專(zhuān)利名稱(chēng)：：α-微管蛋白的嵌合基因的啟動(dòng)子元件的制作方法在所有種類(lèi)的細(xì)胞中微管是供發(fā)揮多種功能的重要元件。尤其在植物中，它們?cè)趲追N重要的現(xiàn)象中起中心作用，特別在那些涉及形態(tài)發(fā)生的現(xiàn)象中。在所有的真核生物中，微管由大量高度保守的蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中最豐富的便是微管蛋白。蛋白質(zhì)的兩種主要亞基已經(jīng)有人描述過(guò)，稱(chēng)為α-微管蛋白和β-微管蛋白。微管的重要功能以及分布的廣泛性常暗示，編碼微管蛋白的基因是高表達(dá)和結(jié)構(gòu)性表達(dá)的基因的好例子。事實(shí)上，在真核生物中，微管蛋白的亞基是由一族基因編碼的。在植物領(lǐng)域，已經(jīng)研究過(guò)一些植物，如玉米，擬南芥屬，大豆，豌豆，和胡蘿卜中的α-和β-微管蛋白。在所有這些情況中，各種基因組碼多個(gè)α-和β-微管蛋白基因，它們?cè)谥参锏陌l(fā)育過(guò)程中表達(dá)不盡相同。在擬南芥屬中，對(duì)一族微管蛋白基因的仔細(xì)分析揭示有15個(gè)基因(6個(gè)α-微管蛋白和9個(gè)β-微管蛋白)編碼這些蛋白質(zhì)(Kopczaketal.，1992；Snustadetal.，1992)。在玉米中，克隆并測(cè)序了3個(gè)α-微管蛋白基因(Montoliuetal.，1989；Mont-loiuetal.，1990)，而且還通過(guò)PCR分析基因組DNA(Montoliuetal.，1992)檢測(cè)到另外6個(gè)基因。根據(jù)最近的研究，從玉米組織中至少有6個(gè)不同的α-微管蛋白的DNA順序已被克隆和定性(Ville-muretal，1992)。來(lái)自玉米的α-Tub1和α-Tub2基因一前一后排列，中間被至少2kb堿基對(duì)的DNA分開(kāi)。它們?cè)谒械挠衩追稚M織中表達(dá)，而且在胚根系統(tǒng)中高水平地表達(dá)(Montoliuetal.，1989)。α-Tub1基因在所有分析過(guò)的組織中的表達(dá)水平高于α-Tub2基因，此外，它還在花粉中高表達(dá)(Montoliuetal.，1990)。體外雜交實(shí)驗(yàn)表明，在分生組織中，α-Tub1基因是在靜止中心激活期表達(dá)的(Rigauetal.，出版中)。在擬南芥屬中，找到了一個(gè)在花粉中特異表達(dá)的基因，但其表達(dá)方式不同于玉米基因α-Tub1或α-Tub2(carpeateretal.，1990)。玉米基因α-Tub3在所有正在分裂并有高含量纖維素的植物器官中表達(dá)，尤其是未成熟的胚胎中(Montoliuetal.，1990)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，來(lái)自玉米α-微管基因的啟動(dòng)子調(diào)控元件能在單子葉植物和雙子葉植物種的花粉，胚根系，分生組織區(qū)域及未成熟胚胎中控制組織特異性的表達(dá)。本發(fā)明可以更好地控制基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，尤其能更好地控制抗除草劑基因。本發(fā)明的主題是玉米α-微管蛋白的5′調(diào)控區(qū)域。在本發(fā)明中，該區(qū)域被定義為上游調(diào)控群(upstreamregulatoryeusemble，URE)，它能用于控制編碼異源基因的基因的表達(dá)。URE含幾個(gè)調(diào)控元件，當(dāng)它們連在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的異源基因的編碼區(qū)域時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同方式的受控表達(dá)。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了有關(guān)從玉米基因α-Tub1的DNA中分離得到的區(qū)域的信息，該區(qū)域能特異性地控制基因在根、花粉及分生組織中的表達(dá)。本發(fā)明的另一方面涉及含這些調(diào)控元件的植物嵌合基因。調(diào)控元件在功能上與異源基因的編碼順序相連，從而使調(diào)控元件能控制由異源基因編碼的產(chǎn)物的表達(dá)。如果需要，在嵌合基因構(gòu)建物中也可以部分或全部地插入其他的啟動(dòng)子元件。這類(lèi)互補(bǔ)性的元件包括(但并不限于)單子葉植物的內(nèi)含子順序如水稻肌動(dòng)蛋白基因的內(nèi)含多，它會(huì)大大增強(qiáng)異源基因在單子葉植物組織中的表達(dá)。本發(fā)明還包括植物轉(zhuǎn)化載體，以及用這些載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，和含嵌合基因的植物和種子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，產(chǎn)生的嵌合基因含有編碼含氨基端轉(zhuǎn)運(yùn)肽的融合多肽的DNA順序，該轉(zhuǎn)運(yùn)肽能引導(dǎo)異源肽向植物細(xì)胞特有的亞細(xì)胞細(xì)胞器中進(jìn)行亞細(xì)胞定位。而且在轉(zhuǎn)基因植物中獲得基因表達(dá)的更佳控制和更佳定靶。本發(fā)明的主題還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的，具有新品質(zhì)并且尤其能抗除草劑的單子葉或雙子葉植物的方法。用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞通過(guò)再生和/或培養(yǎng)可以產(chǎn)生抗性植株。本發(fā)明包括玉米α-微管蛋白的基因的上游調(diào)控群(URE)的順式調(diào)控元件。這些順式調(diào)控元件是URE的分立的區(qū)域，它們對(duì)受其控制的表達(dá)施加調(diào)控。具體地，本發(fā)明包括一種分離的核酸，它含有至少一個(gè)允許在根、花粉、分生組織和未成熟胚胎中特異性表達(dá)的基因元件。任何微管蛋白的基因都能形成調(diào)控元件，尤其是單獨(dú)的或組合的玉米基因α-Tub1，α-Tub2和α-Tub3，它們?yōu)槿齻€(gè)相似的α-微管蛋白基因。優(yōu)先使用玉米α-微管蛋白基因α-Tub1作為調(diào)控元件來(lái)源。按照本發(fā)明調(diào)控元件之一是在根中特異基因表達(dá)的。一種根特異性的調(diào)控元件含一特定的核苷酸順序，它能在根中引發(fā)基因在其控制下的表達(dá)，也就是說(shuō)是在根中檢測(cè)到它的基因表達(dá)產(chǎn)物的。根特異性的表達(dá)可以在根的任何部位找到，例如(但并不限于)根的分生組織區(qū)域，根的側(cè)芽、側(cè)根、和根的維管區(qū)域。沒(méi)有在芽尖、莖或葉中檢測(cè)到基因表達(dá)。為了鑒別那些控制根特異性基因表達(dá)的調(diào)控元件，必須對(duì)玉米α-微管蛋白的完整基因URE進(jìn)行缺失分析。在一項(xiàng)缺失分析中，連續(xù)地將完整URE的核苷酸除去，得到的片段連于報(bào)導(dǎo)基因的編碼順序，或連于其他異源編碼順序。通過(guò)檢測(cè)在所期望的特定組織中異源基因產(chǎn)物的存在而排除其他組織，來(lái)分析構(gòu)建物控制組織特異性的基因表達(dá)的能力。經(jīng)鑒別的組織特異性元件也可被修飾，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變。接著可以測(cè)試修飾過(guò)的調(diào)控元件在各組織在特異性基因表達(dá)的能力，并因而鑒別其他在組織中賦于特異性的順序。這些鑒別調(diào)控元件的技術(shù)適用于所有的玉米α-微管蛋白基因。例如，以一種優(yōu)選方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub1的URE表明，控制根特異性的基因表達(dá)的調(diào)控元件是由SEQIDNo.1代表的順序的963-1115以及1—1115核苷酸組成的。本發(fā)明的其他調(diào)控元件控制花粉特異性的基因表達(dá)?；ǚ厶禺愋缘幕虮磉_(dá)是人們特別感興趣而且至關(guān)重要的。通常，玉米α-微管蛋白基因α-Tub1在根和花粉中都表達(dá)。當(dāng)從本發(fā)明的全URE中分離出玉米α-微管蛋白的基因α-Tub1的特定區(qū)域時(shí)，其表達(dá)完全限定于花粉?；ǚ厶禺愋缘恼{(diào)節(jié)元件含一特定的核苷酸順序，它能在花粉中引發(fā)在其控制下的表達(dá)，也就是說(shuō)是在除其他組織之外的花粉中檢測(cè)到基因產(chǎn)物。如上面鑒別根特異性調(diào)控元件那樣，通過(guò)分析玉米α-微管蛋白基因的各個(gè)片段的控制花粉特異性基因表達(dá)的能力，鑒別出控制花粉特異性表達(dá)的調(diào)控元件，不同的是在花粉中檢測(cè)表達(dá)。如上所述地鑒別了對(duì)允許花粉特異性表達(dá)和核苷酸順序進(jìn)行的修飾。來(lái)自任何玉米α-微管蛋白基因的花粉特異性調(diào)控元件都可用這些技術(shù)鑒別。例如，以一種優(yōu)先的方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub1的URE表明，控制花粉特異性基因表達(dá)的調(diào)控件是由SEQIDNo.1順序中的核苷酸1-1348和1295—1348組成的。據(jù)本發(fā)明存在于玉米α-微管蛋白的基因的URE的其他調(diào)控元件控制分生組織特異性的基因表達(dá)。如上面鑒別其他調(diào)控元件那樣，鑒別了分生組織特異性基因表達(dá)的調(diào)控元件。例如，可以使用缺失分析來(lái)鑒別在分生組織中特異表達(dá)它所控制的基因的任何玉米α-微管蛋白的基因的核苷酸順序。對(duì)這樣的順序可如上進(jìn)行修飾，并測(cè)試以鑒別其他提供分生組織特異性基因表達(dá)的順序。例如以?xún)?yōu)先的方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub3的URE表明，控制分生組織特異性基因表達(dá)的調(diào)控元件是由SEQIDNo.3的順序的核苷酸1—695和542—695組成的。據(jù)本發(fā)明存在于玉米α-微管蛋白基因中的其他調(diào)控元件控制著未成熟胚胎中特異性的基因表達(dá)。如上面鑒別其他調(diào)控元件那樣，鑒別了提供未成熟胚胎特異性基因表達(dá)的調(diào)控元件。例如，可以使用缺失分析來(lái)鑒別在未成熟胚胎中表達(dá)它所控制的任何玉米α-微管蛋白基因的核苷酸順序。對(duì)這樣的順序可如上進(jìn)行修飾并測(cè)試以鑒別其他提供未成熟胚胎特異性基因表達(dá)的順序。例如，以?xún)?yōu)先的方式，分析玉米α-微管蛋白基因α-Tub3的URE表明，控制未成熟胚胎特異性基因表達(dá)的調(diào)控元件是由SEQIDNo.3的順序的核苷酸1—1076組成的。按下列方法，有可能獲得分離的編碼玉米α-微管蛋白基因的上游調(diào)控群的核酸，即可以用α-微管蛋白cDNA篩選玉米基因組DNA文庫(kù)以分離出α-微管蛋白的重組基因組克隆(Montoliuetal.，1989)。獲得α-微管蛋白重組DNA的有用方法在A(yíng)usubel等人，1989的《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，JohnWiley&Sons，NY，中有描述，或者也可以在到處可獲得的大量有關(guān)重組DNA技術(shù)的手冊(cè)中的任一本中找到。至于核苷酸順序測(cè)定，有許多為熟練的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)可供使用。例如，α-微管蛋白基因的URE可以亞克隆入測(cè)序載體如pBluescript(Stratagene)的多連接點(diǎn)。然后這些pBlueseript亞克隆可用“雙鏈雙脫氧法”測(cè)序。編碼玉米α-微管蛋白基因的URE的α-Tub1克隆的核苷酸順序用SEQIDNo.1表示。編碼玉米α-微管蛋白基因URE的α-Tub2克隆的DNA的核苷酸順序用SEQID4No.2表示。編碼玉米α-微管蛋白基因URE的α-Tub3克隆的DNA的核苷酸順序用SEQIDNo.3表示。優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸順序用SEQIDNo.4表示。其他的玉米α-微管蛋白基因的URE可以用同樣的戰(zhàn)略獲得。此外，可以使用所述的α-Tub1，α-Tub2和α-Tub3的URE的轉(zhuǎn)錄的順序作為雜交探針篩選玉米基因組DNA文庫(kù)和鑒別其他α-微管蛋白基因。從而獲得代表玉米α-微管蛋白基因家族的其他成員的克隆。鑒別控制組織特異性基因表達(dá)的順式調(diào)控順序可以如下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄融合特異順序和一個(gè)異源基因的編碼順序，將嵌合基因轉(zhuǎn)移入合適宿主，并檢測(cè)異源基因的表達(dá)。用來(lái)檢測(cè)表達(dá)的測(cè)試方法取決于異源順序的性質(zhì)。例如，報(bào)導(dǎo)基因，如β-葡萄糖醛苷酸酶(GUS)，通?？捎脕?lái)確立嵌合構(gòu)建物的轉(zhuǎn)錄和翻譯的能力。已有靈敏地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物中報(bào)導(dǎo)酶的標(biāo)準(zhǔn)方法。GUS基因能用作檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中啟動(dòng)子活性的報(bào)導(dǎo)基因，因?yàn)樵撁冈谥参锛?xì)胞中很穩(wěn)定而且已有定量的熒光測(cè)量法及組織化學(xué)定位技術(shù)。Teffersonetal.，1987EMBOJ6，3901，已給出在植物組織中生化法和組織化學(xué)法檢測(cè)GUS活性的標(biāo)準(zhǔn)程序。生化測(cè)試是將植物組織裂解液與4-甲基繖形基-β-D-葡糖醛苷酸，GUS的熒光底物相混合，再在37℃保溫1小時(shí)，測(cè)量4-甲基繖形酮的熒光。GUS活性的組織化學(xué)定位是在37℃保溫5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖醛苷酸(X-Gluc)中的植物組織樣品18小時(shí)，再觀(guān)察X-Gluc點(diǎn)的圖形。構(gòu)建這種嵌合基因允許限定調(diào)控表達(dá)所必需的特異的調(diào)控順序，而且通過(guò)分析表明這些順序能控制異源基因的表達(dá)。本發(fā)明還包括一種含來(lái)自玉米α-微管蛋白基因的調(diào)控元件的植物嵌合基因，該調(diào)控元件控制根特異性基因表達(dá)，花粉特異性基因表達(dá)，分生組織特異性基因表達(dá)或未成熟胚胎特異性基因表達(dá)，并且連于一種異源基因的編碼順序上，使得調(diào)控元件能控制這種異源基因。異源基因可以是除玉米α-微管蛋白基因之外的任何基因。如果必需，可以在嵌合構(gòu)物部分或全部地含有其他啟動(dòng)元件，如單子葉的內(nèi)含子，使之足以表達(dá)生成有效量的由異源基因編碼的多肽并提供任何有利的農(nóng)業(yè)性狀，如抗蟲(chóng)，抗線(xiàn)蟲(chóng)，抗真菌以及最好為抗除草劑性能。因此，本發(fā)明包括玉米α-微管蛋白基因和URE區(qū)域的嵌合基因，它提供本發(fā)明的根特異性的表達(dá)并連于編碼抗除草劑酶的順序。最好，URE區(qū)域包括α-Tub1的核苷酸1—1115，963—1115或1—1529。如SEQIDNo.1所示。對(duì)這些提供根特異性表達(dá)的任何修飾構(gòu)成了本發(fā)明一部分。根會(huì)累積某些種類(lèi)的除草劑，這使它們對(duì)低劑量施用的這類(lèi)除草劑十分敏感。因?yàn)橛衩爪?微管蛋白基因的URE元件能在根部控制高且受控的表達(dá)，因此，它們能被用于提供抗性表型。這些元件能用于調(diào)控某些編碼抗除草劑酶的基因的表達(dá)，如來(lái)自S.typhimurium的aroA，編碼能解除草劑毒性的酶的基因，如來(lái)自K.ozaenae的brx基因，它抗溴苯腈。含這些元件的嵌合基因可以用來(lái)生產(chǎn)耐農(nóng)用劑量除草劑的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還包括含玉米α-微管蛋白基的URE的一個(gè)區(qū)的嵌合基因，此區(qū)提供花粉特異性的表達(dá)并與異源基因融合。該構(gòu)建物提供與玉米α-微管蛋白的“正常的”表達(dá)在空間上分離的表達(dá)，即異源基因在植物花粉中直接表達(dá)。換言之，當(dāng)從URE的上下文中去除一個(gè)特定的順序時(shí)，便修飾了組織的特異性的調(diào)控。最好，α-Tub1的URE區(qū)域包括核苷酸1—1348或295—1348，如SEQIDNo.1中所示。同樣最好的是，將該調(diào)控元件與細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)融合以形成雄性不育植株。對(duì)這些提供花粉特異性表達(dá)的嵌合基因進(jìn)行的任何修飾是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明包括含玉米α-微管蛋白基因的URE一個(gè)區(qū)域的嵌合基因，此區(qū)提供分生組織特異性的表達(dá)并與異源基因融合。最好，α-Tub3的URE區(qū)域包括核苷酸1—695或542—695，如SEQIDNo.3中所示。對(duì)這些提供分生組織特異性表達(dá)的嵌合基因的任何修飾是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明包括含玉米α-微管蛋白基因的URE一個(gè)區(qū)域的嵌合基因，此區(qū)提供分生組織特異性的表達(dá)并與異源基因融合。最好，α-Tub3的URE區(qū)域包括核苷酸1—1076，如SEQIDNo.3中所示。對(duì)這些提供未成熟織胚胎特異性表達(dá)的嵌合基因的任何修飾是本發(fā)明的一部分。使用這些嵌合構(gòu)建物對(duì)于提供抗除草劑性狀特別重要。因?yàn)榇蠖鄶?shù)除草劑對(duì)雜草和作物不加區(qū)分，所以通過(guò)遺傳工程產(chǎn)生抗除草劑的作物植株是具相當(dāng)農(nóng)業(yè)重要性的，因其允許使用廣譜除草劑。因此，本發(fā)明包括含玉米α-微管蛋白的URE元件的嵌合基因，該元件將根特異性表達(dá)賦于至少部分啟動(dòng)子，此啟動(dòng)子在植物中起作用并且還與至少一部分aroA基因或編碼提供除草劑抗性的多肽的順序相連。作為例子的有提及的賦于抗草甘膦，與5-烯醇成丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)相近的抑制劑，磺酰脲類(lèi)，咪唑啉酮，乙酰氧羥基酸合成酶(AHS)和4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(CHPPO)的抗性。主要是，α-Tub1的URE區(qū)域包括如SEQIDNo.1中所示的核苷酸1—1115，963—1115或1—1529，并且和報(bào)導(dǎo)基因融合。任何對(duì)這些提供未成熟胚胎特異性的表達(dá)的嵌合基因的修飾是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的嵌合基因的構(gòu)建是通過(guò)將部分或全部的玉米α-微管蛋白的啟動(dòng)子順序與異源基因的編碼順序相融合，可以用多種方法使這些順序并列。較佳地，從5′至3′，順序的次序是這樣的玉米α-微管蛋白的URE、單子葉或雙子葉如煙草的內(nèi)含子順序，編碼順序和多聚腺嘌呤化(poly(A)位點(diǎn))。構(gòu)建這種嵌合基因的傳統(tǒng)方法是本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所熟知的，而且可以在文獻(xiàn)中找列，如Ausubel等人(1989)的文獻(xiàn)。有多種不同的連接DNA片段的方法可供使用，取決于DNA片段末端的性質(zhì)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，對(duì)于待表達(dá)的異源基因，構(gòu)建物需要啟動(dòng)子以及使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有效地多聚腺嘌呤化的信號(hào)。因此含有已知的CAAT和TATA盒的啟動(dòng)子順序的玉米α-微管蛋白的URE區(qū)域可以直接與沒(méi)有啟動(dòng)子的編碼順序融合。此外，不含CAAT和TATA盒的玉米α-微管蛋白的URE區(qū)域可以連于編碼啟動(dòng)子并在植物中起作用的DNA片段。植物啟動(dòng)子可以購(gòu)買(mǎi)到或者參照其發(fā)表的順序而化學(xué)合成。作為這樣的一個(gè)片段的例子，可以提及的是縮短的花椰菜菜葉病毒的35S啟動(dòng)子，它保留了CAAT和TATA盒?？梢允褂闷渌膯?dòng)子，如胭脂堿合成酶和核酮糖1，5-二磷酸羧化酶的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子片段再連于異源編碼順序。編碼順序的3′端與多聚腺嘌呤化位點(diǎn)融合，例如(但并不局限于此)，胭脂堿合成酶的聚腺嘌呤化位點(diǎn)。此外，可以使用植物轉(zhuǎn)化載體，這些載體在轉(zhuǎn)化植物所需的順序周?chē)粋€(gè)種或多個(gè)聚腺嘌呤化位點(diǎn)?？梢詫⒂衩爪?微管蛋白的URE元件和本發(fā)明的異源編碼順序亞克隆入植物轉(zhuǎn)化載體的多連接點(diǎn)，從而獲得嵌合基因。本發(fā)明的5′元件可以通過(guò)用限制性的內(nèi)切核酸酶或外切酶消化玉米α-微管蛋白基因組克隆而得到。含CAAT和TATA盒的限制性片段連于沒(méi)有啟動(dòng)子的異源基因，如GUS或aroA的編碼順序。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道可用其他方法獲得玉米α-微管蛋白的5′調(diào)控部分，如用化學(xué)法或酶法(PCR)合成。異源產(chǎn)物可以是任何基因的編碼順序，它可在這樣的構(gòu)建物中表達(dá)。所有這些例子是本發(fā)明的一部分。編碼順序的3′端可以任意地與多聚腺嘌呤化位點(diǎn)融合，例如(但并個(gè)局限于此)，胭脂堿合成酶的，章肉堿T-DNA的基因7的或擬南芥屬組蛋白基因的H4A748基因的多聚腺嘌呤化位點(diǎn)。以外，多聚腺嘌呤化位點(diǎn)也可由異源基因自身提供。玉米α-微管蛋白的不含TATA盒的5′調(diào)控元件可以連于至少部分植物啟動(dòng)子順序，也就是說(shuō)至少含CAAT及TATA順序。最好此啟動(dòng)子是縮短的花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子。得到的嵌合復(fù)合體可以連于異源編碼順序和多聚腺苷酸化順序上。為了獲得異源基因的受控的表達(dá)，用本發(fā)明的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物。作為一種在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)異源基因的方法，基因轉(zhuǎn)移在本領(lǐng)域是人們熟知的。煙草是最常用的植物，因?yàn)樗子谠偕瑔沃甑姆N子產(chǎn)量高而且因?yàn)榭梢杂脕?lái)自農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的載體高頻率地轉(zhuǎn)動(dòng)(Kleeetal.，(1987)。Annu.Rev.PlantPhysiol38,467)。雙子葉植物，例如(但不限于此)棉花，油菜和大豆是優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因宿主。但是，何種植物可以作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因宿主被有效地轉(zhuǎn)化并再生將是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的事。已知有許多轉(zhuǎn)化方法?？梢杂萌~圓片上的轉(zhuǎn)化法將嵌合基因引入并再生，如Horsch等人，(1985)Science227，1229中所述。其他的轉(zhuǎn)化法，如原生質(zhì)體培養(yǎng)，(Horschetal.(1984)Science223,496；DeBlocketal.(1984)EMBROJ2，2143；Bartonetal.(1983)Cell32，1033)或體外轉(zhuǎn)化莖或根的外植體(Zambriskyetal.(1983)EMBOJ2，2143；Bartonetal.(1983)Cell32，1033)，也可以在本發(fā)明的框架下加以使用。最好植物用來(lái)自農(nóng)桿菌的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。但是，也有其他方法可以用來(lái)將本發(fā)明的嵌合基因插入植物細(xì)胞。在這些方法中，有基因槍法(Kleinetal.，(1983)，Na-ture32770)，電穿孔法，通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)吸收DNA以及使用病毒或花粉作為載體。如果轉(zhuǎn)化方法需要，本發(fā)明的嵌合基因可以引入植物轉(zhuǎn)化載體，例如Bevan描述的二元載體(1984)或在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)337,899中所述的另一方法。植物轉(zhuǎn)化載體可通過(guò)修飾天然的Agrobacteri-umtrmefaciens基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)而得到。天然系統(tǒng)包括大Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒，它含有一個(gè)大片段，即T-DNA，它會(huì)轉(zhuǎn)移至被轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一片段，即vir區(qū)域是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移T-DNA的。T-DNA被末端重復(fù)順序所圍繞。在修飾過(guò)的二元載體中，已去除誘導(dǎo)腫瘤的基因并利用vir區(qū)域的功能轉(zhuǎn)化用T-DNA邊界順序界定的外來(lái)DNA。T區(qū)域還含一個(gè)可篩選的抗生素抗性記號(hào)，和用于插入待轉(zhuǎn)移的順序的多克隆位點(diǎn)。這些遺傳工程菌株是已知的“解除武裝”的Agrobacteriumtumefaciens而且它們能有效地在植物核基因組中轉(zhuǎn)化由T區(qū)域界定的順序。表面滅菌的葉圓片用含外來(lái)DNA的Agrobacteriumtumefa-ciens接種，培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)入含抗生素的培養(yǎng)基中。在含適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出根后，選擇轉(zhuǎn)化芽，并轉(zhuǎn)入土壤。轉(zhuǎn)基因植物自花授粉，收獲這些植物的種子并培養(yǎng)于含抗生素的培養(yǎng)基中。報(bào)導(dǎo)基因或異源基因在根、芽、花粉、分生組織和未成熟胚胎中的表達(dá)可以用免疫學(xué)或組織化學(xué)試驗(yàn)或活性試驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)。下面將看到，選擇什么樣的試驗(yàn)方法檢測(cè)嵌合基因的表達(dá)取決于異源編碼區(qū)域的性質(zhì)。例如如果有適當(dāng)?shù)暮塑账崽结槪捎肗orthern分析監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)錄。如果有針對(duì)異源基因編碼的多肽的抗體，可以使用Western分析和免疫-組織化學(xué)定位法以監(jiān)測(cè)產(chǎn)物并將多肽定位。取決于異源基因，還可使用生化測(cè)試法。例如，通過(guò)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)底物的乙?；磻?yīng)可檢測(cè)乙酰基轉(zhuǎn)移酶?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量轉(zhuǎn)化植物的除草劑抗性而監(jiān)測(cè)抗除草劑基因的表達(dá)。本發(fā)明還包括含本發(fā)明的嵌合基因單子葉及雙子葉轉(zhuǎn)基因植物及后代。植物細(xì)胞可以利用上述的任一種轉(zhuǎn)化植物的方法，用嵌合基因轉(zhuǎn)化。通常在愈份組織或葉圓片培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的方法(如Horschetal.(1985)Science227，1129)被再生完整的轉(zhuǎn)基因植物。最好，轉(zhuǎn)基因植物是棉花，油菜，玉米，煙草或大豆。因?yàn)檗D(zhuǎn)化的植物將嵌合基因傳遞給后代，因此可以用轉(zhuǎn)化植物的種子或外植體來(lái)維持轉(zhuǎn)基因植物系。本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生具有改良的抗除草劑性能的植物的方法。該方法包括用含嵌合基因的載體轉(zhuǎn)化植物，該嵌合基因含對(duì)根或分生組織特異的，并連于抗除草劑酶或降解除草劑的酶的編碼順序的調(diào)控元件，并選擇具所期望性狀的植物。最好，這類(lèi)元件是α-Tub1的URE的區(qū)域，含SEQIDNo.1中的核苷酸1—1115，963—1115或1—1529。轉(zhuǎn)化植物被再生成對(duì)施用的除草劑具抗性的植株。本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生雄性不育的植物的方法。該方法包括用含嵌合基因的載體轉(zhuǎn)化植物，該嵌合基因含對(duì)花粉特異的，并連于細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的編碼順序的調(diào)控元件，以及選擇具所期望性狀的植物。最好，這類(lèi)元件是α-Tub1的URE的區(qū)域，含SEQIDNo.1中的核苷酸1—1348或1295—1348。轉(zhuǎn)化植物被再生成雄性不育的植株。本發(fā)明還包括一種產(chǎn)生抗除草劑性狀的植物的方法。該方法包括用含嵌合基因的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該嵌合基因含對(duì)根特異的并連于抗除草劑如N-膦羧基甲基甘氨酸的基因的編碼順序；然后，選出具有所期望的抗除草劑性狀的植株。選出的植株是在用除草劑處理時(shí)能存活的，而在同樣條件下非轉(zhuǎn)化的同物種的植株被殺滅。最好此類(lèi)元件是α-Tub1的URE區(qū)域，含SEQIDNo.1中核苷酸1—1115，963—1115或1—1529，且異源基因順序由編碼EPSPS合成酶乙酰乳酸合成酶，或4-羥基苯基丙酮酸雙加氧化酶的基因，或者經(jīng)突變而使它們具有抗性的基因提供的。轉(zhuǎn)化植株再生成抗除草劑的植株。最好，植物是用載體pRPA—RD—65(或pRPA—RD—88)轉(zhuǎn)化，該載體含有含α-Tub1的URE的核苷酸70—1529的對(duì)根特異的調(diào)控元件，一個(gè)單子葉植物的內(nèi)含子(pRPA—RD—88單獨(dú))，一個(gè)優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及抗除草劑基因aroA。下列實(shí)施例將更全面地闡述本發(fā)明。在實(shí)施例中引用的核苷酸順序排為SEQIDNo.1到4。圖1為親本質(zhì)粒pBI101.1結(jié)構(gòu)。圖2是嵌合構(gòu)建物α-Tub1/GUS啟動(dòng)子的示意圖。數(shù)字是依轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)給出的。上圖對(duì)應(yīng)于α-Tub1和α-Tub2之間的基因間區(qū)域，而且通過(guò)在適當(dāng)位點(diǎn)的限制酶消化來(lái)形成缺失。下圖對(duì)應(yīng)于片段-449，這里，缺失是通過(guò)用外切核酸酶III消化數(shù)次而得。SacII位點(diǎn)(+48)對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子和質(zhì)粒pBI101.1的轉(zhuǎn)錄融合點(diǎn)。(+)對(duì)應(yīng)于微管蛋白基因α-Tub1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。圖3是嵌合構(gòu)建物α-Tub3/GUS啟動(dòng)子的示意圖。數(shù)字是依轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)給出的。用外切核酸酶III消化數(shù)次而形成缺失。BglII位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于啟動(dòng)子和質(zhì)粒pBI101.1的轉(zhuǎn)錄融合點(diǎn)。(+)對(duì)應(yīng)于微管蛋白α-Tub的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。實(shí)施例1a)帶GUS報(bào)導(dǎo)基因的構(gòu)建物在實(shí)施例中使用的通用的GUS報(bào)導(dǎo)基因盒已由Jefferson等人，1987，EMBOJ6，3901描述的。簡(jiǎn)而言之，將GUS的編碼順序連接在來(lái)自A.tumefaciens的載體pBIN19的多連接位點(diǎn)處的胭脂堿合成酶的多聚腺苷酸化位點(diǎn)的5′部分(Bevan(1984)NucleicsAcidsRes.12，8711)。載體pBIN19含植物轉(zhuǎn)化所需的T-DNA的左右邊界，以及卡那霉素抗性基因。得到的構(gòu)建物PBI101.1見(jiàn)圖1。只有GUS的起始密碼子AUG上游的限制性位點(diǎn)才能插入啟動(dòng)子DNA片段。表1列出了親本質(zhì)粒及衍生的構(gòu)建物。玉米α-Tub1及含于衍生的構(gòu)建物中的啟動(dòng)子元件的位置列于圖2。構(gòu)建物pα-Tub1-GUS為長(zhǎng)的重迭片段，它函蓋了調(diào)控區(qū)域的全長(zhǎng)(圖2中的-1410至48)。幾個(gè)構(gòu)建物的5′端是通過(guò)外切核酸酶III消化pBI101.1(stratagene)中α-Tub1的497堿基對(duì)而得的〔-449(SpcI-SacII)，表1〕。各種缺失的位置見(jiàn)圖2。b)轉(zhuǎn)化植物按照標(biāo)準(zhǔn)程序(Horsch等人，(1985))，用基于pBIN19的質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)化煙草(NicotianatabaccmcvpetiteHavanaSRI)，方法的不同處是初始轉(zhuǎn)化子在100μg/ml卡那霉素上篩選。植物經(jīng)自花傳粉，F(xiàn)I代種子在200μg/ml的卡那霉素上萌發(fā)以鑒別轉(zhuǎn)化子，因?yàn)榛趐BIN19的構(gòu)建物含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因，它提供對(duì)有毒的卡那霉素的抗性。對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化子，整合入煙草基因組的每種GUS構(gòu)建物下的拷貝數(shù)通過(guò)分析卡那霉素抗性的分離頻率計(jì)算出。大多數(shù)轉(zhuǎn)化子包含一個(gè)來(lái)自構(gòu)建物的發(fā)生分離計(jì)算出的基因(locus)。轉(zhuǎn)基因植物在溫室中生長(zhǎng)。表I構(gòu)建物描述親本質(zhì)粒pBI101.1基因的pBIN-19盒，無(wú)啟動(dòng)子，來(lái)自GUS報(bào)導(dǎo)基因(Jeftersonetal.，1987)(cf.圖1)pRPA-BL-504類(lèi)似于pBI101.1，不同處在于氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶代替了GUS基因pα-Tub1來(lái)自MG19/b的3058bp的XhoI片段(Montoliuet.al.，1989)，克隆入pUC-18；含全部的玉米α-Tub1上游調(diào)控群pα-Tub1—1588克隆入pUC18的來(lái)自玉米α-Tub1的1588bp的XhoI-AluI片段(Montoliuet.al.，1989)；含轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1410bp及下游180bppα-Tub3—1072來(lái)自玉米α-Tub3的1072bp的BglII片段(Montoliuet.al.，1990)，克隆入pUC-18的BamHI位點(diǎn)；含轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游1020bp及下游62bppRPA-RD-37BaroA表達(dá)盒，含以符合讀碼框方式融合的優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(EP508909)，aroA基因和NOS多聚腺苷酸化信號(hào)順序，克隆入pBSIISK(-)(stratagene)pRPA-RD-49單子葉轉(zhuǎn)化載體，含35SCaMV啟動(dòng)子，bar基因以及TR7多聚腺苷酸化信號(hào)順序，克隆入pUC-18的HindIII和EcoRI位點(diǎn)之間。在兩個(gè)AflIII位點(diǎn)和SspI位點(diǎn)之間的平頭末端處將NotI接頭連接上去，并形成含基因構(gòu)建的35SCaMV-bar的3.1kb的NotI片段pRPA-RD-26來(lái)自克隆入EcoRI-HindII消化的pUC-19的pα-Tub1的1865bp的EcoRI-ScaI片段。翻譯起始的ATG旁的順序用PCR突變從而含NcoI位點(diǎn)，使用的引物為5′→3′CGGCCGCTCCACCCGTACGACGACCACCATGGGGGAGpRPA-RD-32將pRPA-RD-26的1458bp的PstI-NcoI片段，由來(lái)自玉米基因α-Tub1的核苷酸-1340至118構(gòu)成(SEQIDNo.1的核苷酸71—1527)，連于pRPA-RD-37B的PstI—NcoI位點(diǎn)，形成玉米α-Tub1-OTP-aroA基因-NOS表達(dá)盒pRPA-RD-87將含玉米adhI內(nèi)含子的600bpNcoI-PstI片段克隆入pRPA-RD-37B的NcoI-PstI位點(diǎn)，形成表達(dá)盒玉米adhI內(nèi)含子1—優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽(EP508909)，aroA基因和NOSpoly(A)化信號(hào)pRPA-RD-90來(lái)自pRPA-RD-32的1430bp的EagI片段(含玉米基因α-Tub1的核苷酸-1340至90；SEQIDNo.1的順序71—1499)，并用E.coli的DNA聚合酶I的Klenow片段切成平頭末端，克隆入pBSIIsk(-)的SmaI位點(diǎn)(stratagene)衍生的構(gòu)建物—1410將來(lái)自pαTub1-1588的HindIII-SacII片段克隆入HindIII-SmaI消化過(guò)的pBI101.1；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1410bp及下游48bpα-Tub3-1020將pα-Tub3-1072的1115bp的HindIII-SmaI片段克隆入HindIII-SmaI消化的pBI101.1；含轉(zhuǎn)錄·起點(diǎn)上游1020bp及下游62bp.(cf圖2)—956用BammHI消化并重新環(huán)化而得的-1410衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游956bp及下游48bp—449用SpeI消化并重新環(huán)化而得的-1410衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游449bp和下游48bp—352用外切核酸酶III消化并重新環(huán)化而得的-449(pBI101.1中)衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游352bp及下游48bp?！?97用外切核酸酶III消化并重新環(huán)化而得的-449(pBI101.1中)衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游297bp及下游48bp—252用外切核酸酶III消化并重新環(huán)化而得的-449(pBI101.1)中衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游252bp及下游48bp—184用外切核酸酶III消化并重新環(huán)化而得的-449(pBI101.1中)衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游184bp及下游48bp—117用外切核酸酶III消化并重新環(huán)化而得的-449(pBI101.1中)衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游117bp及下游48bp—64用外切核酸酶III消化并重新環(huán)化而得的-449(pBI101.1)中衍生構(gòu)建物；含轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游64bp及下游48bppRPA-RD-53含來(lái)自pRPA-RD-32的表達(dá)盒玉米α-Tub1-aroA的3.5kb的SacI-EcoRI片段，克隆入pBIN-19的ScaI-EwRI位點(diǎn)pRPA-RD-653.5kb的SacI-EcoRI片段，含來(lái)自pRPA-R-32的表達(dá)盒玉米α-Tub1-A，通過(guò)T4DNA多聚酶使末端補(bǔ)平，克隆入用Ecoli的DNA聚合酶的Klenow是片段切成平頭末端的pRPA-RD-49的NdeI位點(diǎn)。來(lái)自pRPA-RD-32的表達(dá)盒玉米α-Tub1-aroA的方向與aroA及bar基因轉(zhuǎn)錄單元的方向經(jīng)證實(shí)是相反的pRPA-RD-88來(lái)自pRPA-R-90的1.5kb的PstI片段，含玉米α-Tub1基因的核苷酸-1340至90(SEQIDNo.1中順序7(至1499)，克隆入pRPA-RD-87的PstI位點(diǎn)，形成表達(dá)盒玉米α-Tub1-玉米adhI內(nèi)含子1-優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(EP508909)，aroA基因及NOSpoly(A)化信號(hào)pRPA-RD-7優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(EP508900，SEQIDNo.4)的衍生物；用PCR突變，使用下列合成的寡核苷酸(1)GAATTCCGAAAGACAAAGATTATCGCCATGGCTTCG〔核苷酸1—36；SEQIDNo.3〕；(2)CCGTAGGCCGGCCACACCTGCATACATTGAACTCTTCC〔核苷酸228—181；SEQIDNO31〕；和(3)CGAGACGCTGTCGTACCTGCCGCCGCTGTCTATGGCG〔核苷酸231.—267；SEQIDNo.3〕該優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽被克隆入pBSIIsk(-)〔stratagene〕的EcoRI和EcoRV位點(diǎn)，形成含優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽的克隆盒實(shí)施例2GUS活性的組織化學(xué)定位；根及花粉特異性的表達(dá)在含構(gòu)建物的各轉(zhuǎn)基因煙草的根、花粉及大量其他組織測(cè)定GUS活性，并列于表1。按照J(rèn)efferson等人(1987)的通常的程序。在含來(lái)自玉米α-Tub1基因的啟動(dòng)子片段的嵌合GUS基因的轉(zhuǎn)基因植株中，進(jìn)行了GUS活性的組織化學(xué)定位。樣品用50mMNaPO4，pH7，0.2mM5-溴-4-氯-3吲哚基-葡糖醛酸(X-Glue)，0.1mM鐵氰化鉀和0.1mM亞鐵氰化鉀的混合物洗滌。樣品置于顯微鏡載玻片上。用80％甘油蓋住。表2以總結(jié)形式列出含玉米α-Tub1基因的調(diào)控元件的煙草植株的典型的顯微照像的結(jié)果。表2表明α-Tub1的調(diào)控元件在分生組織，尤其根的分生組織及花粉中能給出高水平的表達(dá)。用熒光光度法分析GUS活性，在提取緩沖液(50mMNaPO4，10mMEDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％TritonX-100和100mMβ-巰基乙醇)在研磨植物組織。裂解液經(jīng)離心后，取出上清液，置于新管中以100μl一份地加入。加入等體積的溶于提取液中的2mM4-甲基繖形基-γ-葡糖醛酸，在37℃保溫1小時(shí)。加入0.8mlNa2CO3(0.2m)使反應(yīng)終止。4-甲基繖形酮(4-MU)的熒光用Hoeffer微型熒光計(jì)，按Jefferson等人(1987)所述的方法進(jìn)行測(cè)量。GUS活性以對(duì)每分鐘每單位蛋白質(zhì)總質(zhì)量的4-MU的皮摩爾數(shù)表示。為了確定負(fù)責(zé)分生組織特異性的和關(guān)于花粉特異性表達(dá)的啟動(dòng)元件，測(cè)定了各種啟動(dòng)子缺失體(cf圖2)的GUS在轉(zhuǎn)基因的煙草植株中的表達(dá)方式。測(cè)量了含指導(dǎo)GUS表達(dá)的α-Tub1的各種順序元件(總結(jié)于圖2)的轉(zhuǎn)基因植物的根尖，芽尖，葉，莖和花粉的GUS活力。結(jié)果列于表3。所有含有玉米α-微管蛋白的α-Tub基因的URE的-1410和-352(SEQIDNo.1至1058)之間的部分的構(gòu)建物都賦與轉(zhuǎn)基因煙草根部以GUS活性。全長(zhǎng)的調(diào)控區(qū)域及其片段都賦與煙草原生質(zhì)體以高活性。只有缺失轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游小于-352bp(SEQIDNo.1中的1058)的啟動(dòng)子部分，GUS活性才會(huì)在轉(zhuǎn)基因的根中受抑制，這表明α-Tub1的根特異性的調(diào)控部分是上游的-352bp(SEQIDNo.1至1058)。所有含有玉米α-微管蛋白的α-Tub基因的URE的-1410和-64(SEQIDNo.1中1至1058)之間的部分的構(gòu)建物中都賦與轉(zhuǎn)基因煙草花粉以GUS活性。只有缺失轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游小于-64bp(SEQIDNo.1中的1348)的啟動(dòng)子部分，GUS活性才會(huì)在轉(zhuǎn)基因的花粉中受抑制，這表明α-Tub1的根特異性的調(diào)控部分是上游的-64bp(SEQIDNo.1至1058)。表2組織化學(xué)分析轉(zhuǎn)基因植物數(shù)字表示與整個(gè)分析過(guò)的植株相比每種構(gòu)建物植物各部分中帶藍(lán)點(diǎn)(用(+)表示)的植株數(shù)或無(wú)表達(dá)的(-)植株數(shù)。表3熒光光度測(cè)試轉(zhuǎn)基因煙草植株的帶玉米α-微管蛋白的α-Tub1基因的啟動(dòng)子的GUS構(gòu)建物實(shí)施例3GUS活性的組織化學(xué)定位分生組織特異性表達(dá)在含使用來(lái)自玉米α-Tub3基因的啟動(dòng)子片段(SEQIDNo.3中核苷酸1—1082)的嵌合GUS基因的轉(zhuǎn)基因植株中，進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)定位。樣品用50mMNaPO4，pH7；0.2mM5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖醛酸(X-Gluc)；0.1mM鐵氰化鉀和0.1mM亞鐵氰化鉀的混合物洗滌。樣品置于顯微鏡載波片上，用80％甘油蓋住。表4以總結(jié)形式列出含玉米α-Tub3基因的調(diào)控元件的煙草植株的典型的顯微圖像的結(jié)果。表4表明α-Tub3的調(diào)控元件(核苷酸1至1082，SEQIDNo.3)在分生組織優(yōu)先給出高水平的表達(dá)。用熒光光度法分析了GUS活性，在提取緩沖液(50mMNaPO4，10mMEDTA，0.1％Sarkosyl，0.1％TritonX-100和100mMβ-巰基乙醇)中研磨植物組織。裂解液經(jīng)離心后，取出上清液，置于新管中以100μl一份加入。加入等體積的溶于提取液中的2mM4-甲基繖形基-γ-葡糖醛酸，在37℃保溫1小時(shí)。加入0.8mlNa2CO3(0.2M)使反應(yīng)終止。4-甲基繖形酮(4-MU)的熒光用Ho-elfer熒光光度計(jì)，按Jefferson等人(1987)所述的方法進(jìn)行測(cè)量。GUS活性以每分鐘每單位蛋白質(zhì)總質(zhì)量的4-MU的皮摩爾數(shù)表示。為了確定負(fù)責(zé)分生組織特異性的啟動(dòng)元件，在轉(zhuǎn)基因的煙草植株中確定了各種啟動(dòng)子缺失體(cf圖2)的GUS的表達(dá)方式。表4熒光光度測(cè)試轉(zhuǎn)基因煙草植株的帶玉米α-微管蛋白的α-Tub3基因的啟動(dòng)子的GUS構(gòu)建物植物用與GUS報(bào)導(dǎo)基因融合的啟動(dòng)子片段—1024穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。結(jié)果的pmol/hr×mg蛋白質(zhì)表示，為4個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化的F1植株中每一個(gè)的6—16個(gè)后代植株的平均值。實(shí)施例4將抗除草劑性能引入煙草將來(lái)自親本質(zhì)粒pRPA-RD-32(cf表1)的3.5kb的SacI-EcorI片段克隆入PBIN-19的SacI-EcoRI位點(diǎn)。得到的構(gòu)建物，叫pRPA-RD-53，在轉(zhuǎn)錄框架中含下列元件玉米α-Tub1調(diào)控元件，優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(OTP)，aroA基因，和nos終止子。將親本質(zhì)粒pRPA-RD-53通過(guò)三親本雜交轉(zhuǎn)入Agrobacteri-umtumefaciensEHA105菌株(Hoodetal.，(1986)J.Bacteriol，168，1291)，得到的農(nóng)桿菌用于煙草葉圓片的轉(zhuǎn)化。再生的煙草植株，約20cm高，在溫室中用RoundUp劑型的草甘膦噴灑。含pRPA-RD-53的轉(zhuǎn)化植株存活并健壯，表明對(duì)草甘膦的耐受性提高了。SEQIDNo.1玉米α-Tub1啟動(dòng)子順序CTCGAGAAGGACTACGAGGAGGTTGGTGCTGAGTTTGATGAGGGTGAGGAAGGTGATGAT60GGTGATGAGTACTAGAAGTATCCTGATGCGGTCATCGTCAGGCTTGTGTGCTGCTCTTGT120CCCCGTTGTGGTTTGCAACACCTGATGTTGTAAGACTTTCTCGTTATGTCCGCCCCGCTG180TGCCACTGGGTTATTAAGAACGTCGTTATGGATGGTTGTCTACACTACATTATTGCTTCT240CGATATTGGAAAACTGTTATGCGCCTCGGTGGATTGTGTTGTTGTCGTAATGTCATCACT300CATACGCCGCTGGGAATTTTGAGGCCTGTCAAGCATCAGGATTGCGTTATGAGTTAAATG360CTTCAGCGACGTTTAAACTTGTCTAAGGTGCCATCTAGATCATGAACTTGTCAAGGGTTG420CCACTTAGATCATGAACTTCGTAAATATGTTTTTGGATCCAAAATATGTTTTTTATCCTT480AAGGGTGTGTTTGTGTGTTTGGTTGAATGTATAAGAAGGGATGAAAGAGGAATGTCATAA540TTTCTATAGTGTTTGGTTGAGAGACAAGTGAGGACGAGATAAATACCTAAGAAGGGATGA600AAGAGGAATGCCACAATTTCTATAGTGTTTGGTTCAGAGACAAGTGACAATTTCTATAGT660GTTTGGTTGAGAGACAAGTGAGGGCGAGTAAATACCGCAATAATTTTTTGGTGGCACCAA720ATTTTTGTGAAGTTGTATACATTTTGGACACCAATAGAAAATAGAATTAAAAAAATATAA780AACTGGTGTCATTTAAATCAGTGTCACGTTATTAAAATTTAAAACTATCAACTAAAATTG840TCTAATGGATTATTTATGTGGTTTTGTAAAGTTGTGGAGATTAAACAACCAGTTTTGAAG900ATAAGTAAGTGAAATAGTCAAATAGACCGTACTAAAGGTTAAGAATTTAGGTACACTTAC960GACTAGTTTAGATGCCGCAAAATGGGTTAAATTTTTCTTCTTATTCAAAATTAAATAATA1020AGGTGAATTTAACTACTCTAATTTCCTCTGTTTTTTTAACTCCCAAACTATCCCTTATTC1080GTAATAATAGGAAGCGGTGACAGTTTGGTGGTGAGAACTCAGGTATCAACAAAAAGAAAT1140GTATTTTTGAAATATTTTGCTCGTAATGCCCTGCAAGGTTTCGATTTCCGTAGCCAGTAC1200ATGTCCGCTCTTGACCCAGGTACTGTGACACGAACCAACCGACCGTTGAACGGACGTGGA1260GCACGAACCATTAAAACAATCAAAATCTCAGGGGCTCAAACGAAAAAACACCGCCCCCTT1320CCCTCGCTTGCGCTGGCACTCCATCGTGGGCTCGTGGCCCAGGCTGTCGTTCTGTTCTAT1380AAAGCGAGACGAGTGGGAGCAGGCGTAACCCTAATTGAGCATCGCAGAGATAGGCGTCTT1440CGTACTCGCCTACCTCCGCGGCTCAAACCTTTCCCCCTTCTCCCAATTCCTTCCGCCGGC1500CGCCGCTCCACCCGTACGACGACACCATG1529SEQIDNo.2玉米α-Tub2啟動(dòng)子順序GAATTCCCTTTGTGAGAAATCTCCACAAGTTGGAGCCTCTCACCCTTACAAGATTGATCA60CAATTAAACCACAAGAGTAAGGGAGGGAACAGAAACACACACAAGTGCTAGAGTCGCAGC120AATGACATGCACACAAGTCAAGAAACGAGCACACAACACAGCGCAACGAGGTCACAGTTC180AAACAAGTGCTCAAATCTTAAACACAATGAATCGAATGCGTGCTTGCGGAGTCTAGACGT240TTTTTCAATGGAGGCTTGGTGTACTGCTCCATGTGTCTAGGGGTCCCTTTTATAGCCCCA300AGGCAGCTAGGAGCCGTTGGAGCTCCATTTGGAAGGCCATTGTTGCCTTCTATCCGTGGG360TGCACCGGACAGTACGCGCTCGGGACGCGGCACATAATCCCATGATTGGCCGGTTTCCGC420TTCTGGGGGCACCAGACGGTCCAGACGACCAGTGCGCCTGTCGACCGTTGGCCAGCGCTG480ACGTGGCCACTAGTCGTTGCGTGGCTGATACAACAGACTGTTCGGCGCATTGCGGACCAT540CCGGTGAATTATAGCTGATGTAGGCTAAAAAACCCGAGAGCAGCGAGTTCGGCCGAACCG600TGCACCAGACTGTATGGTGGGTGGCATCAGACCGTTCGGTGCTACACAGTCTAGCAACTT660TTCCCTGTTTCTTCTTTTGTCTTCTTTGTTTCTTTTGGACTTCACTTAGCTGGGTCCCCT720GGCACTTAGACAAATATGATTAACACTCAAATCAATTGACTTAGTGTCTAGAGCATACCT780TTTAGCTTGATCCATATAGCTTTGTACTAAGTCCTCTTCCGAGCTCATTTTGCCTCACAC840TTTTGCTTAACATCATGTTAGTTCAAACATCATGTGTTGTGCATCTAATCACCAAACCAA900TATAGAAATGCCCAAGGACACATTTCCCTTTCAGTCGGGGGGAGGGGGGTTGGTGGTCGA960CGCCCCGGTACGAAGTGGGTGGGGGCAGGCGAGAGGGGGTGCACCATGGGCCACCCAGTG1020CGTGGTCCGGTTTTGATCCATGTAACTCTATATAAATCTCTATTTAATTCGGTATAAAAT1080AGTTAAGATGAAAGAGAGAATAAAATTTAGTAGATTTGACAGTCATATAAAATTTCTAGA1140TCGACCCCTGTGGTGGGTGCGTCGAAATTTCTAGACCGCCCTAGGCCGGGGATGACACAT1200GGAACCGTGTATGCACAAAGCTGCTGCATTATAATTGTAGAGATTAATTATGTTATTTAG1260GAAATAAAAGTTTAGGAATAGTATATAAAACAAGGATTGAGCTCCAGATATATAATAGGC1320CGAGTCCTGTAATTTTGTGACATTTTTTTGAAACCAGGATTGAGCTGCAGTTTTTAGTGT1380TAGAGTCCAGCGTCTCACAGGAGTGGTCCAATTCAAATTCGAAAATGTATCACCGCTGAA1440GCGAAAAATATCATAAATTCATAACGAACCAACCGACCGTTGCACGGACGAGAACTCGAC1500GAGACCGAACCGTGAAAACAACCGAAAGCACAGGGGCTCAAACGAAACAATCCCGCCCAC1560ACTTCCTTCGCCGGCTCATGGTGGCCACTGGCCAGGCTGTCATCCTGTTCTATAAAGCGA1620GCCGAGGGGAAGAGCCGGAACCCTAGCCCAGCACCGCAGAGGCGCAGAGACAGGCGTCTT1680CGTACTCGCCTATCTCCGCGACTCAAAGCTTCTTCCATTTCCTACCGCCGCCGCTGCAGC1740TCCACCCCATTCCGTCGACACCATG1765SEQIDNo.3玉米α-Tub3啟動(dòng)子順序AGATCTTGATTCTGTGCAGTGCTGGTGATGGGAAAAAGCGAAAAACCATCGGTATGTTTT60TGACAAATATGAAAATGGGACAAAAACAACATGTGTGTTTTTTCGACCGTTTCCGCTTTT120CTTGTTTTAGTCACAATAGCTCGTTTTTATCCACATATGATATCTCATTTTAGATAATAC180ATGAACAAATCATAATTGATTATATCATATCTCAACAAATTAACCCGTAATGAATTATTT240TTCTTTGATAGTCATATGTACATTACAATATTTCGCTTCCATATGTATGGATGTGATGTT300TTAATCGATTGCAACACTACTTTTATTTTTATACTCTATGTGACAATTATTTCCGCTTTT360ATTTACATCTTATTCCGATCTGTTATCGATATCGATTTGTTCCGTCCCGTTTTTATCTTA420TTTCTGATAGTTCCAATTTAATCTTATTTTCGAAATAAAGTATGAAAATAAAAATAAGAG480AGATTGTTACGTTCGATCCGGTTTTGAACCCTAGCTATACTTGCCCGTTGTTGCAACTGG540CCGGCCATTCCATAGGCGGGCACAGTCAGCACTCAGCAGTGACAGAGTGCGCGTGCGACA600CACAGTTTCAAATTTCAAAACTGAAACGGGCGGCTATAAACAGAACCCGCTGCTCCCAGG660AGCCTCACGCAGATAAATTCACCCACATCAATGCGGCCCAAATATTTATAACCATCTATT720GGTCCCACATGTTCGTGTCACAACATCCTCTACCGCAGGTAAAGATAGCCGTCTCGCCAA780GACCCCGAGCCCGCCGCTGCCCGGACCCGCCGCCAGCTCACACCCACCGTTGCCGGCCGC840TGAGCCGTTCGAAGCCAAAACGGTCGTTAACCACCCAGCTGCCCGTCGGCTACCATCACG900CCGTTAGCCCCGAACCAGACGGCGGCTAGGTCTTCCGCCGCGCGCCGCGCCATCACGGGC960CGGCCGCGGCCTTCTTTCCCACGCTGCCTATAAAAGCCGCCGCGGGGCTGAGCAGCATTA1020TCGCTTCAGCTCGGCGTCTTCACAAACGCCGGCGCAAACTCTCGCCCGAGCCCGACAGAT1080CTTCAATTCCCCATTCCGCCCACCGATCGACCTTCACGCCAGTCTCGGTCTCTTCCGAAG1140GCGTCGCGCGCGGTTGTTTGAGAGGGGAGGAGGAAGATG1179SEQIDNo.4修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)肽GAATTCCGAAAGACAAAGATTATCGCCATGGCTTCGATCTCCTCCTCAGTCGCGACCGTT60AGCCGGACCGCCCCTGCTCAGGCCAACATGGTGGCTCCGTTCACCGGCCTTAAGTCCAAC120GCCGCCTTCCCCACCACCAAGAAGGCTAACGACTTCTCCACCCTTCCCAGCAACGGTGGT180GGAAGAGTTCAATGTATGCAGGTGTGGCCGGCCTACGGCAACAAGAAGTTCGAGACGCTG240TCGTACCTGCCGCCGCTGTCAATGGCGCCCACCGTGATGATGGCCTCGTCGGCCACCGCC300GTCGCTCCGTTCCAGGGGCTCAAGTCCACCGCCAGCCTCCCCGTCGCCCGCCGCTCCTCC360AGAAGCCTCGGCAACGTCAGCAACGGCGGAAGGATCCGGTGCATG405為方便起見(jiàn)，將文中提及的參考文獻(xiàn)列于下面。參考文獻(xiàn)Amstrong，C，L.，Petersen，W.L.，Buchholz，W.G.andBowen，B.A.(1990)FactorsaffcctingPEG—mediatedstabletransformationofmaizeproloplasts.PlantCellReports，9，335-339.Bedinger，P.andEdgerton，M.D.(1990)Developmentalstagingofmaizemicrosporesrevealsatransitionindevclopingmi-crosporeproteins.PlanPhysiol.92，474-479.Carpenter，J.L.，Ploense，S.E.，Snustad，D.P.andSilliow，C.D.(1992)PreferentialExpressionofanα-TubulinGeneofAra-bidopsisinPollen.PlantCell，4，557-571.Chu，C.，Wang，C.，Sun，C.，HsuC.，Yin，K.andChu，C.(1975)Establishmentofandefficientmediumforanothercultureofricethroughcomparativeexperimerntsofthenitrogensources.ScientiaSinica，18，659-668.Feldman，L.J.(1984)Regulationofrootdevelopment.Ann.Rev.PlantPhysiol，35，223-242Gorman，C.M.，Moffat，L.F.andHoward，B.H.(1982)Mol.Cell.Biol.2，1044-1051.Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.andBevan，M.W.(1987a)GUSfusionsβ-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.3901-3907.Jefferson，R.A.(1987b)AssayingChimeticGenesinPlantsTheGUSgenefusionsystem.PlantMOl.Biol.Rep.5，387-405.Kopczak，S.D.，Haas，N.A.，Hussey，P.J.，SiofloW，C.D.andSnustad，D.P.(1992)TheSmallgenomeofArabidopsisContainsatLeastSixExpressedα-TubulinGcnes.PlantCell.4，539-547.Kosugl，S.，Ohashi，Y.，Nakajima，K.andAral，Y.(1990)Animprovedassayforβ-glucuronidaseintransformedcellsMethanolalmostcompletelysuppressesaputativecndoge-nousβ-glucuronidaseactivity.PlantSci.70，133-140.Mandaron，P.，Niogret，M.F.Mache，RandMoneger，F(xiàn).(1990)InvitroproteinsynthesisinisolatedmicrosporesofZeamaysatseveralstagesofdevelopment，Theor.Appl.Genet.80，134-138.Mc.Cormick，S.，(1991)Molecularanalysisofmalegameto-genesisinplants.TrendsGenet.7，289-303.Montoliu，L.，Puigdomenech，P.andRigau，J.(1990)TheTubα3genefromZ.maysstructureandexpressionindividingplanttissues.Gene，94，201—207.Montoliu，L.，Rigau，J.andPuigdomenech，P.(1989)Atandemofα-tubulingenespreferentiallyexpressedinradiculartis-suesofZ.mays.PlantMol.Biol.14，1-15.Montliu，L.，Rigau，J.andPuigdomenech，P.(1992)Analy-sisbyPCRofthenumberofhomologousgenomicsequencestoα-tubulininmaiza.PlantSci.84，179-185.Murashigue，T.andSkoog.F.(1962).ArevisedMediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant，15，473-497.Paszkowski，J.andSaul，M.W.(1986)Directgenetransfertoplants.InMethodsinEnzymology.Vol.118.PlantMolecularBiology.AcademicPressInc.PP.669-684.Snustad，D.P.，Haas，N.A.，Kopczak，S.D.andSilflow，C.D.(1992)TheSmallgenomeofArabidopsisContainsatNineExpressedβ-TubulinGenes，PlantCell，4，549-566.Stinson，J.R.，Eisenberg，A.R.，Willin，R.P.，Pe，M.E.，Hanson，D.D.andMascarenhas，J.P.(1987)Genescxpressedinthemalegametophyteoffloweringplantsandtheirisolation.PlantPhysiol.83，442-447.Villemur，R.，Joyce，C.M.，Haas，N.A.，Godbard，R.H.，Kopcak，S.D.，Hussey，P.J.，Snustad，D.P.andSilflow，C.D.(1992)alpha-TubulinGeneFamilyofMaize(Zea-MaysL).Evi-dencefor2Ancieatalpha-tubulinGenesinPlants.J.Mol.Biol.227，81-96.權(quán)利要求1.一種來(lái)自α-微管蛋白基因的分離的核酸，其特征在于，含有至少一個(gè)控制至少一種花粉，根，分生組織和未成熟胚胎中的特異性表達(dá)的調(diào)控元件。2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，該基因是玉米α-Tub1基因。3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，該基因是玉米α-Tub2基因。4.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其特征在于，該基因是玉米α-Tub3基因。5.如權(quán)利要求1—4所述的分離的核酸，其特征在于，該調(diào)控元件控制在其控制下的基因的表達(dá)，且能在花粉中檢測(cè)出。6.如權(quán)利要求1—4所述的分離的核酸，其特征在于，該調(diào)控元件控制在其控制下的基因的表達(dá)，且能在根中檢測(cè)出。7.如權(quán)利要求1—4所述的分離的核酸，其特征在于，該調(diào)控元件控制在其控制下的基因的表達(dá)，且能在分生組織中檢測(cè)出。8.如權(quán)利要求1—4所述的分離的核酸，其特征在于，該調(diào)控元件控制在其控制下的基因的表達(dá)，且能在未成熟胚胎中檢測(cè)出。9.如權(quán)利要求5所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo1中的核苷酸1—1348。10.如權(quán)利要求9所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo1中的核苷酸1295—1348。11.如權(quán)利要求6所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo.1中核苷酸1—1529。12.如權(quán)利要求11所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo.1的核苷酸1—1115。13.如權(quán)利要求7和8所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo.3中核苷酸1—695。14.如權(quán)利要求13所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo.3中核苷酸542—695。15.如權(quán)利要求7和8所述的核酸，其特征在于，調(diào)控元件含SEQIDNo.3中核苷酸1—1076。16.一種植物嵌合基因，其特征在于，含有權(quán)利要求1—15中任一權(quán)利要求所述的啟動(dòng)子DNA的充分的部分，該部分啟動(dòng)子DNA能在植物中起作用并在功能上連于編碼順序從而能使異源基因表達(dá)。17.如權(quán)利要求16所述的植物嵌合基因，其特征在于，在啟動(dòng)子和編碼順序之間，含有此基因的另一個(gè)調(diào)控元件。18.如權(quán)利要求17所述的植物嵌合基因，其特征在于，基因調(diào)控元件是能在植物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。19.如權(quán)利要求18所述的植物嵌合基因，其特征在于，另外的調(diào)控元件是花椰菜花葉病毒的35SCaMV啟動(dòng)子。20.如權(quán)利要求18所述的植物嵌合基因，其特征在于，另外的調(diào)控元件是植物組蛋白啟動(dòng)子。21.如權(quán)利要求18所述的植物嵌合基因，其特征在于，另外的調(diào)控元件是水稻肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子。22.如權(quán)利要求16—21所述的植物嵌合基因，其特征在于，它含有選自下列中的一種異源基因編碼脂質(zhì)代謝的酶、去飽和酶的基因、抗除草劑基因，或編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，乙酰乳酸酶和4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPO)的基因。23.如權(quán)利要求22所述的植物嵌合基因，其特征在于，并源基因是抗草甘膦的aroA基因。24.一種植物轉(zhuǎn)化載體，其特征在于，含有如權(quán)利要求16—23所述的植物嵌合基因。25.含有如權(quán)利要求24所述的載體的植物細(xì)胞。26.植物或植物后代，其特征在于，它是由如權(quán)利要求25所述的細(xì)胞再生而得的。27.如權(quán)利要求26所述的植株，其特征在于，它是單子葉植物。28.如權(quán)利要求27所述的植物，其特征在于，它是玉米或谷類(lèi)作物。29.如權(quán)利要求26所述的植物，其特征在于，這是雙子葉植物。30.如權(quán)利要求29所述的植物，其特征在于，它是煙草，棉花或大豆。31.一種產(chǎn)生具有改良的農(nóng)學(xué)性狀的方法，其特征在于，它依次包括a)用權(quán)利要求24所述的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，b)再生植株。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)自玉米α-微管蛋白的嵌合基因的植物啟動(dòng)子，并將其用于植物的基因轉(zhuǎn)化。文檔編號(hào)C12N15/82GK1121958SQ9411805公開(kāi)日1996年5月8日申請(qǐng)日期1994年11月10日優(yōu)先權(quán)日1993年11月10日發(fā)明者M(jìn)·卡佩拉德斯,R·德羅斯,L·蒙托里,P·普伊斯門(mén)尼奇,J·里戈,M·A·托里斯,J·烏里韋申請(qǐng)人:羅納-普朗克農(nóng)業(yè)化學(xué)公司