專利名稱：抗微生物制劑及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一篩選抗微生物制劑的方法、由此方法確認的抗微生物制劑以及一種抑制微生物生長的方法。
更具體地，本發(fā)明的方法涉及利用一公認的核糖核酸(RNA)解旋酶來篩選抗微生物制劑。
無論在原核還是真核生物中，核糖核酸(RNA)都是細胞存活所需的基本分子。最熟知的RNA是信使RNA(mRNA)，它是蛋白質(zhì)生成所必需的，正是通過它細胞核中的基因組所編碼的遺傳信息才得以轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中以翻譯成蛋白質(zhì)。然而，其它類型的RNA也是蛋白質(zhì)生所必需的，如轉(zhuǎn)運RNA(tRAN)和核糖體RNA(rRNA)。核糖體是蛋白質(zhì)事實上生成的場所，通過特異tRNA(攜帶一特異氨基酸)與mRNA上相應(yīng)的密碼子(堿基三聯(lián)體)相連接而實現(xiàn)。已知核糖體是復(fù)雜的分子，包括rRNA和幾個多肽。此rRNA為核糖體的功能所必需，并在不同的生物體間高度保守，雖然原核生物和真核生物的rRNA間存在明顯差異。
在許多RNA分子中，其功能不僅依賴于核酸堿基的實際序列(初級結(jié)構(gòu))，還依賴于此分子折疊形成精確的三維構(gòu)型(二級結(jié)構(gòu))的方式。
RNA二級結(jié)構(gòu)的控制是細胞中許多關(guān)鍵過程的一個基本步驟，這些關(guān)鍵過程包括RNA拼接，核糖體組裝和將RNA翻譯成蛋白質(zhì)。因此，影響RNA二級結(jié)構(gòu)的RNA解旋酶是細胞存活所必需的。
一大族具有已知或公認的依賴ATP的RNA解旋酶活性的蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)引起了人們對RNA二級結(jié)構(gòu)的極大興趣(Linder等，1989；Schmid和Linder，1992；Fuller-Pace& Lane，1992).此家族的成員構(gòu)成了另一更大的蛋白質(zhì)超級家族的一部分，此超級家族的蛋白質(zhì)可與多聚核苷酸和核苷酸三磷酸相互作用，并共有七個高度保守的區(qū)段。在幾個事例中，這些蛋白包含一個特征性的Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)區(qū)段，并由此被命名為“DEAD盒”蛋白(Linder，1989)。而隨著越來越多的蛋白質(zhì)被歸于此家族中(通過序列上的同源性和在一些情形中生化功能上的相似性)，人們已清楚地看到它至少包含兩個亞群DEAD亞群和DEXH亞群(Fuller-Pace，1992)。
DEAD盒家族的個別成員在整個進化過程中一直高度保守(Linder等，1989；Iggo等，1991)。DbpA基因是通過用一來自非洲粟釀酒酵母的p68基因的對應(yīng)物做探針雜交而得，P68蛋白是典型的DEAD盒蛋白之一(Iggo等，1990)。然而對預(yù)測的氨基酸序列的分析表明，雖然DbpA蛋白含有DEAD盒蛋白家族的特征性保守區(qū)段，但事實上它與P68的關(guān)系并不比與本家族其它成員的關(guān)系更近。在大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)了五個類似的基因(Kalman等，1991)，其中的二個srmB(Nishi等，1988)和deaD(Toone等，1991)被認為涉及到了核糖體的生物發(fā)生。第三個，rhlB，看起來在一些遺傳背景中是一個必需的基因(Kalman等，1991)，但互補實驗表明，rhlB與srmB基因間沒有功能上的互補，這表明這些基因有不同功能。然而對rhlB或另外兩個到目前為止在大腸桿菌中被確認的基因rhlE(Kalman等，1991)和dbpA(Iggo等，1990)的生物學(xué)功用還所知甚少。
到目前為止，關(guān)于大腸桿菌DEAD盒蛋白的唯一已報道的生化研究是關(guān)于SrmB蛋白的，該蛋白在核酸存在下可水解ATP，但對核酸并無特異性的要求。此ATP酶活性可被Poly(U)，Poly(A)，tRNA，rRNA所誘導(dǎo)，單鏈和雙鏈的DNA只能誘導(dǎo)到一個較低的程度(Nishi等，1988)。到目前為止，生化上檢測過的其它DEAD盒蛋白，包括該家族的典型成員真核生物轉(zhuǎn)譯起始因子eIF-4A(Grifo等，1984)，也顯示了對RNA的類似要求，即體外ATP酶活性測驗中對任何特殊的RNA都無特異性。
RNA解旋酶高度保守的特性證實了其功能的重要性，因此它們?yōu)榭刮⑸镏委熤苿┑淖饔锰峁┝艘粋€有吸引力的靶位點。
然而對這些制劑的確認一直較為困難，雖然使感染病人的微生物的某一特殊的RNA解旋酶失活的治療藥物在理論上是可能的，但畢竟存在一種同時使病人的RNA解旋酶失活并由此導(dǎo)致依賴RNA解旋酶的生命過程停止的危險。
成為本發(fā)明基礎(chǔ)的驚人發(fā)現(xiàn)是雖然純化的DbpA有DEAD盒蛋白的依賴RNA的ATP酶活性特征，但與其它的DEAD盒蛋白不同，DbpA的活性僅依賴于單一的特殊RNA，即原核生物的核糖體23SrRNA。剛開始時用于這些觀察的23S rRNA來源于大腸桿菌。真核生物的核糖體RNA存在下DbpA沒有活性。
影響RNA的酶(如DbpA)在通過將rRNA的二級結(jié)構(gòu)處理成核糖體活性所需要的構(gòu)型，以產(chǎn)生一個有功能的核糖體中是必需的?，F(xiàn)在看來DbpA很可能是選擇性地作用于原核生物的高度保守的23S rRNA。對DbpA的抑制將阻礙原核生物核糖體的功能，而由于真核生物的rRNA不會受到影響，從而可能提供選擇性地抗微生物的活性。
DbpA的ATP酶活性絕對需要原核生物23SrRNA這一發(fā)現(xiàn)意味著使一個正在感染宿主的微生物的DbpA失活不會影響宿主細胞的進程，因為DbpA不影響宿主細胞的RNA。因此本發(fā)明的完成就依賴于在檢測抗微生物物質(zhì)的方法中DbpA的底物特異性。
在其正常功能中，DbpA在表現(xiàn)出可觀察到的影響RNA結(jié)構(gòu)的活性前，要求核苷磷酸(一般是ATP)的存在。在DbpA表現(xiàn)活性的過程中，核苷磷酸被降解。例如當(dāng)核苷磷酸是ATP時，它被轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP和磷酸。降解的量提供了測量DbpA活性的有用方法。因此DbpA和其它類似的RNA解旋酶可被視為核苷酸磷酸酶或特殊的ATP酶。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于確定一種物質(zhì)抗微生物活性的方法，所述的方法包括(i)將一微生物所必需的核苷酸磷酸酶，被測物質(zhì)和一核苷磷酸混合；
(ii)估價被所述的磷酸酶所影響的核苷磷酸的量，從而估價所述的物質(zhì)對所述的磷酸酶的作用效果。
此處術(shù)語“核苷”指僅含一個堿基和一個糖基的分子。術(shù)語“核苷磷酸”指一個核苷通過化學(xué)鍵聯(lián)結(jié)一個或多個磷酸基團，從而“核苷磷酸”包括核苷單磷酸(僅有一個磷酸基團)，核苷二磷酸(有二個磷酸基團)和核苷三磷酸(有三個磷酸基團)。術(shù)語“核苷酸”在現(xiàn)有技術(shù)中是與“核苷磷酸”等效的術(shù)語，在此用于指如上所述含有一個，二個或三個磷酸基團的核苷分子。
術(shù)語“核苷酸磷酸酶”指一種能使核苷酸(核苷磷酸)分子部分或全部脫去磷酸的酶。例如，核苷三磷酸能夠被核苷酸磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑斩姿?，并伴隨產(chǎn)生一磷酸組分，也可被轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑諉瘟姿?，同時伴有一焦磷酸組分的產(chǎn)生。同樣，核苷二磷酸可被轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑諉瘟姿峄蚝塑?。在一定的條件下，一種酶可以朝相反的方向起作用，因此，核苷酸磷酸酶能夠催化核苷到核苷磷酸的轉(zhuǎn)變，或在核苷磷酸底物上增加另外一個磷酸組分。“核苷酸磷酸酶”另一可選擇的命名為“核苷磷酸磷酸酶”。
微生物所需要的磷酸酶優(yōu)選是一種ATP酶如RNA解旋酶，譬如核糖體RNA(rRNA)解旋酶。本文提到了此種磷酸酶的幾個例子，盡管DbpA仍是優(yōu)選的。
上述方法中所要求的核苷磷酸可為能被磷酸酶分解的任何一種物質(zhì)。適用于上述方法的核苷磷酸的例子包括ATP，脫氧ATP(dATP)，ADP，GTP，GDP，AMP，CTP，TTP等或其類似物。通常使用的是ATP。
任選地也提供了一種激活核苷酸磷酸酶活性的制劑，在測定過程的步驟(i)中加入到核苷酸磷酸酶、被測物質(zhì)和核苷磷酸中。
核苷酸磷酸酶的活性可依賴于RNA，在這種情況下，一種合適的激活制劑是RNA。優(yōu)選地，核苷酸磷酸酶的活性專一依賴于微生物的RNA，最優(yōu)選是僅僅依賴于一種存在于一些微生物中的可明顯區(qū)分的RNA，如核糖體RNA或其一特殊片斷或序列。
RNA可來源于微生物或人類，但優(yōu)選能激活核苷酸磷酸酶對核苷磷酸的降解。
最優(yōu)選地，為了RNA能夠?qū)Ｒ坏丶せ詈塑账崃姿崦杆夂塑樟姿岫x擇核苷酸磷酸酶和RNA。
一方面，本發(fā)明提供了一種確定一種物質(zhì)的抗微生物活性的方法，該方法包括(i)將所述的物質(zhì)與影響原核生物rRNA二級結(jié)構(gòu)的酶和該酶的必需底物相混合；(ii)估價所述的物質(zhì)對所述的酶活性的作用。
上述所指的酶最好是DbpA，其必需底物為原核生物23SRNA，或其片段或其功能類似物，和一核苷磷酸，如ATP或其功能類似物。
因此，本發(fā)明提供了一種確定一種物質(zhì)抗微生物活性的方法，所述的方法包括(i)將所述的物質(zhì)與DbpA，原核生物23SrRNA或其一片段，或其功能類似物以及ATP或其功能類似物混合；(ii)估價所述的物質(zhì)對DbpA活性的作用。
此方法也可便利地在體外完成。
優(yōu)選以純化的形式提供核苷酸磷酸酶，例如大致純化的形式。
被測物質(zhì)對酶(或核苷酸磷酸酶)的作用優(yōu)選通過測量反應(yīng)混合物中磷酸的量而定量。通常核苷磷酸被降解釋放磷酸，被釋放的磷酸的量可被測定。作為一種替代的方法，也可將磷酸加到核苷或核苷磷酸上，從而可測定所吸收的磷酸(或形成的核苷酸磷)的量。被測物質(zhì)存在時所釋放的磷酸的量的變化優(yōu)選與該物質(zhì)不存在時所釋放的磷酸的量相比較，二者之比可以表明被測物質(zhì)影響核苷酸磷酸酶活性的程度。
核苷磷酸可包括一個標(biāo)記如放射性的、發(fā)光的、發(fā)熒光的或發(fā)色的標(biāo)記，該標(biāo)記最好位于核苷磷酸的γ磷酸部分。
進一步根據(jù)本發(fā)明，提供了一種抗微生物制劑，該制劑可降低微生物必需的核苷酸磷酸酶的活性。
優(yōu)選地，當(dāng)微生物為原核生物，如大腸桿菌時，核苷酸磷酸酶為DbpA，盡管其他細菌和病毒及相應(yīng)的酶也可成為目標(biāo)。
制劑優(yōu)選為抗生素，盡管本發(fā)明也包括用作治療制劑的抗體。
抗微生物制劑可為任何可以結(jié)合于核苷酸磷酸酶和/或降低核苷酸磷酸酶活性的制劑。例如，抗微生物制可包括一ATP類似物，它不能被核苷酸磷酸酶水解。
其他抗微生物制劑的例子包括核苷酸磷酸酶(如RNA解旋酶)的天然底物的類似物或針對該酶的至少一部分有特異性的抗體。
其他抗微生物制劑包括核苷磷酸的不可水解類似物或能結(jié)合到核苷酸磷酸酶或能降低核苷酸磷酸酶活性的蛋白質(zhì)。這些抗微生物制劑的作用機制通常是通過結(jié)合到核苷酸磷酸酶上的核苷磷酸結(jié)合位點上，從而通過對核苷磷酸結(jié)合的防止或競爭來實現(xiàn)。被考慮的具體的抗微生物制劑為5’-p-氟磺酰苯甲酰腺苷，腺苷5’-〔B，γ-亞氨〕三磷酸，腺苷5’-〔γ-硫代〕三磷酸或腺苷5’〔B，γ-亞甲基〕三磷酸。
RNA解旋酶的天然底物包括核苷酸多聚物(如RNA)和核苷磷酸(如ATP)。這些底物的類似物眾所周知并且容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。
尤其有用的抗微生物劑包括仍能結(jié)合到RNA解旋酶上的微生物23SrRNA的非功能類似物。
本發(fā)明還提供了利用任何上述抗微生物制劑抑制微生物生長的方法。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一種抑制微生物生長的方法，所述方法包括運用一種物質(zhì)，該物質(zhì)可抑制微生物必需的核苷酸磷酸酶，如微生物所需的RNA解旋酶，優(yōu)選是一種特異地作用于原核生物rRNA的RNA解旋酶，如DbpA。
在導(dǎo)致本發(fā)明的實驗工作中，發(fā)現(xiàn)可以運用一個較以前被Iggo等人公認的更上游的起始位點表達DbpA一個額外的N末端部分。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該DbpA額外的N末端部分是維持活性所必需的，并且發(fā)現(xiàn)通過使用上游起始位點會增加DbpA的表達。在DbpA額外的N-末端部分存在的情況下，從相應(yīng)遺傳物質(zhì)的翻譯在位于曾被確認為DbpA起始位點的ATG的上游的GTG起始位點起始。
據(jù)此，本發(fā)明提供了編碼DbpA或其部分或其有功能的衍生物的重組遺傳物質(zhì)，該遺傳物質(zhì)至少包括自然發(fā)生的DbpA基因或其功能等價物的第一個ATG位點上游的天然序列的一部分，其中，有一個ATG密碼子存在于該上游序列。
優(yōu)選地，從ATG起始位點上游直到并包括GTG起始位點的所有天然上游序列(或其功能等價物或衍生物)或其功能等價物都包括進去。將DNA中天然存在的GTG起始位點轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€ATG密碼子也是值得一做的?？梢酝ㄟ^同源重組將一個ATG密碼子摻入到上游序列中，例如通過化學(xué)合成寡核苷酸或應(yīng)用其他的已知技術(shù)。也可通過例如定點突變改變或取代一個已存在的密碼子或核苷酸。將一個化學(xué)合成的上游序列接到dbPA基因或其一部分或其功能等價物上也是可行的。DNA中ATG的轉(zhuǎn)錄降在RNA中產(chǎn)生AUG，AUG將被轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)的氨基酸(如蛋氨酸)。同樣DNA中的GTG轉(zhuǎn)錄成RNA中的GUG并將相應(yīng)轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)中。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上游序列的存在會在被表達的DbpA蛋白中造成活性的提高，原先并未了解到上游序列的存在會有此效果。據(jù)信dbpA基因的體內(nèi)表達發(fā)生于上游序列的GTG密碼子，此GTG密碼子突變成ATG密碼子會增強有較高活性的(即含有上游序列的)DbpA變體的翻譯。
以前Iggo等所用的編碼序列已示出并存入EMBL資料庫，編號為X52647。Iggo等的dbpA序列包括一個距Iggo確認的ATG起始密碼子上游75到73個堿基的GTG密碼子。此GTG密碼子被發(fā)明人轉(zhuǎn)變?yōu)锳TG，由此所得的序列被稱為SEQ.ID.NO2并在本文中列出來。其中的經(jīng)改變而產(chǎn)生的ATG被命名為ATG1。
SEQ.ID.NO1顯示了從修飾的轉(zhuǎn)譯起始密碼子ATG1到位于第1372-1374堿基的TAA終止密碼子的編碼DbpA蛋白的DNA序列。
SEQ.ID.NO2的序列(包括SEQ.ID.NO1及其外圍序列)在1994年3月22日作為一個大腸桿菌DH5α所含的一個質(zhì)粒的一部分被保藏在國家典型培養(yǎng)物保藏中心(NCTC)地址為Central Public Health Laboratory，61 Colindale Avenue，London，NW9 5HT，編號為NCTC 12867。
在此所用術(shù)語“遺傳物質(zhì)”包括單鏈或雙鏈形式的RNA或DNA及其功能性等價物。此遺傳物質(zhì)可用任何適當(dāng)?shù)氖侄萎a(chǎn)生，包括化學(xué)合成?！肮δ苄缘葍r物”指任何編碼有所要求的活性的多肽的遺傳物質(zhì)。
任選地，此遺傳物質(zhì)作為克隆或表達載體的一部分被包括。根據(jù)本發(fā)明，含此遺傳物質(zhì)的重組載體形成了本發(fā)明的另外一個方面。這些載體可包括選擇標(biāo)記，復(fù)制起始區(qū)或增強或控制表達的部分，如啟動子和/或增強子。
本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生重組載體的方法，所述的方法包括將根據(jù)本發(fā)明的遺傳物質(zhì)連接到一個合適的載體序列上。
本發(fā)明還提供了一種含有上述遺傳物質(zhì)(任選地可以作為重組載體的一部分存在)的被轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生一種被轉(zhuǎn)染的宿主細胞的方法，該方法包括用一個根據(jù)本發(fā)明的載體去轉(zhuǎn)染一種細胞。
本發(fā)明也提供了一種生產(chǎn)DbpA的方法，所述的方法包括從本發(fā)明的遺傳物質(zhì)表達DbpA。優(yōu)選地，此遺傳物質(zhì)存在于載體中，和/或存在于被轉(zhuǎn)染的宿主細胞中。
一些修改或改進可以加進去而不會背離本發(fā)明的范圍，以下通過附圖和實施例描述本發(fā)明的一個實施方案。


圖1顯示了序列已知的大腸桿菌DEAD盒蛋白氨基末端的氨基酸序列的比較(Kalman等，1991)。eIF-4A相應(yīng)區(qū)域也列于圖中。圖中標(biāo)出了保守的氨基酸和保守的取代物(*).DbpA的第一個氨基酸(由GTG編碼)被列為纈氨酸(圖中)，但也可以為蛋氨酸。因為tRNAf met會識別GUG并將之譯成蛋氨酸(見結(jié)果)。
圖2展示了一個顯示DbpA在bluescript和pT7·7質(zhì)粒上表達情況的Western雜交。所用質(zhì)粒及其起始位點和每種情況下的密碼子已列于圖中，并說明如下1以GTG為翻譯起始密碼子編碼全長DbpA的bluescript質(zhì)粒；2以ATG取代GTG起始密碼子的編碼全長DbpA的bluescript質(zhì)粒；3基因的5’端已作缺失，從而使內(nèi)部的ATG作為翻譯起始密碼子的pT7·7質(zhì)粒；4GTG起始位點被突變?yōu)锳TG，以利于在T7系統(tǒng)中翻譯起始的編碼全長DbpA的pT7·7質(zhì)粒。在pT7·7質(zhì)粒的情形中，IpTG被加入以誘導(dǎo)蛋白表達。DbpA是用DbpA特異性的抗多肽抗體來檢測的(見下述“材料和方法”部分)。
圖3為Coomassie染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠，顯示了被IpTG誘導(dǎo)前(-)和誘導(dǎo)后(+)的細菌裂解物(可溶部分)的蛋白情況。A含有以內(nèi)部的ATG為翻譯起始位點的表達DbpA蛋白的pT7·7質(zhì)粒的細菌(圖2中3)。B含有以在原來的GTG位置上的ATG為起始位點表達DbpA蛋白的pT7·7質(zhì)粒(圖2中4)的細菌。分子量標(biāo)記物(M)的大小以千道爾頓為單位。
圖4為Coomassie染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠，顯示了DbpA的純化方法。Total.sol.表示細菌裂解物中全部的可溶性蛋白。PEI表示聚乙烯亞胺。Sup.12表示FPLCsuperose12柱。DNA cell表示單鏈DNA纖維素柱。分子量標(biāo)記物(M)的大小以千道爾頓為單位。
圖5為聚乙烯亞胺薄層層析板的放射自顯影，顯示了在一個標(biāo)準(zhǔn)ATP水解測驗中，從〔γ-32P〕ATP上釋放的放射性磷酸的分離情況(從左向右遷移)。圖中標(biāo)出了反應(yīng)中DbpA和RNA的存在與否情況；DbpA和大腸桿菌總RNA的用量分別為200ng和800ng。
圖6顯示了在不同的大腸桿菌RNA濃度下，ATP被各種濃度的DbpA的水解。反應(yīng)時間均為一小時，所釋放的磷酸(cpm-Cerenkov)按“材料和方法”中所述進行測量。
圖7顯示了在限制RNA(A)和DbpA(B)的量的條件下，ATP水解的時間過程。A400mg DbpA，100ng RNA；反應(yīng)20分鐘以后又另外加入100ng RNA；B100ngDbpA，800ng RNA；反應(yīng)20分鐘以后又另加入100ng DbpA。所釋放的磷酸(cpm-Cerenkov)按“材料和方法”中所述進行測量。每種情況下的數(shù)據(jù)均為兩次實驗的平均計數(shù)。
圖8為聚乙烯亞胺薄層層析板的放射自顯影，顯示了在各種RNA存在下，在用DbpA水解ATP的測驗中，從〔γ-32P〕ATP釋放的放射性磷酸的分離(從左向右遷移)。每種情況下DbpA和RNA的用量均分別為200ng和800ng。
圖9為聚乙烯gog亞胺薄層層析板的放射自顯影，顯示了在體外合成的大腸桿菌16S和23S核糖體RNA存在下，在用DbpA水解ATP的測驗中，從〔γ-32P〕ATP釋放的放射性磷酸的分離(從左向右遷移)。體外轉(zhuǎn)錄RNA的方法見“材料與方法”部分。在每次測驗中，DbpA和RNA的用量均分別為100ng和400ng。
材料與方法質(zhì)粒和菌株編碼DbpA的bluescript克隆見Iggo等所述(Iggo等，1990)。pT7.7表達載體和BL21(DE3)細胞(Tabor，1985；Studier，1990)由C.A.Middley贈送。編碼大腸桿菌16S和23SrRNA(Brosivs，1981)的pKK3535質(zhì)粒由H.F.Noller和A.Huttenhofer贈送。
DNA和RNA的制備參見Sambrook等(Sambrook，1989)。
DbpA的定點突變用Amersham寡核苷酸指導(dǎo)的突變試劑盒完成。
16S和23S rRNA的亞克隆和RNA的體外合成編碼16S和23S rRNA的DNA片段被分別克隆到體外轉(zhuǎn)錄載體pGEM3和pGM4上，以便這些RNA可被分開合成。RNA是據(jù)Promega公司的指示用T7和sp6多聚酶合成的。
DbpA表達菌的生長和誘導(dǎo)將含有編碼受控于IpTG可誘導(dǎo)的17啟動子(Tabar，1985)的dpPA基因的pT7.7質(zhì)粒的BL21(DE3)細胞的新鮮過夜培養(yǎng)培養(yǎng)物稀釋30倍，在37℃培養(yǎng)到O.D.(650nm)0.3-0.4，用0.5mMIpTG進行誘導(dǎo)。培養(yǎng)物移至26℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后離心收集細胞。用50mM Tris-HUpH7.5洗滌細胞沉淀物，離心，回收，存入-70℃直到用于DbpA純化。
細菌裂解物中蛋白質(zhì)的分離和免疫雜交細菌裂解物中的蛋白(或按下述制備可溶性蛋白的方法制備，或通過直接向細菌沉淀物中加入十二烷基磺酸鈉(SDS)緩沖液制備總蛋白)用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，如Harlow；1988所述。DbpA用針對DbpA C末端的七個氨基酸的抗體和Amersham ECL試劑盒進行測定。
DbpA的純化將細菌沉淀物重懸于冷的含50mMTris-HCl pH7.5，10％蔗糖，1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)，1mM氨基苯，2μg/ml抑肽酶，2μg/ml抑(蛋白)酶醛肽的溶液中(每升細菌培養(yǎng)物加0.5ml)，置于冰-鹽水浴中，氯化鈉和溶菌酶分別加至終濃度100mM和150μg/ml。細胞在冰-鹽水浴中放置30分鐘，然后在37℃保溫1分鐘，再重新放回冰中。重復(fù)此步驟直至細胞裂解，懸浮液用超聲波探頭處理以切碎DNA，然后通過離心沉淀不溶性物質(zhì)。(2700G，15分鐘)?？扇苄缘牟糠种糜诒?，邊攪拌邊緩慢加入聚乙烯亞胺(PEI，Sigma)至終濃度0.2％。10％的PEI貯備液按Gegenheimer(Gegenheimer，1990)所述通過透析50％的商品溶液(Sigma)制得。通過離心(12000G，15分鐘)除去沉淀的核酸，上清液中的蛋白用60％的硫酸銨沉淀，然后27000G，15分鐘離心收集。蛋白沉淀重懸于含50mM Tris-Hcl pH7.5，1mM PMSF，1mM氨基苯，2μg/ml抑肽酶，2μg/ml抑(蛋白)酶醛肽的溶液中(每升細菌培養(yǎng)物加0.5ml)，12000G離心15分鐘以除去任何顆粒物質(zhì)。含DbpA的可溶性部分在50mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，10％甘油，1mM氨基苯溶液中，在pharmacia FPLC12柱(商標(biāo))上進一步純化。然后通過在50mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl 1mM氨基苯溶液中結(jié)合到單鏈DNA硝酸纖維素上，再用250mMNaCl洗脫，將DbpA純化到均一程度。純的蛋白存放在液氮中，活性可保持幾個月。
ATP水解實驗ATP酶活性實驗在50mM Tris-HClpH7.5，5mM MgCl2，1mM DTT，含1μci〔γ-32p〕ATP的終濃度為0.1mM的ATP溶液中完成。除非特別說明，反應(yīng)均包含純的DbpA和大腸桿菌總RNA，總體積為20μl。除非有特別說明，反應(yīng)混合物均在37℃保溫1小時，通過加入3μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。通過測量放射性磷酸的釋放以測定ATP的水解；磷酸用薄層層析(TLC)從剩余ATP中分離。每個樣品取2μl加入到聚乙烯亞胺薄層層析板上(Camlab)，層析在1M甲酸，0.5M氯化鋰溶液中室溫放置三小時完成。反應(yīng)產(chǎn)物用富士RX膠片通過放射自顯影可看到。通過在液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)薄層層板的相關(guān)區(qū)域可測得釋放出的磷酸的量(如Cerenkov計數(shù))。
估價一種物質(zhì)影響微生物存活力的能力的一種更好的方法是利用依賴于RNA的ATP酶和公認的RNA解旋酶DbpA，此解旋酶對于許多細菌正常的RNA操作功能是必需的。此方法利用了DbpA的依賴于RNA的ATP酶活性。因此，一種更好的DbpA依賴于RNA的ATP水解實驗包括在緩沖液中(例如，50mM Tris-HCl pH7.5，5mMMgCl2，1mM DTT)將DbpA蛋白與細菌RNA或核糖體RNA(rRNA)，或特異的RNA底物(23S rRNA)，和0.1mM ATP一起保溫。通過測定從〔γ-32P〕ATP上釋放的放射性磷酸的量可檢測ATP的水解，從ATP釋放出的放射性磷酸可以被分離，例如，在1M甲酸和0.5M Lice溶液中，用聚乙烯亞胺薄層層析板進行層析，或用其他的常規(guī)方法進行分離。放射量(對應(yīng)于自由磷酸的量)可用Sambrook等所述的常規(guī)技術(shù)測定。也可用常規(guī)的ATP生物發(fā)光實驗測量ATP的水解。這將使用96孔微量滴定板進行抑制劑的半自動篩選成為可能。
本實驗測定了來源于某些細菌家族，包括人類致病菌在內(nèi)的一系列革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的總RNA。這些菌包括鼠傷寒沙門氏菌，弗萊斯納氏志賀氏桿菌，克萊勃士肺炎桿菌，支氣管敗血性鮑臺氏菌和枯草桿菌。這些RNA均能激活大腸桿菌DbpA對ATP的水解。
下表列出了一些抗微生物制劑的例子。如不可被水解的類似物，同時也列出了當(dāng)抗微生物制劑加入到反應(yīng)混合物中時所測得的核苷酸磷酸酶(DbpA)的ATP酶活性。ATP酶活性的百分值是與對照樣相比后兩次實驗的平均值?？刮⑸镏苿┚^量10倍。
(表)抗微生物制劑 ATP酶活性的百分值5’-p-氟磺酰苯甲酰腺苷 2％腺苷5’〔B，γ-亞氨〕三磷酸 52％腺苷5’-〔γ-硫代〕三磷酸 57％腺苷5’-〔B，γ-亞甲基〕三磷酸 90％結(jié)果DbpA的轉(zhuǎn)譯起始所預(yù)測的DbpA氨基酸序列與其他大腸桿菌DEAD盒蛋白基因的產(chǎn)物序列的對比表明，DbpA基因在5’端明顯地更短一些。然而，dbpA DNA序列中存在一個符合讀框的上游GTG密碼子，它若被用為翻譯起始碼子，該基因?qū)⒕幋a一個蛋白質(zhì)，其“額外”的N端序列會與其他的大腸桿菌DEAD盒蛋白一起分享幾個關(guān)鍵的保守氨基酸(或保守性替代物)(圖1)。大約10％的大腸桿菌mRNA在GUG處轉(zhuǎn)譯起始，起始子tRNAfmet能與GUG相互作用而在起始位點給出一個蛋氨酸(Hershey，1987)。從真正的大腸桿菌啟動子處表達DbpA蛋白的質(zhì)粒中的原始dbpA分離物包含上游序列(包括推測的GTG起始密碼子)。此質(zhì)粒不能產(chǎn)生足夠量的蛋白用于直接進行氨基酸測序，因此，為了確定哪一個密碼子被正常用于轉(zhuǎn)譯起始，用可被IpTG誘導(dǎo)的pT7.7系統(tǒng)(Tabor，1985)構(gòu)建了二個過量表達質(zhì)粒。在其一，DbpA的轉(zhuǎn)譯起始于被原先認為是真正的起始密碼子的ATG處，而在另一個中，轉(zhuǎn)譯起始于上游的GTG位點。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳將此二質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白與初級克隆產(chǎn)生的蛋白作了比較。為了使pT7.7質(zhì)粒在GTG處起始，此密碼子被用寡核苷酸的指導(dǎo)的突變技術(shù)突變?yōu)锳TG，以便在pT7.7體系中進行最適轉(zhuǎn)譯(見圖2)，從而這二個質(zhì)粒具有相同的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)譯起始密碼子。
如圖2所示，由bluescript克隆所產(chǎn)生的蛋白(泳道1)與在GTG處起始的pT7.7質(zhì)粒所產(chǎn)生的蛋白(泳道4)有相同的大小，而且在bluescript克隆中未產(chǎn)生與起始于下游的ATG位點有相對的大小的蛋白(泳道3)，這表明，對DbpA而言，當(dāng)其自動啟動子和核糖體結(jié)合位點被應(yīng)用時，GTG為唯一的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，也表明，真實的全長DbpA蛋白包括AUG上游的序列。pT7.7質(zhì)粒中全長蛋白的表達量比起始于內(nèi)部AUG位點的蛋白表達量高許多(20-50倍，數(shù)據(jù)未列出)。因此初始的bluescript克隆的GTG密碼子被突變?yōu)锳TG(用寡核苷酸指導(dǎo)的突變)以確定這是否對轉(zhuǎn)譯效率有影響。事實上此突變消除了DbpA從其天然啟動子處的表達(圖2，泳道2)。這有些令人吃驚，因為通常GTG是比ATG轉(zhuǎn)譯起始效率低的密碼子(Gold，1988)。有趣的是，在體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯反應(yīng)中，未觀察到這兩個bluescript質(zhì)粒在轉(zhuǎn)譯效率上有差異(數(shù)據(jù)未列出)。
目前尚不清楚為什么在pT7.7質(zhì)粒中起始于GTG的全長蛋白的表達量比起始于內(nèi)部ATG的蛋白的量高如此之多。雖二種蛋白的脈沖追蹤分析表明，二者的穩(wěn)定性無明顯差別，另然全長蛋白處于穩(wěn)定狀態(tài)的水平反而更高一些(數(shù)據(jù)未列出)。細菌細胞總RNA制備物的Northern雜交不能確定二種質(zhì)粒的dbpA RNA的相對水平是否有明顯差異(數(shù)據(jù)未列出)。然而當(dāng)細胞中其他RNA的水平也明顯不同時，去比較二個質(zhì)粒的dbpA轉(zhuǎn)錄水平是很困難的。當(dāng)來自二種pT7.7表達質(zhì)粒的細菌裂解物進行比較時，明顯看到，在表達全長蛋白的質(zhì)粒中，細胞中其他蛋白質(zhì)的表達水平即使在IpTG誘導(dǎo)前也是很低的(圖3)。而且DbpA常常得到一個高的本底表達水平(圖3)。但在大規(guī)模制備物中，IpTG會導(dǎo)致DbpA產(chǎn)量的增加(數(shù)據(jù)未列出)。
DbpA的純化和DbpA的ATP酶活性除非特別說明，均用從T7啟動子(即GTG起始位點)表達完整DbpA基因的質(zhì)粒進行蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。按“材料和方法”所述之方法培養(yǎng)DbpA表達細胞并用IpTG誘導(dǎo)且將蛋白質(zhì)純化至均一程度(圖4)。DbpA粗提物含有高濃度的核酸(RNA和DNA)，它會結(jié)合到DbpA蛋白質(zhì)上，用常規(guī)方法不能去掉(例如高的鹽濃度，DNA酶和RNA酶)。因此要用聚乙烯亞胺(PEI)從制備物中除去核酸。PEI可沉淀核酸，并經(jīng)常在低鹽濃度下沉淀結(jié)合了蛋白的核酸；隨后用高鹽可將蛋白從沉淀物中洗脫(Gegenheimer，1990)。然而對于50mM NaCl中的DbpA粗提物，當(dāng)核酸被沉淀時，大部分的DbpA蛋白仍存在于溶液中，而且此步驟基本上完成了DbpA的純化(見圖4)。通過在硫酸銨中沉淀蛋白將PEI除去，經(jīng)凝膠過濾(FPLC Superose12)和在單鏈DNA纖維素膜上層析即可得高純度的DbpA制備物。常規(guī)情況下用此純化方法可從每升細菌培養(yǎng)物中獲得2-3mg的均一DbpA蛋白(終產(chǎn)物)。
通過測量DbpA水解ATP的能力以及確定比活性是否依賴于RNA的存在-DEAD盒蛋白家族的成員的功能特點-可以檢測純化的DbpA的生化功能。按“材料和方法”所述，純蛋白的ATP酶活性可通過測定其從γ-32P標(biāo)記的ATP上釋放磷酸的能力而判定。如圖5所示，在大腸桿菌總RNA存在下DbpA可水解ATP。在無RNA存在下，DbpA不表現(xiàn)此活性，而且當(dāng)RNA酶加入反應(yīng)物中時此ATP酶的活性將消失，表明此活性依賴于所加的RNA。因此，DbpA表現(xiàn)了DEAD盒蛋白家族的成員的特征性的RNA依賴性ATP酶活性，而且象家族中典型成員一樣，其活性不被單鏈或雙鏈DNA所激活。
DbpA水解ATP反應(yīng)的Km值被確定為150μm，此值處于所報道的eIF-4A(50μm)(Grifo等，1984)和p68(100-1000μm)(Iggo&Lane，1989)的同樣范圍內(nèi)。
也做了確定DbpA是否水解其它核苷三磷酸的實驗。在用于表明DbpA水解ATP實驗條件下，沒有觀察到放射性磷酸從γ-32P標(biāo)記的GTP(所余僅有的商業(yè)上可獲得的γ標(biāo)記的核苷三磷酸)上釋放出來，這表明該蛋白不水解GTP(數(shù)據(jù)未列出)。然后通過檢查在標(biāo)準(zhǔn)的ATP酶測定中加入其它核苷酸是否與[γ-32P]ATP競爭，以確定DbpA是否水解其他的核苷酸。在每種情況下，未標(biāo)記的核苷酸磷酸都過量10倍，只發(fā)現(xiàn)dATP與ATP存在競爭，但這是因為原先已證明dATP是DbpA的一個底物。在本發(fā)明范圍內(nèi)仍可能存在其他的核苷酸磷酸酶能水解其他的核苷酸磷酸。
對起始于原先被認為是真正的起始密碼子的內(nèi)部ATG位點的DbpA蛋白的生化活性也進行了測量。此蛋白含有DEAD盒蛋白特征性的七個保守區(qū)段(Iggo等，1990；Kalman等，1991；Fuller-Pace，1992)。雖然此蛋白可以象全長蛋白一樣以相同方式結(jié)合到尿嘧啶多聚物瓊脂糖(poly(U)Sepharose)，ATP瓊脂糖和單鏈DNA纖維素膜上，但是在純的制備物中不能檢測到任何ATP酶活性(數(shù)據(jù)未列出)。
ATP酶活性對RNA和蛋白質(zhì)濃度的依賴性我們檢查了DbpA水解ATP對大腸桿菌總RNA和DbpA蛋白濃度的依賴。在各種RNA濃度下，完成了在蛋白質(zhì)濃度不斷提高時的ATP水解實驗。按“材料和方法”所述保溫一小時后，測定了釋放出的自由磷酸的量(圖6)。在50ngRNA下，當(dāng)DbpA濃度從50ng提高到200ng時，磷酸的釋放不斷增加；在更高的濃度下，未觀察到產(chǎn)物進一步增加，這表明反應(yīng)可能受到了RNA濃度的限制。(在每種情況下，只有一部分ATP參與了反應(yīng)(數(shù)據(jù)未列出了))。當(dāng)RNA濃度提高到400ng時，磷酸的釋放量也隨之增加。然而，每種情況都有一個十分相似的動力學(xué)模式，即當(dāng)DbpA濃度大于200ng時，磷酸的釋放不會進一步增加。這再次表明，雖然RNA濃度提高了，其水平仍是有限的(圖6)。這意味著或者RNA在與DbpA反應(yīng)后來恢復(fù)原來的構(gòu)型，或者DbpA與RNA結(jié)合形成了一個復(fù)合物。為了區(qū)別這兩種可能性，做了兩個平行實驗，其一限制DbpA濃度，另一限制RNA濃度(由圖6確定)。在每個實驗中，ATP水解按時間進程完成，反應(yīng)分別在0，20，40和60分鐘后被終止。20分鐘后，更多的被限制了濃度的成分(DbpA或RNA)被加入到一組樣品中，以確定是否會影響ATP水解的最終水平。圖7A證實在限制RNA濃度條件下，加入更多的RNA促進了放射性磷酸從ATP的釋放；在圖7B中，DbpA的量被限制，反應(yīng)中另外加入100ngDbpA導(dǎo)致釋放出大約兩倍的磷酸。
用更長的時間過程(120分鐘)，并在80分鐘時額外加γ100ngDbpA或500ngRNA，重復(fù)了該實驗，結(jié)果相同，這是一個非常有趣的結(jié)果。如果DbpA正在進行催化，應(yīng)釋放出相同總量的磷酸，但應(yīng)更快達到反應(yīng)終點。然而，增加DbpA量導(dǎo)致產(chǎn)物形成平行增加的結(jié)果表明，DbpA未從反應(yīng)中釋放出來以進行下一輪催化，而是與RNA一起存在于一復(fù)合物中。
DbpA的特異性RNA底物的確認為了確定在ATP水解反應(yīng)中對RNA的需求是否存在任何特異性，利用了各種RNA制備物，包括大腸桿菌、酵母和Hela細胞的總RNA，大腸桿菌的轉(zhuǎn)運RNA，以及大腸桿菌和兔子的核糖體RNA。引人注意的是，只有大腸桿菌總RNA和大腸桿菌核糖體RNA激活了ATP酶的水解作用。用任何真核生物的RAN或tRNA都不能觀察到水解(圖8)。同樣，象大腸桿菌DNA和M13單鏈DNA一樣，polyURNA不能激活A(yù)TP的水解(數(shù)據(jù)未列出)。這表明，不同于到目前為止被檢測過的其他DEAD盒蛋白，DbpA在底物要求上顯示了一個與眾不同的特異程度。例如，真核生物轉(zhuǎn)譯起始因子eIF-4A，大腸桿菌的SrmB，酵母拼接因子PRP16和梅樹痘病毒的CI蛋白的ATP酶活性可被幾種RNA激活，包括polyA或polyU(Grifo等，1984；Nishi等，1988；Schwer & Guthne，1991；Lain等，1991)。
為了確定是否是一個特殊的大腸桿菌核糖體RNA激活A(yù)TP水解，測試了商業(yè)上可得到的5SRNA和16S與23SrRNA的混合物(Boehringer)。5SrRNA未觀察到活性)而16S和23SrRNA的混合物激活了ATP酶的活性(圖8)。這表明激活DbpA水解ATP或同時需要16S和23SrRNA，或只需其一。有趣的是，通過煮沸和冰上快速冷卻變性RNA并不影響它激活DbpA水解ATP的能力，這表明被DbpA識別的序列或二級序列是穩(wěn)定的。
為了確定16S或23SrRNA中哪一個是DbpA的底物，這兩種RNA被分別體外合成，并被直接用于ATP水解反應(yīng)。為了獲得合適的體外合成這些RNA的質(zhì)粒，編碼16S和23SrRNA的基因被從含所有大腸桿菌rRNA基因(作為rrnB操縱子)(Brosius，1981)pKK3535質(zhì)粒亞克隆到體外轉(zhuǎn)錄載體上，如“材料和方法”所述，16S和23SrRNA分開合成，對16S和23SrRNA都分別合成了各自的正義和反義RNA。隨后這些RNA被用作ATP水解反應(yīng)中的底物。在這些實驗中，只有23S正義RNA激活了ATP的水解；而23S反義和16S正義及反義RNA不能作為DbpA的底物(圖9)。即使用更高濃度的RNA(1μg)，16S RNA和23S反義RNA仍不能激活A(yù)TP的水解(數(shù)據(jù)未列出)。這些發(fā)現(xiàn)表明，在生理環(huán)境中DbpA特異地與23S rRNA反應(yīng)，且不同于目前研究過的其他DEAD盒蛋白，DbpA在反應(yīng)中對RNA底物表現(xiàn)了與眾不同的特異性要求。
已經(jīng)確定，DbpA所作用的23S rRNA分子的特異位點位于2418-2605堿基區(qū)內(nèi)。一個包含此區(qū)域的RNA片段可激活DbpA的全部ATP酶活性。
討論以前未被描述特征的大腸桿菌DEAD盒蛋白DbpA已被高水平表達，并在此描述了一個快速制備毫克量的均一DbpA蛋白的方法。重組DbpA生化特征的確定導(dǎo)致了以下有意義的發(fā)現(xiàn)。1DbpA以依賴RNA的方式水解ATP，此活性是DEAD盒蛋白家族典型成員的特點；2在限定RNA或蛋白量的條件下的ATP水解實驗表明，在ATP水解反應(yīng)中DbpA和其RNA底物之間形成了一復(fù)合物；3DbpA特異地與原核生物23S rRNA相互作用，只有此RNA能激活DbpA對ATP的水解；(4)雖然DbpA可結(jié)合到各種RNA分子上，但只有在原核生物23SrRNA存在下才能水解ATP。
ATP水解反應(yīng)中DbpA所表現(xiàn)的對RNA的這種特異性要求的發(fā)現(xiàn)是極為令人感興趣的，這是DEAD盒蛋白表現(xiàn)此種序列特異性的首次記錄。到目前為止，在生化上研究過的其他DEAD盒蛋白都未表現(xiàn)出此種特異性要求。例如，真核生物翻譯起始因子eIF-4A和梅樹痘病毒的CI蛋白不僅將在各種RNA底物(分別包括poly U和poly A)存在時水解ATP(Grifo等，1984；Lain等，1991)，而且將解旋一定范圍的合成的RNA底物(Rozen等，1990；Lain等，1990)。未檢測到類似的小的合成RNA分子的解旋(數(shù)據(jù)未列出)。這也許并不奇怪，因為在RNA相互作用水解ATP時，DbpA表現(xiàn)出如此的特異性，同時所使用的底物并不激活A(yù)TP水解。23S rRNA分子的大小(2904個堿基)和其相當(dāng)重要的二級結(jié)構(gòu)(Noller，1984)使得很難使用常規(guī)的凝膠移動方法(Hirling等，1989；Rozen等，1990)確定DbpA是否解旋此RNA的某些特異區(qū)段。
DbpA和23S rRNA相互作用的特異性可能起源于一種序列和二級或三級結(jié)構(gòu)上的結(jié)合，雖然煮沸過的RNA仍是合適的底物的發(fā)現(xiàn)意味著某一個特殊序列可能是此特異性的決定因素。對能夠激活DbpA的全部ATP酶活性的在23S rRNA上位于2418-2685堿基間區(qū)域的確認證實了此觀點。DEAD盒蛋白的底物中的此種序列特異性可能解釋了如下發(fā)現(xiàn)即使在具有相對小的基因組的有機物中，也存在幾種DEAD盒蛋白(Linder，1989)，而且大腸桿菌的五個DEAD盒蛋白間的互補實驗表明這些蛋白質(zhì)彼此不能互補(Kalman等，1991)，這表明它們擔(dān)負不同的功能，可能作用于不同的RNA底物。
23S rRNA與5S rRNA和34個核糖體蛋白一起形成了大腸桿菌核糖體的大亞基(50S)。無論在體外還是在體內(nèi)，50S大亞基的組裝包括三個可詳細說明的階段(Dohme，1976；Niehaus，1982)。在體外，一半核糖體蛋白與RNA結(jié)合后需要加熱以進一步進行反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)表明此階段需要一個構(gòu)型的改變，而且，當(dāng)核糖體的體內(nèi)組裝只需要在37℃幾分鐘即可完成時，50S亞基的體外重新組裝的二步途徑卻需要在高溫下保溫很長時間(Dohme 1976；Herold & Niehaus，1987)。因此，核糖體RNA的構(gòu)型可能需要精微的修飾(可能通過部分解鏈)以便正確地組裝成核糖體亞單位。在體內(nèi)此步可能由RNA解旋酶完成，而在體外重新組裝實驗中可能缺少此酶。也有一些遺傳證據(jù)表明，在大腸桿菌中其他的DEAD盒蛋白也與核糖體的裝配有關(guān)，這些基因包括srmB和deaD基因，二者在高水平表達時，可分別抑制編碼核糖體蛋白L24和S2的基因中的溫度敏感突變(Nishi等；1988；Tooen等，1991)，因此核糖體的正確組裝可能也需要DbpA。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，tRNA與16S和23S rRNA相互作用(Moazed等，1988；Moazed & noller，1989)，也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄延長因子EF-G和EF-Tu可與23S rRNA的一個保守的環(huán)形結(jié)構(gòu)相互作用(Moazed等，1988)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了核糖體內(nèi)的這些RNA的正確構(gòu)型對實現(xiàn)正確轉(zhuǎn)譯的重要性。因此此處所述的DbpA，即公認的RNA解旋酶，特異性地與23S rRNA相互作用的觀察意味著此蛋白可能在翻譯中起著另外的作用，這對DbpA在核糖體的結(jié)構(gòu)、組裝或功能上的作用的認識可能有深刻的啟示。
DbpA的ATP酶活性的激活特異地需要23SrRNA的發(fā)現(xiàn)引起了一個有趣的問題。DbpA可與poly U(數(shù)據(jù)未列出)和單鏈DNA結(jié)合。事實上單鏈DNA纖維素膜也被用為一個最后的純化步驟(見上)。因此這表明在DbpA與RNA的僅僅結(jié)合和DbpA與導(dǎo)致ATP水解的RNA底物的特異性相互作用間存在著差異。
此處已經(jīng)表明，在dbpA基因中翻譯起始并不發(fā)生在原先預(yù)測的AUG(或DNA中的ATG)密碼子處(Iggo等，1990)，而是發(fā)生在一個上游的符合讀框結(jié)構(gòu)的GUG(或DNA中的GTG)密碼子處。即使在內(nèi)源的dbpA啟動子和核糖體結(jié)合位點都被利用的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中，轉(zhuǎn)譯仍然起始于GTG處，而不是在ATG處。而且，當(dāng)此質(zhì)粒中的GTG被突變?yōu)锳TG時，DbpA的表達事實上也不存在了。這表明存在一個要求GTG作為起始密碼子的非同尋常的轉(zhuǎn)譯起始機制。大約10％的大腸桿菌mRNA使用GTG作為起始密碼子(Hershey，1987)。
然而有趣的是，在真正的DbpA啟動子和核糖體結(jié)合位點都被利用的質(zhì)粒中，當(dāng)GTG被突變成ATG時，DbpA基本上不再表達。(ATG通常是比GTG更有效的轉(zhuǎn)譯起始密碼子)。因此這表明對于DbpA，看來存在一個非同尋常的轉(zhuǎn)譯起始機制，此機制只識別GTG，而非ATG作為轉(zhuǎn)譯起始密碼子。另外。DbpA的高表達導(dǎo)致細胞中其他蛋白正常轉(zhuǎn)譯的明顯減少的發(fā)現(xiàn)是富有啟發(fā)性的，暗示了DbpA可能行使了某些普遍的轉(zhuǎn)譯反饋抑制的功能。今后可溶性的均一且穩(wěn)定的有酶促活性的高水平的DbpA的生產(chǎn)將允許詳細分析此蛋白在細胞中的生化功能。
許多抗生素類藥物是通過抑制細菌中蛋白質(zhì)的生成起作用的。然而一些對這些抗生素有抗性的菌株已經(jīng)出現(xiàn)。DbpA對RNA底物以及與23S rRNA相互作用的高度特異性為新一代治療藥物，如抗生素的生產(chǎn)提供了可能。
用于治療藥物如抗生素、抗體生產(chǎn)的常規(guī)技術(shù)已被描述。不被此特殊RNA解旋酶水解的ATP類似物可以作為一種有效的抗生素。這種情況下此RNA解旋酶將失去能力來源，從而停止行使功能。這對微生物是有害的，而對真核宿主是無害的，因為RNA解旋酶(如DbpA)對真核細胞的轉(zhuǎn)譯是無效且不必要的。參考文獻下面列出本論文的參考文獻Brosius，J，Ullrieh，A，Baker，M A，Gray，A，Dull，TJ，Gutell，RR，and Noller，H F(1981).Plasmid 6，112-118.Chang，T H，Arenas，J and Abelson，J(1990).Proc Natl Acad Sci U S A 87，1571-5.Dohme，F(xiàn) and Nierhaus，K H(1976).J Mol Biol 107，585-590.Fuller-Pace，F(xiàn) V and Lane D P.(1992).In Nucleic Acids and Molecular Biology F Eckstein and DM J Lilley，eds(BerlinSpringer-Verlag)，6，159-173.Gegenheimer，P(1990).Methods Enzymol.182，174-193.Gold，L.(1988).Ann Rev.Biochem.57，199-223.Grifo，J A，Abramson，R D，Satler，C A and Merrick，W C(1984).J Biol.Chem.259，8648-8654.Harlow，E and Lane，D(1988).in Antibodies，ALaboratory Manual.(Cold Spring Harbor，New YorkColdSpring Harbor Laboratory).Herold，M and Nierhaus，K H(1987).J Biol Chem 262，8826-33.Hershey，J W B(1987).In Escherichia coli andSalmonella typhimurium，Cellular and Molecular Biology.F C Neidhardt，ed.(Washington，DC，American Society ofMicrobiology).Hirling，H，Scheffner，M，Restle，T andStahl，H.(1989).Nature 339，562-4.Iggo，R，Picksley，S，Southgate，J，McPheat J and Lane D P(1990).Mucleic Acids Res 18，5413-7.Iggo，R D，Jamieson，D J 7 MacNeill，S A，Southgate，J，McPheat，J and Lane，D P(1991).Mol Cell Biol 11，1326-33.Iggo，R D and Lane，D P(1989).Embo J.8 1827-31.Kalman，M，Murphy，H and Cashel，M(1991).New Biol 3；886-95.Lain，S，Martin，M T，Riechmann，J L andGarcia，J A(1991).J Virol 65，1-6.Lain，S，Riechmann，J L and Garcia，J A(1990).NucleicAcids Res 18，7003-6.Linder，P，Lasko，P F，Leroy，P，Melsen，P J，Nishi，K，Schnier，J，Slominski，P P(1989).Nature 337，121-122.Moazed，D and Noller，H F(19S9).Cell 57，585-97.Moazed，D，Robertson，J M and Noller，H F(1988).Nature 334，362-4.Nierhaus，K H(1982).Curr.Top.Microbiol.Immunol.97，82-155.Nishi，K，Morel，D F，Hershey，J W，Leighton，T andSchnier，J(1988).[published erratum appears in Nature1989 Jul 20；340(6230)246].Nature 336，496-8.Noller，H P(1984).Ann.Rev.Biochem.53，119-162.Rozen，F(xiàn)，Edery，I，Meerovitch，K，Dever，T E，Merrick，W.C.and Sonenberg，N.(1990).Mol Cell Biol 10，1134-44.Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，E.F，Maniatis，T(1989).Molecular Cloning A laboratory ManualSecond Edition.Second Edition，(Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory)Schmid，S R and Linder，P(1992).Mol Microbiol 6，283-91.Schwer，B and Guthrie，C(1991).Nature 349，494-9.Studier，F(xiàn) W.，Rosenberg，A H.，Dunn，J J，Dubendorff，J W(1990).Methods Enzymol.185，60-89.Tabor，S and Richardson，C C(1985).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82，1074-1078.Toone，W M，Rudd，K E and Friesen，J D(1991).J Bacteriol 173，3291-3302.
序列表申請人鄧迪大學(xué)董事會地址Tower Building，Dundee，DD1 4HN發(fā)明名稱抗微生物制劑及其篩選序列數(shù)目2計算機可讀形式IBM PC兼容的MS-DOS系統(tǒng)的3.5寸小盤軟件Wordperfect 5.1SEQ.ID.NO1的信息(i)序列特征(A)長度1374個堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(只列出了編碼鏈)(D)構(gòu)型線形(ii)分子類型從基因組DNA衍生的質(zhì)粒(iii)假說無(iv)反義無(v)片段類型編碼區(qū)(vi)來源大腸桿菌DH5α(ix)特征被改變了的起始密碼子(A)名稱/關(guān)鍵ATG1(B)位置1-3堿基(ix)特征原先被視為起始密碼子(A)名稱/關(guān)鍵ATG2(B)位置75-77堿基SEQ.ID.No1ATG ACC GCT TTT TCT ACC CTG AAT GTT TTG CCT CCC GCC CAA CTC ACG 48AAC CTT AAT GAG TTG GGT TAT TTA ACC ATG ACG CCG GTG CAG GCC GCC 96GCG CTT CCG GCG ATC CTT GCC GGA AAA GAT GTT CGC GTG CAG GCG AAA 144ACC GGC AGC GGC AAA ACG GCG GCT TTT GGC CTC GGC TTG TTA CAG CAA 192ATT GAT GCG TCG CTA TTT CAA ACC CAG GCT TTA GTG CTG TGT CCT ACG 240CGT GAA CTG GCG GAT CAG GTG GCA GGT GAA TTG CGT CGG CTG GCG CGT 288TTT CTG CCA AAT ACC AAA ATT TTG ACG TTG TGC GGT GGT CAA CCG TTC 336GGT ATG CAG CGT GAT TCG TTG CAA CAT GCG CCG CAT ATT ATC GTG GCA 384ACG CCG GGG CGT TTG CTG GAT CAC CTG CAA AAA GGC ACG GTA TCA CTG 432GAT GCG TTG AAT ACG CTG GTG ATG GAT GAG GCC GAC CGC ATG CTG GAT 480ATG GGA TTT AGC GAT GCC ATT GAT GAT GTC ATC CGT TTT GCG CCT GCA 528TCT CGA CAG ACG CTT CTG TTT TCG GCA ACC TGG CCG GAA GCC ATC GCT 576GCA ATC AGC GGA CGA GTG CAA CGC GAT CCT TTG GCG ATT GAA ATT GAC 624TCA ACA GAT GCT TTG CCA CCC ATT GAA CAA CAA TTT TAT GAG ACA TCC 672AGC AAA GGC AAA ATT CCT CTG TTG CAA CGG TTA TTA AGC TTG CAT CAG 720CCA TCC TCT TGC GTG GTG TTT TGC AAT ACC AAA AAA GAT TGC CAG GCT 768GTC TGC GAC GCG CTG AAT GAA GTA GGG CAA AGT GCA TTG TCA TTA CAC 816GGC GAT TTG GAG CAA CGC GAT CGC GAT CAG ACC CTG GTA CGT TTT GCT 864AAC GGT AGC GCC CGT GTA CTG GTC GCG ACT GAT GTT GCT GCG CGT GGT 912CTG GAT ATT AAA TCG CTT GAG CTG GTG GTG AAC TTT GAG CTG GCG TGG 960GAC CCT GAA GTT CAT GTA CAT CGC ATC GGT CGT ACA GCT CGT GCA GGA 1008AAT AGC GGT CTG GCG ATC AGT TTC TGT GCT CCG GAA GAA GCA CAG CGG 1056GCC AAT ATC ATT TCT GAC ATG TTG CAG ATA AAA CTT AAC TGC CAA ACG 1104CCG CCA GCT AAT AGT TCC ATT GCG ACG CTG GAA GCA GAA ATG GCA ACG 1152TTG TGT ATC CAT GGC GGG AAA AAA GCC AAA ATG CGC CCG GGT GAT GTA 1200TTA GGT GCA CTG ACA GGA GAT ATC GGG CTT GAT GGC GCA GAT ATT GGC 1248AAA ATC GCC GTG CAT CCG GCG CAT GTC TAT GTC GCG GTC CGT CAG GCT 1296GTT GCT CAT AAA GCA TGG AAA CAG TTA CAG GGC GGG AAG ATT AAA GGA 1344AAA ACG TGC CGG GTG CGG TTA TTA AAA TAA 1374SEQ.ID.NO2的信息(i)序列特征(A)長度1614個堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(只列出了編碼鏈)(D)構(gòu)型線形(ii)分子類型從基因組DNA衍生的質(zhì)粒(iii)假說無(iv)反義無(vi)來源大腸桿菌DH5α(ix)特征被改變了的起始密碼子(A)名稱/關(guān)鍵ATG1(B)位置130-132堿基(ix)特征原先被視為起始密碼子(A)名稱/關(guān)鍵ATG2(B)位置205-207堿基SEQ.ID.NO2GAT CCC TCG CCC GCA ACC CAT GCC TGA CCC ACC ACC CGA TGA AGA ACC 48GAT TAA ATT GTC GCA TCG TGA GCG TAG ATC TGC GAG GAT ACG CGC CTG 96CTA ACT TTG CGT CGA TGA CCA CGA GAA TAG ATT ATG ACC GCT TTT TCT 144ACC CTG AAT GTT TTG CCT CCC GCC CAA CTC ACG AAC CTT AAT GAG TTG 192GGT TAT TTA ACC ATG ACG CCG GTG CAG GCC GCC GCG CTT CCG GCG ATC 240CTT GCC GGA AAA GAT GTT CGC GTG CAG GCG AAA ACC GGC AGC GGC AAA 288ACG GCG GCT TTT GGC CTC GGC TTG TTA CAG CAA ATT GAT GCG TCG CTA 336TTT CAA ACC CAG GCT TTA GTG CTG TGT CCT ACG CGT GAA CTG GCG GAT 384CAG GTG GCA GGT GAA TTG CGT CGG CTG GCG CGT TTT CTG CCA AAT ACC 432AAA ATT TTG ACG TTG TGC GGT GGT CAA CCG TTC GGT ATG CAG CGT GAT 480TCG TTG CAA CAT GCG CCG CAT ATT ATC GTG GCA ACG CCG GGG CGT TTG 528CTG GAT CAC CTG CAA AAA GGC ACG GTA TCA CTG GAT GCG TTG AAT ACG 576CTG GTG ATG GAT GAG GCC GAC CGC ATG CTG GAT ATG GGA TTT AGC GAT 624GCC ATT GAT GAT GTC ATC CGT TTT GCG CCT GCA TCT CGA CAG ACG CTT 672CTG TTT TCG GCA ACC TGG CCG GAA GCC ATC GCT GCA ATC AGC GGA CGA 720GTG CAA CGC GAT CCT TTG GCG ATT GAA ATT GAC TCA ACA GAT GCT TTG 768CCA CCC ATT GAA CAA CAA TTT TAT GAG ACA TCC AGC AAA GGC AAA ATT 816CCT CTG TTG CAA CGG TTA TTA AGC TTG CAT CAG CCA TCC TCT TGC GTG 864GTG TTT TGC AAT ACC AAA AAA GAT TGC CAG GCT GTC TGC GAC GCG CTG 912AAT GAA GTA GGG CAA AGT GCA TTG TCA TTA CAC GGC GAT TTG GAG CAA 960CGC GAT CGC GAT CAG ACC CTG GTA CGT TTT GCT AAC GGT AGC GCC CGT 1008GTA CTG GTC GCG ACT GAT GTT GCT GCG CGT GGT CTG GAT ATT AAA TCG 1056CTT GAG CTG GTG GTG AAC TTT GAG CTG GCG TGG GAC CCT GAA GTT CAT 1104GTA CAT CGC ATC GGT CGT ACA GCT CGT GCA GGA AAT AGC GGT CTG GCG 1152ATC AGT TTC TGT GCT CCG GAA GAA GCA CAG CGG GCC AAT ATC ATT TCT 1200GAC ATG TTG CAG ATA AAA CTT AAC TGG CAA ACG CCG CCA GCT AAT AGT 1248TCC ATT GCG ACG CTG GAA GCA GAA ATG GCA ACG TTG TGT ATC GAT GGC 1296GGG AAA AAA GCC AAA ATG CGC CCG GGT GAT GTA TTA GGT GCA CTG ACA 1344GGA GAT ATC GGG CTT GAT GGC GCA GAT ATT GGC AAA ATC GCC GTG CAT 1392CCG GCG CAT GTC TAT GTC GCG GTC CGT CAG GCT GTT GCT CAT AAA GCA 1440TGG AAA CAG TTA CAG GGC GGG AAG ATT AAA GGA AAA ACG TGC CGG GTG 1488CGG TTA TTA AAA TAA TGA AAT GTT GAA TTG CCG GGT GCA AGA GTA AAC 1536ATC TTA TTC GGG ATT GCC GGA TGC GAC GCT GGC CGC GTC TTA TCC GGC 1584CTC CAT AAG AGT AGC CCG ATA CGC TTG CGC 161權(quán)利要求
1.測定一種物質(zhì)抗微生物活性的方法，該方法包括(i)將一微生物所需的核苷酸磷酸酶、所述物質(zhì)和一核苷磷酸相混合；(ii)估價被所述磷酸酶所作用的核苷磷酸的量，從而估價該被測物質(zhì)對該磷酸酶的作用效果。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中微生物所需的磷酸酶為一RNA解旋酶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中的核苷酸磷酸酶為DbpA。
4.如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中，RNA也作為一種激活核苷磷酸酶活性的物質(zhì)被加入到混合物中。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中的RNA為核糖體RNA；
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中的RNA為原核生物的23S核糖體RNA。
7.如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中的核苷酸磷酸酶以基本上純的形式被供給。
8.如上述任一權(quán)利要求中所述的任一方法，其中的核苷磷酸的降解通過測定磷酸量的改變而定量。
9.如上述任一權(quán)利要求所述的方法，其中的核苷磷酸包括一位于其γ磷酸部分的標(biāo)記。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中的標(biāo)記包括放射性的，發(fā)光的，發(fā)熒光的標(biāo)記或一發(fā)色基團。
11.測定一種物質(zhì)的抗微生物活性的方法，該方法包括(i)將該物質(zhì)與一種影響原核生物rRNA二級結(jié)構(gòu)的酶和此種酶的必需底物一起混合；(ii)估價所述的物質(zhì)對所述的酶的活性的作用。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該方法包括(i)將所述的物質(zhì)與DbpA，原核生物23SrRNA或其一部分或其功能類似物以及ATP或其功能類似物相混合；(ii)估價所述的物質(zhì)對DbpA活性的作用。
13.降低一種微生物必需的核苷酸磷酶的活性的抗微生物制劑。
14.如權(quán)利要求13所述的抗微生物制劑，其能降低一種RNA解旋酶的活性。
15.如權(quán)利要求13或14所述抗微生物制劑，其能降低DbpA的活性。
16.如權(quán)利要求13-15任一項所述的可被權(quán)利要求1-12所述的任一方法確定的抗微生物制劑。
17.如權(quán)利要求13-16任一項所述的為一抗體的抗微生物制劑。
18.如權(quán)利要求13-16之一所述的抗微生物制劑，該制劑包括一不被磷酸酶水解的一種核苷磷酸的類似物。
19.如權(quán)利要求18所述的抗微生物制劑，包括5′-P-氟磺酰苯甲酰腺苷，腺苷5′-[B，γ-亞氨]三磷酸，腺苷5′-[γ-硫代]三磷酸，腺苷5′-[B，γ-亞甲基]三磷酸。
20.如權(quán)利要求13-16任一項所述的為原核生物23S rRNA的非功能類似物的抗微生物制劑。
21.如權(quán)利要求13-20任一項所述的抗微生物制劑在抑制微生物生長中的應(yīng)用。
22.如權(quán)利要求13-20任一項所述的一種化合物在一種抑制微生物生長的藥物的制備中的應(yīng)用。
23.抑制微生物生長的方法，所述方法包括運用一種抑制微生物必需的核苷酸磷酸酶的物質(zhì)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中的核苷酸磷酸酶為RNA解旋酶。
25.如權(quán)利要求23和24任一項所述方法，其中所述的核苷酸磷酸酶為DbpA。
26.編碼DbpA或其部分或其功能性衍生物的重組遺傳物質(zhì)，所述的遺傳物質(zhì)包括至少一部分天然產(chǎn)生的dbpA基因或其功能等價物中的第一個ATG上游的天然序列，其中有一個ATG密碼子存在于該上游序列中。
27.如權(quán)利要求26所述的包含SEQ.ID.NO1或SEQ.ID.NO2序列的重組遺傳物質(zhì)。
28.包含如權(quán)利要求26和27任一項所述的遺傳物質(zhì)的載體。
29.如權(quán)利要求28所述的包含IpTG啟動子序列的載體。
30.生產(chǎn)如權(quán)利要求28或29所述的載體的方法，所述的方法包括將如權(quán)利要求26和27任一項所述的遺傳物質(zhì)連接到一載體序列上。
31.包含如權(quán)利要求26所述的遺傳物質(zhì)或如權(quán)利要求28或29所述的載體的被轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
32.生產(chǎn)一被轉(zhuǎn)染的宿主細胞的方法，所述的方法包括用如權(quán)利要求28或29所述的載體轉(zhuǎn)染細胞。
33.生產(chǎn)DbpA的方法，所述的方法包括從如權(quán)利要求26所述的遺傳物質(zhì)或從如權(quán)利要求28或29所述的載體表達DbpA。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中的DbpA由如權(quán)利要求31所述的被轉(zhuǎn)染的宿主細胞生產(chǎn)。
全文摘要
一種用于確定被公認的抗微生物制劑的活性的方法，所述的方法包括將一種微生物所需要的核苷酸磷酸酶，一種核苷磷酸和被測物質(zhì)相結(jié)合，評估在被測物質(zhì)存在與不存在時核苷磷酸被降解的程度，從而本方法可以測定核苷酸磷酸酶被該物質(zhì)所抑制的程度。本方法優(yōu)選用于測定RNA解旋酶，如DbpA(它選擇性地作用于原核生物的核糖體RNA)的被抑制程度。本發(fā)明公開了合適的DbpA抑制物和編碼有活性的DbpA的遺傳物質(zhì)。
文檔編號C12N15/55GK1120353SQ94191619
公開日1996年4月10日 申請日期1994年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月27日
發(fā)明者弗朗西斯·維多利亞·富勒-佩斯, 大衛(wèi)·菲利普·萊恩 申請人:鄧迪大學(xué)董事會