǎn)入DH25受菌體;(6)進(jìn)行篩選白斑菌落，酶切。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，所述工藝過程b中的對上述菌種5末端動能基因段中的堿基進(jìn)行修飾包括(1)將通過轉(zhuǎn)譯理論合成的6個DNA片段經(jīng)T4磷酸化酶、連接酶、電泳進(jìn)行分離，得到143堿基對的DNA片段，(2)從PCR白細(xì)胞介素-6載體中，經(jīng)TaqⅠ/XbaⅠ酶切、分離，得到454堿基對的DNA片段;(3)將454堿基對片段與上述143堿基對的DNA片段連接，得到597堿基對片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，所述的構(gòu)建其表達(dá)載體為(1)載體PEX-2經(jīng)BsrBI/SspI酶切、分離，得到DNA大片段；(2)除去Amp基因，與Kan基因片段連接得到PKEX-2，(3)PKEX-2經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ酶切，再與597堿基對的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化到DH25受菌體中，經(jīng)酶切和DNA序列鑒定，得到陽性克隆PKEXIL-6;(4)將PKEXIL-6載體DNA轉(zhuǎn)到N4830-1大腸桿菌中，得到白細(xì)胞介素-6的工業(yè)菌種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，所述的發(fā)酵用大腸桿菌高效表達(dá)該菌種為(1)將陽性克隆PKEXIL-6在100ml LB培養(yǎng)基接種過夜;(2)以1∶50稀釋到發(fā)酵培養(yǎng)液中，在25-35℃振搖過夜，溫度達(dá)42℃時，誘導(dǎo)3-6小時，收菌，用SDS-PAGE電泳，染色;(3)將菌種破碎細(xì)胞、離心、分離，將沉淀物洗滌、離心、得到包涵體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝，所述的提純過程為(1)將用大腸桿菌高效表達(dá)的白細(xì)胞介素-6的包涵體溶解于鹽酸胍溶液，攪拌0.8-1.2小時，用分子凝膠過濾，SDS蛋白電泳、收集主峰;(2)在緩沖溶液中稀釋，使復(fù)性;(3)經(jīng)超濃縮后用凝膠柱層析，收集主峰，高效液相純化。
全文摘要
白細(xì)胞介素-6的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明系利用PCR技術(shù)獲得白細(xì)胞介素-6(記為IL-6)的基因片斷，并引入第二SD序列，從而得到半合成的IL-6的功能基因，構(gòu)建高效表達(dá)的IL-6的工程菌，該菌種在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從工程菌中分離表達(dá)的包函體，經(jīng)抽提復(fù)性后得到IL-6活性蛋白。本方法用來制作有明顯抗癌活性，能增加血小板的生物調(diào)節(jié)劑IL-6，即利用基因工程的菌種發(fā)酵工藝工業(yè)化生產(chǎn)高純IL-6。
文檔編號C12P21/00GK1113954SQ9410660
公開日1995年12月27日 申請日期1994年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月24日
發(fā)明者奚紹祁, 孫玉昆 申請人:哈爾濱市醫(yī)藥工程技術(shù)研究開發(fā)中心