專(zhuān)利名稱(chēng)：重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用基因工程技術(shù)制備重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)。特別闡明了表達(dá)含凝血酶識(shí)別多肽的rhGM-CSF融合蛋白?？朔薶GM-CSF天然基因不利表達(dá)的缺點(diǎn)，使該蛋白工業(yè)化生產(chǎn)成為可能的方法。
基因表達(dá)技術(shù)一般是將克隆的外源基因置于表達(dá)載體中，導(dǎo)入適當(dāng)宿主。通過(guò)培養(yǎng)、(誘導(dǎo))、表達(dá)得到目的產(chǎn)物的過(guò)程，目的基因一般通過(guò)早期的Okayama/Berg法等克隆cDNA或通過(guò)近期的PCR技術(shù)直接克隆成熟蛋白編碼區(qū)。表達(dá)載體可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與翻譯，直接控制外源基因編碼蛋白在宿主中的合成。
該技術(shù)近年來(lái)發(fā)展很快，目前已可在原核及真核系統(tǒng)中表達(dá)多種蛋白。真核表達(dá)系統(tǒng)中哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白最接近天然蛋白。但一般表達(dá)量不理想。目前僅有為數(shù)極少的蛋白如HBsAg可用于工業(yè)化生產(chǎn)。昆蟲(chóng)及酵母表達(dá)系統(tǒng)由于其合成蛋白糖基化修飾差異太大，用于人體易引起不良反應(yīng)。原核系統(tǒng)如大腸桿菌不具有糖基化修飾功能，因而不適宜于表達(dá)糖基化對(duì)其生物學(xué)活性重要的蛋白，但相當(dāng)數(shù)量的多肽如一些細(xì)胞因子，其生物活性與糖基化修飾關(guān)聯(lián)不大，尤其是hGM-CSF.其非糖基化蛋白的生物學(xué)活性是糖基化形式的5-6倍(Kaushansky.K.，生物化學(xué)，264861-4867)。
hGM CSF是一種多功能細(xì)胞因子，主要調(diào)節(jié)機(jī)體的造血功能，促進(jìn)髓系組細(xì)胞的增殖分化。在造血功能障礙的治療上具有廣泛的用途。自從Wong等首次報(bào)道hGM-CSF cDNA以來(lái)，相繼有多家報(bào)道了不同人體細(xì)胞來(lái)源的cDNA克隆(Wong，G.G.等人，科學(xué)，228810-815和Cantrell.M.A.等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào).826250-6256)。使hGM-CSF cDNA資料日趨完整;但采用的方法，均耗時(shí)、費(fèi)力、難于推廣，對(duì)克隆的cDNA改造極其復(fù)雜。采用COS細(xì)胞僅實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)表達(dá)，采用CHO、酵母和昆蟲(chóng)等一定程度可穩(wěn)定表達(dá)hGM CSF(Okamoto.M.等人.生物/工程.8550 553，Ernst.J.F.等人.生物/工程.5831 834和Chiou.C.J.等人.歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快訊，259249-253)。Libby等利用分泌性載體于大腸桿菌表達(dá)hGM-CSF.最后僅可得到每升幾個(gè)毫克的產(chǎn)量(Libby.R.T.等人。脫氧核糖核酸.6221-229)Greenberg等采用類(lèi)似方式表達(dá)，結(jié)果蛋白主要結(jié)合于細(xì)胞膜上，難于獲得活性蛋白(Greenberg.K.等人.當(dāng)代微生物學(xué).17321-332)。Burgess等利用蛋白酶缺陷菌株提高h(yuǎn)GM-CSF的表達(dá)量至8-10%;張智清等改變hGM-CSF基因5′末端部分密碼中的CG為AT而保留編碼氨基酸不變，將表達(dá)量提高到20%(張智清等人，病毒學(xué)報(bào).9136-143);但兩者表達(dá)的蛋白其N(xiāo)端均多一個(gè)Met(甲酰甲硫氨酸)。
本發(fā)明提供了一種經(jīng)原核系統(tǒng)高效表達(dá)，純化后N端不帶任何多余氨基酸的rhGM-CSF活性多肽，由127個(gè)氨基酸組成，不含糖基化修飾。
本發(fā)明提供了一種表達(dá)含凝血酶識(shí)別多肽的rhGM-CSF融合蛋白，經(jīng)凝血酶消化，釋放出天然型hGM-CSF活性多肽的步驟。
1.采用PCR方法改建hGM-CSF cDNA。
2.制備表達(dá)含凝血酶識(shí)別多肽的rhGM-CSF融合蛋白的載體。
3.載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
4.培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主，誘導(dǎo)表達(dá)rhGM-CSF融合蛋白5.凝血酶消化融合蛋白，釋放出天然型rhGM-CSF活性蛋白。


圖1A表達(dá)rhGM-CSF融合蛋白的載體。hGM-CSF cDNA上游可以是任何一種細(xì)菌蛋白基因如β-gal、CAT、MS2 RNA多聚酶、GST、ZZ等。每一種細(xì)菌蛋白基因經(jīng)適當(dāng)改造后.再在二者之間嵌入凝血酶接頭.表達(dá)產(chǎn)物可用凝血酶切開(kāi).釋放出天然型rhGM-CSF活性多肽。
圖1B顯示凝血酶識(shí)別多肽與hGM-CSF N端部分序列及切割點(diǎn)(箭頭所示)要得到原核系統(tǒng)高效表達(dá)的克隆及具有hGM-CSF生物活性的多肽，應(yīng)從如下幾個(gè)方面著手。
1.表達(dá)載體應(yīng)具有強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，如PR、PL、PRPL、T7等。有效的轉(zhuǎn)錄終止子如rrnB.Tfd、T7等.有效的調(diào)控機(jī)制如cIts857、Lac I等。
2.改建cDNA.如將5′端部分密碼中的CG改為AT，保持編碼氨基酸不變，使其mRNA結(jié)構(gòu)利于翻譯.變cDNA的終止密碼為更為有效的原核系統(tǒng)終止密碼TAA等。
3.表達(dá)融合蛋白.一般來(lái)說(shuō).任何一種蛋白在原核系統(tǒng)達(dá)到高效表達(dá)之后.含相應(yīng)基因的表達(dá)載體均可用作表達(dá)融合蛋白的載體.在其基因之后連入目的基因即可表達(dá)融合蛋白但由于插入DNA的特殊要求，如上游蛋白基因不宜含常用內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn).或不含有可利用的位點(diǎn)等限制了上游蛋白的種類(lèi)。另外，最好在上游蛋白基因的3′端含有多克隆位點(diǎn).便于插入目的基因.目前可用于表達(dá)融合蛋白的載體有PEX、PMS32b、PL-CAT-3、PR1T2T等。其細(xì)菌蛋白基因下游均含有多克隆位點(diǎn)或其中含有可用于克隆的位點(diǎn)，如PLCAT-3系采用如下方式構(gòu)建而成將PBR325用內(nèi)切酶Sau3A消化，獲得1.0kb片段.其中含有完整的CAT基因編碼區(qū).將其連入PKPL-2D的BglⅡ切點(diǎn).篩選得到克隆PL-CAT-3，該質(zhì)粒含有EcoRⅠ、XbaⅠ、HindⅢ，可用于基因克隆。其它有關(guān)載體的改建將在實(shí)施中說(shuō)明。
4.目的蛋白以融合蛋白方式表達(dá)，除利于表達(dá)翻譯外，由于其中帶部分細(xì)菌蛋白，對(duì)細(xì)菌蛋白酶的降解作用具有更高的耐受力，但表達(dá)為融合蛋白后，由于空間構(gòu)象的變化，其生物活性往往部分或完全被掩蓋。要得到活性蛋白.一般需在細(xì)菌蛋白與目的蛋白之間設(shè)立化學(xué)物質(zhì)或酶的切割點(diǎn);不同蛋白要求設(shè)立特定位點(diǎn).才能使N-末端不添加或減少氨基酸.以保證切割的準(zhǔn)確性和切割的有效性。設(shè)立識(shí)別位點(diǎn)還應(yīng)考慮用于切割的物質(zhì)來(lái)源及識(shí)別特異性。
5.為防止細(xì)菌蛋白酶的降解作用，宜采用蛋白酶缺陷菌株。
根據(jù)本發(fā)明PCR法改進(jìn)后的rhGM-CSF cDNA適宜于原核表達(dá)。翻譯終止更為有效.相對(duì)提高mRNA的穩(wěn)定性，最終提高了表達(dá)量.表達(dá)的融合蛋白因其中部分為細(xì)菌蛋白.對(duì)細(xì)菌蛋白酶的耐受力增強(qiáng).易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
表達(dá)的融合蛋白經(jīng)凝血酶消化釋放出天然型rhGM-CSF活性多肽.N-末端不帶任何多余氨基酸(包括原核表達(dá)常帶的甲酰甲硫氨酸).除不含糖基化修飾外.與人體內(nèi)的hGM-CSF成熟蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)完全相同.具有天然hGM-CSF的全部生物學(xué)活性，可用于有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究和人體疾病治療。
綜上所述.本發(fā)明組建了表達(dá)含凝血酶識(shí)別多肽的rhGM-CSF融合蛋白的載體.轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主.如為PR、PL啟動(dòng)子可導(dǎo)入含clts857的大腸桿菌如POP2136、N4380-1;如載體上帶clts857基因則可導(dǎo)入任何一種大腸桿菌內(nèi)？如為T(mén)7啟動(dòng)子.則導(dǎo)入含可控制T7RNA多聚酶合成的宿主如JM109(DE3)。適當(dāng)溫度發(fā)酵.如PR、PL類(lèi)載體則30℃增菌.42℃誘導(dǎo)表達(dá);T7類(lèi)載體則37℃增菌.IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)后.收集菌體.超聲裂解，離心沉淀包涵體.變性、復(fù)性即得到可溶性融合蛋白.加入凝血酶消化后.天然型rhGM-CSF即釋放出來(lái)。采用常規(guī)層析(凝膠過(guò)濾、離子交換、疏水層析、反相層析)及制備電泳等均可獲得純品.尤其層析純化后樣品可用于各種實(shí)驗(yàn)研究和作為藥物.單用或合用具有如下疾病治療作用1.減少癌癥化療、放療后的骨髓毒性;2.增強(qiáng)骨髓移植后的再生能力;3.增加再障病人的白細(xì)胞數(shù)量;4.增強(qiáng)輻射抵抗力;5.治療MDS;6.增強(qiáng)AIDS患者、年老體弱者、大面積燒傷和重癥感染病人等的免疫功能，促進(jìn)燒傷和創(chuàng)傷愈合等。
下面通過(guò)實(shí)例，提供實(shí)驗(yàn)資料和信息.但也不限此而已實(shí)施例1.cDNA改建按公布的人GM-CSF cDNA(Wong.G.G.等人，科學(xué)，228810-815)序列設(shè)計(jì)引物，其中5′引物ATCCATGGCACCCGCCCGCTCGCCGA3′引物AAGCTTACTCCTGGACTGGCTCCCA以PKPL 2D GM CSF質(zhì)粒DNA(孫英等人.中國(guó)免疫學(xué)雜志，6247-250)為模板.擴(kuò)增30輪.使其cNDA5′帶Nco Ⅰ切點(diǎn)和起始密碼.3′帶HindⅢ切點(diǎn)和終止密碼TAA.后者取代野生型TGA.為大腸桿菌的高效密碼子.改建后的cDNA便于克隆化和直接表達(dá)天然型蛋白.其序列經(jīng)Sanger法分析表明與Cantrell(Cantrell.M.A.等人.美國(guó)科學(xué)院院報(bào).826250-6256)報(bào)道完全一致。
2.凝血酶接頭的合成根據(jù)纖維蛋白原中凝血酶識(shí)別多肽序列設(shè)計(jì)如下DNA序列及相應(yīng)編碼氨基酸.5′帶Cla Ⅰ粘性末端.便于嵌入有關(guān)載體.3′為平末端。
C GGC GTA CGT GGT CCG CGCCG CAT GCA CCA GGC GCGGly Val Arg Gly Pro Arg3.rhGM-CSF融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建(詳見(jiàn)圖2)1)將純化的hGM-CSF cDNA PCR產(chǎn)物與 (Nco Ⅰ、Hind Ⅲ)按一定比例重組連接.篩選含hGM-CSF cDNA的質(zhì)粒即 .將該質(zhì)粒(Sal Ⅰ、Hind Ⅲ)與 (Xho Ⅰ、HindⅢ)重組連接、篩選PMS hGM CSF;Nco Ⅰ切開(kāi)該質(zhì)粒，核酸酶S1去突出末端.再用Cla Ⅰ消化，與純化的凝血酶接頭連接.篩選含凝血酶接頭的質(zhì)粒即PMT-hGM-CSF-1。
2)將PMT-hGM-CSF-1經(jīng)EcoRⅠ消化，短時(shí)微量BaⅠ 31核酸酶處理，再連入12mer EcoRⅠ接頭構(gòu)建成PMT-hGM-CSF-2。
3)將PMT-hGM-CSF-1與PEx-2(EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ)重組為PEX-hGM-CSF-1，再用Pvu Ⅱ消化，去除兩個(gè)Pvu Ⅱ切點(diǎn)之間的片段即為PEX-hGM-CSF-2，再用Pvu Ⅱ酶切，加12mer EcoR Ⅰ接頭.EcoRⅠ消化.連接即構(gòu)建成PEX-hGM-CSF-3。
4)將質(zhì)粒PMT-hGM-CSF-1與PL-CAT-3(EcoR Ⅰ、HindⅢ)重組構(gòu)建PCAT′-hGM-CSF。
4.rhGM-CSF融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將上述四種表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌POP2136。取其克隆于30℃擴(kuò)增，42℃誘導(dǎo)表達(dá)4-6小時(shí).離心收集菌體，SDS-PAGE分析表明PMT hGM-CSF-1、和PMT-hGM-CSF-2表達(dá)蛋白分子量均約為26KD、其中15kD部分為hGM-CSF.11kD分別為細(xì)菌蛋白MS2 RNA多聚酶N端部分及改建產(chǎn)物;表達(dá)量約占可溶性細(xì)菌蛋白的30%以上。PEX-hGM-CSF-3表達(dá)蛋白分子量為25kD，其中15kD部分同前.10kD部分為Cro及β-gal部分蛋白.表達(dá)率為27%。PCAT′hGM CSF含兩套SD及ATG.有兩種表達(dá)帶.分子量各為26、22kD.其中11和7kD部分均為CAT部分蛋白.表達(dá)率在30%以上.所有表達(dá)蛋白經(jīng)裂菌分析.主要以不溶性包涵體存在，需經(jīng)變性復(fù)性方可得到可溶性蛋白。
5.rhGM-CSF融合蛋白的凝血酶消化將一定量的包涵體經(jīng)8mol/L尿素、5mmol/L DTT變性溶解后，用0.05mol/LpH8-9硼酸緩沖液透析4-6小時(shí)，加入凝血酶，25-30℃作用6～10小時(shí).各種融合蛋白經(jīng)凝血酶消化后均釋放出實(shí)施4預(yù)計(jì)的二種蛋白.其中15KD為hGM-CSF.余下均為細(xì)菌蛋白。其中PMT hGM CSF 1和PCAT′hGM CSF表達(dá)的融合蛋白凝血酶加量即使達(dá)1單位/mg蛋白.仍難達(dá)到80%消化;而另二種尤其PEX hGM CSF 3的表達(dá)蛋白很易被消化.僅0.01單位/mg蛋白即完全切開(kāi).同時(shí)經(jīng)電泳證實(shí)其上游細(xì)菌蛋白內(nèi)部也含有潛在凝血酶識(shí)別多肽.采用1單位/mg蛋白凝血酶消化時(shí).電泳圖譜顯示不再有10KD的小片段;而hGM-CSF即使5單位/mg蛋白酶消化時(shí)也未顯示潛在切點(diǎn)。本發(fā)明說(shuō)明.凝血酶識(shí)別多肽上游的蛋白構(gòu)象包括一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其作用的有效性具有很大的影響。
6.rhGM生物學(xué)活性鑒定一般利用hGM-CSF依賴(lài)細(xì)胞株鑒定其生物活性，目前國(guó)際上可利用的細(xì)胞株有AML-193、MO7E、TF-1等.但最受推薦的僅有TF-1細(xì)胞株。本發(fā)明制備的rhGM-CSF采用如下方式鑒定活性將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TF-1細(xì)胞配成5×104/ml.96孔板中每孔100μl細(xì)胞，加入一定比例稀釋的待測(cè)rhGM-CSF.37℃培養(yǎng)44小時(shí).同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，用MTT法測(cè)細(xì)胞增殖活性。測(cè)定結(jié)果表明本發(fā)明制備的rhGM-CSF有明顯的刺激TF-1細(xì)胞增殖的效應(yīng).其活性單位可達(dá)107iu/mg.見(jiàn)圖3。另外本發(fā)明制備的rhGM-CSF應(yīng)用于恒河猴體內(nèi)試驗(yàn)表明對(duì)其造血祖細(xì)胞具有明顯的增殖分化作用.而且增殖具有劑量依賴(lài)關(guān)系.主要促進(jìn)中性粒細(xì)胞.嗜酸性粒細(xì)胞的分化.在體內(nèi)可明顯促進(jìn)外周血細(xì)胞增高，且主要促進(jìn)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的增高.未見(jiàn)嚴(yán)重毒付作用。
總之本發(fā)明為制備rhGM-CSF提供了一種新方法.而且制備的蛋白其N(xiāo)-末端不帶任何多余氨基酸具有分泌性載體(原核和真核)表達(dá)蛋白的優(yōu)點(diǎn).但它具有產(chǎn)量大.易于工業(yè)化生產(chǎn)的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。目前我們每升可得到60mg以上純品。另外本發(fā)明提供的四種rhGM-CSF融合蛋白為研究凝血酶識(shí)別構(gòu)象提供了一個(gè)研究對(duì)象.詳細(xì)研究四種融合蛋白的立體構(gòu)象將有助于進(jìn)一步闡明凝血酶的作用機(jī)理和條件.為其它外源蛋白采用類(lèi)似表達(dá)途經(jīng)制備重組分子提供了有益的借鑒經(jīng)驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.制備rhGM-CSF融合蛋白表達(dá)載體的方法該方法是在改進(jìn)多種表達(dá)融合蛋白載體的基礎(chǔ)上，克隆入hGM-CSF cDNA，其特征在于細(xì)菌蛋白基因與hGM-CSF cDNA之間嵌入凝血酶接頭。
2.制備rhGM-CSF融合蛋白的方法該方法是在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利1要求載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞。其特征在于細(xì)菌蛋白與hGM-CSF之間含凝血酶識(shí)別多肽。
3.制備N(xiāo)-末端不帶任何多余氨基酸的rhGM-CSF活性多肽該方法是通過(guò)凝血酶消化權(quán)利1載體表達(dá)的融合蛋白，其特征在于釋放出的15kD蛋白部分具有hGM-CSF全部生物學(xué)活性。
全文摘要
采用PCR方法改建人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的cDNA，3′換用TAA終止密碼，將其克隆入多種不同表達(dá)融合蛋白的載體中，并在cDNA與上游細(xì)菌蛋白基因之間嵌入凝血酶接頭，導(dǎo)入適當(dāng)宿主后均獲得高效表達(dá)，表達(dá)融合蛋白經(jīng)凝血酶消化后釋放出N-末端與天然成熟蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)(糖基化除外)完全相同的rhGM-CSF，經(jīng)層析純化可得到適宜人體應(yīng)用的活性蛋白。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1108303SQ9411166
公開(kāi)日1995年9月13日 申請(qǐng)日期1994年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月7日
發(fā)明者張學(xué)述, 馬大龍 申請(qǐng)人:衛(wèi)生部成都生物制品研究所, 北京醫(yī)科大學(xué)