專利名稱：：高效低毒人腫瘤壞死因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種突變的人腫瘤壞死因子(HumanTumorNecrosisFactor－α，簡稱hTNF－α)。它是用蛋白質(zhì)工程和重組DNA的方法將hTNF－α的第二位精氨酸(Arg)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)而獲得的，命名為[Lys2]hTNF－α。在大腸桿菌中表達的[Lys2]hTNF－α具有高比活、低毒性的特點，對某些人腫瘤細胞表現(xiàn)出高效的特異抑制活性，這一新型的重組人腫瘤壞死因子對某些腫瘤病人有實際的治療效果。人腫瘤壞死因子(hTNF－α)的最顯著特征是能夠選擇性地殺傷或抑制腫瘤細胞，尤其是和干擾素等聯(lián)合使用時能發(fā)揮出很好的效果。這一特性是其他細胞因子無可比擬的。然而，hTNF－α的臨床試驗結(jié)果不盡人意，主要是毒副作用太大，一般認(rèn)為hTNF－α對腫瘤病人的有效劑量是病人最大耐受劑量的5－25倍。為了減輕hTNF－α對腫瘤病人的毒副作用，更好地發(fā)揮hTNF－α治療癌癥病人的作用，通常的作法是用蛋白質(zhì)工程的方法改造hTNF－α，以期獲得高效、低毒的hTNF－α突變體。hTNF－α的N末端1－7個氨基酸是自由的或無構(gòu)象的。已有的報道對hTNF－α的N－末端改造，主要是在N－末端缺失或延長方面，例如，在N－末端缺失1－7個氨基酸或延長4個氨基酸等(例如中國專利審定號CN1016967B)。本發(fā)明則是在N－端第二位氨基酸處進行突變而得到的新型的hTNF－α突變體。實現(xiàn)這一突變的基本過程是通過DNA合成儀合成一個突變引物，該引物將編碼hTNF－αN－末端第二位精氨酸密碼子CGT突變?yōu)榫幋a賴氨酸的密碼子AAA，用聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction，簡稱PCR)改造了hTNF－α基因，將突變后的基因插入表達載體pKKH中，使該基因直接置于Ptoc啟動子控制之下，轉(zhuǎn)化大腸桿菌71/18，轉(zhuǎn)化菌在37℃培養(yǎng)16－20小時，使[Lys2]hTNF－α基因在大腸桿菌中獲得高效表達，[Lys2]hTNF－α的表達量占細菌總蛋白量的40％。菌體經(jīng)離心后，用超聲波破碎細胞，離心后上清用硫酸銨鹽析，沉淀物透析后先過陰離子柱，再過陽離子柱，最后過一次分子篩，即可得高純度的[Lys2]hTNF－α。在以下實施例中對發(fā)明作進一步的詳細描述圖1是[Lys2]hTNF－α表達載體的構(gòu)建示意圖。圖2是[Lys2]hTNF－α的DNA序列和氨基酸序列圖。圖3是[Lys2]hTNF－α在大腸桿菌中表達后的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。其中1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量對照；2.陰性對照(E·coli71/18)；3－8.分別為37℃培養(yǎng)10、12、14、16、18、20小時。圖4是[Lys2]hTNF－α的純化電泳圖譜。其中1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量對照；2.菌體裂解后直接走電泳；3.硫酸銨鹽析后；4.陰離子柱(DEAE)純化后；5.陰離子柱(CM)純化后；6.分子篩(S－200純化后。實施例1，[Lys2]hTNF－α表達載體的構(gòu)建。參見圖1、圖2，在DNA合成儀上，選擇大腸桿菌偏愛的密碼子及適當(dāng)提高hTNF－α基因(該基因由南京大學(xué)朱德熙教授惠贈)5’端突變引物中的嘌呤比例，設(shè)計并合成了hTNF－α基因的5’端突變引物(5’－AGCCATGGTAAAATCTAGCTCTCGCACTCCATCTGACAAACCA－3’)，另一端為噬菌體M13通用引物，模板為含hTNF－α基因的pUC19質(zhì)粒，用聚合酶鏈反應(yīng)(反應(yīng)條件變性，94℃60秒；復(fù)性，52℃60秒；延伸，72℃90秒)改造hTNF－α基因，PCR產(chǎn)物用1％低熔點膠回收后，用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI酶切，克隆進用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切的表達載體pKKH中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌71/18。轉(zhuǎn)化子(E·coli71/18/pKKH-TK，存放標(biāo)記為CCTCCNOM94037中國·武漢·武漢大學(xué)校內(nèi)·中國典型培養(yǎng)物保藏中心)用堿裂解法抽取質(zhì)粒，用NcoI和BamHI酶切質(zhì)粒后，走6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，能切出500bp大小片段的質(zhì)粒進一步用Sanger雙脫氧末端終止法測定基因序列。實施例2，[Lys2]hTNF－α在大腸桿菌中的表達、純化和鑒定。參見圖3、圖4，將含目的基因(即突變后的基因)的轉(zhuǎn)化子在37℃培養(yǎng)過夜，取一小部分細胞培養(yǎng)液離心后，菌體加樣品緩沖液，走15％SDS－PAGE鑒定[Lys2]hTNF－α的表達量，另一部分細菌離心5分鐘(5000轉(zhuǎn)/分)收集菌體，按5－10g濕菌加100mlPBS緩沖液(pH7.4)超聲破碎細胞后，離心10分鐘(15000轉(zhuǎn)/分)取上清，加固體硫酸銨至40％飽和度，冰浴靜置2－4小時，離心10分鐘(15000轉(zhuǎn)/分)去除沉淀雜蛋白，上清繼續(xù)加固體硫酸銨至65％飽和度，4℃靜置過夜，離心10分鐘(15000轉(zhuǎn)/分)，收集硫酸銨40－60％飽和度沉淀組分，對20mMTris-HCl(pH8.0)透析除鹽，中途更換透析液2－3次，上DEAE-SepharoseFastFlow陰離子柱，用含20mMNaCl的20mMTri-HCl(pH8.0)充分平衡柱后，以NaCl鹽梯度(0.02－0.35M)線性梯度洗脫，收集[Lys2]hTNF－α洗脫峰，加固體硫酸銨置665％飽和度，冰浴靜止4小時后，離心10分鐘(15000轉(zhuǎn)/分)，收集沉淀對磷酸緩沖液(pH5.9)透析除鹽，上CM-SepharoseFastFlowy陽離子柱，用磷酸緩沖液充分平衡柱后，用NaCl鹽梯度(0－0.4M)線性梯度洗脫，收集[Lys2]hTNF－α洗脫峰，走分子篩SephacrylS－200HR柱，用PB(pH7.4)洗脫，即可得純度大于95％的[Lys2]hTNF－α。實施例3，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α的活性測定。96孔細胞培養(yǎng)板每孔接2×104個L929細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加不同稀釋度的[Lys2]hTNF－α或hTNF－α及放線菌素D(終濃度為1ug/ml)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)16個小時，結(jié)晶紫染色，570nm處讀光密度值，以殺傷50％L929細胞時的稀釋度為一個活性單位，測得[Lys2]hTNF－α的比活為6.9(±0.5)×107單位/毫克蛋白，hTNF－α的比活為1.5(±0.5)×107單位/毫克蛋白，[Lys2]hTNF－α比hTNF－α的比活高4倍還多。實施例4，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α對人體腫瘤細胞株的抑制作用。腫瘤細胞株為M7906人體結(jié)腸癌細胞株，MGC人體胃癌細胞株，LAX人體的肺腺癌細胞株，OS人體骨肉瘤細胞株，SPC人體小細胞肺癌細胞株。取靶細胞以1×104細胞/孔的濃度加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，再加入不同濃度的[Lys2]hTNF－α或hTNF－α，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時后，加入H3－TdR0.5微居里/孔，用多頭細胞器收集細胞，液閃儀上測定CPM值，計算腫瘤細胞抑制率(表1)表1－A不同濃度的[Lys2]hTNF－α對人體腫瘤細胞的抑制作用表1－B不同濃度的hTNF－α對人體腫瘤細胞的抑制作用表1及以后出現(xiàn)的表格中，rTNF－α即[Lys2]hTNF－α，對照組則用生理鹽水。從表1中可見，[Lys2]hTNF－α對MGC，LAX細胞隨著藥物濃度的變化而有不同程度的抑制作用，在0.05－0.5ug/ml濃度下已表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而在相應(yīng)條件下無明顯的抑制作用，另外還可看出[Lys2]hTNF－α的抗癌譜發(fā)生了變化。實施例5，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α對小鼠腫瘤細胞株的抑制作用。靶細胞為小鼠白血病L1210細胞，小鼠白血病P388細胞，小鼠黑色素瘤B16，小鼠Ehchich(Ec)腹水癌細胞，小鼠YAC－1細胞，方法完全同人體腫瘤細胞株(見表2)。從表2可見，[Lys2]hTNF－α對小鼠腫瘤細胞L1210，P388，B16，Ec，YAC－1的增殖均有不同程度的抑制作用，其中以B16，YAC－1，Ec較為明顯。hTNF－α雖然對這些腫瘤細胞也有一定的抑制作用，但不及[Lys2]hTNF－α強。表2－A不同濃度的[Lys2]hTNF－α對小鼠腫瘤細胞的抑制作用表2－B不同濃度的hTNF－α對小鼠腫瘤細胞的抑制作用</tables>實施例6，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α對小鼠移殖性腫瘤Ec白血病的抑瘤效果。取生長旺盛的小鼠Ec腹水癌，用生理鹽水1∶3稀釋后給每只DBA/2小鼠腹腔接種0.2ml/鼠，隨機分為給藥組及對照組，次日起每日腹腔給藥1次，共5次，觀察并記錄動物死亡時間，計算小鼠生命延長率，并與對照組進行比較(表3)。實驗證明，[Lys2]hTNF－α0.25－2ug/鼠對小鼠移殖性腫瘤Ec腹水癌有一定的療效，并隨著劑量的增加抑制作用明顯，而hTNF－α則效果較差。表3不同劑量的[Lys2]hTNF－α與hTNF－α對小鼠Ec白血病腫瘤細胞的抑制作用比較表權(quán)利要求1.一種突變的人腫瘤壞死因子(簡稱[Lys2]hTNF－α)，由157個氨基酸殘基組成，其特征在于將天然人腫瘤壞死因子(hTNF－α)N端第二位的精氨酸(Arg)突變成賴氨酸(Lys)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的[Lys2]hTNF－α，其特征在于將編碼hTNF－α的N－末端第二位精氨酸的密碼子CGT突變?yōu)榫幋a賴氨酸的密碼子AAA。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的[Lys2]hTNF－α，其特征在于設(shè)計并合成了hTNF－α基因的5’端突變引物5’－AGCCATGGTAAAATCTAGCTCTCGCACTCCATCTGACAAACCA－3’。4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的[Lys2]hTNF－α，其特征在于將改造后的hTNF－α基因克隆進表達載體pKKH中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌71/18，獲轉(zhuǎn)化子E·coli71/18/pKKH-TK，存放標(biāo)記為CCTCCNOM94037(中國·武漢·武漢大學(xué)校內(nèi)·中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的[Lys2]hTNF－α，其特征在于將陰、陽離子交換同時組合進[Lys2]hTNF－α的純化過程中，構(gòu)成透析→上陰離子柱→上陽離子柱→過分子篩的純化過程。全文摘要本發(fā)明為一種新型高比活，高藥效，低毒性的人腫瘤壞死因子[Lys文檔編號C12P21/00GK1121927SQ9411229公開日1996年5月8日申請日期1994年9月1日優(yōu)先權(quán)日1994年9月1日發(fā)明者陳常慶,高長壽申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心