專利名稱：生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法和微生物。
可以由屬于產(chǎn)堿菌或土壤桿菌的微生物生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖。一種上述葡聚糖產(chǎn)物(curdlan)是已知的[New Food Industry 20，49(1978)，美國專利3，754，925等]。
典型的所述微生物是糞產(chǎn)堿菌myxogenes變種(Agricultural Biological Chemistry30，196(1966)，等)。此外，已從該微生物得到了各種突變體，已報導的這些突變體包括尿嘧啶需要型菌株NTK-u(IFO 13140)和非尿嘧啶需要型自發(fā)突變體，即ATCC 31749和ATCC 31750(美國專利4，355，106)。
在這些文獻中，未公開該微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(carboxykinase)(該酶催化將草酰乙酸轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇丙酮酸的反應)的活性。
在IFO Research Communications 15，57-75(1991)和List of Cultures 9th ed.(1992)(兩者均由Institute for Fermentation，Osaka(IFO)出版)中，糞產(chǎn)堿菌myxogenes變種10C3(IFO 13714)經(jīng)分類分析，鑒定為Agrobacterium Sp.biovar I。
本發(fā)明的主要目的是提供生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法和微生物。
通過下列描述，該目的和其它目的以及本發(fā)明的優(yōu)點對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明的發(fā)明人想要得到一種具有工業(yè)化優(yōu)點的，以高產(chǎn)率和高效率生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法。作為其研究結(jié)果，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)用化學誘變劑處理糞產(chǎn)堿菌myxogenes變種10C3K得到的突變菌株是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性缺乏的，并且不能在含有以琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，還發(fā)現(xiàn)用該突變菌株生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法具有高生產(chǎn)力和高產(chǎn)率。
因此，本發(fā)明涉及以高生產(chǎn)力和高產(chǎn)率生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法。
根據(jù)本發(fā)明，提供了1).一種屬于土壤桿菌屬的微生物，它能生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性缺乏或缺陷的;
2).根據(jù)上述1)的微生物，其中所述微生物是磷酸烯醇丙酮酸活性為其親本菌株的0%到約50%的突變體;
3).根據(jù)上述1)的微生物，其中，所述微生物屬于土壤桿菌屬，并能生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖，但不能在含有琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長;
4).根據(jù)上述1)的微生物，其中所述微生物是Agrobacteriumsp.biovar I;
5).根據(jù)上述4)的微生物，其中所述微生物是Agrobacteriumsp.biovar I GA-27(FERM BP-4350);
6).根據(jù)上述4)的微生物，其中所述微生物是Agrobacteriumsp.biovar I GA-33(FERM BP-4351);
7).一種生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法，包括在養(yǎng)基中培養(yǎng)1)的微生物以便生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖，然后回收生產(chǎn)的β-1，3-葡聚糖;
8).根據(jù)上述7)的方法，其中所述微生物是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性為其親本菌株的0%到約50%的突變體;
9).根據(jù)上述7)的方法，其中所述微生物屬于土壤桿菌屬并能生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖，但不能在含琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長;
10).根據(jù)上述7)的方法，其中所述微生物是Agrobacteriumsp.biovar I;
11).根據(jù)上述10)的方法，其中所述微生物是Agrobacteriumsp.biovar I GA-27(FERM BP-4350);
12).根據(jù)上述10)的方法，其中所述微生物是Agrobacteriumsp.biovar I GA-33(FERM BP-4351);
13).根據(jù)上述7)的方法，其中所述β-1，3-葡聚糖是curdlan;
14).根據(jù)上述7)的方法，其中所述培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基;和15).根據(jù)上述7)的方法，其中所述微生物是在有氧條件下培養(yǎng)的。
在本發(fā)明的上下文中，屬于土壤桿菌屬的微生物包括屬于舊屬名為產(chǎn)堿菌屬的所有微生物。
本發(fā)明的β-1，3-葡聚糖是一種大部分以β-1，3-配糖鍵相連的葡萄糖單元組成的多糖，聚合度為約100到約20，000，優(yōu)選約500到約10，000。其具體的實例是curdlan，原生動物糖(paramylon)等。在本發(fā)明中，curdlan是優(yōu)選的。
若本發(fā)明所用的微生物是磷酸烯醇丙酮酸(下文簡稱PEPCK)活性不足或缺陷的突變菌株，則所述微生物的PEPCK活性為其親本菌株活性的0%到約50%，優(yōu)選的是0%到約30%?？梢杂肦.J.Hansen等人[Analytical Biochemistry 74，576，(1976)，參閱下文描述的參考實施例]的方法完成PEPCK活性的檢測。若本發(fā)明的微生物不是突變菌株，則可將具有與上述突變體相同程度PEPCK活性的微生物用于本發(fā)明。例如，所述微生物包括PEPCK活性不超過約0.006(△E340/分/mg蛋白質(zhì))，優(yōu)選的是不超過約0.004(△E340/分/mg蛋白質(zhì))的微生物。
本發(fā)明的微生物包括Agrobacteriumsp.biovarⅠ，這只是其中之一。作為優(yōu)選的實施例，包括提到的Agrobacterium sp.biovarⅠGA-27(IFO 15490，F(xiàn)ERM BP-4350)和Agrobacterium sp.biovarⅠGA-33(IFO 15491，F(xiàn)ERM BP-4351)，兩者均可用下文實施例1中描述的方法生產(chǎn)。
本發(fā)明優(yōu)選的微生物是屬于土壤桿菌屬的微生物，它有能力生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖，但不能在含有琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。該菌株也不能在含有除琥珀酸外的任何其他與TCA循環(huán)(三羧酸循環(huán)，檸檬酸循環(huán))有關(guān)的有機酸(如蘋果酸、富馬酸、α-氧代戊二酸等)或任何與TCA循環(huán)有關(guān)的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。
在本發(fā)明中，不能生長是指當在含有10g/l與所述TCA循環(huán)有關(guān)的有機酸或氨基酸作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基(如下文描述的培養(yǎng)基B)中將特定的微生物在32℃培養(yǎng)48小時，則所述微生物幾乎不生長。如用液體培養(yǎng)基作為試驗培養(yǎng)基，則在含有所述有機酸或氨基酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基(如下文描述的培養(yǎng)基B)，于32℃將所述微生物培養(yǎng)48小時，用去離子水將所得的培養(yǎng)液稀釋5倍，并用分光光度計(如Perkin-Elmer Spectrophotometer 35，cell dimensions 12×75mm，The Perkin-Elmer Corporation)測定其在590nm的光密度(OD)。若OD值不超過0.03，則認為該微生物不生長。
可以使其親本菌株經(jīng)本身已知的方法如用UV照射，或用化學誘變劑[如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(稱為NTG)或亞硝酸等]處理可得到本發(fā)明的微生物。
例如，用適量的，約200到約500μg/ml的NTG將親本菌株在32℃處理30分鐘以誘導其突變，然后將處理過的細胞放在適當?shù)呐囵B(yǎng)基(如含有葡萄糖作為唯一碳源的瓊脂培養(yǎng)基)上培養(yǎng)。然后，將所得的菌落復制平鋪在含有琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基上，并將在含有葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，但在含有琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中不生長或生長遲緩的菌落(不利用琥珀酸的突變體)檢出。也可以通過用與TCA循環(huán)(檸檬酸循環(huán))有關(guān)的有機酸(如蘋果酸、富馬酸、α-氧代戊二酸等)或氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)代替琥珀酸，以此衍生不利用所述酸的突變體，從而得到本發(fā)明的微生物。
使因此得到的本發(fā)明微生物在培養(yǎng)基中生長。該培養(yǎng)基可以是液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基。使用液體培養(yǎng)基是優(yōu)選的。
可用于所述培養(yǎng)基中的主要碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖、粗糖、糖蜜(如甜菜糖蜜、蔗糖蜜等)和各種淀粉的糖化產(chǎn)物(如木薯淀粉、西米棕櫚淀粉、甜馬鈴薯淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉等)，及其它。所用的上述碳源的濃度(以培養(yǎng)基計)為約3到約20%(w/v)，優(yōu)選的為約5到約10%(w/v)?？梢砸匀魏芜m當?shù)姆绞郊尤胨鎏荚?，即在培養(yǎng)開始時一次加入所需的量或培養(yǎng)期間順序或連續(xù)加入以達到必需的數(shù)量。
除上述特定的碳源外，對培養(yǎng)基的組成沒有特別的限制，如氮源、無機鹽的數(shù)量等。因此，例如氮源包括無機氮源如氨、硫酸銨、氯化銨、脲、磷酸氫銨等;各種有機物質(zhì)的銨鹽(例如有機酸如琥珀酸、富馬酸、α-氧代戊二酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸等的銨鹽，以及酸銨鹽如谷氨酸、天冬氨酸的銨鹽等);及中性氨基酸(如丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸等)。磷酸鹽的實例包括磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀或磷酸氫銨。可以單獨或以適當?shù)慕M合使用這些氮源和磷酸鹽。
另外，可以單獨或以適當?shù)慕M合使用對于所述微生物生長所必需的無機鹽，例如無機物質(zhì)(如鈣、鉀、鎂、錳、鐵、鋅、鈷和銅)的硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽或磷酸鹽，及其他鹽。
如果需要，可以單獨或以適當?shù)慕M合加入胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸、維生素等。此外，可以按需要加入消泡劑如硅油和其它添加劑。
優(yōu)選的是在有氧條件下完成培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為約20到約40℃，優(yōu)選的是約25到約35℃、培養(yǎng)基的pH為約4到約9，優(yōu)選的是約5到約7，并可以用酸或堿調(diào)整。
關(guān)于培養(yǎng)時間，連續(xù)培養(yǎng)直到β-1，3-葡聚糖產(chǎn)量達到最大值。因此，培養(yǎng)時間為約24小時到約10天，優(yōu)選的是約48小時到約5天。
用本身已知的方法(如離心、過濾、超濾等)回收在培養(yǎng)基中積累的β-1，3-葡聚糖，并按需要純化(如，美國專利3，754，925等)。
可以將按本發(fā)明得到的β-1，3-葡聚糖用于各種領(lǐng)域，包括食品、化學和民用工程工業(yè)。
用于食品，β-1，3-葡聚糖可作為增稠劑，粘度填充劑、粘合劑等。適宜的食品包括(但不限于)魚肉產(chǎn)品(如Kamaboko、chikuwa、hampen、tempura、蟹腿kamaboko、魚腸等)，動物肉產(chǎn)品(如香腸、咸牛肉、烤火腿、漢堡包、肉丸子等)，熟食(如gyoza、燒麥(shao-mai)等)，面條(如粗的、蒸熟的或煮的中國面條，udon面條，方便面、soba，烤soba，harusame，米粉面條、通心面，意大利式細面條，gyoza卷，燒麥卷等)，大豆產(chǎn)品(如，tohu、凍tohu、aburaage、gammodoki等)，調(diào)味品(如味噌、醬油、番茄沙司、tare等)，飲料，糊狀食品(如果醬、馬萊蘭、花生醬、面粉糊等)，豆醬、鮮美食品，乳品(如黃油、人造奶油、奶酪、攪打起泡沫的稀奶油等)，米丸子和餃子(如warabi mochi、mitarashi dango、botamoti，等)，大米和其它糕點及糖果(如arare、okaki、sembei、糖果、小甜餅、yokan、wanamagashi、煎餅、巴維利亞奶油、木斯、奶油泡夫、棉花軟糖、口香糖、冰激淋、裝飾果(肉)凍(aspic jelly)等)，等等。
可將根據(jù)本發(fā)明得到的β-1，3-葡聚糖單獨或與其它食品材料結(jié)合起來用于各種類型食品的生產(chǎn)，包括魔芋類食品、銀耳類食品、各種果(肉)凍、模制的食品(如片狀和somen類食品)裝飾凍類食物、熟大米制成的成形食品、可食性薄膜、低卡路里食品、含纖維食品的食譜等。
在化學或民用工程工業(yè)方面，如可用本發(fā)明得到的β-1，3-葡聚糖作為用于液體組合物(如浸膏或膠泥)的分離還原劑。
本發(fā)明使得可以以高生產(chǎn)力和高產(chǎn)率(按碳水化合物計)及高效率生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖。
下列參考實施例及操作實施例用于詳細說明本發(fā)明。
已經(jīng)將下列實施例1中得到的突變體，即Agrobacterium sp.biovar I GA-27和Agrobacterium sp.biovar I GA-33自1993，5，27，分別以登記號IFO 15490和15491寄存于Institute for Fermentation，Osaka(IFO 2-17-85，Tuso Honmachi Yodogawa-Ku，Osaka-shi)，并自1994，6，24，分別以登記號FERM BP-4350和FERM BP-4351寄存于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi Ibaraki)。
參考實施例PEPCK活性的檢測由于PEPCK活性水平極低，所以培養(yǎng)Agrobacterium sp.biovar I 10C3K(稱為親本菌株)并檢測親本菌株的PEPCK活性作為初步研究。
首先，使親本菌株在含有谷氨酸作為唯一碳源(不包括瓊脂)的液體培養(yǎng)基(實施例1下文描述的培養(yǎng)基B)中生長。從所得的培養(yǎng)液中，按如下步驟制備粗酶。將處于對數(shù)生長期親本菌株的培養(yǎng)液離心以回收細胞。用0.1M Tris-鹽酸緩沖液(pH7)洗滌這些細胞，并懸浮于相同的緩沖液中，用聲處理破碎。將細胞懸浮液離心以除去細胞碎片。此后，逐漸加入硫酸銨達到80%的飽和度，然后將混合物放在4℃過夜。將混合物進一步離心，將沉淀溶解，對相同的緩沖液作透析。透析產(chǎn)物用作酶樣品。
按照Hansen等人的方法，用分光光度計(Shimadzu Spectropho-tometer UV-160)測定在下文表1中所列的各不同反應系統(tǒng)中上述酶樣品在340nm吸收值的改變(△E340/分)，結(jié)果列于表1。
上述Hansen等人的方法是基于PEPCK是一種催化磷酸烯醇丙酮酸+ADP+CO2→草酰乙酸+ATP的反應(以及該反應的逆反應)的酶(作為催化劑，Mn2+是必需的)。在蘋果酸鹽脫氫酶的存在下，由NADH將草酰乙酸鹽還原為蘋果酸鹽。在該反應中，減少的NADH量用草酰乙酸鹽量來化學計算。用其在340nm處吸收值的變化來測定NADH的降低率。
從上面的結(jié)果清楚地看出該反應需要磷酸烯醇丙酮酸、ADP、HCO-3和MnCl2，IDP或GDP均不能代替ADP、MgCl2不能代替MnCl2，丙酮酸也不能代替磷酸烯醇丙酮酸。因此，可以肯定該反應是由PEPCK催化。
在PEPCK活性的檢測中，所用的酶樣品未被完全純化而含有蘋果酸脫氫酶，因此，不必加入蘋果酸脫氫酶。
PEPCK活性(△E340/分/mg蛋白質(zhì))是通過從表1中描述的完全系統(tǒng)的△E340/分/ml減去無ADP(除去ADP)系統(tǒng)的△E340/分/ml，然后將差轉(zhuǎn)變成每克蛋白質(zhì)活性值而得到的活性。用Lowry等人的方法(J.Biol.Chem.，193，265(1851))測定酶中的蛋白質(zhì)量。
親本菌株酶中的蛋白質(zhì)量是1.18mg/ml。該親本菌株的PEPCK活性(△E340/分/mg蛋白質(zhì))為0.192[(0.239-0.012)/1.18＝0.192]。
實施例1用200μg/ml NTG將Agrobacterium sp.biovar I 10C3K(親本菌株)在32℃處理30分鐘以誘導突變，并將其放在由表2中培養(yǎng)基A欄所示的組合物組成的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)中。確定生長后(32℃，2天)，將菌落復制平鋪在在由表2培養(yǎng)基B欄所示的組合物組成的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基B)中。
檢出表現(xiàn)出不生長或僅僅生長遲緩的微生物(不利用谷氨酸的突變體)，命名為Agrobacterium sp.biovar I GA-27和Agrobacterium sp.biovar I GA-33。
＊1 在液體培養(yǎng)基的情況下除去掉瓊脂＊2 用氨水調(diào)整＊3 用谷氨酸作為唯一碳源用與參考實施中相同的方法檢測每個得到的突變體的PEPCK活性。由于突變體幾乎不在含有谷氨酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基B中生長，所以應用通過在實施例2中描述的培養(yǎng)基C培養(yǎng)得到的細胞。結(jié)果列于表3。
從上面的結(jié)果清楚地表明，若將親本菌株的PEPCK活性作為100%，這些突變體，Agrobacterium sp.biovar I GA-27(FERM BP-4350，IFO 15490)和GA-33(FERM BP-4351，IFO 15491)的PEPCK活性分別低達28%和22%。
實施例2制備表4中所列的種子培養(yǎng)基并以每個燒瓶20ml，將其分到200ml的錐形瓶中。將每個燒瓶在118℃高壓滅菌10分鐘，用一菌環(huán)實施例1得到的Agrobacterium sp.biovar I GA-27(FERM BP-4350)，Agrobacterium sp.biovar I GA-33(FERM BP-4351)或Agrobacterium sp.biovar I 10C3K的斜面培養(yǎng)物接種每個得到的培養(yǎng)基，并在32℃培養(yǎng)24小時以得到種子培養(yǎng)液。
作為主要培養(yǎng)基，制備表4中描述的培養(yǎng)基C并分散到200ml錐形燒瓶中。將每個燒瓶在118℃高壓滅菌10分鐘后，將另高壓滅菌的葡萄糖加至含有主要培養(yǎng)基中的燒瓶中。
將2ml表現(xiàn)為完全生長的上述種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到主要培養(yǎng)基中并在32℃培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)完成后，以1N的終濃度加入氫氧化鈉以便溶解培養(yǎng)液中生產(chǎn)的curdlan，然后經(jīng)離心除去細胞。將得到的上清液適當?shù)叵♂專⒂梅?硫酸法檢測其全部的糖含量。此外，用葡萄糖檢測盒(由Technikon生產(chǎn)的)測定培養(yǎng)基中殘余的葡萄糖量。從全部的糖含量中減去殘余的葡萄糖含量，用0.9乘以得到的數(shù)字，得到生產(chǎn)的Curdlan量。表5中列出了有關(guān)本發(fā)明突變體生產(chǎn)的Curdlan數(shù)量，殘余的葡萄糖含量(表5中稱為“殘余的葡萄糖”)和按葡萄糖計算的Curdlan產(chǎn)率(表5中稱為“以葡萄糖計的”Curdlan產(chǎn)率)。

＊Curdlan產(chǎn)率(以葡萄糖計)＝(生產(chǎn)的Curdlan量/利用的葡萄糖)×100從表5可以看出，由兩個突變體，GA-27和GA-33生產(chǎn)的Curdlan量均大于親本菌株的生產(chǎn)量。用GA-33得到的Curdlan產(chǎn)率(以葡萄糖計)比親本菌株大至少約4%，而這種差異對于商業(yè)上β-1，3-葡聚糖的生產(chǎn)有顯著的經(jīng)濟意義。
實施例3制備表6中描述的種子培養(yǎng)基，并以每個燒瓶20ml分散到200ml的錐形燒瓶中。將每個燒瓶在118℃高壓滅菌10分鐘。然后用一菌環(huán)Agrobacterium sp.biovar I 10C3K、Agrobacterium sp.biovar I GA-27(FERM BP-4350)或Agrobacterium sp.biovar I GA-33(FERM BP-4351)的斜面培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基并在32℃培養(yǎng)24小時，產(chǎn)生種子培養(yǎng)液。
制備表6中描述的除去葡萄糖外的主要培養(yǎng)基，并倒入5升的罐發(fā)酵器中，然后滅菌。將葡萄糖單獨滅菌，將葡萄糖加至培養(yǎng)基后，將125ml表現(xiàn)出完全生長的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到主要培養(yǎng)基中，并在700rpm攪拌，1.01/分通氣率，2.51液體體積，及32℃的條件下培養(yǎng)，直到消耗完加入的葡萄糖。以1N的終濃度將氫氧化鈉加到所得的培養(yǎng)液中，并用與實施例2中相同的方法測定生產(chǎn)的Curdlan量。結(jié)果列于表7。
此外，將100ml的1N氫氧化鈉加到20ml上述培養(yǎng)液中，并將所得的混合物攪拌約1小時以溶解產(chǎn)物Curdlan。然后經(jīng)離心(9000rpm，10分鐘)除去細胞。用4N HCl中和，得到糊狀的中和凝膠。將含凝膠的溶液離心，用去離子水洗滌沉淀部分并再次離心(900rpm，10分鐘)。將上述方法重復兩次，以便足以脫鹽，用丙酮洗滌沉淀，離心，減壓干燥以回收粉末形式的Curdlan。將200mg的該Curdlan部分在10ml去離子水中溶脹，勻化，脫氣，然后放入試驗試管并在100℃加熱10分鐘。在該方法中，得到熱可成膠產(chǎn)物(熱凝結(jié)的凝膠)。用電流計(SUN Scientific Co.，Ltd.)檢測該凝膠的凝膠強度。結(jié)果列于表7。
＊硅油(Shin-Etsu.Chemical.Co.，Ltd.)
上述結(jié)果表明本發(fā)明突變體GA-27和GA-33的Curdlan生產(chǎn)能力遠高于親本菌株。
實施例4制備表6中描述的種子培養(yǎng)基并以每個燒瓶20ml的量分至數(shù)個200ml的錐形瓶中。將每個燒瓶在118℃高壓滅菌10分鐘。然后，用一菌環(huán)Agrobacterium sp.biovar I 10C3K、Agrobacterium sp.biovar I GA-27(FERM BP-4350)或Agrobacterium sp.biovar I GA-33(FERM BP-4351)的斜面培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基并在32℃培養(yǎng)24小時以得到種子培養(yǎng)液。
制備表6中描述的除去葡萄糖外的主要培養(yǎng)基，然后倒入5升的發(fā)酵罐中，滅菌。將葡萄糖單獨滅菌。將一半量的葡萄糖加到培養(yǎng)基中，將125ml表現(xiàn)為完全生長的上述種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至主要培養(yǎng)基，并于以800rpm攪拌率，1.01/分通氣率，2.51液體體積和32℃的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，加入剩余的一半葡萄糖并繼續(xù)培養(yǎng)直到完全消耗完加入的葡萄糖。用與實施例2和3相同的方法測定生產(chǎn)的Curdlan量和凝膠強度。結(jié)果列于表8。
上述結(jié)果表明甚至分兩次加入葡萄糖，本發(fā)明突變體的Curdlan生產(chǎn)能力仍高于親本菌株的能力。
實施例5使實施例1中得到的Agrobacterium sp.biovar I GA-27、Agrobacterium sp.biovar I GA-33及其親本菌株分別在表2描述的液體培養(yǎng)基、培養(yǎng)基B(各含有10g/l葡萄糖、琥珀酸、谷氨酸、富馬酸、α-氧代戊二酸或蘋果酸作為唯一碳源)中生長(32℃，48小時)。
為了研究每個培養(yǎng)基中菌株的生長程度，用去離子水將每個培養(yǎng)液稀釋5倍，并用分光光度計(Perkin-Elmer Spectrophotometer 35 cell 12×75mm The Perkin-Elmer Corporation)測定在590nm處的吸收值(光密度)。結(jié)果列于表9。
同樣，在表2描述的固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基B(各含有表10中描述的10g/l葡萄糖、琥珀酸、谷氨酸、富馬酸、α-氧代戊二酸和蘋果酸作為唯一碳源)中生長(32℃，48小時)，用肉眼評估在不同培養(yǎng)基中每個菌株的生長程度。結(jié)果列于表10。
++生長良好+生長±偶爾零星地生長-不生長上述結(jié)果表明，盡管親本菌株在分別含有這些有機酸或氨基酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，但本發(fā)明的突變體GA-27和GA-33并不是在任何培養(yǎng)基中均有可觀察到的生長。
權(quán)利要求
1.一種屬于土壤桿菌屬的、能生長β-1，3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性不足或缺乏的微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中，所述微生物是磷酸烯醇丙酮羧激酶活性為其親本菌株的0%到約50%的突變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中，所述微生物屬于土壤桿菌屬并能生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖，但不能在含有琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的微生物，其中，所述衍生物是Agrobacterium sp.biovarⅠ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的微生物，其中，所述衍生物是Agrobacterium sp.biovarⅠGA-27(FERM BP-4350)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的微生物，其中所述衍生物是Agrobacterium sp.biovarⅠGA-33(FERM BP-4351)。
7.一種生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法，它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1的微生物，產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖，然后回收生產(chǎn)的β-1，3-葡聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性為其親本菌株的0%到約50%的突變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物屬于土壤桿菌屬并能生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖，但不能在含有琥珀酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述衍生物是Agrobacteriumsp.biovarⅠ。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述衍生物是Agrobacteriumsp.biovarⅠGA-27(FERM BP-4350)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述衍生物是Agrobacteriumsp.biovarⅠGA-33(FERM BP-4351)。
13.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述β-1，3-葡聚糖是Curdlan。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。
15.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述微生物是在有氧條件下培養(yǎng)的。
全文摘要
本發(fā)明包括一種屬于土壤桿菌、能生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧酸酶活性不足或缺乏的微生物和一種生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖的方法，即在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述微生物，然后將其回收。本發(fā)明的方法可以以高產(chǎn)率(以碳水化合物計)和高效率生產(chǎn)β-1，3-葡聚糖。
文檔編號C12P19/04GK1100141SQ94108278
公開日1995年3月15日 申請日期1994年7月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月5日
發(fā)明者鐘江幸洋, 湯谷章, 中對勇 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社