專利名稱：蛹蟲草優(yōu)良菌種的選育及高產(chǎn)栽培方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種食用兼藥用真菌的選育及栽培技術(shù)，一種蛹蟲草優(yōu)良菌種的選育及高產(chǎn)栽培方法。
專利號為CN88103453.3的發(fā)明專利公開了一種“冬蟲夏草菌及其培養(yǎng)方法”，從新鮮的冬蟲夏草中分離、經(jīng)人工培養(yǎng)，取其孢子接種于人工飼養(yǎng)的寄生昆蟲，產(chǎn)生子座、形成菌蟲結(jié)合的復合體。實驗證明，該方法不僅周期長，而且子實體難以形成，故人工栽培冬蟲夏草并沒有獲得完全成功。蛹蟲草(cor-dycepsmiLitaris(L)Link)又名北冬蟲夏草，是與冬蟲夏草極為相近的一個種。本菌種已于1993年4月1日保藏在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO 0193，本發(fā)明人曾在一項發(fā)明專利中公開過“北冬蟲夏草菌及其人工栽培子實體的方法”。該方法通過人工栽培得到的北冬蟲夏草子實體，因其含特有的蟲草菌素、蟲草多糖、超氧化物岐化酶、蟲草酸等，故具有抗癌、抗衰老和營養(yǎng)肌膚等作用，可用于治療多種疾病和做滋補、保健食品、藥品、飲料、化妝品的原料。但目前蛹蟲草的菌種及其栽培方法還不夠理想。例如菌種不純、退化現(xiàn)象比較嚴重，其表現(xiàn)為菌絲絨毛短、緊貼培養(yǎng)基表面，并出現(xiàn)水珠，鏡檢分生孢子多、呈圓柱形，菌絲分枝呈直角，這樣的菌種栽培后，盡管給予合適的溫度、光照、濕度等條件仍不易轉(zhuǎn)色，難以出現(xiàn)子實體。影響產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，在栽培技術(shù)上，以往只收一茬子實體，生物轉(zhuǎn)化率僅30-60%，有的甚至只有10%左右，因而造成產(chǎn)量低，成本高。
本發(fā)明的目的是提供一種蛹蟲草的良種選育和高產(chǎn)栽培方法。它有效地保證選育的菌種純正，不易退化，明顯提高生物轉(zhuǎn)化率，縮短生產(chǎn)周期，顯著降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的將新采集的蛹蟲草通過常規(guī)單孢或多孢分離方法獲得的原始菌株，經(jīng)過人工選育和高產(chǎn)栽培。其選育經(jīng)過三個階段的篩選母種階段將原始菌株接種在經(jīng)滅菌的試管或培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)7-10天，見光后呈桔黃色，根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢挑選菌絲絨毛長，均勻一致，菌絲分枝多而長、呈鈍角、分生孢子呈圓形的菌株留作母種進行第一次篩選;原種階段將上述母種接種在經(jīng)滅菌的三角瓶中的液體培養(yǎng)基上經(jīng)振蕩、避光培養(yǎng)5天后，再經(jīng)2天靜止培養(yǎng)，見光后呈桔黃色，按上述標準挑選菌株留作原種，進行第二次篩選;栽培種階段將上述原種接種在經(jīng)滅菌的罐頭瓶中的液體培養(yǎng)基上，經(jīng)10-12天避光培養(yǎng)，見光1-2天后呈桔黃色，按上述標準挑選菌株留作栽培種，進行第三次篩選。菌種提純復壯經(jīng)過三次篩選的菌種再進行3-5次重復栽培試驗，最后選出栽培母種，然后將培養(yǎng)基增加1-5%的活蛹或幼蟲體或奶粉，進行復壯。蛹蟲草的高產(chǎn)栽培在無菌室內(nèi)每個培養(yǎng)瓶的固體培養(yǎng)基上接種2毫升上述經(jīng)復壯的栽培種，避光培養(yǎng)10-20天，長滿菌絲移入栽培室，室內(nèi)相對濕度85-90%，CO2 0.03-0.05%，光照2千5-2萬Lux，經(jīng)3-5天即可長出子實體，在子囊孢子未大量散發(fā)及時采收。采收第一茬子實體后，將培養(yǎng)基表面用無菌刀清理干凈，露出白色菌絲，在其上扎孔或劃0.5厘米深的溝，注入10-20毫升營養(yǎng)液，將瓶口封好，在上述同樣條件下經(jīng)7-10天培養(yǎng)可長出第二茬子實體，同樣方法和條件可再連續(xù)長出第三、第四茬子實體。在選育各階段和高產(chǎn)栽培方法中所用培養(yǎng)基配方如下選育母種階段培養(yǎng)基配方馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、瓊脂2.1-2.5%、蛋白胨0.2-0.25%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蠶蛹或幼蟲1-5%，加土壤浸出液至100%;原種階段培養(yǎng)基配方是馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蠶蛹或幼蟲1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值為8-8.5;栽培種階段培養(yǎng)基配方是馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、奶粉2-3%，加土壤浸出液至100%，其PH值為8-8.5;高產(chǎn)栽培所用固體培養(yǎng)基配方是大米30-50克加土豆汁1.7倍，調(diào)PH8-8.5;大米30-50克加奶粉2-5克，再加水1.6倍，調(diào)PH值8-8.5;大米30-50克加蠶蛹蛋白2-5克，再加水1.6倍，調(diào)PH8-8.5。所加營養(yǎng)液配方是馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蠶蛹或幼蟲1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值為8-8.5。
由于本發(fā)明是對現(xiàn)有北冬蟲夏草菌及其人工栽培子實體方法進行大量的實驗研究后，確認蛹蟲草的無性階段屬頭孢霉屬(ce-phalosporlum mitilaris kob)，所以它為蛹蟲草菌種選育、提純、復壯提供了可靠的依據(jù)。在研究中，還發(fā)現(xiàn)了蛹蟲草存在“異核現(xiàn)象”，這種異核現(xiàn)象對子實體的產(chǎn)生有直接影響，經(jīng)過長時間的大量栽培實驗，總結(jié)出上述蛹蟲草的良種選育和高產(chǎn)栽培方法，取得了意想不到的積極效果。該方法通過母種、原種、栽培種三個階段的篩選和復壯后，獲得種性相對穩(wěn)定的純正菌種，不易退化，該菌種在得到第一茬子實體后，在其固體培養(yǎng)基再追加營養(yǎng)液，可連續(xù)獲得第二、三、四茬子實體，可使生物轉(zhuǎn)化率達到150%以上，縮短生產(chǎn)周期20天以上，降低生產(chǎn)成本40%左右。
下面結(jié)合具體實施方法對本發(fā)明作進一步說明。
實施方法一優(yōu)良菌種的選育母種階段將按常規(guī)孢子分離技術(shù)獲得的原始菌種接種在經(jīng)滅菌的試管(或培養(yǎng)皿)中的固體培養(yǎng)基上，在20-25℃溫度下避光培養(yǎng)7-10天后，見光1-2天呈桔黃色，根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢挑選菌絲絨毛長，均勻一致，菌絲分枝多而長，呈鈍角，分生孢子呈圓形的菌株留作母種，進行第一次篩選，其余淘汰。其固體培養(yǎng)基配方是馬鈴薯210克、蔗糖25克、瓊脂22克、蛋白胨2克、磷酸二氫鉀1.8克、磷酸氫二鉀1.2克、硫酸鎂1克、VBl 10毫克、活蠶蛹10克，加土壤浸出液至1000毫升。原種階段將上述母種接種在經(jīng)滅菌的三角瓶中的液體培養(yǎng)基上，在20-25℃條件下，經(jīng)振蕩避光培養(yǎng)5天后，再經(jīng)2天靜止培養(yǎng)，見光后呈桔黃色，按上述標準挑選菌株留作原種，其余淘汰。其培養(yǎng)基配方馬鈴薯220克、蔗糖24克、磷酸二氫鉀2克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂1.5克、VBl 15毫克、活蠶幼蟲50克，加土壤浸出液至1000毫升，調(diào)PH8-8.5。栽培種階段將上述原種接種在經(jīng)滅菌的罐頭瓶的液體培養(yǎng)基上，在20-25℃溫度下經(jīng)10-12天避光培養(yǎng)，見光1-2天后呈桔黃色，按上述標準挑選菌株留作栽培種，其余淘汰。其培養(yǎng)基配方是馬鈴薯250克、蔗糖20克、磷酸二氫鉀2克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂1克、VBl 20毫克、奶粉30克，加土壤浸出液至1000毫升，調(diào)PH8-8.5，經(jīng)過三次篩選獲得的菌種再進行3次重復栽培試驗，最后選出栽培母種，然后將其培養(yǎng)基增加1%的活蛹或幼蟲體進行復壯。高產(chǎn)栽培在無菌室內(nèi)將上述經(jīng)復壯的栽培種2毫升接種在每個培養(yǎng)瓶的固體培養(yǎng)基上，在24±2℃溫度下，空氣相對濕度60-65%，CO2濃度0.05-0.1%避光培養(yǎng)10-20天，長滿菌絲后移入栽培室，溫度在21±2℃，空氣相對濕度85-90%、CO2濃度0.03-0.05%，有明亮均勻的散射光照射，光照2千5-2萬Lux，每天通風3-4次，每次20分鐘左右，在瓶蓋上扎眼防止子實體畸形，經(jīng)3-5天即可長出子實體，在子囊孢子未大量散發(fā)時及時采收第一茬子實體。第一茬子實體采收后，將其培養(yǎng)基取出用無菌刀將培養(yǎng)基表面清理干凈，露出白色菌絲，然后放回栽培瓶中，在其表面扎眼或劃0.5厘米深的溝，根據(jù)其含水量多少加入10-20毫升營養(yǎng)液，將瓶口封好，放在24±2℃溫度下，空氣相對濕度60-65%，CO2濃度0.05-0.1%，避光培養(yǎng)5-7天，長滿菌絲后，移入栽培室，溫度在21±2℃，相對濕度85-90%，CO2濃度0.03-0.05%，光照2千5-2萬Lux，經(jīng)過3-5天即可長出子實體，在子囊孢子未大量散發(fā)時及時采收第二茬子實體，按照同樣方法和條件可連續(xù)采收第三、第四茬子實體。第一茬子實體的培養(yǎng)基配方是大米30克，加1.7倍的土豆汁，PH8-8.5，第2-4茬的固體培養(yǎng)基上所加營養(yǎng)液配方是馬鈴薯250克、蔗糖20克、磷酸二氫鉀1.6克、磷酸氫二鉀1.4克、硫酸鎂1克、VBl 20毫克、活蠶蛹30克，加土壤浸出液至1000毫升，PH8-8.5。
實施方法二蛹蟲草優(yōu)良菌種選育采用如實施方法一相同的方法步驟和相同的良種標準，經(jīng)過母種階段、原種階段、栽培種階段，再經(jīng)過復壯獲得種性相對穩(wěn)定的栽培種。各階段的培養(yǎng)基配方是母種階段馬鈴薯250克、蔗糖20克、瓊脂25克、蛋白胨2.5克、磷酸二氫鉀2克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂1.5克、VBl 20毫克、活蠶蛹或幼蟲50克，加土壤浸出液至1000毫升;原種階段馬鈴薯240克、蔗糖25克、磷酸二氫鉀1.8克、磷酸氫二鉀1.2克、硫酸鎂1.5克、VBl 15毫克、活蠶蛹30克，加土壤浸出液至1000毫升;栽培種階段馬鈴薯230克、葡萄糖20克、磷酸二氫鉀1.6克、磷酸氫二鉀1.4克、硫酸鎂1.2克、VBl 10毫克、奶粉30克，加土壤浸出液至1000毫升，PH8-8.5，選取的栽培母種，將其培養(yǎng)基加5%的奶粉進行復壯。高產(chǎn)栽培方法步驟條件同實施方法一，其第一茬子實體培養(yǎng)基配方是大米50克，加2-5克的奶粉(或蠶蛹蛋白)，再加1.6倍的水，調(diào)PH8-8.5，第2-4茬培養(yǎng)基所加營養(yǎng)液配方是馬鈴薯220克、葡萄糖25克、磷酸二氫鉀2克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂1.5克、VBl 10毫克、活蠶蛹或幼蟲50克，加土壤浸出液至1000毫升，PH8-8.5。
權(quán)利要求
1.一種蛹蟲草優(yōu)良菌種的選育及高產(chǎn)栽培方法，蛹蟲草(cordycepsmilitaris(L)link)又名北冬蟲夏草，本菌種已于1993年4月1日保藏在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO0193，包括將新采集的蛹蟲草通過常規(guī)單孢或多孢分離方法獲得的原始菌株，進行人工選育和高產(chǎn)栽培，其操作步驟如下1.1、蛹蟲草優(yōu)良菌種的選育將原始菌種經(jīng)過母種階段、原種階段和栽培種階段三次篩選后，進行復壯；1.1.1、母種階段先將原始菌株接種在經(jīng)滅菌的試管或培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)7-10天，見光后呈桔黃色，根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢挑選菌絲絨毛長，均勻一致，菌絲分枝多而長、呈鈍角、分生孢子呈圓形的菌株留作母種進行第一次篩選；1.1.2、原種階段將上述母種接種在經(jīng)滅菌的三角瓶中的液體培養(yǎng)基上經(jīng)振蕩、避光培養(yǎng)5天后，再經(jīng)2天靜止培養(yǎng)，見光后呈桔黃色，按上述標準挑選菌株留作原種，進行第二次篩選；1.1.3、栽培種階段將上述原種接種在經(jīng)滅菌的罐頭瓶中的液體培養(yǎng)基上，經(jīng)10-12天避光培養(yǎng)，見光1-2天后呈桔黃色，按上述標準挑選菌株留作栽培種，進行第三次篩選；1.1.4、菌種提純復壯經(jīng)過三次篩選的菌種再進行3-5次重復栽培試驗，最后選出栽培母種，然后將培養(yǎng)基增加1-5%的活蛹或幼蟲體或奶粉，進行復壯；1.2、蛹蟲草的高產(chǎn)栽培；1.2.1、在無菌室內(nèi)每個培養(yǎng)瓶的固體培養(yǎng)基上接種2毫升上述經(jīng)復壯的栽培種，避光培養(yǎng)10-20天，長滿菌絲移入栽培室，室內(nèi)相對濕度85-90%，CO20.03-0.05%，光照2千5-2萬lux，經(jīng)3-5天即可長出子實體，在子囊孢子未大量散發(fā)及時采收；1.2.2、采收第一茬子實體后，將培養(yǎng)基表面用無菌刀清理干凈，露出白色菌絲，在其上扎孔或劃0.5厘米深的溝，注入10-20毫升營養(yǎng)液，將瓶口封好，在上述同樣條件下經(jīng)7-10天培養(yǎng)可長出第二茬子實體，同樣方法和條件可再連續(xù)長出第三、第四茬子實體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是選育母種階段培養(yǎng)基配方馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、瓊脂2.1-2.5%、蛋白胨0.2-0.25%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蠶蛹或幼蟲1-5%，加土壤浸出液至100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是選育原種階段培養(yǎng)基配方是馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蠶蛹或幼蟲1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值為8-8.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是選育栽培種階段培養(yǎng)基配方是馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、奶粉2-3%，加土壤浸出液至100%，其PH值為8-8.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是高產(chǎn)栽培所用固體培養(yǎng)基配方是大米30-50克加土豆汁1.7倍，調(diào)PH8-8.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是高產(chǎn)栽培所用固體培養(yǎng)基配方是大米30-50克加奶粉2-5克，再加水1.6倍，調(diào)PH值8-8.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是高產(chǎn)栽培所用固體培養(yǎng)基配方是大米30-50克，加蠶蛹蛋白2-5克，再加水1.6倍，調(diào)PH8-8.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是高產(chǎn)栽培追加營養(yǎng)液的配方是馬鈴薯21-25%、葡萄糖或蔗糖2.1-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.2%、磷酸氫二鉀0.11-0.15%、硫酸鎂0.1-0.15%、VBl 0.001-0.002%、活蠶蛹或幼蟲1-5%，加土壤浸出液至100%，其PH值為8-8.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛹蟲草的良種選育及高產(chǎn)栽培方法。將通過常規(guī)單孢或多孢分離方法獲得的原始菌株經(jīng)過母種、原種、栽培種三次篩選，獲得優(yōu)良菌種。通過增加培養(yǎng)基營養(yǎng)成分復壯，使其菌種種性相對穩(wěn)定、純正、不易退化。該良種通過對培養(yǎng)基追加營養(yǎng)液，可連續(xù)采收3—4茬子實體，其生物轉(zhuǎn)化率可達150％以上，縮短了生產(chǎn)周期20天以上，顯著降低生產(chǎn)成本40％左右。
文檔編號C12N1/14GK1094091SQ9411006
公開日1994年10月26日 申請日期1994年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月5日
發(fā)明者李春燕 申請人:李春燕