專利名稱：一種固定化活細(xì)胞或酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化活細(xì)胞或酶的制備方法，特別是采用聚乙烯醇作載體的固定化方法。
固定化活細(xì)胞技術(shù)是近幾年來(lái)繼固相酶技術(shù)后迅速發(fā)展起來(lái)的生物工程新技術(shù)，該技術(shù)采用包埋法將肉眼看不清的微生物活細(xì)胞固定在載體上，形成直觀的固定化活細(xì)胞實(shí)體，活細(xì)胞仍能增殖，新陳代謝，其酶系完整，可迅速完成一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，得到有用產(chǎn)物。
在固定化方法中，載體可以是天然或合成高分子材料，例如，褐藻膠，K-卡拉膠，聚丙烯酰胺等，其中，褐藻膠，K-卡拉膠存在強(qiáng)度差、使用壽命短等缺點(diǎn)(只有1000多個(gè)小時(shí))，而聚丙烯酰胺由于其單體分子及聚合促進(jìn)劑等皆具毒性，不利于微生物活細(xì)胞的生長(zhǎng)，在高分子材料中，采用聚乙烯醇(PVA)材料不具毒性甚至對(duì)人體亦公認(rèn)無(wú)害、價(jià)格低，較適合于包埋微生物活細(xì)胞，已有以PVA為載體的固定化方法，尚存在一些缺點(diǎn)，例如將微生物或酶與PVA溶液混合后，置于飽和硼酸溶液中短時(shí)間內(nèi)使其形成球體，隨之將球體與磷酸鹽溶液接觸，使其完全硬化，制成微生物或酶固定化產(chǎn)物，這種方法存在步驟多，無(wú)機(jī)鹽濃度高，對(duì)微生物生長(zhǎng)不利等缺點(diǎn);有些采用PVA載體的固定化方法中，需要有真空干燥脫水步驟，工藝復(fù)雜，費(fèi)時(shí);有的需用模具成形，或加油類作為成形劑，其效果均不太理想。
本發(fā)明的目的是提供一種固定化活細(xì)胞或酶的制備方法，該方法簡(jiǎn)便，不需在模具中成形，機(jī)械強(qiáng)度高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，并能長(zhǎng)期反復(fù)使用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案制備方法中采用PVA為載體，首先將聚乙烯醇溶液與活細(xì)胞懸浮液混合，以無(wú)菌淀粉為隔離成形劑，經(jīng)冷凍定型、解凍、漂洗后絞碎加工成顆粒狀產(chǎn)物。
在固定化活細(xì)胞混合液中，聚乙烯醇濃度控制在10-20%(W/W)，活細(xì)胞懸浮液濃度在2-15%(W/W)，其余為水;無(wú)菌淀粉與混合液的重量比為0.5-2∶1;冷凍溫度在-10--30℃，時(shí)間48小時(shí)-12小時(shí)，解凍溫度一般控制在5-40℃，最好是10-25℃的室內(nèi)，自然空氣中解凍5-48小時(shí)。聚乙烯醇的聚合度在400-1900之間，最好控制在1750±75，PVA聚合度過(guò)高，流動(dòng)性差，操作不便，過(guò)低不易成型，聚乙烯醇濃度最好為15±0.5%(W/W)。
無(wú)菌淀粉制備普通淀粉100℃，干熱滅菌1小時(shí)，或常壓干蒸15分鐘(上汽計(jì)時(shí))，務(wù)使其中心溫度達(dá)100℃，然后冷卻至20-30℃，即為無(wú)菌淀粉。
制得固定化微生物活細(xì)胞可直接用于生產(chǎn)，邊增殖邊發(fā)酵，也可先在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)增殖一段時(shí)間后再用于生產(chǎn)。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1制備固定化啤酒酵母活細(xì)胞6Kg，各組分配比啤酒酵母懸浮液(活細(xì)胞數(shù)106-109個(gè)/ml)0.6Kg，聚乙烯醇0.9kg，水4.5kg，淀粉5kg，其操作步驟是將PVA放入水中，攪勻，用沸水浴或蒸汽浴加熱溶解，溫度在80-120℃，溶解后冷卻至室溫，加無(wú)菌水補(bǔ)足溶解時(shí)損失的水量，隨后加入啤酒酵母懸浮液，混合均勻，將上述粘液進(jìn)行成形處理，即以一直徑為5-25mm的噴嘴，以均勻速度注入予置滅菌淀粉的容器中，形成線條層狀，條間、層間以無(wú)菌淀粉隔離成型，再經(jīng)冷凍處理定型，溫度為-30℃，時(shí)間12小時(shí)，將冷凍產(chǎn)物進(jìn)行自然解凍，溫度為20℃，時(shí)間36小時(shí)，(全部軟化為止)，除去大部分淀粉后，漂洗2-5次，至水清亮為止。產(chǎn)物以Φ8mm的無(wú)菌絞肉機(jī)絞碎處理，得到直徑為2-5mm的顆粒狀產(chǎn)物。
上述所使用的淀粉可回收重復(fù)使用。將制得的固定化酵母活細(xì)胞取出4.3kg，放入容積12.5升的酒化生物反應(yīng)器中，從下部泵入16%(折光計(jì))糖化液，上部流出8%(折光計(jì))的酒化液，流速0.1L/h，溫度10-30℃，酒化液乙醇7.3%(V/V)，總酸0.15%(W/V，以HAC計(jì))還原糖1.1%(W/V，以葡萄糖計(jì))。
連續(xù)發(fā)酵4800小時(shí)，載體強(qiáng)度無(wú)任何降低。可使用1年甚至數(shù)年。
實(shí)施例2制備固定化醋酸菌活細(xì)胞6kg，其各組分的配比，聚乙烯醇0.9kg、水4.5kg、淀粉5kg、醋酸菌體懸浮液(活細(xì)胞數(shù)108個(gè)/ml)0.6kg，其操作步驟同實(shí)施例1。
將制得的固定化醋酸菌活細(xì)胞載體取出4.8kg，放入容積為12.5升的醋化生物反應(yīng)器中，下部通入無(wú)菌空氣，上部流入酒化液，溫度30℃轉(zhuǎn)化率80-100%，日產(chǎn)0.8升食醋，總酸4.0-4.4%(W/V，以HAC計(jì))，進(jìn)行半連續(xù)發(fā)酵4800小時(shí)，載體除有小于1/4的磨損外，強(qiáng)度沒(méi)有降低，將可繼續(xù)使用1年-數(shù)年。所生產(chǎn)的食醋達(dá)到ZB×66004-86，GB2719-81標(biāo)準(zhǔn)要求。
實(shí)施例3固定化魯氏酵母、球擬酵母、乳鏈球菌活細(xì)胞各5kg的制備。
各組分配比同實(shí)施例1、2。
其操作步驟同實(shí)施例1將分別制得的固定化魯氏酵母菌、球擬酵母菌，乳鏈球菌活細(xì)胞各5kg，對(duì)以低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝(前酵)生產(chǎn)的醬油浸淋液為底液，于20℃溫度下，進(jìn)行半連續(xù)或者批次后酵增香，多次反復(fù)使用4800小時(shí)，載體完好如初，可使用1-數(shù)年，所生產(chǎn)的醬油符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)ZB×66013-87，GB2717-81，質(zhì)量風(fēng)味明顯提高，總酯及乙醇含量提高1.5-9倍，批次后酵周期3-15天。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)制作簡(jiǎn)單，造價(jià)低，強(qiáng)度高，使用壽命長(zhǎng)，適于工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用范圍廣泛，例如可用于制酒工業(yè)，以固定化酵母菌活細(xì)胞發(fā)酵制酒精;食用酒精、啤酒、白酒、低度白酒、黃酒、葡萄酒、汽酒等，利用固定化酵母，可使發(fā)酵速度大大加快，前發(fā)酵由傳統(tǒng)發(fā)酵法7天縮短至2天，后酵時(shí)間由20-60天縮短至10天左右，另外，可采用分別包埋不同菌株，混和發(fā)酵，避免菌種間相互拮抗;調(diào)味品工業(yè)在食醋醬油的生產(chǎn)方面，采用本發(fā)明的固定化酵母菌、醋酸菌活細(xì)胞于食醋生產(chǎn)的兩個(gè)重要生化階段-酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段，可克服上述傳統(tǒng)工藝的諸多缺點(diǎn)，不需輔料和翻坯，不僅改善和減輕勞動(dòng)條件和強(qiáng)度，解決醋渣成災(zāi)的問(wèn)題。而且生產(chǎn)周期縮短1/2，轉(zhuǎn)換率達(dá)80-100%，出品率相應(yīng)提高，實(shí)現(xiàn)食醋生產(chǎn)機(jī)械化、半連續(xù)化、管道化、安全衛(wèi)生;醫(yī)藥方面，利用固定化微生物活細(xì)胞生產(chǎn)或轉(zhuǎn)化出昂貴的抗生素、干擾素等;微生物學(xué)領(lǐng)域可在短期內(nèi)制取大量微生物，可將用基因工程獲得新種微生物進(jìn)行快速培養(yǎng)，并應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)，造福于人類社會(huì);食品工業(yè);用于氨基酸、維生素的生產(chǎn);還可用于廢水處理等等。
權(quán)利要求
1.一種固定化活細(xì)胞或酶的制備方法，其特征在于所用載體為聚乙烯醇，首先將聚乙烯醇溶液與活細(xì)胞懸浮液混合，以無(wú)菌淀粉為隔離成形劑成型，再經(jīng)低溫冷凍定型室溫自然解凍，漂洗后加工成顆粒狀產(chǎn)物。
2.按權(quán)利要求1所述固定化活細(xì)胞或酶的制備方法其特征在于在固定化活細(xì)胞混合液中聚乙烯醇含量為10-20%(W/W)，活細(xì)胞懸浮液含量為2-20%(W/W)，其余為水;無(wú)菌淀粉與上述混合液的重量比為0.5-2∶1;，所述冷凍溫度為-10--30℃，其對(duì)應(yīng)冷凍時(shí)間為48小時(shí)-12小時(shí)。
3.按權(quán)利要求2所述固定化活細(xì)胞或酶的制備方法其特征在于所述聚乙烯醇其聚合度為400-1900，最好為1750±75;聚乙烯醇濃度15±0.5%;
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的活細(xì)胞或酶的固定化方法，其特征在于所述加工成顆粒狀產(chǎn)物是采用鉸碎機(jī)鉸碎。
5.按權(quán)利要求1或2或3所述固定化活細(xì)胞或酶的制備方法其特征在于所述的固定化活細(xì)胞混合液通過(guò)直徑5-25mm的噴嘴注入裝有無(wú)菌淀粉的容器中隔離成型。
全文摘要
一種固定化活細(xì)胞或酶的制備方法，它以聚乙烯醇為載體，首先將聚乙烯醇溶液與活細(xì)胞懸浮液混合，以無(wú)菌淀粉為隔離成型劑成型，再經(jīng)低溫冷凍定型、解凍、漂洗后加工成顆粒狀產(chǎn)物。本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)便、可大批量生產(chǎn)。適用于所有微生物的固定化，造價(jià)低，產(chǎn)物無(wú)論在中性介質(zhì)酸性介質(zhì)或高濃度無(wú)機(jī)鹽介質(zhì)中，強(qiáng)度都很高，使用壽命4800小時(shí)以上，實(shí)際上可使用1至數(shù)年，可廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，改進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝。
文檔編號(hào)C12N11/08GK1101943SQ9411508
公開(kāi)日1995年4月26日 申請(qǐng)日期1994年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月26日
發(fā)明者邱懷廣, 施柔遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:北京市食品釀造研究所, 北京市釀造六廠