專利名稱：新生隱球菌的鑒定方法及其所用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新生隱球菌的鑒定方法，即一種能夠同時檢測出該菌種尿素酶特性與酚氧化酶特性的鑒定方法以及該方法所使用的培養(yǎng)基。
新生隱球菌是臨床引起隱球菌病的最主要病原性真菌，該病易發(fā)生于免疫功能受損的病人，尤其多見于AIDS患者。由于新生隱球菌感染的治療困難，早期診斷及發(fā)現(xiàn)病原菌具有重要意義。傳統(tǒng)上，國內(nèi)外許多醫(yī)學(xué)臨床實驗室都將尿素酶檢測作為新生隱球菌鑒定的重要項目，其陰性結(jié)果往往是否定被鑒定菌株為新生隱球菌的主要依據(jù)之一。但是近些年，對新生隱球菌的研究結(jié)果表明，該菌具有明顯的生物學(xué)多態(tài)性，尤其是新近發(fā)現(xiàn)該菌的尿素酶陰性株，這就給臨床的菌種鑒定提出了鑒定方法的問題。傳統(tǒng)方法顯然不能鑒定出尿素酶陰性菌株。同時尿素酶試驗方法已經(jīng)應(yīng)用了多年，其培養(yǎng)基的制備較為復(fù)雜。在我們研究過程中及結(jié)合國外已有的報告觀察到具不同生物學(xué)特性的新生隱球菌均特異性地含有酚氧化酶活性，但是由于酚氧化酶檢測的培養(yǎng)基的制備亦無統(tǒng)一的簡便方法，從而限制了這些檢測項目的廣泛使用。
另外，如果采用檢測酚氧化酶的方法鑒定新生隱球菌，則在臨床上仍需用傳統(tǒng)方法再鑒別其尿素酶活性，以區(qū)分出尿素酶陽性菌株與陰性菌株。在兩種不同培養(yǎng)基中分別進(jìn)行兩次試驗，顯然不利于結(jié)果的判斷，而且費時，費力，經(jīng)濟上造成浪費。在同時作大量樣品鑒定時，還增加了出差錯的可能。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明將提供一種新生隱球菌的鑒定方法及其培養(yǎng)基，它能準(zhǔn)確，簡便，快捷，經(jīng)濟地鑒定出新生隱球菌，并且同時鑒定它的兩種生物特性，即在檢測酚氧化酶，以鑒定新生隱球菌的同時，鑒別出尿素酶陽性菌株或陰性菌株，將使該菌種鑒定的工作量減少到傳統(tǒng)方法的1/3，有利于臨床上的推廣，應(yīng)用。
為完成上述任務(wù)，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案在同一培養(yǎng)基中同時設(shè)置兩組針對不同生物特性的檢測底物，即可因尿素酶的存在而使培養(yǎng)基變色的尿素酶檢測底物，與可因酚氧化酶的存在而使菌落變色的酚氧化酶檢測底物，同時在培養(yǎng)基中設(shè)置H+濃度調(diào)節(jié)劑，并控制兩組底物的濃度與溫度，以使兩組檢測反應(yīng)同步進(jìn)行，同時顯示結(jié)果。
尿素酶是一種胞外酶，該酶作用于尿素，使其分解為NH3和CO2，導(dǎo)致PH升高使PH指示劑變色，如酚紅由黃變紅。酚氧化酶是一種胞內(nèi)酶，該酶作用于雙酚或單酚化合物如多巴、甲基多巴、兒茶酚、咖啡酸等產(chǎn)生黑色素(melanin)，導(dǎo)致菌的生長菌落變?yōu)樽厣?。即同一培養(yǎng)基中含有二種相應(yīng)的底物時，可以發(fā)生二個可以明確區(qū)分的酶反應(yīng)，即尿素酶使培養(yǎng)基變色，酚氧化酶使菌落變色，從而達(dá)到同時檢測二種酶活性的目的。
本發(fā)明實驗方法如下①使用多因素正交試驗及線性分析方法研究底物濃度、溫度、H+離子含量等變化對二種酶同時反應(yīng)的影響。
②對尿素酶反應(yīng)選擇更好的PH指示劑和最適尿素用量。
③比較并簡化基礎(chǔ)培養(yǎng)基并確定各種成份的用量(配方)，同時考慮在國內(nèi)實施生產(chǎn)的可行性。
④與分別進(jìn)行兩種酶檢測法比較在同一培養(yǎng)基上進(jìn)行兩種酶檢測方法的可靠性。
⑤用多種臨床常見的酵母或酵母樣真菌作敏感性、特異性、檢測效率及可行性分析。
經(jīng)實驗得到的綜合試驗培養(yǎng)基的配方為尿素檢測底物為尿素與適量的PH指示劑(如溴麝香草酚藍(lán)或酚紅等);酚氧化酶的檢測底物為單酚或雙酚化合物，例如咖啡酸，兒茶酚，多巴，多巴胺，沒食子酸，腎上腺素，去甲腎上腺素或甲基多巴等;H+濃度調(diào)節(jié)劑為KH2PO4或NaH2PO4;培養(yǎng)溫度在25℃;培養(yǎng)時間為24-72小時。培養(yǎng)基的賦型劑可以用玉米瓊脂如Cornmeal agar (CDifco，USA)或加入葡萄糖，蛋白胨與NaCl的瓊脂。其中玉米瓊脂還可用玉米浸出液代替，玉米浸出液的制作方法是取玉米粉40g，加入1000ml蒸餾水混勻，于90℃浸出15分鐘(搖動)之后用尼龍布過濾，即可。實施生產(chǎn)的流程為各種成份的稱量→消毒滅菌→制成試管斜面→備用。使用方法為接種待檢菌后于25℃培養(yǎng)觀察，72小時內(nèi)可得到結(jié)果(見附

圖1和表1)。
即各組分的含量如下雙酚或單酚化合物 0.3-0.6g/L尿素 3-20g/L
PH指示劑 適量(使用酚紅時，為0.005-0.02g/L;使用麝香草酚藍(lán)時為0.0008-0.0002g/L)H+濃度調(diào)節(jié)劑 0.1-0.8g/L賦型劑 適量(使用玉米瓊脂時為15-20g/L，使用加菌葡萄糖，蛋白胨與NaCl的瓊脂時，葡萄糖為0.5-2g，蛋白胨為0.5-2g，NaCl為3-8g，瓊脂為15-20g)助溶酚類化合物時可使用15-25ml無水乙醇，其余為蒸餾水。
優(yōu)點及效果采用本發(fā)明所示的方法檢測二種酶的活性具有下述優(yōu)點1.與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明提供了同時進(jìn)行兩項檢測的方法，從而極大地方便了實驗的實施，結(jié)果的觀察和記錄。使用者僅需將接種好的試管放于25℃培養(yǎng)72小時即可得到二種酶反應(yīng)的結(jié)果。
2.本發(fā)明解決了臨床快捷，可靠的鑒定具不同生物學(xué)特性的新生隱球菌的問題，尤其是解決了正確鑒定尿素酶陰性新生隱球菌的問題。
3.由本發(fā)明得到的綜合培養(yǎng)基的構(gòu)成做到盡可能的簡化，且制備過程僅相當(dāng)于制備一項檢測所使用的培養(yǎng)基的工作量，原材料大約只相當(dāng)于分開進(jìn)行兩項試驗的1/3。并且全部采用國產(chǎn)試劑，無毒，無污染，極有利于本發(fā)明的生產(chǎn)實施和推廣。
對44株新生隱球菌，以6株白念珠菌為對照，分別使用Christensen尿素酶培養(yǎng)基(日本W(wǎng)akopure Chemical Industries，LTD產(chǎn)品)，僅含咖啡酸的培養(yǎng)基，僅含尿素酶的培養(yǎng)基及綜合試驗培養(yǎng)基進(jìn)行試驗。結(jié)果由四種培養(yǎng)基得到的結(jié)果完全一致，對13株具有現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的不同生物學(xué)特點的新生隱球菌典型菌株在綜合培養(yǎng)基上檢測兩種酶的活性，結(jié)果與由傳統(tǒng)方法得到的完全一致。
使用綜合試驗培養(yǎng)基檢測140株臨床常見酵母或酵母樣真菌，結(jié)果全部受試的新生隱球菌(43株)均現(xiàn)酚氧化酶陽性反應(yīng)，97株其它受試菌株均為陰性反應(yīng)，表明所測酚氧化酶對新生隱球菌的特異性和敏感性均為100%。除受試新生隱球菌中兩株已知尿素酶陰性株外，其余均呈尿素酶陽性，揭示本綜合試驗培養(yǎng)基可以有效地鑒定新生隱球菌尿素酶陰性株。此外，受試的其它菌種中除酚氧化酶全部陰性外，淺白和羅倫隱球菌，絲孢酵母屬菌種，少數(shù)克柔氏念珠菌呈尿素酶陽性結(jié)果，提示該綜合培養(yǎng)基有助于鑒定其它臨床常見的酵母樣真菌。
現(xiàn)通過實施例作進(jìn)一步說明實施例1培養(yǎng)基分A，B兩部分配制A液取咖啡酸0.4g，加入無水乙醇20ml，微加熱助溶;溶解后補加5ml蒸餾水，可防止此后過濾除菌時無水乙醇破壞醋酸纖維濾膜而使除菌失敗。加入尿素5g，溶解;加入4%溴麝香草酚藍(lán)(儲存液)15ml，溶解。
B液取玉米粉40g，加入1000ml蒸餾水混勻，于90℃±浸出15分鐘(搖動)，之后用尼龍布過濾，不足960ml時用蒸餾水補足，加入KH2PO40.2g，瓊脂20g。于121℃高壓滅菌15分鐘后冷卻至60℃左右。
將A液用0.22um孔徑的醋酸纖維濾膜過濾A液至冷卻60℃左右的B液中，立即分裝入0.4×10Cm試管(已消毒)，每管3ml，加蓋后制成斜面。凝固后放4℃冰箱存放，可用3個月(暫定)。
使用時，加溫后接種待測樣品，在25℃下培養(yǎng)72小時，如出現(xiàn)棕色菌落，可鑒定為新生隱球菌;同時觀察培養(yǎng)基，如無顏色改變，則為尿素酶陰性菌，如培養(yǎng)基變?yōu)樘m色則為尿素酶陽性菌。具體分析結(jié)果見圖1與表1。
圖1綜合培養(yǎng)基檢測酚氧化酶和尿素酶實驗結(jié)果(解釋見表1)
表1綜合培養(yǎng)基試驗結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)果尿素酶 酚氧化酶 結(jié)果分析 見附圖中+ + 新生隱球菌 ⑧⑨- + 新生隱球菌尿素酶陰性株 ⑧⑦+ - 隱球菌屬中的其它菌種,等 ④⑤- - 念球菌菌屬大部份菌種,等 ②③實施例2配制方法及使用方法與實施例1相同，配方更改如下兒茶酚 0.3g/L尿素 3g/L酚紅 0.02g/LNaH2PO40.1g/L玉米瓊脂 17.5g加蒸餾水至900ml無水乙醇 15ml蒸餾水補足 1L實施例3配制方法及使用方法與實施例1相同，配方更改如下多巴 0.6g/L尿素 20g/L酚紅 0.005g/LKH2PO40.8g/L葡萄糖 2g/L蛋白胨 2g/LNaCl 8g/L瓊脂 20g/L無水乙醇 25ml蒸餾水補足 1L
實施例4配制方法及使用方法與實施例1基本相同，配方更改如下多巴胺 0.5g/L尿素 10g/LNaH2PO40.6g/L4%溴麝香草酚藍(lán) 5ml4%玉米浸液 9800g無水乙醇 15ml蒸餾水補足 1L
權(quán)利要求
1.新生隱球菌的鑒定方法，將待檢樣品接種在培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，其特征是在培養(yǎng)基中同時設(shè)置兩組針對不同生物特性的檢測底物，即可因尿素酶的存在而使培養(yǎng)基變色的尿素酶檢測底物，與可因酚氧化酶的存在而使菌落變色的酚氧化酶檢測底物，同時，在培養(yǎng)基中設(shè)置H+濃度調(diào)節(jié)劑，并控制兩組底物的濃度與培養(yǎng)溫度，以使兩組檢測反應(yīng)同步進(jìn)行，同時顯示結(jié)果。
2.按照權(quán)利要求1所述的新生隱球菌的鑒定方法，其特征是尿素酶檢測底物為尿素與PH值指示劑，酚氧化酶的檢測底物為單酚或雙酚化合物，H+濃度調(diào)節(jié)劑為KH2PO4或NaH2PO4，接種后最佳培養(yǎng)溫度為25℃。
3.一種新生隱球菌的培養(yǎng)基，由賦型劑，檢測底物與蒸餾水組成，其特征是在培養(yǎng)基中同時設(shè)置有兩組不同生物特性矯檢測底物一組檢測尿素酶的底物為尿素與ph值指示劑，另一組檢測酚氧化酶的底物為單酚或雙酚化合物，同時設(shè)置H+濃度調(diào)節(jié)劑。
4.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征是單酚或雙酚化合物為咖啡酸或兒茶酚或多巴或多巴胺，PH指示劑為溴麝香草酚藍(lán)或酚紅，H+濃度調(diào)節(jié)劑為KH2PO4或NaH2PO4，賦型劑為玉米瓊脂或玉米浸液或加有葡萄糖，蛋白胨與NaCl的瓊脂。
5.按照權(quán)利要求3或4所述的培養(yǎng)基，其特征是各組份配方如下單酚或雙酚化合物 0.3-0.9g/L尿素 3-20g/LPH指示劑 適量H+濃度調(diào)節(jié)劑 適量無水乙醇(助溶酚類化合物用) 15-25ml其余為賦型劑與蒸餾水。
6.按照權(quán)利要求3，4或5的培養(yǎng)基，其特征是各成份優(yōu)選含量為單酚或雙酚化合物 最佳值0.4g/L尿素 最佳值5g/LPH指示劑 使用酚紅時為0.005-0.02g/L，最佳值0.012g/L，使用溴麝香草酚蘭時為0.0008-0.0002，最佳值0.0006g/L，無水乙醇 20mlH+濃度調(diào)節(jié)劑 0.2g/L
全文摘要
新生隱球菌的鑒定方法及其所用的培養(yǎng)基，可以在一種培養(yǎng)基上同時檢測新生隱球菌的兩種生物特性，即在培養(yǎng)基中同時設(shè)置兩組檢測底物；檢測尿素酶的底物為尿素與pH值指示劑，可在尿素酶存在時使培養(yǎng)基變色；檢測酚氧化酶活性的底物為雙酚或單酚化合物，可在酶氧化酶存在時使菌株變?yōu)樽厣Ｍ瑫r調(diào)節(jié)pH值、培養(yǎng)溫度與底物濃度，使兩種檢測反應(yīng)同步進(jìn)行，同時顯示結(jié)果，可簡便，快捷，準(zhǔn)確，經(jīng)濟地鑒定該菌種，并同時鑒定出菌株的尿素酶活性。
文檔編號C12Q1/04GK1092468SQ94111230
公開日1994年9月21日 申請日期1994年1月25日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月25日
發(fā)明者李安生, 吳紹熙 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所