專利名稱：含有兩種纖維素酶成分的洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有纖維素酶的洗滌劑組合物，它在用于洗滌含纖維素織物時(shí)能提供更好的顆粒污物去除作用以及清色作用。
重復(fù)洗滌織物(特別是含纖維素織物)常造成織物粗糙。很早以前就已建議并證明使用溶纖維素酶降低含纖維素織物(如棉布)的粗糙度。但這種降低的機(jī)制仍未被詳細(xì)闡明。
本領(lǐng)域至今仍未能完滿解決對(duì)不僅具有良好清潔性能、還具有優(yōu)良的織物軟化性能和其它織物維護(hù)益處的洗滌劑組合物之需求。
在專利申請(qǐng)WO 89/09259(Novo Industri A/S)中已描述了用于降低含棉織物粗糙度的纖維素酶制劑。該專利申請(qǐng)(WO 89/09259)中公開了富含內(nèi)切葡聚糖酶活性的纖維素酶部分。
溶纖維素酶(即纖維素酶)的效力作為織物清潔劑和降粗糙劑已被認(rèn)識(shí)到一段時(shí)間；GB—A—2,075,028、GB—A—2,095,275和GB—A—2,094,826公開了含纖維素酶以提高清潔性能的洗滌劑組合物；GB—A—1,368,599公開了纖維素酶降低含棉織物粗糙度的應(yīng)用；US.4,435,307教導(dǎo)了親自腐質(zhì)霉Humicola insolens的溶纖維素酶及其部分(稱為ACX1)作為降粗糙度洗滌劑添加劑的應(yīng)用。
EP—A—0 269 168公開了含纖維素酶的優(yōu)化洗滌劑組合物，其在弱堿性PH范圍內(nèi)配制并提供織物清潔、軟化和維護(hù)性能。
纖維素酶的實(shí)際應(yīng)用受到阻礙，因?yàn)楸绢I(lǐng)域中已知纖維素酶制劑是種復(fù)雜的混合物，而其中只有某部分在織物維護(hù)環(huán)境中有效；因而難于實(shí)現(xiàn)用于洗滌劑工業(yè)的纖維素酶的有經(jīng)濟(jì)效益的工業(yè)生產(chǎn)；而且為了在織物上獲得所需效果將需要應(yīng)用大量的這種纖維素酶制劑。
纖維素酶生產(chǎn)的改進(jìn)常不能證明可有效地應(yīng)用于洗滌劑中。
某些酶制劑如纖維素酶對(duì)洗衣的有益作用與國(guó)際接受的酶分類間模棱兩可的關(guān)聯(lián)至今仍是個(gè)問(wèn)題。例如，許多被描述為纖維素酶的酶，按迄今已知的所有標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)可期望顯示良好的洗滌性能，但在洗滌條件下對(duì)含纖維素織物的清色作用不好。
選擇能夠顯示良好洗滌性能和清色作用的適當(dāng)酶的現(xiàn)今僅有方法是大規(guī)模的洗滌試驗(yàn)，這需要大量的時(shí)間和資源。用于評(píng)價(jià)纖維素酶活性的所有已知方法，如使用CMC、濾紙、無(wú)定形和結(jié)晶纖維素的方法，都不能區(qū)別有價(jià)值的酶和無(wú)活性的酶，并且不能對(duì)用于洗滌含纖維素織物時(shí)的預(yù)期性能提供任何參考。
因此，開發(fā)更有效的含纖維素酶洗滌劑組合物以滿足消費(fèi)者的需要仍是一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)楸绢I(lǐng)域現(xiàn)在還不知何種纖維素酶對(duì)此目的切實(shí)有效。
還有，希望提供一種新型含酶洗滌劑組合物，它能夠提供有效的清色作用和顆粒污物去除作用，在有限洗滌循環(huán)次數(shù)后，它既不損壞也不部分降解含纖維素織物，如棉織物。
本發(fā)明涉及包含第一和第二纖維素酶成分的洗滌劑組合物，第一纖維素酶成分具有保持型活性并能夠去除顆粒污物；第二纖維素酶成分具有多個(gè)功能區(qū)，包括結(jié)合于催化區(qū)的至少一個(gè)非催化區(qū)，并具有清色能力；其中至少一種纖維素酶成分是單一(重組)成分。
這種組合物無(wú)論是粒狀洗滌劑還是液體洗滌劑形式都特別適用作洗衣洗滌劑。
令人驚異地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于洗滌含纖維素織物時(shí)具有清色活性的纖維素酶成分優(yōu)選具有多個(gè)功能區(qū)，即一個(gè)或多個(gè)催化區(qū)與一個(gè)或多個(gè)非催化區(qū)結(jié)合，例如纖維素酶結(jié)合區(qū)，以及此成分可具有保持型活性或反轉(zhuǎn)型活性；當(dāng)用于洗滌含纖維素織物時(shí)具有顆粒污物去除活性的纖維素酶成分具有保持型活性。
相信第一纖維素酶成分的保持型活性可用該成分對(duì)低分子量碳水化合物底物顯示催化活性的能力來(lái)證明；具有清色能力的第二纖維素酶成分的多功能區(qū)結(jié)構(gòu)可用該成分對(duì)纖維糊精(尤其是具有6個(gè)葡萄糖單位的纖維糊精(DP6)，如染色微晶纖維素)顯示高催化活性、而對(duì)低分子量碳水化合物底物基本不顯示催化活性的能力來(lái)證明。
還發(fā)現(xiàn)由至少兩種溶纖維素成分組成的纖維素酶組合物互補(bǔ)用于洗滌劑組合物，第一成分對(duì)染色微晶纖維素顯示低度活性而對(duì)短纖維寡糖顯示高度活性，第二成分對(duì)染色微晶纖維素顯示高度活性，以提高用于洗滌含纖維素織物(如棉織物)時(shí)的洗滌劑性能，尤其是在不損害織物條件下獲得顆粒污物去除作用(第一成分)和更好的清色作用(第二成分)。
本發(fā)明還涉及及含有所述第一和第二纖維素酶成分的洗滌劑組合物，除以上益處外，其在蛋白酶存在下在重負(fù)(heavy duty)液體中的穩(wěn)定性提高。以前已觀察到纖維素酶對(duì)蛋白酶的作用敏感，即在洗滌劑中一般使用的蛋白酶存在下，纖維素酶降解為低分子量多肽，使目標(biāo)纖維素酶失活。
本發(fā)明組合物的第一種纖維素酶成分完全出人意料地顯示在中性PH下在含高水平洗滌蛋白酶的重負(fù)液體洗滌劑組合物中性能活性的高穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)該纖維素酶成分的性能穩(wěn)定性對(duì)含有以硼酸為主的常規(guī)可逆性蛋白酶抑制劑的重負(fù)液體組合物中蛋白酶的降解敏感性較低。
該中性PH重負(fù)液體組合物在其表面活性劑組成、蛋白酶和蛋白酶可逆性抑制劑的水平方面可在寬范圍內(nèi)變化，而不喪失本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)。本申請(qǐng)實(shí)施例部分描述了含有上述第一和第二纖維素酶成分的本發(fā)明洗滌劑組合物的典型實(shí)例。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含第一和第二纖維素酶成分的洗滌劑添加劑，所述第一纖維素酶具有去除顆粒污物的能力，第二纖維素酶具有清色能力，其中至少一種纖維素酶成分為單一成分。
本發(fā)明的又一目的是提供一種在洗滌機(jī)中處理織物的方法，其包括應(yīng)用本發(fā)明的洗滌劑組合物。
附圖本發(fā)明通過(guò)附圖作進(jìn)一步說(shuō)明，其中

圖1表示保持型葡萄糖苷酶的機(jī)制；和圖2表示逆轉(zhuǎn)型葡萄糖苷酶的機(jī)制。
在本說(shuō)明書和權(quán)利要求中，術(shù)語(yǔ)“纖維素酶成分”指水解纖維素的酶。纖維素酶成分可為給定微生物產(chǎn)生的纖維素酶系統(tǒng)中存在的成分，這種纖維素酶系統(tǒng)大多含有數(shù)種不同的纖維素酶成分，包括通常鑒別為如纖維生物水解酶、外切纖維生物水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶的那些。
或者，纖維素酶成分可為單一成分，即基本不合通常存在于給定微生物產(chǎn)生的纖維素酶系統(tǒng)中的其他纖維素酶成分，該單一成分為重組成分，即克隆編碼該單一成分的DNA序列，然后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)，參見，如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 91/17243和WO 91/17244，將它們并入本文作為參考。宿主優(yōu)選為異源宿主，但在某些條件下，也可以是同源性宿主。
本文所用術(shù)語(yǔ)“纖維素酶蛋白重量”指構(gòu)成纖維素酶成分的蛋白重量。
本文所用“清色作用”指通過(guò)多次洗滌循環(huán)去除衣服和/或織物表面的絨毛和小球從而保持原始的顏色。
本文所用術(shù)語(yǔ)“顆粒污物去除作用”指對(duì)被污物顆?；蜾亸?jiān)诳椢锉砻娴奈⑿±w維羅網(wǎng)的其它不溶物顆粒所污染的含纖維素織物或衣服的更強(qiáng)的清潔作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“保持型活性”指(第一)纖維素酶成分催化水解的立化化學(xué)過(guò)程，其中(保持型糖苷酶)的機(jī)制如圖1中所示，參見Chem.Rev.，90，p.1171—1202(1990)(Sinott，M.L.酶促糖基轉(zhuǎn)移的催化機(jī)制)。離開具有保持型活性纖維素酶活性位點(diǎn)的裂解產(chǎn)物以及底物均為β-構(gòu)型，參見Eur.J.Biochem，217，p.947—953(1993)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)型活性”指其中(反轉(zhuǎn)型糖苷酶)的機(jī)制如圖2所示的纖維素酶成分催化水解的立體化學(xué)過(guò)程，參見Chem.Rev.，90，p.1171—1202(1990)(Sinott，M.L.酶促糖基轉(zhuǎn)移的催化機(jī)制)和Eur.J.Biochem，217，p.947—953(1993)。
糖苷鍵水解的立體化學(xué)一定由酶活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)決定，并常解釋為單置換或雙置換催化機(jī)制。相信在給定纖維素酶家族(參見Gene(Amst)，81，p.83—95(1989)和Biochem，J.，293，p.781—788(1993))中，甚至在它們的氨基酸保守率極低時(shí)也具有相似的折迭，并進(jìn)一步顯示給定纖維素酶家族的成員都具有相同的總體折選和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(J.Biochem，217，p.947—953(1993))。
另外，考慮第一纖維素酶成分可具有外切式作用。術(shù)語(yǔ)“外切一式作用”指從鏈的非還原端去除纖維二糖單位而開始纖維素的降解。
另外，考慮第二纖維素酶成分具有內(nèi)切一式作用。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切一式作用”指水解纖維素織物中低結(jié)晶度的無(wú)定形區(qū)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“(功能)區(qū)”指能夠完成某一具體任務(wù)的氨基酸序列。例如術(shù)語(yǔ)“碳水化合物結(jié)合區(qū)”或“纖維素結(jié)合區(qū)”(“CBD”)指能夠使酶與碳水化合物底物，尤其是纖維素結(jié)合的氨基酸序列，術(shù)語(yǔ)“催化活性區(qū)”(“CAD”)指能夠進(jìn)行催化裂解并具有一個(gè)或多個(gè)活性位點(diǎn)的氨基酸序列。CBD是一非催化功能區(qū)的實(shí)例。CAD和CBD可通過(guò)連接區(qū)連接或結(jié)合。參見Trends Biotechnol.，5，p.255—261(1987))和Microbiol.Rev.，55，p.303—315(1991)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“核心酶”指基本由單一切能區(qū)即催化活性區(qū)組成的酶，該酶沒(méi)有“尾”。
本文所用術(shù)語(yǔ)“對(duì)染色微晶纖維素的活性”指對(duì)用吸光/產(chǎn)熒光化合物(如活性染料)共價(jià)標(biāo)記的微晶纖維素的水解活性，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量模擬洗滌條件的條件下水解產(chǎn)生的標(biāo)記產(chǎn)物釋放量來(lái)測(cè)定，例如模擬堿性pH、溫度、持續(xù)時(shí)間、攪拌和洗滌劑濃度。該實(shí)驗(yàn)在“方法”下描述。
因此，對(duì)染色微晶纖維素顯示催化活性的纖維素酶成分一定在模擬洗滌條件下能夠從修飾的微晶纖維素上釋放標(biāo)記的可溶產(chǎn)物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“對(duì)短纖維寡糖的活性”指對(duì)含有兩個(gè)葡萄糖單位和一外加的離去基團(tuán)，如葡萄糖單位、或修飾的葡萄糖單位、或產(chǎn)色/產(chǎn)熒光基團(tuán)、或其他基團(tuán)的纖維寡糖的活性，造成糖苷鍵的斷裂，通過(guò)在模擬洗滌條件(如堿性PH、溫度、持續(xù)時(shí)間、攪拌和洗滌劑濃度)的條件下水解，測(cè)量還原性末端復(fù)原或產(chǎn)色或產(chǎn)熒光標(biāo)記化合物的釋放量來(lái)測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)在“方法”下描述。
因此，顯示對(duì)短纖維寡糖催化活性的纖維素酶在洗滌條件下一定能夠水解短纖維寡糖，即含有兩個(gè)葡萄糖單位和一外加離去基團(tuán)的纖維寡糖，外加離去基團(tuán)如為葡萄糖單位，或修飾的葡萄糖單位，或產(chǎn)色/產(chǎn)熒光基團(tuán)，或其他基團(tuán)。
本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“免疫反應(yīng)性”意指產(chǎn)生的蛋白可與針對(duì)原始纖維素—或半纖維素降解酶的抗體發(fā)生反應(yīng)。
本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“同系物”意指由如下DNA編碼的多肽，該DNA和編碼具有目標(biāo)氨基酸序列之纖維素酶成分的DNA在某些特定條件下與同一探針雜交[如在5×SSC中預(yù)浸并在20％甲酰胺溶液、5×Denhard’t溶液、50mM磷酸鈉(PH6.8)和50μg變性超聲處理牛胸腺DNA中-40℃預(yù)雜交1小時(shí)，然后在補(bǔ)有100μM ATP的相同溶液中于-40℃雜交18小時(shí)]。該術(shù)語(yǔ)意在包括目標(biāo)序列的衍生物，如通過(guò)在原序列C—末端和/或N—末端增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，在原序列中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、在原序列的任一末端或兩末端或在原序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基的殘基，或在原序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得。認(rèn)識(shí)到如上所述任何衍生物與同一探針雜交，這說(shuō)明本發(fā)明范圍內(nèi)的纖維素酶衍生物都與含目標(biāo)氨基酸序列的纖維素酶成分具有相同的優(yōu)良活性。另外，任何增加、取代、缺失或插入優(yōu)選涉及目標(biāo)序列的相當(dāng)有限數(shù)目的氨基酸，即小增加、取代、缺失或插入，因?yàn)轭A(yù)期大的增加、取代、缺失或插入可造成不滿足上述雜交要求的纖維素酶成分(多肽)。
本發(fā)明涉及一種洗滌劑組合物，它含有具有保持型活性和顆粒污物去除作用的第一纖維素酶成分，和包含至少一個(gè)與催化區(qū)結(jié)合的非催化區(qū)并具有清以作用的多功能區(qū)第二纖維素酶成分，其中至少一種纖維素酶成分為單一(重組)成分。
纖維素酶成分可使用任何適宜技術(shù)從目標(biāo)微生物獲得。例如，可通過(guò)用本領(lǐng)域中已知方法發(fā)酵微生物和從發(fā)酵液或微生物中分離含纖維素酶的制劑來(lái)獲得纖維素酶制劑，但更優(yōu)選使用本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)。這種方法一般包括在允許目標(biāo)酶表達(dá)的條件下、在培養(yǎng)基中、培養(yǎng)用能夠表達(dá)并攜帶纖維素酶成分編碼DNA的重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收酶。編碼纖維素酶之DNA序列的克隆可按本領(lǐng)域中熟知的各種方法從產(chǎn)生目標(biāo)纖維素酶的任何細(xì)胞或微生物分離編碼親本纖維素酶的DNA序列。首先應(yīng)使用來(lái)自產(chǎn)目標(biāo)纖維素酶的生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果纖維素酶的氨基酸序列已知，可合成同源性標(biāo)記寡核苷酸探針并用于從細(xì)菌DNA或從真菌cDNA文庫(kù)鑒定編碼纖維素酶的克隆。或者，含另一細(xì)菌或真菌菌株纖維素酶之同源序列的標(biāo)記寡核苷酶探針，可用于鑒定纖維素酶編碼性克隆，即通過(guò)雜交并用較低嚴(yán)格性洗滌條件來(lái)進(jìn)行。
還有一種鑒定產(chǎn)纖維素酶克隆的方法，它涉及將基因組DNA片段插入表達(dá)載體中(如質(zhì)粒)，用所形成的基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化不產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪在含纖維素酶底物的瓊脂上。那些含有攜纖維素酶之質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生周圍有清澈瓊脂暈的菌落，這是由于所分泌的纖維素酶對(duì)底物的消化。
或者，可按已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成制備編碼酶的DNA序列，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers在Tetrahedron Letters 22，1981，p.1859—1869中所述磷酸二酰胺法，或Matthes等在The EMBO J.3，1984，p.801—805中所述方法。按照磷酸二酰胺法，如在自動(dòng)DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化、退火、連接并克隆在適當(dāng)?shù)妮d體中。
最后，DNA序列可以是基因組和合成、合成和cDNA或基因組和cDNA的混合來(lái)源，這是按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接合成、基因組或cDNA來(lái)源的片段(適當(dāng)時(shí))而制得的，這些DNA片段相當(dāng)于整個(gè)DNA序列的各個(gè)部分。還可用特異探針通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)制備DNA序列，如按US 4683202或R.K.Saiki等，Science 239，1988，p.487—491中描述的方法。纖維素酶變體的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明，按上述方法或本領(lǐng)域已知的其他替代方法產(chǎn)生的突變的纖維素酶編碼序列可用表達(dá)載體表達(dá)成酶形式，表達(dá)載體一般包含編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)、和選擇性的抑制基因或各種活化基因的調(diào)控序列。為了能使表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌，可在纖維素酶編碼序列之前插入編碼“信號(hào)序列”的核苷酸。為了在調(diào)控序列的引導(dǎo)下表達(dá)，待處理的本發(fā)明靶基因在適當(dāng)?shù)拈喿x框架內(nèi)與調(diào)控序列有效地連接。能加入質(zhì)粒載體并能支持突變纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，包括但不限于原核β—內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa—Kamaroff等，1978，Proc.Natl，Acad.Sci.U.S.A.753737—3731)和tac啟動(dòng)子(DeBer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021—25)。還可參考Scientific Amcrican，1980，24274—94中的“來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白”。
按照一種實(shí)施方案，用帶有突變DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。如果在分泌性微生物如枯草芽孢桿菌中表達(dá)，信號(hào)序列之前可有翻譯起始信號(hào)，之后為目標(biāo)DNA序列。信號(hào)序列的作用是轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)產(chǎn)物至細(xì)胞壁，在此處分泌時(shí)則將信號(hào)序列從產(chǎn)物切下。以上定義的術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”包括存在的信號(hào)序列。
在一現(xiàn)優(yōu)選的生產(chǎn)本發(fā)明纖維素酶變體的方法中，絲狀真菌用作宿主生物。該絲狀真菌宿主可方便地為以前已用作產(chǎn)重組蛋白宿主的種類，如曲霉菌株，例如黑曲霉、構(gòu)巢曲霉或米曲霉。米曲霉在產(chǎn)生重組蛋白中的應(yīng)用廣泛描述在如EP 238 023中。
為了在曲霉中表達(dá)纖維素酶變體，在編碼纖維素酶變體的DNA序列之前加啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可為在曲霉中顯示強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可衍生自胞外或胞內(nèi)蛋白如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纖維素酶或糖酵解酶的編碼基因。
適宜啟動(dòng)子的實(shí)例為那些衍生自米曲霉TAKA淀粉酶、Rhi-zomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶編碼基因啟動(dòng)子。
具體講，當(dāng)宿主生物是米曲霉時(shí)，用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選啟動(dòng)子為米曲霉TAKA淀粉酶啟動(dòng)子，因?yàn)樗诿浊怪酗@示強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性。在EP 238 023中有TAKA淀粉酶啟動(dòng)子的序列。
終止序列和多聚腺苷化序列可適當(dāng)?shù)貋?lái)自啟動(dòng)子的同一來(lái)源。
對(duì)轉(zhuǎn)化真菌宿主細(xì)胞所用技術(shù)在EP 238 023中有適當(dāng)?shù)拿枋觥?br> 為了保證纖維素酶變體從宿主細(xì)胞分泌，編碼纖維素酶變體的DNA序列之前可加信號(hào)序列，它可以是天然存在的信號(hào)序列或其功能性部分或合成序列，只要能使蛋白從細(xì)胞中分泌即可。具體講，信號(hào)序列可衍生自曲霉淀粉酶或葡糖淀粉酶的編碼基因，Rhizo mucormiehei脂酶或蛋白酶的編碼基因，或腐質(zhì)霉纖維素酶、木聚糖酶或脂酶的編碼基因。該信號(hào)序列優(yōu)選衍生自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的編碼基因。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可為任何適于生長(zhǎng)曲霉細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化子通常是穩(wěn)定的，可在無(wú)選擇壓力下培養(yǎng)。但如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，可向細(xì)胞中引入選擇標(biāo)記用于選擇。
可通過(guò)熟知的步驟從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的成熟纖維素酶蛋白，包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，加鹽如硫酸銨從培養(yǎng)基中沉淀蛋白成分，然后經(jīng)層析步驟分離如離子交換層析、親和層析等分離。
本發(fā)明洗滌劑組合物含有的非單一重組成分可為常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生(如由給定微生物產(chǎn)生)的成分，作為纖維素酶體系的一部分。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)在異源宿主中克隆和表達(dá)產(chǎn)生的單一成分在洗滌劑給組合物中存在的量，以組合物中纖維素蛋白總重量為基礎(chǔ)計(jì)算，至少為5％，優(yōu)選至少10％，尤其是至少20％。
第一和第二成分兩者都可為重組(單一)成分，即，通過(guò)克隆編碼該單一成分的DNA序列，用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在異源或同源性宿主中表達(dá)。但第一和第二成分還可在同一異源或同源宿主中克隆和表達(dá)。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，在洗滌劑組合物中存在的第一和第二纖維素酶成分的纖維素酶蛋白重量比率優(yōu)選在約30∶1到約1∶30范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約10∶1到約1∶10范圍內(nèi)，尤其是在約2∶1到1∶2范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明所要求的洗滌劑組合物中應(yīng)優(yōu)選分別含有如下濃度的第一和第二纖維素酶成分，該濃度相當(dāng)于能使形成的洗液中每升含0.001—100mg纖維素酶蛋白的濃度。
優(yōu)選地，第一和第二纖維素酶成分分別為真菌或細(xì)菌纖維素酶成分，即真菌或細(xì)菌來(lái)源的。
設(shè)想第一和第二纖維素酶成分分別來(lái)自或分離和純化自己知能夠產(chǎn)生纖維素水解酶的微生物，如腐質(zhì)霉屬、牙孢桿菌屬、木霉屬、毀絲霉屬、Phanerochaete、Schizophyllum、青霉屬、曲霉屬和地霉屬(Geotricum)的種類。產(chǎn)生的成分可以是同源性或異源性成分。優(yōu)選這些成分是同源性的。但產(chǎn)自特異微生物并與針對(duì)高純度纖維素酶成分(它具有所希望的特性)的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的異源成分也是優(yōu)選的。
優(yōu)選地，第一纖維素酶對(duì)低分子量碳水化合物底物顯示催化活性，尤其是對(duì)纖維三糖在PH8.5的催化活性相當(dāng)于Kcat至少為0.01s-1。
第一纖維素酶不足以或不能夠提供清色作用，因而對(duì)染色微晶纖維素顯示低催化活性。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，第一纖維素酶成分為核心酶，即無(wú)“尾”或?yàn)閱我还δ軈^(qū)蛋白的纖維素酶。
可用于本發(fā)明洗滌劑組合物中的第一纖維素酶成分可方便地為與來(lái)自腐霉H.insolens DSM 1800的高純化～70KD纖維生物水解酶(EC3、2、1、91)抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的纖維生物水解酶成分，或?yàn)樵摗?0KD纖維生物水解酶顯示纖維素酶活性的同系物或衍生物。優(yōu)選的纖維生物水解酶成分具有所附SEQ ID NO1中所示在Nucle-ic Acid Research，vol，18(1990)，p668(De Oliviera，Alzevedo，M和Radford，A.)中所公開的氨基酸序列，或與所述序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選85％，尤其是至少90％同源性的所述纖維生物水解酶的變體。在以下實(shí)施例1中，稱該纖維素酶成分為CBH I。
另一優(yōu)選的纖維生物水解酶成分是由相當(dāng)于所附SEQ ID NO1的第1—449(部分)氨基酸序列的449個(gè)氨基酸的序列組成的核心酶(“核心CBH I”)。核心CBH I的表觀分子量為約48KD。
或者，第一纖維素酶成分可為與來(lái)自腐質(zhì)霉H.insolens，DSM1800的高純化～5.0KD內(nèi)切葡聚糖酶的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖成分，或者該～50KD內(nèi)切葡聚糖酶顯示纖維素酶活性的同系物或衍生物。優(yōu)選的內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID NO2中所示PCT專利申請(qǐng)WO 91/17244中圖14A—E公開的氨基酸序列，或與所述序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，尤其至少90％同源性的所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體。在下文實(shí)施例1中，稱該內(nèi)切葡聚糖酶成分為EGI。
或者，第一纖維素酶成分可為與來(lái)自尖鐮孢DSM 2672的高純化～50KD(表觀分子量，氨基酸組成相當(dāng)于45KD，外加2n糖基化位點(diǎn))內(nèi)切葡聚糖酶的抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶成分，或?yàn)樵摗?0KD切內(nèi)葡聚糖酶顯示纖維素酶活性的同系物或衍生物。優(yōu)選的葡聚糖酶成分具有SEQ ID NO3中所示、PCT專利申請(qǐng)WO91/17244圖3，中公開的氨基酸序列，或與所述序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選85％，尤其是至少90％同源性的所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體。在下述實(shí)施例1中，稱此內(nèi)切葡聚糖酶成分為EGI—F。
使用常規(guī)Taka啟動(dòng)子和AMG終止子，用含有相當(dāng)于SEQ IDNO3氨基酸序列之DNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，米曲霉可產(chǎn)生EGI—F纖維素酶成分?？捎藐?yáng)離子層析將EGI—F純化至同質(zhì)，其PI＞9。應(yīng)用Adv.Protein Chem，17，p.69—165(1962)(C.Tanford)中的PHKa值，基于氨基酸組成計(jì)算的PI為9。計(jì)算的摩爾消光系數(shù)為58180。
另一優(yōu)選的第一纖維素酶成分可為歐洲專利公開EP—A2—271004中公開的任何纖維素酶，該纖維素酶的非降解指數(shù)(NDI)不小于500，是一種最佳PH不低于7的親堿纖維素酶，或當(dāng)羧甲基纖維素(CMC)用作底物時(shí)在PH不低于8時(shí)的相對(duì)活性為最佳條件下活性的50％或更高；該纖維素酶優(yōu)先選自堿性纖維素酶K(由芽孢桿菌KSM—635，F(xiàn)ERM BP 1485產(chǎn)生)、堿性纖維素酶K—534(由芽孢桿菌KSM—53t，F(xiàn)ERM BP 1508產(chǎn)生)、堿性纖維素酶K—539(由芽孢桿菌KSM—539，F(xiàn)ERM BP 1509產(chǎn)生)，堿性纖維素酶K—577(由芽桿菌KSM—577，F(xiàn)ERM BP 1510產(chǎn)生)；堿性纖維素酶K—521(由芽桿菌KSM—521，F(xiàn)ERM BP 1507產(chǎn)生)；堿性纖維素酶K—580(由芽桿菌KSM—580，F(xiàn)ERM BP 1511產(chǎn)生)；堿性纖維素酶K—588(由芽桿菌KSM—588，F(xiàn)ERM BP 1513產(chǎn)生)；堿性纖維素酶K—597(由芽桿菌KSM—597，F(xiàn)ERM BP 1514產(chǎn)生)；堿性纖維素酶K—522(由芽桿菌KSM—522，F(xiàn)ERM BP 1512產(chǎn)生)；CMC酶I，CMC酶II(均由芽桿菌KSM—635，F(xiàn)ERM BP 1485產(chǎn)生)；堿性纖維素酶E—II和E—III(均由芽桿菌KSM—522，F(xiàn)ERM BP1512產(chǎn)生)。
具有清色能力的第二纖維素酶成分優(yōu)選具有多個(gè)功能區(qū)，即一個(gè)或多個(gè)催化區(qū)與一個(gè)或多個(gè)非催化區(qū)結(jié)合，如纖維素結(jié)合區(qū)，因?yàn)槔缋w維素結(jié)合位點(diǎn)的存在增強(qiáng)對(duì)清色作用的活性。
第二纖維素酶成分可具有保持型活性或反轉(zhuǎn)型活性。
優(yōu)選地，第二纖維素酶成分顯示對(duì)纖維糊精的高催化活性，更優(yōu)選對(duì)較長(zhǎng)鏈纖維糊精，尤其對(duì)還原的更長(zhǎng)鏈纖維糊精的高催化活性。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案中，第二纖維素酶成分顯示對(duì)染色微晶纖維素的高催化活性，特別是每1mg纖維素酶蛋白對(duì)紅微晶纖維素(Red Avicel)的催化活性高于10-4IU，1IU酶活性的定義見于“方法”下。
可用于本發(fā)明洗滌劑組合物中清色成分的(第二)纖維素酶成分通常對(duì)低分子量碳水化合物底物基本不顯示活性。優(yōu)選地，第二纖維素酶成分對(duì)低分子量碳水化合物底物(尤其對(duì)纖維三糖)在PH8.5下的催化活性相當(dāng)于Kcat低于0.01s-1；更優(yōu)選第二纖維素酶成分對(duì)纖維三糖基本不顯示催化活性，即該成分不能水解纖維三糖，但能夠水解β-1，4-葡萄糖單位的較高級(jí)寡聚物。
按“方法”下所述方法測(cè)量對(duì)紅微晶纖維素的催化活性。
雖然本發(fā)明洗滌劑組合物中存在第二纖維素酶成分的主要目的是該成分的清色能力，但第二成分常常還能夠去除顆粒污物。
可用于本發(fā)明洗滌劑組合物中的第二纖維素酶成分可方便地為與來(lái)自腐質(zhì)霉H.insolens DSM 1800的高純化～43KD內(nèi)切葡聚糖酶之抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶，或其為該～43KD內(nèi)切葡聚糖酶顯示纖維素酶活性的同系物或衍生物。優(yōu)選的內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID NO4中所示在PCT專利申請(qǐng)WO 91/17243中SEOID#2公開的氨基酸序列，或與所述序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選85％，尤其至少90％同源性的所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體。在下述實(shí)施例1中，稱此內(nèi)切葡聚糖酶為EG V。
另一優(yōu)選的內(nèi)切葡聚糖酶成分含有SEQ ID NO5所示、PCT專利申請(qǐng)WO 93/11249中SEQ ID#11公開的部分DNA序列編碼的氨基酸序列，或氨基酸序列與所述序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選85％，尤其是至少90％同源性的所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體。在下述實(shí)施例1中，該內(nèi)切葡聚糖酶被稱為EG VI。
又一優(yōu)選內(nèi)切葡聚糖酶成分含PCT專利申請(qǐng)WO 93/11249中SEQ ID#9(將其并入本文作為參考)公開的部分DNA序列編碼的氨基酸序列。下文實(shí)施例1中稱此內(nèi)切葡聚糖酶與EG II。
又一優(yōu)選內(nèi)切葡聚糖酶成分含有PCT專利申請(qǐng)WO 93/11249SEQ ID#7(將其并入本文作為參考)公開的部分DNA序列編碼的氨基酸序列。下文實(shí)施例1中稱此內(nèi)切葡聚糖酶為EG III。
或者，第二纖維素酶成分可為與來(lái)自芽孢桿菌B.lautus NCIMB40250的高純化～63KD內(nèi)切葡聚糖酶之抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶，或其為該～60KI內(nèi)切葡聚糖酶顯示纖維素酶活性的同系物或衍生物。優(yōu)選的內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID NO6中所示在PCT專利申請(qǐng)WO 91/10732中SEQ ID#7公開的氨基酸序列，或與所述序列具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選85％，尤其至少90％同源性的所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體。在下述實(shí)施例1中，稱此～60KD內(nèi)切葡聚糖酶為EG C。
在一特異方面，本發(fā)明提供洗滌劑添加劑。可通過(guò)加入含有一種或多種酶的不同添加劑，或通過(guò)加入包含所有這些酶的合并添加劑來(lái)向洗滌劑組合物中加入酶。本發(fā)明的洗滌劑添加劑(即分離的或全并的添加劑)可被配制成如顆粒、液體、漿液等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制物為顆粒(尤其是非粉塵顆粒)、液體(尤其是穩(wěn)定化液體)、漿液、或保護(hù)的酶。
可按如US 4 106 991和US 4661 452中公開的方法制備無(wú)粉塵顆粒，可任選按本領(lǐng)域已知的方法將其包衣。洗滌劑酶可在制粒前或后進(jìn)行混合。
液體酶制劑例如可通過(guò)加入諸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如硼酸芳酯)進(jìn)行穩(wěn)定化，可按已有方法配制該制劑。其他酶穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。可按EP 238 216中公開的方法制備保護(hù)的酶。洗滌劑組合物可將本發(fā)明的洗滌劑組合物配制成任何方便的形式，如粉末或液體。本發(fā)明的洗滌劑組合物可含有本領(lǐng)域中已知的其它洗滌劑成分，如實(shí)施例中所示的助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、抗污物再沉劑、香料等等。
另外，洗滌劑組合物含有表面活性劑，其可為陰離子、非離子、兩性、陽(yáng)離子或兩性離子型以及這些類型的混合物。
1972年5月23日授予Norris等的美國(guó)專利366 4 961中給出了這些表面活性劑的典型實(shí)例。
陰離子表面活性劑的混合物在本申請(qǐng)中尤其適用，如磺酸鹽和硫酸鹽表面活性劑的混合物，其重量比為5∶1至1∶2，優(yōu)選3∶1至2∶3，更優(yōu)選3∶1至1∶1。優(yōu)選的磺酸鹽，包括烷基中含9—15(尤其是11—13)個(gè)碳原子的磺酸鹽，包括烷基中含9—15(尤其是11—13)個(gè)碳原子的烷基苯磺酸鹽，和α-磺酸化脂肪酸甲酯，其中脂肪酸衍生自C12-C18脂肪源，優(yōu)選C16-C18脂肪源。每種情況下陽(yáng)離子為堿金屬，優(yōu)選鈉。優(yōu)選的硫酸鹽表面活性劑為烷基中含12—18個(gè)碳原子的烷基硫酸鹽，其任選與烷基中含10—20(優(yōu)選10—16)個(gè)碳原子、平均乙氧基化度為1—6的乙氧基硫酸鹽混合。本發(fā)明中優(yōu)選的烷基硫酸鹽的實(shí)例為牛脂烷基硫酸鹽、椰子烷基硫酸鹽、和C14-15烷基硫酸鹽。每種中的陽(yáng)離子也是堿金屬陽(yáng)離子，優(yōu)選鈉離子。還優(yōu)選用于本發(fā)明的是硫酸鹽和/或乙氧基硫酸鹽的混合物。
可用于本發(fā)明的一類非離子表面活性劑是環(huán)氧乙烷與疏水殘基的縮合物，以提供平均親水—親脂平衡值(HLB)為8—17，優(yōu)選9.5—13.5，更優(yōu)選10—12.5的表面活性劑。疏水(親脂)殘基可為脂肪或芳香性質(zhì)，可對(duì)與任何特定疏水基團(tuán)縮合的聚氧亞乙基的長(zhǎng)度方便地進(jìn)行調(diào)節(jié)，以產(chǎn)生親水和疏水元件間具有適當(dāng)平衡度的水溶性化合物。
特別優(yōu)選的此類非離子表面活性劑為含3—8摩爾環(huán)氧乙烷/摩爾醇的C9-C15伯醇乙氧基化物，尤其是含6—8摩爾環(huán)氧乙烷/摩爾醇的C14-C15伯醇和含有3—5摩爾環(huán)氧乙烷/摩爾醇的C12-C14伯醇。
另一類非離子表面活性劑包括以下通式的烷基聚葡糖苷化合物RO(CnH2nO)tZx其中Z為葡萄糖衍生的殘基；R為含12—18個(gè)碳原子的疏水烷基；t為0—10，n為2或3；x為1.3—4，該化合物包含10％以下的未反應(yīng)脂肪醇和50％以下的短鏈烷基聚葡糖苷。EP—B—0070077,0075996和0094 118中公開了這類化合物和其在洗滌劑中的應(yīng)用。
合適的非離子表面活性劑還有下式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑或其烷氧基化衍生物 其中R1為H、C1-4烴基、2-羥乙基、2-羥丙基或其混合物，R2為C5-31烷基，及Z為具有線性烴鏈及至少3個(gè)直接與此鏈連接的羥基的多羥基烴基。優(yōu)選，R1為甲基，R2為C11-15烷基或鏈烯基直鏈如椰子烷基或其混合物，Z從還原性糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖在還原胺化反應(yīng)中衍生而來(lái)。
又一類表面活性劑是諸如胺氧化物的半極性表面活性劑。適合的胺氧化物選自單C8-C20(優(yōu)選C10-C14)N—烷基或鏈烯基胺氧化物，和亞丙基-1，3-二胺二氧化物，其中剩余的N位由甲基、羥乙基或羥丙基取代。
另一類表面活性劑是兩性表面活性劑，如基于多胺的種類。
陽(yáng)離子表面活性劑也可用于本發(fā)明洗滌劑組合物中，適當(dāng)?shù)募句@表面活性劑選自單C8-C16(優(yōu)選C10-C14)N—烷基或鏈烯基銨表面活性劑，其中剩余的N位被甲基、羥乙基或羥丙基取代。
優(yōu)選各種類表面活性劑的混合物，更優(yōu)選陰離子—非離子混合物，也優(yōu)選陰離子—非離子—陽(yáng)離子混合物。尤其優(yōu)選的混合物描述在英國(guó)專利2040987和歐洲專利申請(qǐng)公開0087914中。洗滌劑組合物可包含1％—70％(重量)的表面活性劑，但在本發(fā)明組合物中存在的表面活性劑量一般為1％至30％，更優(yōu)選10—25％(重量)。助洗劑助洗劑材料一般占本發(fā)明洗滌劑組合物的5％至80％。本發(fā)明組合物不含或基本沒(méi)有含磷酸鹽組洗劑(此處“基本沒(méi)有”定義為構(gòu)成洗滌劑助洗劑總系統(tǒng)的1％以下)，本發(fā)明助洗劑系統(tǒng)由水溶性助洗劑、水不溶性助洗劑、或其混合物組成。
水不溶性助洗劑可為無(wú)機(jī)離子交換材料，一般為無(wú)機(jī)水合硅鋁酸鹽材料，更優(yōu)選水合合成沸石，如水合沸石A，X，B，MAP或HS。
優(yōu)選的硅鋁酸鹽離子交換材料具有如下晶胞式Mz[(AlO2)2(SiO2)Y]XH2O其中M為鈣交換陽(yáng)離子，z和y至少為6；x與y的摩爾比為1.0至0.5，x至少為5，優(yōu)選為7.5至276，更優(yōu)選為10至264。該硅鋁酸鹽呈水合形式，優(yōu)選含10％至28％、更優(yōu)選18％至22％水的晶體。
上述硅鋁酸鹽離子交換材料進(jìn)一步用粒徑表征，其為0.1到10微米，優(yōu)選為0.1—4微米。本文中的術(shù)語(yǔ)“粒徑”代表通過(guò)常規(guī)分析技術(shù)如掃描電子顯微鏡的測(cè)定測(cè)得的給定離子交換材料的平均顆粒直徑。該硅鋁酸鹽離子交換材料進(jìn)一步用其鈣離子交換容量來(lái)表征，其以無(wú)水物計(jì)算為至少200mg當(dāng)量CaCO3水硬度/g硅鋁酸鹽，一般在300mg eq./g到352mg eq./g范圍內(nèi)。該硅鋁酸鹽離子交換材料進(jìn)一步用其鈣離子交換率來(lái)表征，詳細(xì)描述見GB—1,429,143。
用于實(shí)施本發(fā)明的硅鋁酸離子交換材料是市場(chǎng)上可得到的，可為天然物質(zhì)，但優(yōu)選是合成衍生的。美國(guó)專利3,985,669中討論了一種生產(chǎn)硅鋁酸鹽離子交換材料的方法。優(yōu)選的可用于本發(fā)明的合成結(jié)晶硅鋁酸鹽離子交換材料有沸石A、沸石B、沸石X、沸石MAP、沸石HS和其混合物。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)晶硅鋁酸鹽離子交換材料是沸石A，并具有下式Na12[(AlO2)12(SiO2)12]xH2O其中X為20—30，尤其為27。具有式Na86[(AlO2)86(SiO2)106]—10.276H2O的沸石X，以及式Na6[(AlO2)6(SiO2)6]7.5H2O的沸石HS也適用。
另一適合的水不溶性無(wú)機(jī)助洗劑材料是層狀硅酸鹽，如SKS—6(Hoechst)。SKS—6是一種由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶層狀硅酸鹽。高Ca2+/Mg2+結(jié)合溶量主要是陽(yáng)離子交換機(jī)制。在熱水中該材料變得較易溶解。
水溶性助洗劑可為單體或寡聚的羧酸螯合劑。
含一個(gè)羧基的適當(dāng)羧酸包括乳酸、乙醇酸和其酯衍生物，如比利時(shí)專利831368，821369和821370中所述。含兩個(gè)羧基的多元羧酸包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來(lái)酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及德國(guó)專利公開2,446,686和2,446,687和美國(guó)專利3,935,257中公開的醚羧化物，和比利時(shí)專利840,623中描述的亞磺酰羧化物。含三個(gè)羧基的多元羧酸特別包括水溶性檸檬酸鹽、烏頭酸鹽和檸康酸鹽，以及琥珀酸衍生物如英國(guó)專利1,379,241中描述的羧甲基氨基琥珀酸鹽、荷蘭專利申請(qǐng)72058 73中描述的乳酸氧基琥珀酸鹽(lactoxysuccinates)，和氧雜多元羧酸如美國(guó)專利1,387,447中描述的2-氧雜-1，1，3-丙烷三羧酸鹽。
含有4個(gè)羧基的多元羧酸包括英國(guó)專利1,261,829中公開的氧雜二琥珀酸，1，1，2，2-乙烷四羧酸，1，1，3，3-丙烷四羧酸和1，1，2，3-丙烷四羧酸。含有磺基的多元羧酸包括英國(guó)專利1,398,421和1,398,422和美國(guó)專利3,936,448中公開的磺基琥珀酸衍生物，和英國(guó)專利1,082,1 79中描述的磺酸化熱解檸檬酸，而含膦酸取代基的多元羧酸公開在美國(guó)專利1,439,000中。
脂環(huán)或雜環(huán)多元羧酸包括環(huán)戊烷—順，順，順—四羧酸，環(huán)戊二烯五羧酸，2，3，4，5-四氫呋喃—順，順，順—四羧酸，2，5-四氫呋喃—順—二羧酸，2，2，5，5-四氫呋喃—四羧酸，1，2，3，4，5，6-己烷—六羧酸和多元醇如山梨醇、甘露醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳族多元羧酸包括英國(guó)專利1,425,343中公開的苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和二苯甲酸衍生物。
上述羧酸中，優(yōu)選的多元羧酸是每分子含至多三個(gè)羧基的羥基羧酸，尤其是檸檬酸。
用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選助洗系統(tǒng)包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑如沸石A和水溶性羧酸螫合劑如檸檬酸的混合物。
可形成本發(fā)明助洗劑系統(tǒng)之部分的其他助洗劑材料包括無(wú)機(jī)物，如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機(jī)物，如有機(jī)膦酸、氨基聚亞烷基膦酸和氨基多元羧酸。
其他適當(dāng)?shù)乃苄杂袡C(jī)鹽為均聚或共聚酸或其鹽，其中該聚羧酸包括被不多于2個(gè)碳原子彼此分隔的至少2個(gè)羧基。
此類聚合物公開于GB—A—1,596,756中。這種鹽的實(shí)例為MW 2000—5000的聚丙烯酸鹽和它們與馬來(lái)酸酐的共聚物，如分子量為20,000—70,000(尤其是約40,000)的共聚物。任選成分本發(fā)明組合物典型含有一般構(gòu)成洗滌劑組合物一部分的任選成分。這種任選成分的實(shí)例有防再沉劑和污物懸浮劑、熒光增白劑、漂白劑、漂白活化劑、抑泡劑、防結(jié)塊劑、染料和顏料，可加入所需的不同量。
適于本發(fā)明的防再沉劑和污物懸浮劑包括纖維素衍生物如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，及均聚或共聚羧酸或其鹽。這類聚合物包括以上提及作為助洗劑的聚丙烯酸和馬來(lái)酸酐—丙烯酸共聚物，以及馬來(lái)酸酐與乙烯、甲基乙烯基醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中馬來(lái)酸酐構(gòu)成共聚物的至少20mol％。這些物質(zhì)一般以組合物重量的0.5％—10％，更優(yōu)選0.75％—8％，更優(yōu)選1％—6％的重量使用。
優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子性質(zhì)，其實(shí)例有4，4’-二-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉，4，4’-二-(2-嗎啉代-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-22’-二磺酸二鈉，4，4-二-(2，4-二苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉，4’，4”-二-(2，4-二苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-2-磺酸鈉，4，4’-二-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)茋-2，2’-二磺酸二鈉，4，4’-二-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)茋-2，2’-二磺酸二鈉，4，4’-二-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)茋-2，2’-二磺酸二鈉，2-(茋基-4”-(萘并-1’，2’4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸鈉和4，4’-二(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
可使用任何顆料無(wú)機(jī)過(guò)氧化物漂白劑，其用量為組合物重量的3—40％，更優(yōu)選8—25％，最優(yōu)選12—20％(重量)。這種漂白劑的優(yōu)選實(shí)例是過(guò)硼酸鈉單水合物和四水合物，過(guò)碳酸鹽和其混合物。
例如過(guò)碳酸鹽顆粒與洗滌劑粉末中其它粒狀成分干混合。
本發(fā)明組合物含有1—40％，優(yōu)選3—30％，最優(yōu)選5—25％(重量)的堿金屬過(guò)碳酸鹽漂白劑；其呈平均直徑為250—900μm，優(yōu)選500—700μm的顆粒形式。
當(dāng)本發(fā)明組合物為洗衣活性時(shí)，過(guò)碳酸鹽的水平一般為20％到80％(重量)。
堿金屬過(guò)碳酸鹽漂白劑一般呈鈉鹽形式。過(guò)碳酸鈉是相當(dāng)于式2Na2CO3·3H2O2的添加化合物。為了增強(qiáng)儲(chǔ)存穩(wěn)定性，過(guò)碳酸漂白劑可進(jìn)一步用堿金屬硫酸鹽和碳酸鹽的混合鹽包衣。在1977年3月9日授予Interox的英國(guó)專利1,466,799中已描述了這種包衣及包衣方法?；旌消}包衣材料與過(guò)碳酸鹽的重量比在1∶2000至1∶4范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1∶99至1∶9，最優(yōu)選在1∶49∶1∶19。優(yōu)選該混合鹽為硫酸鈉和碳酸鈉的混合鹽，其通式為Na2SO4·n·Na2CO3，其中n為0.1—3，優(yōu)選n為0.3—1.0，最優(yōu)選n為0.2—0.5。
其他適合的包衣材料為硅酸鈉，SiO2∶Na2O比率為1.6∶1至2.8∶1，及硅酸鎂。
市場(chǎng)供應(yīng)的碳酸鹽/硫酸鹽包衣的過(guò)碳酸鹽漂白劑可包括少量重金屬螯合劑如EDTA，1-羥基亞乙基1，1-二膦酸(HEDP)或氨基膦酸鹽，在制備過(guò)程中加入之。按如上所述加入的優(yōu)選的重金屬螯合劑包括有機(jī)膦酸鹽和氨基亞烷基多(亞烷基膦酸鹽)(如乙烷1-羥基二膦酸堿金屬鹽)、次氮基—三亞甲基膦酸鹽、乙二胺四亞甲基膦酸鹽和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸鹽。
特別當(dāng)制備洗衣用洗滌劑組合物時(shí)，含過(guò)碳酸鹽洗滌劑粉末的堆集密度優(yōu)選為650g/l以上。
另一優(yōu)選的另行混合的成分為過(guò)氧羧酸漂白前體，一般稱為漂白活化劑，其優(yōu)選以顆粒狀或凝結(jié)形式加入。在美國(guó)專利1586769和214 3231中公開了此類化合物的適合例子，在歐洲專利公開0 062523中描述了將其制成粒狀的方法。這種化合物的優(yōu)選實(shí)例是四乙酰乙二胺和3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸鈉。
一般使用組合物重量0.5—10％(重量)，更常用1—8％，優(yōu)選2—6％水平的漂白活化劑。
另一任選成分是抑泡劑，例如硅氧烷、硅石—硅氧烷的混合物。硅氧烷的一般代表是烷基化聚硅氧烷材料，而硅石一般使用粉碎形式如硅石氣溶膠和干凝膠，及各種類型的疏水硅石?？梢灶w粒形式加入這些材料，其中抑泡劑以有利于釋放的形式結(jié)合在水溶性或水不溶性、基本非表面活性的洗滌劑不可滲透的載體中?；蛘?，抑泡劑可溶解或分散在液體載體中，通過(guò)噴霧施于一種或多種其他成分上。
如上所述，有用的硅氧烷泡沫控制劑可包括前文提到的烷基化聚硅氧烷類別與固態(tài)硅石的混合物。可通過(guò)將硅氧烷添加到固體硅石的表面制備這種混合物。優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑的代表是粒徑為10—20mμ、比表面積大于50m2/g疏水硅烷化(最優(yōu)選三甲基硅烷化)硅石與分子量為約500到約200,000的二甲基硅氧烷液體緊密混合，硅氧烷與硅烷化硅石的重量比為約1∶1到約1∶2。
Bartollota等的美國(guó)專利3,933,672中公開了一種優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑。其他特別有利的抑泡劑是自乳化硅氧烷抑泡劑，見1977年4月28日公布的德國(guó)專利申請(qǐng)DTOS 2,645,126中。這種化合物的一個(gè)例子是DC—544，Dow Corning有商品供應(yīng)，這是一種硅氧烷/甘醇共聚物。
以上描述的抑泡劑一般以組合物重量的0.001％—2％，優(yōu)選0.01％—1％(重量)的水平使用。關(guān)于泡沫改性劑的摻入，優(yōu)選將其制成單獨(dú)的顆粒，這使得其中可含有其他泡沫控制劑如C20-C24脂肪酸、微晶纖維素蠟和高分子量環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷共聚物，否則這些物質(zhì)對(duì)基質(zhì)的分散有不利影響。在前述Bartolotta等的美國(guó)專利3,933,672中公開了這種泡沫改性顆粒的制備技術(shù)。
其他有用的聚合物是聚乙二醇，特別是那些分子量為1000—10000，更優(yōu)選2000—8000，最優(yōu)選約4000的聚乙二醇。它們以0.20—5％，更優(yōu)選0.25％—2.5％(重量)的水平使用。這些聚合物和前述均聚或共聚的聚羧酸鹽對(duì)改進(jìn)白度保持、織物灰沉積、和在過(guò)濾金屬雜質(zhì)存在下對(duì)粘土、蛋白和可氧化污物的清除性能有作用。
可用于本發(fā)明組合物的污物釋放劑通常是對(duì)苯二甲酸與二乙醇和/或丙二醇單元以各種排列形成的共聚物或三元共聚物。這種聚合物的例子公開了美國(guó)專利4116885和4711730和歐洲公開專利申請(qǐng)0272 033中。按照EP—A—0 272 033，一種特別優(yōu)選的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(PO-H)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG為-(OC2H4)O-，PO為(OC3H6O)，T為(PCOC6H4CO).
二甲基對(duì)苯二甲酸、二甲基磺基間苯二甲酸、乙二醇和1，2-丙二醇的隨機(jī)共聚物的改性聚酯是非常有用的，末端基團(tuán)主要由磺基苯甲酸酯組成，其次由乙二醇和/或丙二醇的單酯組成。目的是獲得兩端“主要”由磺基苯甲酸酯封端的聚合物，在本發(fā)明中，這里所說(shuō)的共聚物大部分是由磺基苯甲酸酯基團(tuán)封端的。但有些共聚物沒(méi)有完全被封端，因此其末端基團(tuán)可由乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯組成，即“其次”由這種末端組成。
本發(fā)明選擇的聚酯含有約46％(重)的二甲基對(duì)苯二甲酸、約16％(重)的1，2-丙二醇、約10％(重)的乙二醇、約13％(重)的二甲基磺基苯甲酸和約15％(重)的磺基間苯二甲酸，分子量為約3000。EP—A—311 342中描述了這些聚酯和其制備方法。
某些聚合物材料如典型分子量為5000—20000(優(yōu)選10000—15000)的聚乙烯吡咯烷酮還可用作防止洗滌過(guò)程中織物間不穩(wěn)定染料轉(zhuǎn)移的試劑。特別優(yōu)選的洗滌劑組分是結(jié)合了能提供一種顏色保護(hù)益處的技術(shù)。這種技術(shù)的實(shí)例是如共同未決的歐洲專利申請(qǐng)92.202.108.6(以下將公開)中公開的含聚酰胺-N-氧化物的聚合物。
這些聚合物含有以下結(jié)構(gòu)式I的單元 (I)其中P為可聚合單元，其上可結(jié)合N—O基團(tuán)，或其中N—O基團(tuán)形成可聚合單元的一部分或兩者的結(jié)合；A為 -O-，-S-， X為0或1；R為脂族、乙氧基化脂族、芳族、雜環(huán)或脂環(huán)基團(tuán)或其任意組合，其上可結(jié)合N—O基團(tuán)的氮原子或N—O基團(tuán)的氮原子為這些基團(tuán)的一部分。
N—O基團(tuán)可由以下通式代表 其中R1、R2和R3為脂族、芳族、雜環(huán)或脂環(huán)基團(tuán)或其組合，x或/和y或/和z為0或1，其中可結(jié)合N—O基團(tuán)的氮，或N—O基團(tuán)的氮構(gòu)成這些基團(tuán)的一部分。
其中N—O基團(tuán)構(gòu)成可聚合單元一部分的適當(dāng)聚胺N—氧化物包括其中R選自脂族、芳族、脂環(huán)或雜環(huán)基團(tuán)的聚胺N—氧化物。一類所述聚胺N—氧化物包括其中N—O基團(tuán)氮原子構(gòu)成R—基團(tuán)一部分的聚胺N—氧化物。優(yōu)選的聚胺N—氧化物是其中R為雜環(huán)基團(tuán)如吡啶、吡咯、咪唑、吡咯烷、哌啶、喹啉、吖啶和其衍生物的那些。另一類所述聚胺N—氧化物包括其中N—O基團(tuán)氮原子與R—基團(tuán)連接的聚胺N—氧化物。
其他適合的聚胺N—氧代物是其中N—O基團(tuán)結(jié)合在可聚合單元上的聚胺氧化物。這些聚胺N—氧化物的優(yōu)選類別是這樣的通式(I)聚胺N—氧代物，其中R為芳族、雜環(huán)或脂環(huán)基團(tuán)，其中N—O功能團(tuán)的氮原子為R基團(tuán)的一部分。
這些類別的實(shí)例是其中R為雜環(huán)化合物如吡啶、吡咯、咪唑和其衍生物的聚胺氧化物。
另一類優(yōu)選的聚胺N—氧化物是這樣的通式(I)聚胺氧化物，其中R為芳族、雜環(huán)或脂環(huán)基團(tuán)，其中N—O功能團(tuán)的氮與所述R基團(tuán)連接。
這類的實(shí)例是其中R可為芳基如苯基的聚胺氧化物。
可使用任何聚合物骨架，只要形成的胺氧化物聚合物是水溶性的并具有染料轉(zhuǎn)移抑制性能。適當(dāng)?shù)木酆瞎羌艿膶?shí)例有聚乙烯、聚烯烴、聚酯、聚醚、聚酰胺、聚酰亞胺、聚丙烯酸及其混合物。
本發(fā)明胺N—氧化物聚合物中典型的胺與胺N—氧化物比率為10∶1到1∶1000000。但含聚胺N—氧化物聚合物中存在的氧化胺量，可經(jīng)適當(dāng)?shù)墓簿刍蜻m當(dāng)程度的N—氧化來(lái)改變。胺與胺N—氧化物的優(yōu)選比率為2∶3到1∶1000000，更優(yōu)選為1∶4到1∶1000000，最優(yōu)選1∶7到1∶1000000。該聚合物包括隨機(jī)或嵌段共聚物，其中一類單體為胺N—氧化物，另一類單體是或不是胺N—氧化物。聚胺N—氧化物的胺N—氧化物單元的pKa＜10，優(yōu)選pKa＜7，更優(yōu)選pKa＜6。
可獲得幾乎任何聚合度的含聚胺N—氧化物的聚合物。聚合度并不關(guān)鍵，只要使材料具有所希望的水溶解度和染料吸著力。
含聚胺N—氧化物的聚合物平均分子量典型為500到1000，000，優(yōu)選為1000到50,000，更優(yōu)選為2000到30,000，最優(yōu)選為3,000到20,000。
含聚胺N—氧化物的聚合物的存在量一般為洗滌劑組合物重的0.001—10％，更優(yōu)選0.01—2％，最優(yōu)選0.05—1％(重量)。
其他顏色保護(hù)技術(shù)可基于過(guò)氧化物酶的應(yīng)用。
還可以向本發(fā)明洗滌劑組合物中加入織物軟化劑。這些軟化劑可以是無(wú)機(jī)或有機(jī)型。無(wú)機(jī)軟化劑例如為GB—A—1,400,898中公開的綠土粘土。有機(jī)織物軟化劑包括GB—A—1514276和EP—B—0,011,340中公開的水不溶性叔胺，和它們與EP—B—0,026,527和EP—B—0,026,528中公開的C12-C14季銨鹽的組合，及EP—B—0,242,919中公開的二—長(zhǎng)鏈酰胺。其他有用的織物軟化系統(tǒng)有機(jī)成分包括如EP—A—0,299,575和0,313,146中公開的高分子量聚氧化乙烯材料。
綠土粘土的用量一般為5—20％，更優(yōu)選為8—15％(重量)，該物質(zhì)作為干混合成分被加入到配方的其余物質(zhì)中。有機(jī)織物軟化劑如水不溶性叔胺或二—長(zhǎng)鏈酰胺材料的用量為0.5—5％(重量)，一般為1—3％(重量)，而高分子量聚氧化乙烯材料和水溶性陽(yáng)離子物質(zhì)的加入量為0.1—2％，一般為0.15—1.5％(重量)。這些物質(zhì)一般加在組合物的噴霧干燥部分，雖然有時(shí)作為干混合顆粒加入，或作為熔化液體噴酒在組合物其他固體成分上更為方便。
除本發(fā)明洗滌劑組合物中含有的特異纖維素酶成分外，該組合物中可含有其他酶，如蛋白酶、脂酶、酯酶、過(guò)氧化物酶、氧化酶、淀粉酶和其他類纖維素酶。制備方法可通過(guò)各種方法制備本發(fā)明組合物，包括干混合、噴霧干燥、凝結(jié)和制粒以及這些技術(shù)的任何組合。優(yōu)選的制備方法制備本發(fā)明組合物的優(yōu)選方法涉及噴霧干燥、在高速混合器中凝結(jié)及干混合的組合。
將含相對(duì)不溶性陰離子表面活性劑的第一粒狀成分噴霧干燥，轉(zhuǎn)移部分噴霧干燥產(chǎn)品，向其上噴以少量非離子表面活性劑，然后與其余部分再混合。在連續(xù)高速混合機(jī)如Lodige KM混合機(jī)中，用碳酸鈉作為中和劑干中和陰離子表面活性劑制備第二粒狀成分。然后將第一和第二成分連同其他干混合成分如羧酸螫合劑、無(wú)機(jī)過(guò)氧化漂白劑、漂白活化劑、污物懸浮劑、硅酸鹽和酶一起送上傳送帶，它們從此被轉(zhuǎn)移到一水平旋轉(zhuǎn)的鼓上，在這里向產(chǎn)物上噴以香料和硅氧烷抑泡劑。在一特別優(yōu)選的組合物中，采用另一轉(zhuǎn)鼓混合步驟，其中引入少量(約2％)的研細(xì)的結(jié)晶硅鋁酸鹽，以增加密度和改進(jìn)顆粒流動(dòng)特征。
本發(fā)明洗滌劑組合物呈顆粒狀，用其密度來(lái)表征，其密度高于常規(guī)洗滌劑組合物的密度。在20℃測(cè)定的本發(fā)明組合物密度為550—950g/l，優(yōu)選為650—850g/l組合物。
本發(fā)明組合物的“緊密”形式最好地反映在無(wú)機(jī)填充鹽的量上；無(wú)機(jī)填充鹽是粉狀洗滌劑組合物的常規(guī)成分；在常規(guī)洗滌劑組合物中，填充鹽以顯著的量存在，典型地為組合物總重的17—35％。
在本發(fā)明組合物中，填充鹽的量不超過(guò)總組合物的15％，優(yōu)選不超過(guò)10％，最優(yōu)選不超過(guò)組合物重的5％。
本發(fā)明組合物中所用無(wú)機(jī)填充鹽選自堿金屬和堿土金屬的硫酸鹽和氯化物。
優(yōu)選的填充鹽為硫酸鈉。洗滌方法當(dāng)在洗滌機(jī)的主洗循環(huán)中使用較少量本發(fā)明組合物時(shí)，本發(fā)明緊密洗滌劑組合物就能達(dá)到常規(guī)洗滌劑組合物的相同效力。
因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種在洗滌機(jī)中洗滌織物的方法，其中主洗循環(huán)中本發(fā)明洗滌組合物的用量為15—170g。
在歐式條件下，推薦主洗循環(huán)中本發(fā)明洗滌劑組合物的典型用量為80—140g，無(wú)需預(yù)洗。
本發(fā)明組合物優(yōu)選直接輸送到轉(zhuǎn)筒中，而不是經(jīng)由機(jī)器的外殼間接加入。這一點(diǎn)很容易達(dá)到，將組合物裝入一袋或容器中，在洗滌循環(huán)開始時(shí)應(yīng)攪動(dòng)、升溫或轉(zhuǎn)筒中洗滌水的浸沒(méi)的反應(yīng)而從中釋放出該組合物。這種容器應(yīng)與待洗的織物一起放在轉(zhuǎn)筒中?；蛘呖墒瓜礈鞕C(jī)自身適于直接向轉(zhuǎn)筒加入組合物，例如在入口門處備一分配設(shè)置。
一般這樣設(shè)計(jì)其中洗滌劑組合物含于袋或容器中的產(chǎn)品，使得能在干燥狀態(tài)保持容器完整以防止內(nèi)容物在干態(tài)釋出，但該容器在洗滌環(huán)境中適于釋放內(nèi)容物，一般是在水溶液沒(méi)入時(shí)。
該容器通常具有柔韌性，如為袋或囊。這種袋可為纖維結(jié)構(gòu)，外包不透水的保護(hù)材料以保持內(nèi)容物，如歐洲專利申請(qǐng)0018678中公開的那種?；蛘撸捎刹蝗苄院铣删酆喜牧现瞥?，但設(shè)計(jì)邊界密封或閉合使其在水介質(zhì)中破裂，如歐洲公開的專利申請(qǐng)0011500、0011501、0011502和0011968中公開的那樣。遇水易破的閉合的一種方便形式是在由不透水的聚合物膜如聚乙烯或聚丙烯制成的袋囊的一個(gè)邊設(shè)置水溶性粘合劑并密閉。
作為這種袋或容器產(chǎn)品的一種變異形式，可使用迭片產(chǎn)品，其中中心柔韌層用組合物浸漬和/或包衣，然后加上一個(gè)或多個(gè)外層以產(chǎn)生織物樣美效果?？蓪⑦@些層封在一起以保持在使用時(shí)粘合，或與水接觸時(shí)分離以利于釋放包衣或浸漬材料。
另一迭層形式包括一個(gè)凹凸層或變形層，它提供一系列囊樣小容器，向每個(gè)小容器中存入定量的洗滌劑成分，第二層蓋在第一層上，并在囊樣容器間兩層接觸的地方與之封合。洗滌劑成分可以顆粒、糊狀或熔化形式存放在小容器中，迭片層應(yīng)阻止囊樣小容器中的內(nèi)容物在加入水中之前釋出。當(dāng)與水接觸時(shí)，各層可分離或可保持粘合在一起，唯一的要求是該結(jié)構(gòu)應(yīng)允許囊樣小容器的內(nèi)容物向溶液中迅速釋放。每單位面積底物的囊樣小容器的數(shù)目是個(gè)選擇問(wèn)題。但一般將在每平方米500～25,000間變化。
在本發(fā)明的這一方面，用作柔韌性迭片層的適宜材料包括海綿、紙和紡織物和無(wú)紡織物。
但用于本發(fā)明方法的優(yōu)選工具包括使用可重復(fù)用的分配裝置，其壁對(duì)液體可滲透但對(duì)固態(tài)組合物不可透過(guò)。
歐洲專利申請(qǐng)公開0343069和0344070中公開了這類裝置。后一申請(qǐng)中公開了這樣一種裝置，它包括一袋形柔片，該柔片從確定了一孔的支持環(huán)上伸展，該孔和袋相適應(yīng)以包含一個(gè)洗滌循環(huán)中所需的足夠產(chǎn)品。一部分洗滌介質(zhì)經(jīng)該孔流入袋中，溶解產(chǎn)物，然后溶液從該孔流出到洗滌介質(zhì)中。支持環(huán)上備有防止?jié)櫇穸慈芙獾漠a(chǎn)物外漏的設(shè)置，該設(shè)置一般包括一些徑向延伸壁，它們從一中央凸起以輻輪結(jié)構(gòu)向外延伸，或其中壁為螺旋形的相似結(jié)構(gòu)。方法對(duì)標(biāo)記微晶纖維素的活性測(cè)定紅微晶纖維素(Red Avicel)底物的制備紅微晶纖維素底物的制備如下Avicel是由日本Asashi Chemical Co.Ltd生產(chǎn)的一種微晶纖維素產(chǎn)品。162g Avicel相當(dāng)于形成Avicel纖維素聚合鏈的1摩爾葡萄糖單元。
活性染料使用英國(guó)皇家化學(xué)工業(yè)公司(ICI)生產(chǎn)的染料ProcionRed H—E3B。
按制造商提供的用于棉布染色的說(shuō)明，將活性染料與Avicel共價(jià)結(jié)合。
制備ProcionRed H—E3B在蒸餾水中的10g/l溶液，在20℃攪拌過(guò)夜將此溶液以5000rpm離心20分鐘，除去沉淀。
將10g Avicel置于一250ml錐形燒杯中。加入50ml染料溶液，于室溫下攪拌混合物1小時(shí)。將混合物慢慢加熱至50℃計(jì)30分鐘，然后加入1ml Na2SO4的熱水懸液(500克無(wú)水Na2SO4/l)。
將混合物慢慢加熱至90℃計(jì)約45分鐘。在此加熱過(guò)程中，約15分鐘后向混合物中加入3ml Na2SO4/熱水(500g無(wú)水Na2SO4/l)，30分鐘后再加入Na2SO4/熱水(500g無(wú)水的Na2SO4/l)。
將混合物于85℃靜置20分鐘。然后以5分鐘間隔加入3×1ml堿溶液(100g/l Na2CO3，4g/l NaOH)。將形成的混合物于85℃振搖1小時(shí)，再冷卻過(guò)夜。
此混合物于25℃以4000 rpm離心15分鐘。除去上清液，向沉淀中加入60ml水。在一磁力攪拌器上攪拌混合物30分鐘，然后離心15分鐘。重復(fù)這一步驟直到上清液無(wú)色為止，將形成的沉淀冷凍干燥，得到干燥的染色底物，紅微晶纖維素(Red Avicel)。
對(duì)紅微晶纖維素催化活性的測(cè)定方法制備0.1M Tris—HCl緩沖液(pH 7.5)中的底物懸液，它含有40g/l如上所制備的Red Avicel(相當(dāng)于5g染料/162g干Avicel)。
將待測(cè)的酶樣品溶于相同緩沖液中。
將0.5ml底物懸液和0.5ml酶溶液混合，并置于40℃恒溫的微生物搖床上。2小時(shí)后，以4000g 4℃離心混合物終止反應(yīng)。將上清液轉(zhuǎn)移到1cm石英杯中，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。
計(jì)算和結(jié)果定義通過(guò)在536nm濾長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)染色底物在85％磷酸中溶液的吸收度，來(lái)測(cè)定如上所制備的Red Avivel的總?cè)玖县?fù)載。對(duì)分別在85％磷酸和緩沖液中測(cè)得的吸收度之差進(jìn)行了校正。
比較分別在85％磷酸和Tris—HCl緩沖液中的(未結(jié)合)紅染料在536nm處測(cè)得的吸收度，以確定這一校正值。
吸收度(536nm)85％磷酸 0.1M Tris—HCl緩沖液0.1g/l未結(jié)合紅染料 0.88 O.D 0.93 O.DRed Avicel 44 O.D 46.5 O.D**計(jì)算值〔44 O.D.×(0.93/0.88)〕O.D光密度假設(shè)染色過(guò)程非常一致地沿著的水解敏感性曲線進(jìn)行，可以底物(Red Avicel)中每一摩爾葡萄糖單元的總?cè)玖县?fù)載(即每162g干AvicelR5g紅染料)計(jì)算從底物釋放的有色物的濃度。
所得的光密度(O.D)減去相應(yīng)的空白后對(duì)酶濃度(mg酶蛋白/ml)作圖?？瞻滓陨线_(dá)0.2 O.D.的曲線起始區(qū)用于計(jì)算。
因此，對(duì)Red Avicel(用DrocionRed H—E3B染色的Avicel，的1 IU酶活性定義為在1升總體積中，每分鐘能夠溶解1毫摩爾作為葡萄糖單元的有色物(相當(dāng)于0.046 O.D./分的Red Avicel)的酶量。
纖維素酶活性(S—CEVU)的測(cè)定纖維素酶水解CMC，從而增加保溫混合物的粘度。
根據(jù)AF 302/2—GB分析方法以S—CEVU測(cè)定纖維素酶活性，如果請(qǐng)求可從本申請(qǐng)人得到這一方法。
S—SEVU分析通過(guò)測(cè)定樣品降低羧甲基纖維素(CMC)溶液的粘度來(lái)對(duì)樣品中存在的催化活性進(jìn)行定量。在40℃、pH 7.5下用降低CMC底物粘度的相對(duì)酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行此分析。
對(duì)纖維三糖的纖維素酶活性通過(guò)聯(lián)合分析測(cè)定用Kcat(S-1)表示的對(duì)纖維三糖的纖維素酶活性
(催化劑纖維素酶)(催化劑葡糖氧化酶)(催化劑過(guò)氧化物酶)然后在418nm處用分光光度計(jì)測(cè)定吸收度(ABTSOX在418nm處的最大吸收度)。
方法使用GOD—Perid檢測(cè)試劑盒(可從Bochringer Mannheim購(gòu)得，art.124 036)。將試劑盒中的緩沖劑—酶溶液溶于500ml milliQ水中。調(diào)節(jié)溶液的pH至8.5(NaOH)。
將80mgABTSR(可從Bochringer Mcnheim購(gòu)得，art.756 407)溶于10ml GOD—Perid中，相當(dāng)于ABTSR總濃度為10mg/ml。
制備5mmol纖維三糖(可以Merck購(gòu)得，art.24741)在水中的底物原溶液(2.52mg/ml)。制備相當(dāng)于1000μmol、500μmol、376μmol、250μmol、100mo和60μmol的水稀釋液。
將一份底物溶液與一份GOD—Perid混合制備反應(yīng)混合物。
制備濃度為1.0—3.0μmol的待測(cè)纖維素酶的溶液。
混合50μl酶溶液和450μl反應(yīng)混合物。
在HP 8452A二極管陣列分光光度計(jì)上于40℃恒溫、用1cm石英杯在418nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)后每20秒測(cè)一次ABTS的氧化，共600秒。計(jì)算從Lineweaver—Burk曲線(1/V對(duì)1/〔S〕的曲線)計(jì)算對(duì)纖維三糖的纖維素酶活性用線性回歸分析確定斜率和截距。
計(jì)算中使用了下列常數(shù)
纖維毒酶ε＝66，310M-1·cm-1ABTSOX∶ε＝0.0323μmo1-1·cm-1下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明并有助于理解本發(fā)明。實(shí)施例1如上所述測(cè)定纖維素酶活性(以S—CEVU測(cè)定)，即分別測(cè)定對(duì)纖維三糖的活性和對(duì)染色微晶纖維素的活性。
對(duì)列于下表I中的酶(即纖維素酶)進(jìn)行這些測(cè)定，所測(cè)活性也列于此表中。CBH I、EG I和EG I—F具有保持型活性(Eur.J.Biochem.，217.P 947—953(1993))。
表I
*S-(纖維素酶粘度單位)
結(jié)果表明纖維素酶成分EG II、EG III、EG V、EG V核、EGD VI和EG C均對(duì)Red Avicel顯示催化活性，每毫克蛋白相當(dāng)于536nm波長(zhǎng)的收度大于10-4，與之相比，纖維素酶成分CBH I、EG I和EGI—F對(duì)Red Avicel的催化活性非常低。因此，當(dāng)用于洗滌含纖維素織物時(shí)，纖維素酶成分EG II、EG III、EG V、EG V核、EG VI和EGC具有清色能力并能有效地清色。所述纖維素酶成分還具有顆?；钚匀コ芰?，但它們的這種能力伴有中度織物損害作用，這與纖維素酶成分CBH I和EG I的顆粒污物去除能力不同，見下文。
另外，表明纖維素酶成分CBH I、EG I和EG I—F在pH 8.5對(duì)纖維三糖顯示催化活性，而EG II、EG III、EG V、EG C核、EG VI和EG C不對(duì)纖維三糖顯示任何活性。因此，當(dāng)以0.001—100mg劑量使用時(shí)，纖維酶成分CBH I、EG I—F和EG—I能有效去除顆粒污物而不損壞織物，并且無(wú)清色作用。實(shí)施例IIA.去色斑試驗(yàn)步驟將4塊炭黑沾染的布?jí)K(5×7.5cm)在一Linitest中洗滌，于40℃用10個(gè)不銹鋼球攪拌。洗滌劑濃度為0.7％，使用自來(lái)水。每個(gè)Linitest罐中裝有400ml洗滌溶液。洗滌循環(huán)時(shí)間為60分鐘。每個(gè)循環(huán)后，在自來(lái)水下分別漂洗每個(gè)布?jí)K。然后在一洗衣機(jī)中在一起漂洗所有布?jí)K。
參照洗滌劑是不合酶、不含染料轉(zhuǎn)移抑制劑聚合物的歐洲型洗滌劑，加檸檬酸至pH 7。
參照洗滌劑是不含酶和染料轉(zhuǎn)移抑制劑聚合物的歐洲型洗滌劑組合物，加檸檬酸至pH 7。
5次洗滌循環(huán)后與參照(無(wú)酶)相比進(jìn)行肉眼定級(jí)(*)。測(cè)定結(jié)果示于下表中。數(shù)據(jù)為4個(gè)內(nèi)衣布樣的平均值。
*0＝同樣好1＝稍好些3＝好許多4＝極好<
>實(shí)施例III到XIX
制備下列組合物，其中存在或向其中加入第一和第二纖維素酶成分。
a)緊密粒狀洗滌劑實(shí)施例III和IV。
實(shí)例 III IV牛脂烷基硫酸鹽 1.802.40C45烷基硫酸鹽 14.00 13.107倍乙氧基化C45醇4.004.0011倍乙氧基化牛脂醇 1.801.80分散劑 0.070.1硅氧烷液 0.800.80檸檬酸三鈉 14.00 15.00檸檬酸 3.003.00沸石 32.50 32.10馬來(lái)酸丙烯酸共聚物 5.005.00二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DETMPA)1.000.20蛋白酶(4 KNPU) 0.600.60脂酶(100 KLU)0.360.40淀粉酶(60 KNU) 0.300.30硅酸鈉 2.002.50硫酸鈉 3.505.20PVP 0.300.50小成分 達(dá) 100b)常規(guī)粒狀洗滌劑實(shí)施例V和VI實(shí)例 V VI烷基硫酸鹽 6.50 8.0硫酸鈉 15.0 18.0沸石A26.0 22.0次氮基三乙酸鈉 5.05.0PVP 0.50.7TAED 3.03.0過(guò)硼酸鹽 15.0-小成分 達(dá) 100c)液體洗滌劑實(shí)施例VII和VIII本發(fā)明的液體洗滌劑組合物含有有效量的第一和第二纖維素酶成分，優(yōu)選為組合物中纖維素酶蛋白重的0.0001％—10％，更優(yōu)選0.001％—1％，最優(yōu)選0.001％—0.1％。實(shí)例VII VIIIC12-14鏈烯基琥珀酸 3.0 8.0檸檬酸單水合物 10.015.0C12-15烷基硫酸鈉8.0 8.02倍乙氧基化C12-15醇的硫酸酯鈉鹽 - 3.07倍乙氧基化C12-15醇 - 8.05倍乙氧基化C12-15醇 8.0 -二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(DETMPA)0.2 -油酸1.8 -乙醇4.0 4.0
丙二醇2.02.0蛋白酶(4KNPU) 0.20.2PVP 1.02.0抑泡劑0.15 0.15NaOH 達(dá) PH7.5水和小成分達(dá) 100份d)粒狀洗滌劑組合物實(shí)施例IX—XIII本發(fā)明的粒狀洗滌劑組合物含有有效量的第一和第二纖維素酶成分，優(yōu)選為組合物中總纖維素酶蛋白重的0.001％—10％，更優(yōu)選0.005％—5％，最優(yōu)選0.01％—1％。
實(shí)例 IX X XI XII XIII烷基硫酸鹽 8.020.0 7 4.5 -烷基乙氧基硫酸鹽 2.06.0 5 5.5 9.53倍和7倍乙氧基化C25和C45醇的混合物 6.03.0 5 - -多羥基脂肪酸酰胺 2.5 -- - -線性烷基苯磺酸鹽- -- 4.0 100沸石 17.0 20.0 10.0 4.0 0.3層狀硅酸鹽/檸檬酸鹽16.0 12.5 10.0 4.0 0.3碳酸鹽 7.023.5 5.010.0240壬酰基己內(nèi)酰胺 - -5.0 - -馬來(lái)酸丙烯酸共聚物 5.0 -4.05.0 5.0污物釋放聚合物 0.4 -0.2 - -蛋白酶(4 KNPU) 2.51.5 0.31.0 1.5脂酶(100 KLU) 0.2 - 0.30.2 0.2過(guò)硼酸鹽- 3.0 - 22.0 -TAED 6.0 - - 6.0 -過(guò)碳酸鹽 22.0- 15.0- -EDDS 0.3 - 0.4 - -抑泡劑 3.50.32 2.00.7 1.5水、香料和小成分 達(dá) 100份e)液體洗滌劑組合物實(shí)施例XIV—XVII實(shí)例 XIV XV XVI XVIIC12-14烷基硫酸鹽(鈉) 20.0 12.0 10.0 11.52-丁醇辛酸5.0 7.0 - -檸檬酸鈉 1.0 2.5 -3.0C10醇乙氧化物(3) 13.0 3.525.0 9.5單乙醇胺 2.5 6.0 - -脂肪酸 -10.0 14.0 0.1丙二醇8.0 15.0 8.0 4.5脂酶(100 KLU) -0.15-0.9淀粉酶(66 KNU) -0.10- -蛋白酶(4 KNPU) -0.501.2 0.5污物釋放劑 -0.50- -水/丙二醇/乙醇 達(dá) 100 份f)條形織物清潔組合物按標(biāo)準(zhǔn)的擠出加工方法制備適于手洗污染織物的洗衣條。該洗衣條含有有效量的第一和第二纖維素酶成分，優(yōu)選為組合物重的0.001％—10％，更優(yōu)選0.01％—1％，并含有下列成分。實(shí)施例XVIII成分重量百分比烷基硫酸鹽 30磷酸鹽(按三聚磷酸鈉計(jì)) 7碳酸鈉 25焦磷酸鈉7可可單乙醇酰胺 2沸石A(0.1—10μm) 5羧甲基纖維素0.2聚丙烯酸(分子量1400)0.2(6-壬酰氨基己酰)氧基苯磺酸鹽5過(guò)碳酸鈉0.2蛋白酶 0.3**脂酶(100 KNU) 0.3CaSO41MgSO41水 4填料平衡至100％*可選自方便的材料如CaCO3、滑石、粘土、硅酸鹽等。
**指每克組合物的活性酶mg數(shù)。
用本領(lǐng)域中普通采用的制備常規(guī)皂?xiàng)l或洗滌條的設(shè)備加工本發(fā)明的洗衣條。實(shí)施例XIX
緊密粒狀洗滌劑w/w％烷基硫酸鹽 8.0烷基乙氧基硫酸鹽 2.03倍和7倍乙氧基化的C25和C45醇的混合物 6.0多羥基脂肪酸酰胺 2.5沸石 17.0層狀硅酸鹽/檸檬酸鹽16.0碳酸鹽 7.0馬來(lái)酸丙烯酸共聚物 5.0污物釋放共聚物 0.4CMC0.4聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 0.1PEG20000.2蛋白酶(4 KNPU) 2.5脂酶(100KLU) 0.2EG V(1000 S-CEVU) 0.2EG I(1250 S-CEVU) 1.0TAED 6.0過(guò)碳酸鹽 22.0乙二胺二琥珀酸(EDDS) 0.3抑泡劑 3.54，4’-二(2-嗎啉代-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-2，2’-二磺酸二鈉 0.254，4’-二(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯0.05水，香料(Encaps)和小成分 達(dá) 100份序列表(1)一般信息(i)請(qǐng)人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹表(F)郵編(ZIF)DK-2880(G)電話+45 4444 8888(H)傳真+45 4449 3256(I)電傳37173(A)名稱The Procter &amp; Gamble Company(B)街道One Procter &amp; Gamble plaza(C)城市Cincinnati(D)州OHIO(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編(ZIP)45 202(ii)題目含纖維素酶的洗滌劑組合物(iii)序列數(shù)目6(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatenIn Release #1.0，Version #1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度507個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(A)生物體灰腐質(zhì)霉H.griseus(X)出版信息(A)作者de Oliviera Azevedo，M.
Radford，A.
(C)雜志Nucleic Acids Res(D)卷18(F)頁(yè)668(G)日期1990(xi)序列描述SEQ ID NO1Gln Gln Ala Cys Ser Leu Thr Thr Glu ARg His Pro Ser Leu Ser Trp1 5 10 15Asn Lys Cys Thr Ala Gly Cys Gln Cys Gln Thr Val Gln Ala Ser Ile20 25 30Thr Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Thr His Gln Val Ser Gly Ser Thr35 40 45Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Lys Trp Asp Thr Ser Ile Cys Thr Asp Ala50 55 60Lys Ser Cys Ala His Asn Cys Cys Val Asp Gly Ala Tyr Thr Ser Thr65 70 75 80Tyr Gly Ile Thr Thr Asn Gly Asp Ser Leu Ser Ser Leu Lys Phe Val85 90 95TAr Lys Gly Gln His Ser Thr Asn Val Gly Ser His Thr Tyr Leu Met100 105 110Asp Gly Glu Asp Lys Tyr Gln Thr Phe Glu Leu Leu Gly Asn Glu Phe115 120 125Thr Thr Asp Val Asp Val Ser Asn Ile Gly Cys Gly Leu Asn Gly Ala130 135 140Thr Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Arg Tyr Pro145 150 155 160Cys Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln165 170 175Cys Pro Arg Asp Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Glu Gly180 185 190Trp Thr Gly Ser Thr Asn Asp Pro Asn Ala Gly Ala Cys Ser Arg Tyr195 100 205Gly Thr Cys Cys Ser Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Gln Gln His Ala210 215 220Thr Ala Phe Pro His Pro Cys Thr Ile Ile Ala Gln Ser Arg Cys Glu225 230 235 240Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asn Glu Arg Tyr Ala Gly Val245 250 255Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Gln Gly Asn Lys260 265 270Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val His Thr Thr Lys Lys Ile Thr275 280 285Val Val Thr Pro Phe Leu Lys Asp Ala Asn Gly Asp Leu Gly Glu Ile190 295 300Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asp Gly Lys Ile Ile Pro Asn Ser Glu Ser305 310 315 320Thr Ile Pro Gly Val Glu Gly Asn Ser Ile Thr Gln Asp Trp Cys Asp325 330 335Arg Gln Lys Val Ala Phe gly Asp Ile Asp Asp Phe Asn Arg Lys Gly340 345 350Gly Ala Met Lys Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val Leu355 360 365Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Ser Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser370 375 380Thr Phe Pro Val Asp Ala Ala Gly Lys Pro Gly Ala Glu Arg Gly Ala385 390 395 400Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala Pro405 410 415Asn Ser Asn Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Pro Gly Pro Ile Gly Ser420 425 430Thr Val Ala Gly Leu Pro Gly Ala Gly Asn Gly Gly Asn Asn Gly Gly435 440 445Asn Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Ala Thr Thr450 455 450Thr Thr Ala Ser Ala Gly Pro Lys Ala Gly Arg Trp Gln Gln Cys Gly465 470 475 480Gly Ile Gly Phs Thr Gly Pro Thr Gln Cys Glu Glu Pro Tyr Ile Cys485 490 495Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu500 505(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度415個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(A)生物體腐質(zhì)霉H.insolens(B)菌株DSM 1800(xi)序列描述SEQ ID NO2Gln Lys Pro Gly Glu Thr Lys Glu Val His Pro Gln Leu Thr Thr Phe1 5 10 15Arg Cys Thr Lys Arg Gly Gly Cys Lys Pro Ala Thr Asn Phe Ile Val20 25 30Leu Asp Ser Leu Ser His Pro Ile His Arg Ala Glu Gly Leu Gly Pro35 40 45Gly Gly Cys Gly Asp Trp Gly Asn Pro Pro Pro Lys Asp Val Cys Pro50 55 60Asp Val Glu Ser Cys Ala Lys Asn Cys Ile Met Glu Gly Ile Pro Asp65 70 75 80Tyr Ser Gln Tyr Gly Val Thr Thr Asn Gly Thr Ser Leu Arg Leu Gln85 90 95His Ile Leu Pro Asp Gly Arg Val Pro Ser Pro Arg Val Tyr Leu Leu100 105 110Asp Lys Thr Lys Arg Arg Tyr Glu Met Leu His Leu Thr Gly Phe Glu115 120 125Phe Thr Phs Asp Val Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ser130 135 140Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met His Pro Thr Gly Ala Lys Ser Lys Tyr145 150 155 160Asn Pro Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys165 170 175Phe Val Thr Pro Phe Ile Asn Gly Leu Gly Asn Ile Glu Gly Lys Gly180 185 190Ser Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ser195 200 205His Val Als Pro His Thr Cys Asn Lys Lys Gly Leu Tyr Leu Cys Glu210 215 220Gly Glu Glu Cys Ala Phe Glu Gly Val Cys Asp Lys Asn Gly Cys Gly225 230 235 240Trp Asn Asn Tyr Arg Val Asn Val Thr Asp Tyr Tyr Gly Arg Gly Glu245 250 255Glu Phe Lys Val Asn Thr Leu Lys Pro Phe Thr Val Val Thr Gln Phe260 265 270Leu Ala Asn Arg Arg Gly Lys Leu Glu Lys Ile His Arg Phe Tyr Val275 280 285Gln Asp Gly Lys Val Ile Glu Ser Phe Tyr Thr Asn Lys Glu Gly Val290 295 300Pro Tyr Thr Asn Met Ile Asp Asp Glu Phe Cys Glu Ala Thr Gly Ser305 310 315 320Arg Lys Tyr Met Glu Leu Gly Ala Thr Gln Gly Met Gly Glu Ala Leu325 330 335Thr Arg Gly Met Val Leu Ala Met Ser Ile Trp Trp Asp Gln Gly Gly340 345 350Asn Net Glu Trp Leu Asp His Gly Glu Ala Gly Pro Cys Ala Lys Gly355 360 365Glu Gly Ala Pro Ser Asn Ile Val Gln Val Glu Pro Phe Pro Glu Val370375 380Thr Tyr Thr Asn Leu Arg Trp Gly Glu Ile Gly Ser Thr Tyr Gln Glu385 390 395 400Val Gln Lys Pro Lys Pro Lys Pro Gly His Gly Pro Arg Ser Asp405 410 415(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度409個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(A)生物體尖鐮孢(B)菌株DSM 2672(xi)序列描述SEQ ID NO3Gln Thr Pro Asp Lys Ala Lys Glu Gln His Pro Lys Leu Glu Thr Tyr1 5 10 15Arg Cys Thr Lys Ala Ser Gly Cys Lys Lys Gln Thr Asn Tyr Ile Val20 25 30Ala Asp Ala Gly Ile His Gly Ile Arg Arg Ser Als Gly Cys Gly Asp35 40 45Trp Gly Gln Lys Pro Asn Ala Thr Ala Cys Pro Asp Glu Ala Ser Cys50 55 60Ala Lys Asn Cys Ile Leu Ser Gly Met Asp Ser Asn Ala Tyr Lys Asn65 70 75 80Ala Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Lys Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ile85 90 95Asn Asn Gln Leu Val Ser Pro Arg Val Tyr Leu Leu Glu Glu Asn Lys100 105 110Lys Lys Tyr Glu Met Leu His Leu Thr Gly Thr Glu Phe Ser Phe Asp115 120 125Val Glu Met Glu Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Gly Ala Leu Tyr Leu130 135 140Ser Glu Met Pro Gln Asp Gly Gly Lys Ser Thr Ser Arg Asn Ser Lys145 150 155 160Ala Gly Ala Tyr Tyr Gly Ala Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Tyr Val165 170 175Thr Pro Phe Ile Asn Gly Val Gly Asn Ile Lys GLy Gln Gly Val Cys180 185 190Cys Asn Glu Leu Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ala Thr His Ile195 200 205Ala Pro His Pro Cys Ser Lys Pro Gly Leu Tyr Gly Cys Thr Gly Asp210 215 220Glu Cys Gly Ser ser Gly Ile Cys Asp Lys Ala Gly Cys Gly Trp Asn225 230 235 240His Asn Arg lle Asn Val TAr Asp Phe Tyr Gly Arg Gly Lys Gln Tyr245 250 255Lys Val Asp Ser Thr Arg Lys Phe Thr Val Thr Ser Gln Phe Val Ala260 265 270Asn Lys Gln Gly Asp Leu Ile Glu Leu His Arg His Tyr Ile Gln Asp275 280 285Asn Lys Val Ile Glu Ser Ala Val ValAsn Ile Ser Gly Pro Pro Lys290 295300Ile Asn Phe Ile Asn Asp Lys Tyr Cys Ala Ala Thr GLy Ala Asn Glu305 310 315 320Tyr Met Arg Leu Gly Gly Thr Lys Gln Met Gly Asp Ala Met Ser Arg325 330 335Gly Met Val Leu Ala Met Ser Val Trp Trp Ser Glu Gly Asp Phe Met340 345 350Ala Trp Leu Asp Gln Gly Val Ala Gly Pro Cys Asp Ala Thr Glu Gly355 360 365Asp Pro Lys Asn Ile Val Lys Val Gln Pro Asn Pro Glu Val Thr Phe370 375 380Ser Asn Ile Arg Ile Gly Glu Ile Gly Ser Thr Ser Ser Val Lys Ala385 390 395 400Pro Ala Tyr Pro Gly Pro His Arg Leu405(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度305個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(A)生物體腐質(zhì)霉H.insolens(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro-21 -20 -15 -10Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser TAr Arg Tyr Trp Asp Cys-5 1 5 10Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro15 20 25Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala30 35 40Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln45 50 55Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr60 65 70 75Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu80 85 90Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lye Lys Met Val ual Gln95 100 105Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn110 115 120Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe125 130 135Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu140 145 150 155Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe160 165 170Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val175 180 185Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp190 195 200Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser205 210 215Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr TAr220 225 230 235Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu240 245 250Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys255 260 265Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys270 275 280Leu(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度724堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(vi)原始來(lái)源(A)生物體腐質(zhì)霉H.insolens(xi)序列描述SEQ D NO5CCTAGGTCGC CCACCATGCG CGTTTCTCTT GCTCTCCTCG CCTACCTGCT CAGCGCCGCC 60CCGGCCTCGC CCGTCCCGGA GCTCGAGCCC CGGCAGTCCG GCAACCCCTT CTCCGGCCGC 120ACCCTGCTGG TCAACTCGGA CTATAGCAGC AAGCTCGACC AGACGCGCCA GGCCTTTCCT 180GTCCCGCGGC GACCAGACCA ACGCTGCCAA GGTCAAGTAC GTCCAGGAGA AGGTTGGCAC 240CTTTCTATTG GACTTCCAAC ATCTTCCTCC TGCGCAGCAC TGACGTTGCC ATCCAGAATG 300CGCGCCGCCA AGGCCGCGCG AGAACCCCAT CGTCGGTCTC GTCCTGTACA ACCTCCCCGA 360CCGCGACTGC AGCGACGCGG CAGTACCTCT GGCGACGTTA AGCTCTCCCA GAACGGCCTG 420AACCGGTACA AGAACGAGTA CGTCAACCCG TTCGCCCAGA AGCTCAAGGC CGCGTCCGAC 480GTGCAGTTCG CCGTCATCCT CGAGCCCGAT GCCATCGGCA ACATGGTCAC GGGCACCACC 540GCCTTCTGCC GCAACGCCCG CGGCCCTCAG AGGAGGCCAT CGGCTATGCT ATCTCTCCTC 600GGCTGGGCCG ATAAGCTCGA GCCAACTGCC CAGCAGGTGC CACCATCCTC CAAAAGGCCG 660GTAACAACGC AAGATCGCGG CTTCTCAGCA ACGTTCCAAC TACAACCTAT TCACGACAAC 720CGCG724(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度526個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來(lái)源(A)生物體芽孢桿菌B.lautus(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Arg Ile His Ala Ile Arg Gln Ser Cys Arg Leu Val Leu Thr Met1 5 10 15Val Leu Met Leu Gly Leu Leu Leu Pro Val Gly Ala Pro Lys Gly Tyr20 25 30Ala Ala Pro Ala Val Pro Phe Gly Gln Leu Lys Val Gln Gly Asn Gln35 40 45Leu Val Gly Gln Ser Gly Gln Ala Val Gln Leu Val Gly Met Ser Ser50 55 60His Gly Leu Gln Trp Tyr Gly Asn Pha Val Asn Lys Ser Ser Leu Gln65 70 75 80Trp Met Arg Asp Asn Trp Gly Ile Asn Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr85 90 95Thr Ser Glu Asp Gly Tyr Ile Thr Asp Pro Ser Val Lys Asn Lys Val100 105 110Lys Glu Ala Val Gln Ala Ser Ile Asp Leu Ala Leu Tyr Val Ile Ile115 120 125Asp Trp His Ile Leu Ser Asp Gly Asn Pro Asn Thr Tyr Lys Ala Gln130 135 140Ser Lys Ala Phe Phe Gln Glu Met Ala Thr Leu Tyr Gly Asn Thr Pro145 150 155 160Asn Val Ile Tyr Glu Ile Ala Thr Ser Pro Thr Glu Cys Val Leu Gly165 170 175Arg Cys Gln Ser Ser Glu Glu Val Ile Thr Ala Ile Arg Ser Ile Asp180 185 190Pro Asp Gly Val Val Ile Val Gly Ser Pro Thr Trp Ser Gln Asp Ile195 200 205His Leu Ala Ala Asp Asn Pro Val ser His Ser Asn Val Met Tyr Ala210 215 220Leu His Phe Tyr Ser Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Arg Ile225 230 235 240Thr Tyr Ala Met Asn Lys Gly Ala Ala Ile Phe Val TAr Glu Trp Gly245 250 255Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Pro Tyr Leu Pro Gln Ser Lys260 265 270Glu Trp Ile Asp Phe Leu Asn Ala Arg Lys Ile Ser Trp Val Asn Trp275 280 285Ser Leu Ala Asp Lys Val Glu Thr Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly Ala290 295 300Ser Pro Thr Gly Ala Gly Pro Met Pro Asn Cys Arg Met Gly Lys Ser305 310 315 320Gly Ser Arg Ser Asn Pro ALa Ser Asn Trp Arg Arg Gln Gly Asn Pro325 330 335Thr Ala Pro Ala Ala Pro Thr Asn Leu Ser Ala Asn Gly Gly Asn Ala340 345 350Gln Val Ser Leu Thr Trp Asn Ala Val Ser Gly Ala Thr Ser Tyr Thr355 360 365Val Lys Arg Ala Thr Thr Ser Gly Gly Pro Tyr Thr Asn Val Asp Arg370 375 380Gly Val TAr Ala Thr Ser Tyr Thr Asn Thr Gly Leu Thr Asn Gly Thr385 390 395 400Thr Tyr Tyr Tyr Val Val Arg Ala Ser Asn Ser Ala Gly Ser Ser Ala405 410 415Asn Ser Ala Gln Ala Ser Ala Thr Pro Ala Ser Gly Gly Ala Ser Thr420 425 430Gly Asn Leu Val Val Gln Tyr Lys Val Gly Asp Thr Ser Ala Thr Asp435 440 445Asn Gln Met Lys Pro Ser Phe Asn Ile Lys Asn Asn Gly Thr Thr Pro450 455 460Val Asn Leu Ser Gly Leu Lys Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Asp Gly465 470 475 480Pro Ala Asp Met Ser Cye Ser Ile Asp Trp Ala Gln Ile Gly Arg Thr485 490 495Asn Val Leu Leu Ala Phe Ala Asn Phe Thr Gly Ser Asn Thr Asp Thr500 505 510Tyr Cys Cys Glu Leu Ser Phe Ser Cys Thr Ala Gly Ser Tyr Pro Gly515 520 525Tyr Ala Trp530
權(quán)利要求
1.一種洗滌劑組合物，它含有具有保持型活性并能去除顆粒污物的第一纖維素酶成分，和具有包括與催化區(qū)結(jié)合的至少一個(gè)非催化區(qū)的多功能區(qū)、具有清色能力的第二纖維素酶成分，其中至少一種纖維素酶成分是單一(重組)成分。
2.要求1的洗滌劑組合物，其中單一成分存在的量為組合物中纖維素酶蛋白總重的至少5％。
3.權(quán)利要求1或2的洗滌劑組合物，其中第一和第二成分均為單一成分。
4.權(quán)利要求1—3的任一洗滌劑組合物，其中第一和第二纖維素酶成分各自存在的濃度相當(dāng)于每升洗滌溶液0.001—100mg纖維素酶蛋白的洗液中的濃度。
5.權(quán)利要求1洗滌劑組合，其中存在的第一和第二纖維素酶成分的纖維素酶蛋白重量比在約30∶1到約1∶30范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求5的洗滌劑組合物，其中存在的第一和第二纖維素酶成分的纖維素酶蛋白重量比在約10∶1到約1∶10范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求6的洗滌劑組合物，其中存在的第一和第二纖維素酶成分的纖維素酶蛋白重量比在約2∶1到約1∶2范圍內(nèi)。
8.權(quán)利要求1—7中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一和第二纖維紗酶成分各自為真菌或細(xì)菌纖維素酶成分。
9.權(quán)利要求8的洗滌劑組合物，其中第一和第二纖維素酶成分各自來(lái)自腐質(zhì)霉屬、芽孢桿菌屬、木霉屬、鐮孢霉屬、毀絲霉屬、Phanerochaete、Schizophyllum、青霉屬、曲霉屬或地霉屬(Geotricum)的菌株。
10.權(quán)利要求1—9中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分對(duì)低子量碳水化合物底物顯示催化活性。
11.權(quán)利要求10的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分在PH8.5時(shí)對(duì)纖維三糖的催化活性相當(dāng)于Kcat至少為0.01S-1。
12.權(quán)利要求1—11中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分為核心酶或單功能區(qū)蛋白。
13.權(quán)利要求1—12中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分對(duì)染色微晶纖維素顯示低催化活性，不足以或不能提供清色作用。
14.權(quán)利要求1—13中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分是能與針對(duì)腐質(zhì)霉H.insolens、DSM 1800的高純化～70KD纖維生物水解酶(EC3.2.1.91)之抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的纖維生物水解酶，或?yàn)樵摗?0KD纖維生物水解酶顯示纖維素酶活性的衍生物。
15.權(quán)利要求14的洗滌劑組合物，其中纖維生物水解酶成分具有SEQ ID No1所列的氨基酸序列，或所述纖維生物水解酶的變體具有與所述序列至少60％同源的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求1—13中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分是能與針對(duì)腐質(zhì)霉H.insolens DSM 1800的高純化～50KD內(nèi)切葡聚糖酶的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶成分，或?yàn)樵摗?0KD內(nèi)切葡聚糖酶的顯示纖維素酶活性的衍生物。
17.權(quán)利要求16的洗滌劑組合物，其中內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID No2所列的氨基酸序列，或所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體具有與所述序列至少60％同源的氨基酸序列。
18.權(quán)利要求1—13中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分是能與針對(duì)尖鐮孢DSM 2672的高純化～58KD內(nèi)切葡聚糖酶的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶成分，或?yàn)樵摗?8KD內(nèi)切葡聚糖酶的顯示纖維素酶活性的衍生物。
19.權(quán)利要求18的洗滌劑組合物，其中內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID No3所列的氨基酸序列，或所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體具有與所述序列至少60％同源的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求1—13中任一種的洗滌劑組合物，其中第二纖維素酶成分對(duì)具有6個(gè)葡萄糖單位(DP6)的纖維糊精顯示高催化活性。
21.權(quán)利要求20的洗滌劑組合物，其中第二纖維素酶成分對(duì)染色微晶纖維素顯示高催化活性。
22.權(quán)利要求21的洗滌劑組合物，其中第二纖維素酶成分對(duì)Red Avicel的催化活性為每1mg纖維素酶蛋白高于10-4IU。
23.權(quán)利要求20—22中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第二纖維素酶成分在PH8.5對(duì)纖維三糖的催化活性相當(dāng)于Kcat小于0.01s-1。
24.權(quán)利要求20—23中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中第二纖維素酶成分是能與針對(duì)腐質(zhì)霉H.insolens DSM 1800的高純化～43KD內(nèi)切葡聚糖酶的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶成分，或?yàn)樵摗?3KD內(nèi)切葡聚糖酶的顯示纖維素酶活性的衍生物。
25.權(quán)利要求24的洗滌劑組合物，其中內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID No4所列的氨基酸序列，或所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體具有與所述序列至少60％同源的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求25的洗滌劑組合物，其中內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ IDNo5所列部分DNA序列編碼的氨基酸序列，或所述內(nèi)切葡聚糖酶變體具有與所述氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求20的洗滌劑組合物，其中第二纖維素酶成分是能與針對(duì)芽孢桿菌B.lautus NCIMB 40250的高純化～60KD內(nèi)切葡聚糖酶的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的內(nèi)切葡聚糖酶成分，或?yàn)樵摗?0KD內(nèi)切葡聚糖酶的顯示纖維素酶活性的衍生物。
28.權(quán)利要求27的洗滌劑組合物，其中內(nèi)切葡聚糖酶成分具有SEQ ID No6所列的氨基酸序列，或所述內(nèi)切葡聚糖酶的變體具有與所述序列至少60％同源的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求1—28中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑組合物為粒狀組合物。
30.權(quán)利要求29的洗滌劑組合物，其中該粒狀洗滌劑組合物為緊密粒狀組合物。
31.權(quán)利要求1—28中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，其中該洗滌劑組合物為液體組合物。
32.權(quán)利要求31的洗滌劑組合物，其中該液體組合物為重負(fù)液體組合物。
33.權(quán)利要求1—32中任一項(xiàng)的洗滌劑組合物，它另外還含有一種或多種選自蛋白酶、脂酶、酯酶、氧化酶、過(guò)氧化物酶和淀粉酶的酶。
34.權(quán)利要求31或32的洗滌劑組合物，其中第一纖維素酶成分在蛋白酶存在下具有改進(jìn)的穩(wěn)定性。
35.一種洗滌劑添加劑，它包括具有保持型活性并能去除顆粒污物的第一纖維素酶成分，和具有包括與催化區(qū)結(jié)合的至少一個(gè)非催化區(qū)的多功能區(qū)、具有清色能力的第二纖維素酶成分，其中至少一種纖維素酶成分是單一(重組)成分。
36.一種在洗滌機(jī)中處理織物的方法，其中織物用一洗滌液處理，該洗滌液含有具有保持型活性并能去除顆粒污物的第一纖維素酶成分，和具有包括與催化區(qū)結(jié)合的至少一個(gè)非催化區(qū)的多功能區(qū)、具有清色能力的第二纖維素酶成分，其中至少一種纖維素酶成分是單一(重組)成分。
全文摘要
含有如下第一和第二纖維素酶成分的洗滌劑組合物，1)第一纖維素酶成分具有保持型活性，優(yōu)選在pH8.5下對(duì)纖維三糖的催化活性相當(dāng)于Kcat至少為0.01S
文檔編號(hào)C12R1/07GK1129011SQ9419307
公開日1996年8月14日 申請(qǐng)日期1994年7月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月12日
發(fā)明者M·舒萊因, A·C·康文特, B·杰弗雷斯, D·F·迪科米羅夫 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司, 普羅克特和甘保爾公司