專利名稱：一種利用微生物雙轉(zhuǎn)化株制備二羥乙酸/氨甲基膦酸混合物改進(jìn)方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明涉及的領(lǐng)域該發(fā)明是關(guān)于改進(jìn)二羥乙酸與氨甲基膦酸混合物的生產(chǎn)工藝，改進(jìn)后是將二羥乙酸與氧在氨甲基膦酸和催化劑存在的條件下，在水溶液中進(jìn)行反應(yīng)。更具體地說，不過不限于此，該發(fā)明是關(guān)于基因工程得到的微生物雙轉(zhuǎn)化株的應(yīng)用，該轉(zhuǎn)化株表達(dá)兩個外源酶作催化劑，一個是羥基乙酸氧化酶(例如，(S)-2-羥-酸氧化酶，EC1.1.3.15)；另一個是不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的過氧化氫酶(例如，EC1.11.1.6)，例如來源于啤酒酵母的過氧化氫酶T。
2.有關(guān)工藝的描述羥基乙酸氧化酶一般存在于綠葉植物和哺乳類細(xì)胞中，它催化羥基乙酸氧化生成二羥乙酸，伴隨過氧化氫產(chǎn)生 N.E.Tolbert等(J.Biol.Chem.，Vol.181，905～914，1949)首先報道，自煙葉中提取的一種酶，催化羥乙酸氧化成甲酸和二氧化碳的反應(yīng)，該反應(yīng)的中間產(chǎn)物是二羥乙酸。加入某些化合物，如乙二胺，可限制二羥乙酸的進(jìn)一步氧化。氧化反應(yīng)發(fā)生在pH8左右，羥乙酸的典型濃度約為3～40mM(毫克分子)。報道的羥基乙酸氧化的最佳pH值是8.9。據(jù)報道草酸(100mM)可阻止羥基乙酸氧化酶的催化作用。K.E.Richardson和N.E.Tolbert(J.Biol.Chem.，Vol.236，1280～1284，1961)有相似的報道，含有三羥甲基氨基乙烷(TRIS)的緩沖溶液，在羥基乙酸氧化酶催化羥乙酸氧化過程中，抑制草酸的形成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris(J.Biol.Chem.，Vol.178，977～987，1949)報道，對于羥基乙酸氧化酶催化的羥基乙酸與氧的氧化反應(yīng)，最佳pH值是7.8～8.6，最佳溫度是35～40℃。
I.Zelitch和S.Ochoa(J.Biol.Chem.，Vol.201，707～718，1953)和J.C.Robinson等(J.Biol.Chem.，Vol.237，2001～2009，1962)報道，在菠菜羥基乙酸氧化酶催化作用下，羥基乙酸氧化產(chǎn)生甲酸和CO2，這是由H2O2同二羥乙酸的非酶催化反應(yīng)引起的。他們發(fā)現(xiàn)加入催化過氧化氫分解的過氧化氫酶，能夠通過抑制甲酸和二氧化碳的形成極大地提高二羥乙酸產(chǎn)率。加入FMN(黃素單核苷酸)大大地增加了羥基乙酸氧化酶的穩(wěn)定性。
N.A.Frigerio和H.A.Harbury(J.Biol.Chem.，Vol.231，135～157，1958)已經(jīng)報道了自菠菜中分離得到的羥基乙酸氧化酶的制備和性質(zhì)。純化的該酶在溶液中很不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定性歸因于，F(xiàn)MN(黃素單核苷酸)與其活性位點(diǎn)的結(jié)合比較弱，另一方面是該酶具有酶活性的四聚體和八聚體解聚成無酶活性的單體和二聚體。這些單體和二聚體發(fā)生不可逆的聚集和沉淀。向酶溶液中加入FMN(黃素單核苷酸)，可大大提高其穩(wěn)定性。高蛋白質(zhì)濃度和高離子強(qiáng)度，可維持該酶以四聚體和八聚體的形式存在。
美國專利5,135,860(U.S.Patent 5,135,860)已描述了一種二羥乙酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的制備方法。羥乙酸和氧在水溶液中反應(yīng)，該反應(yīng)是有AMPA(氨甲基膦酸)和兩種酶催化劑存在條件下進(jìn)行的，其一是可溶性的菠菜羥基乙酸氧化酶，另一個是可溶性過氧化氫酶(例如黑曲霉過氧化氫酶)。這個方法證明使用過氧化氫酶(以破壞副產(chǎn)物過氧化氫，它引起甲酸的生成)以及作為胺添加劑的AMPA，能夠同二羥乙酸形成抗氧化的N-取代半縮胺和/或亞胺(限制其進(jìn)一步氧化)。美國專利(U.S.Patent5,180,846)描述了這些混合物氫化，生成N-(甲基膦酰)甘氨酸的方法，這是一種苗期植物毒性劑和除草劑。本發(fā)明是對上述制備過程的特別的改進(jìn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)了當(dāng)某些過氧化氫酶被用于水溶液中進(jìn)行的、AMPA存在條件下的羥乙酸(和/或它的鹽)與氧發(fā)生的酶促氧化反應(yīng)，生成二羥乙酸(和/或它的鹽溶液)和AMPA的混合物的原有的可逆的抑制。一般說來，本發(fā)明的優(yōu)越性在于，利用基因工程得到的雙轉(zhuǎn)化株微生物細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)了兩個外源酶作催化劑，一個是羥基乙酸氧化酶(例如，(S)-2-羥酸氧化酶，EC1.1.3.15)(如來源于菠菜)，另一個是過氧化氫酶(EC1.11.1.6)。更具體地說，本發(fā)明為外源性催化酶提供了表達(dá)，選擇這種酶的原因是因為它不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制(例如啤酒酵母過氧化氫酶T)。二羥乙酸和AMPA(氨甲基膦酸)混合物，對于制備苗期除草劑N-(甲基膦酰)甘氨酸是有用的。
這樣，本發(fā)明提供了制備二羥乙酸和氨甲基膦酸混合物的改進(jìn)方法，包括在水溶液中，在氨甲基膦酸和羥基乙酸氧化酶和催化酶存在的條件下，用氧氧化羥乙酸的步驟，其中改進(jìn)包括利用微生物雙轉(zhuǎn)化株細(xì)胞催化劑，用以表達(dá)兩個外源酶，羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶。
附圖和生物樣品的保藏的概述依據(jù)本發(fā)明所述，利用多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株催化劑，連續(xù)進(jìn)行了30批試驗。

圖1表明了每批實(shí)驗的反應(yīng)時間、二羥乙酸產(chǎn)率(％)、透性細(xì)胞羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的百分回收率(以其透性化之后的起始值為基準(zhǔn))的曲線。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，下述生物材料保藏于InternationalDepository Authority，Agricultural Research Service CultureCollection(NRRL，農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機(jī)構(gòu)培養(yǎng)繁殖樣品收集處)，位于美國的1815N，University Street，Peoria，IL 61604。保藏的生物材料名稱 NRRL編號 保藏日期Hansenula polymorpha，G01 Y-21065 1993.3.30Pichia pastoris，GS115-MSP10 Y-21001 1992.9.24Hansenula polymorpha，G02 Y-21113 1993.6.25Hansenula polymorpha，G03 Y-21114 1993.6.25Pichia pastoris，MSP8.6Y-21187 1994.2.1
優(yōu)選實(shí)施方案描述一個相近的、尚未批準(zhǔn)的、普通轉(zhuǎn)讓的專利，U.S.S.N.08/026,615(CH-2279-B，PCT/ )描述了二羥乙酸與AMPA(氨甲基膦酸)混合物的制備。該方法采用幾個基因工程微生物轉(zhuǎn)化株之一作為催化劑。這些轉(zhuǎn)化株表達(dá)了菠菜羥基乙酸氧化酶以及內(nèi)源性過氧化氫酶。利用多形漢遜酵母或pastoris畢赤酵母微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化株作催化劑氧化羥乙酸/AMPA(氨甲基膦酸)混合物時，需加入第二種過氧化氫酶源，以提高二羥乙酸的產(chǎn)率。與來源于構(gòu)巢曲霉和黑曲霉的過氧化氫酶相比，多形漢遜酵母和pastoris畢赤酵母的透性細(xì)胞所能達(dá)到的內(nèi)源性過氧化氫酶活力較低，致使生成了大量的甲酸(二羥乙酸被過氧化氫氧化之后生成的產(chǎn)物)。加入來自黑曲霉或啤酒酵母可溶性過氧化氫酶或完整的透性啤酒酵母細(xì)胞，作為補(bǔ)充的過氧化氫酶來源，使得利用多形漢遜酵母和pastoris畢赤酵母轉(zhuǎn)化株作催化劑，制備二羥乙酸的產(chǎn)量顯著提高。
來源于黑曲霉、啤酒酵母(過氧化氫酶T)、多形漢遜酵母和pastoris畢赤酵母及牛肝的過氧化氫酶被一一試驗用作分解羥乙酸/AMPA(氨甲基膦酸)混合物氧化生成的過氧化氫的催化劑。這些催化酶都編目作為“Cytostolic”，已發(fā)現(xiàn)來源于多形漢遜酵母、pastoris畢赤酵母和牛肝的過氧化氫酶被AMPA(氨甲基膦酸)可逆抑制這種情況在以前未見報道。不論是使用可溶性過氧化氫，固定化過氧化氫酶還是含有過氧化氫酶的完整細(xì)胞作為催化劑，都表現(xiàn)出抑制作用。
對于被用作催化劑的、其內(nèi)源過氧化氫酶被AMPA抑制的微生物轉(zhuǎn)化株(例如多形漢遜酵母或pastoris畢赤酵母轉(zhuǎn)化株)來說，另一種向羥乙酸/AMPA反應(yīng)混合物添加補(bǔ)充抗抑制過氧化氫酶源的方法是，將微生物轉(zhuǎn)化株(它表達(dá)了外源的羥基乙酸氧化酶)再次進(jìn)行了基因工程，使之表達(dá)了補(bǔ)充的不被AMPA抑制的外源過氧化氫酶，例如來自啤酒酵母的過氧化氫酶。在沒有加入不被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的過氧化氫酶的條件下，利用此微生物“雙”轉(zhuǎn)化株作催化劑，比利用其過氧化氫酶可被AMPA(氨甲基膦酸)抑制的微生物細(xì)胞“單”轉(zhuǎn)化株(即外源性羥基乙酸氧化酶和內(nèi)源性過氧化氫酶)作催化劑，二羥乙酸的產(chǎn)率大大提高，生成的甲酸酯則顯著減少。
以既有羥基乙酸氧化酶活性，又具有抗AMPA(氨甲基膦酸)的催化酶活性的微生物細(xì)胞雙轉(zhuǎn)化株作催化劑，來氧化羥乙酸/AMPA混合物，比過去使用的具有可溶性的抗抑制的催化酶微生物細(xì)胞單轉(zhuǎn)化株，有幾個優(yōu)點(diǎn)1)雙轉(zhuǎn)化株容易回收、再利用；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物離心或過濾即可。而單轉(zhuǎn)化株回收困難，活性損失較大。2)抗抑制過氧化氫酶內(nèi)含在微生物細(xì)胞中，其過氧化氫酶活性比可溶性過氧化氫酶更穩(wěn)定，這表現(xiàn)在催化劑周轉(zhuǎn)使用的次數(shù)上和回收的酶活性上。3)雙轉(zhuǎn)化株對于反應(yīng)條件是穩(wěn)定的，氧被噴射到反應(yīng)混合物中，增加了氧溶解速率和反應(yīng)速率，而在相似條件下，可溶性的過氧化氫酶很快變性，不可逆地?fù)p失其酶活性。
本發(fā)明使用多形漢遜酵母(一種甲醇營養(yǎng)型酵母)的雙轉(zhuǎn)化株為生物細(xì)胞催化劑，它表達(dá)了菠菜的羥基乙酸氧化酶，以及啤酒酵母的過氧化氫酶T。制備了幾種具有充分的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶T活力的多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化株。例如，發(fā)現(xiàn)于pHCT-124(Hansen and Roggenkamp，Eur.J.Biochem.，184173～179(1989))質(zhì)粒的編碼過氧化氫酶T(最初來源于啤酒酵母)的CTTl編碼序列，被亞克隆到M13(Ledeboer et al.，Nucleic Acids Res.，13，3063(1985)and Messing，Methods Enzymol；10120～78(1983))載體上，通過定點(diǎn)突變，在CTT1基因的ATG起始密碼和TAA終止密碼側(cè)翼產(chǎn)生了BglII限制性酶切酶位點(diǎn)。pBR質(zhì)粒插入了CTT1基因、融合了ADH1/卡那霉素抗性之后，產(chǎn)生的載體是pRBCATT。將CTT1基因插入FMD啟動子和MOX終止序列之間，構(gòu)成G0表達(dá)質(zhì)粒。以pRBCATT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化形成的多形漢遜酵母G01，其存取號被確定為NRRL No.Y-21065，而其表達(dá)G0(羥基乙酸氧化酶)和過氧化氫酶T的菌株，其確認(rèn)過程在尚未確定的、廣泛轉(zhuǎn)讓的美國專利申請U.S.S.N.08/085,491 PCT WO- 得到詳盡描述，其中伴有文獻(xiàn)。采用pBRCATT質(zhì)粒進(jìn)行基因工程時，鑒定了七十多個具有不同表達(dá)水平的克隆，其表達(dá)水平的定義是在G0(羥基乙酸氧化酶)之外每毫克蛋白所具有的CTT1酶活。從其亞克隆中設(shè)定了兩個獨(dú)立的微生物雙轉(zhuǎn)化株，分別是G02和G03，它們的存取號被分別確定為NRRL NO.Y-21113和Y-21114。
多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株的典型制備方法是，首先將雙轉(zhuǎn)化株接種到培養(yǎng)基中(500ml)培養(yǎng)，含有0.7g YNB(無硫酸銨)、0.5g酵母提取物，2.5g硫酸銨，1g明膠水解液(BBL)1.5g酪蛋白氨基酸(Difco)，0.3g K2HPO4，0.25mg維生素H，1.25mg維生素B1和7.5g甘油。在30℃、pH5.0條件下振蕩培養(yǎng)(200轉(zhuǎn)/分)24小時。然后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到14升的發(fā)酵桶里，發(fā)酵桶原盛有噴霧干燥的玉米浸取液(Roquette，4.7g/L)、硫酸銨(3.5g/L)、維生素H(0.36mg/L)，維生素B1(1.0mg/L)和甘油(30g/L)，共10升。細(xì)胞培養(yǎng)15～20小時，溫度30℃，攪拌速度為500～550轉(zhuǎn)/分，空氣換氣速率為2～4升/分，利用無水氨控制pH為5。當(dāng)與生長有關(guān)的甘油耗盡時，則加入甲醇(10.0g/L)到發(fā)酵桶中，誘導(dǎo)羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶T的表達(dá)，同時補(bǔ)充加入0.67g/L的YNB(無氨基酸和硫酸銨)，0.1mg/L維生素H，0.5mg/L的維生素B1和0.5g/L的甘油。甲醇濃度保持在2～10g/L，甘油濃度保持在＜1g/L。誘導(dǎo)后2 0～30小時，羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶T的表達(dá)。達(dá)到最大值。
培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)的細(xì)胞通過離心來收集，并儲存于-20℃。多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化提取物里，各種酶活分別是，羥基乙酸氧化酶90～180DCIP IU/g濕細(xì)胞，總過氧化氫酶(啤酒酵母過氧化氫酶T加上內(nèi)源性多形漢遜酵母過氧化氫酶)的酶活是165,000～330,000IU/g濕細(xì)胞，過氧化氫酶T的酶活是90,000～175,000IU/g濕細(xì)胞。
另一種應(yīng)用于本發(fā)明的微生物細(xì)胞催化劑是pastoris畢赤酵母(一種甲醇營養(yǎng)酵母)的雙轉(zhuǎn)化株，它表達(dá)了菠菜羥基乙酸氧化酶和啤酒過氧化氫酶。將編碼羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶T的DNA插入表達(dá)載體，處于乙醇氧化酶(AUX)啟動子控制之下，從而制備出幾個具有足夠羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶活力的pastoris畢赤酵母轉(zhuǎn)化株。以此載體轉(zhuǎn)化pastoris畢赤酵母，制備出的菌株是pastoris畢赤酵母MSP8.6具有高水平的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶T，其存取號被確定為NRRL No.Y-211187。
pastoris畢赤酵母的雙轉(zhuǎn)化株的制備方法是，首先在培養(yǎng)液中培養(yǎng)(1.0L)，組成如下酵母提取物3.0g，麥芽提取物3.0g。胨5.0g，甘油10.0g。然后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到14升的發(fā)酵桶中。桶內(nèi)盛有9升培養(yǎng)液，內(nèi)含38.2g/L的KH2PO4，9.7g/L的硫酸銨，45g/L的甘油，10.53g/L的MgSO4·7H2O，0.81g/L的CaSO4·2H2O和12.9mL的微量元素溶液，微量元素組成如下6.0g/L的CuSO4·5H2O，0.8g/L的KI，3.0g/L的MnSO4·H2O，0.2g/L的NaMoO4·2H2O，0.02g/L的H3BO3，0.5g/L的CoCl2·6H2O，20g/L的ZnSO4，5mL/L的H2SO4，65g/L的FeSO4·7H2O和0.2g/L的維生素H。細(xì)胞在30℃，攪拌速度500～550轉(zhuǎn)/分，空氣交換速率5L/分，利用氫氧化銨控制pH為5.0的條件下培養(yǎng)45小時。當(dāng)與細(xì)胞生長有關(guān)的甘油耗盡時，向發(fā)酵桶中加入50mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶T的表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基是由下列物質(zhì)組成的混合物1.5升甲醇；7.5mL微量金屬，7.5mL濃度為0.20g/L的維生素H等的溶液。通過向發(fā)酵桶添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，保持甲醇濃度為0.2～0.6％。誘導(dǎo)47小時后收集細(xì)胞。
發(fā)酵結(jié)束后，離心收集這些細(xì)胞，儲存于-20℃。在pastoris畢赤酵母雙轉(zhuǎn)化株提取物里，各種酶活是，羥基乙酸氧化酶是218～254 DCIP IU/g濕細(xì)胞，總過氧化氫酶(啤酒酵母的過氧化氫酶加上畢赤酵母的內(nèi)源性過氧化氫酶)是233,000～252,000IU/g濕細(xì)胞，過氧化氫酶T的活性20,000～58,000IU/g濕細(xì)胞。
多形漢遜酵母及pastoris畢赤酵母雙轉(zhuǎn)化株要經(jīng)過透性化之后，才能用于催化羥基乙酸氧化成二羥乙酸。有許多已知的透性化方法可用于制備具有足夠羥基乙酸氧化酶活力的細(xì)胞(Felix，Anal.Biochemistry，Vol.120，211～234，1982)。一個方法是將10％(重量比)濕細(xì)胞懸浮到0.1％(v/v)“Triton”(三硝基甲苯)X-100/20mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，混合15分鐘，然后在液氮中冷凍，融化，再用20mM磷酸緩沖液洗透性細(xì)胞。第二種透性化方法是將10％(重量比)的濕細(xì)胞懸浮于0.1％(w/v)氯化芐烷銨/50mM磷酸緩沖液中(pH7.0)60分鐘。然后用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)洗透性細(xì)胞。透性化之后，選擇一定數(shù)量的完整細(xì)胞催化劑加入反應(yīng)混合物中，以提供所需的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的活性濃度。反應(yīng)后回收的透性細(xì)胞催化劑具有的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶活性大于它們起始值的100％，因為反應(yīng)過程中，整細(xì)胞的透性增加了。
在生產(chǎn)二羥乙酸/AMPA(氨甲基膦酸)混合物過程中，采用微生物細(xì)胞雙轉(zhuǎn)化株作催化劑，消除了用可溶性催化酶與微生物單轉(zhuǎn)化株聯(lián)合使用作催化劑的許多不足之處。通過將催化劑從反應(yīng)混合物中離心分離出來重新投入新反應(yīng)混合物中循環(huán)使用，很容易地回收和重新使用整細(xì)胞催化劑。使用這種方法，羥基乙酸氧化酶可循環(huán)使用數(shù)可高達(dá)107。噴射氧氣或含氧氣體到反應(yīng)混合物中，而過氧化氫酶的活性無損失(如聯(lián)合使用可溶性過氧化氫酶與微生物單轉(zhuǎn)化株時所出現(xiàn)的)提高了從催化循環(huán)中回收過氧化氫酶活性。
羥基乙酸氧化酶活性(以透性微生物雙轉(zhuǎn)化株加入)，在反應(yīng)中的有效濃度通常是0.01到100IU/mL，優(yōu)選濃度是0.1到10IU/mL。1IU(Intermational Unit，國際單位)被定義為，每分鐘催化一微克分子底物發(fā)生轉(zhuǎn)變所需的酶量?？扇苄悦傅臋z測方法見文獻(xiàn)Zelitch和Ochoa，J.Biol.Chem.，Vol.201，707～718，1953。該方法的一個改進(jìn)方案被用檢測新制備的或循環(huán)再用的微生物雙轉(zhuǎn)化株中羥基乙酸氧化酶活性。雙轉(zhuǎn)化株的羥基乙酸氧化酶酶活按下面步驟測定準(zhǔn)確稱取5～10mg滲透過的濕細(xì)胞，置于一個3mL的石英比色槽中，槽內(nèi)有磁攪拌棒，加入2.0mL緩沖液(0.12mM的二氯苯酚-靛酚(DCIP)和80mM的TRIS(pH8.3))。比色槽用橡皮膜封口，通N25分鐘除氧。用注射器向槽中加0.04mL的1.0M羥乙酸/1.0M TRIS(pH8.3)，在攪拌的情況下，于605nm波長處(ε＝22.000)測量隨時間所發(fā)生的吸光度的變化。
抗AMPA抑制的過氧化氫酶酶活(例如，啤酒酵母過氧化氫酶T，以透性微生物雙轉(zhuǎn)化株形式加入)在此反應(yīng)中，有效濃度是50～100,000IU/mL，優(yōu)選濃度是500～14,000IU/mL。透性微生物雙轉(zhuǎn)化株總過氧化氫酶活性(啤酒酵母過氧化氫酶T加上內(nèi)源性多形漢遜酵母和pastoris畢赤酵母過氧化氫酶)的測定方法是，準(zhǔn)確稱取2～5mg的透性濕細(xì)胞，置于3mL的石英比色槽中，槽中有攪拌棒，然后加入2.0mL的59mM H2O2(溶于16.7mM磷酸緩沖液中，pH7.0)，在攪拌情況下，于波長240nm處(ε＝39.4)測量吸光度隨時間的變化。微生物雙轉(zhuǎn)化株的過氧化氫酶T和內(nèi)源性過氧化氫酶酶活通過制備雙轉(zhuǎn)化株的提取物、按上述步驟在pH7.0和pH4.0條件下分別進(jìn)行測定，與它們各自在pH7.0的活性相比，在pH4.0時，啤酒酵母過氧化氫酶T的酶活是pH7.0時的60％，內(nèi)源性多形漢遜酵母的過氧化氫酶酶活，僅是pH7.0時的7％，而內(nèi)源性pastoris畢赤酵母菌過氧化氫酶酶活在pH4.0時，幾乎測不出來。
羥乙酸(2-羥基醋酸)可以在市場上買到。在本反應(yīng)中，其起始濃度可以在0.1M到2.0M范圍內(nèi)變動，優(yōu)選濃度是0.25M到1.0M。羥乙酸及其合適的鹽都可使用，這種鹽是水溶性的，其陽離子不干擾預(yù)期的羥乙酸向二羥乙酸的轉(zhuǎn)變。也不干擾隨后的二羥乙酸同氨甲基膦酸作用，生成N-(甲基膦酰)甘氨酸的反應(yīng)。通過實(shí)驗很容易確定合適的形成鹽的陽離子基團(tuán)。代表性的鹽有堿金屬、堿土金屬、銨(NH4+)、取代的銨、(PR4+)及取代的鹽(PR4X)。
羥乙酸向二羥乙酸的轉(zhuǎn)變，優(yōu)選地在水溶性介質(zhì)中進(jìn)行，這種轉(zhuǎn)變很便利。加入氨甲基膦酸(AMPA)或其適當(dāng)?shù)柠}，使AMPA、羥乙酸的摩爾比率(起始量)為0.01/1.0到3.0/1.0，優(yōu)選是0.25/1.0到1.05/1.0。AMPA與羥乙酸在水溶液中結(jié)合之后，混合物的pH調(diào)到6到10，最佳值是7.0到8.5。再用適當(dāng)?shù)?、無干擾的堿，包括堿金屬氫氧化物，碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽調(diào)到所需的精確的值。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)混合物的pH值略有降低。所以通常采用如下有效的措施，反應(yīng)開始時其pH值采用接近其最大酶活力pH范圍的最高值，大約是9.0～8.5，以彌補(bǔ)在反應(yīng)過程中的降低。由于酶的活力隨pH值改變，最好通過分批加入無干擾無機(jī)或有機(jī)緩沖液來保持pH值。
羥乙酸和二羥乙酸在水中高度解離，在pH7～20之間，大部分以羥乙酸和二羥乙酸離子形式存在。專業(yè)人員認(rèn)為，二羥乙酸(以及其共軛堿，二羥乙酸根陰離子)亦可能以水合物形式如(HO)2CHCOOH和/或半縮醛HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH存在。其組成及陰離子對應(yīng)物與二羥乙酸及陰離子對應(yīng)物是等價的，適于反應(yīng)生成N-(甲基膦酰)甘氨酸。
黃素單核苷酸(FMN)是最佳的加入組分，其濃度為0.0～2.0mM。
羥乙酸轉(zhuǎn)化成二羥乙酸的氧化劑是氧氣(O2)氧氣可以通過攪拌氣-液界面處的液體以氣體形式加入，或通過一個可以透過氧氣的膜，或把氧氣噴射到(鼓泡)到反應(yīng)混合物中。通過控制加氧氣速度(氧氣溶于水溶液介質(zhì)的速率)，在大多數(shù)情況下，至少部分性地控制于氧氣溶解于液體培養(yǎng)基的速率。雖然也能以空氣代替氧氣，但最好還是使用較純的氧氣，甚至提高加氧氣的壓力。氧氣壓力上限雖然不知道，但可用到50個大氣壓，優(yōu)選為是15個大氣壓。為了維持氣氧氣的溶解速度(亦即維持反應(yīng)速率)，攪拌是很重要的。任何便利的振蕩方式均可采用，例如攪拌。
反應(yīng)溫度是個重要的條件，它影響反應(yīng)速率和酶的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度采用0℃～40℃，但優(yōu)選的反應(yīng)溫度范圍是5℃～15℃。在最佳溫度范圍內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時可回收到最大的酶活性。溫度不能低到水溶液開始結(jié)冰的程度?？捎煤芷胀ǖ姆椒▉砜刂茰囟龋绲痪窒抻?，使用帶夾套的反應(yīng)器，讓適當(dāng)溫度的液體通過夾套。反應(yīng)容器可用任何相對于反應(yīng)物為惰性的材料構(gòu)成。
停止反應(yīng)溶液同氧氣接觸之后，用傾析過濾或離心的方法移去透性細(xì)胞，再重復(fù)使用。除去黃素單核苷酸(FMN)的最佳方案是將溶液和活性碳接觸。含有二羥乙酸和氨甲基膦酸的溶液(它被認(rèn)為與相應(yīng)的半縮胺和胺處于平衡狀態(tài))，可按照任何一個本專業(yè)所熟知的生產(chǎn)N-(甲基膦酰)甘氨酸的方法來處理。
催化氫化是從含有二羥乙酸和氨甲基膦酸的混合物制備N-(甲基膦酰)甘氨酸的優(yōu)選的方法。適用于此目的氫化催化劑包括(但不限于此)各種鉑金屬，如銥、鋨、釕、銠、鉑和鈀；以及其它過渡金屬，如鈷、銅、鎳和鋅。催化劑可能是無載體的，例如阮內(nèi)鎳和氧化鉑；或者可能是有載體的，例如鉑載于碳上，鈀載于氧化鋁上，或者鎳載于硅藻土上。優(yōu)選的是鈀載于碳上，鎳載于硅藻土上和阮內(nèi)鎳。氫化可于pH4～11范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選的是5～10。氫化作用的溫度和壓力可在廣泛范圍內(nèi)改變。一般溫度是0℃～150℃，優(yōu)選的20℃～90℃，H2的壓力一般是1～100個大氣壓，最好是1～10個大氣壓，N-(甲基膦酰)甘氨酸，可自還原液中回收，不論采用任何專業(yè)領(lǐng)域所熟知還原方法，任何回收方法都行。
下面各個實(shí)施例，是對本發(fā)明的進(jìn)一步闡述，二羥乙酸、甲酸和草酸的產(chǎn)率以及羥乙酸的回收率，是相對于反應(yīng)開始時，體系中羥乙酸總量的百分比。用高效液相色譜儀分析反應(yīng)混合物有機(jī)酸用Bio-Rad HPX-87H柱，而AMPA(氨甲基膦酸)和N-(甲基膦酰)甘氨酸，則用Bio-Rad Aminex Glyphosate分析柱。
實(shí)施例1一個裝有Dispersimax高速攪拌機(jī)(Autoclave Engineers)300mL的EZE-密封的經(jīng)高壓滅菌反應(yīng)器，內(nèi)盛100mL溶液，其組成如下羥乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、異丁酸(0.100M，高壓液相色譜分析用的內(nèi)標(biāo)物)和FMN(0.01mM，pH8.3)將溶液冷卻到5℃。然后向反應(yīng)器中加0.5g的多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株G02(NRRL No.Y-21113)(357IU羥基乙酸氧化酶和600,000IU總過氧化氫酶(50％啤酒酵母過氧化氫酶T，50％多形漢遜酵母內(nèi)源性過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)過0.1％氯化芐烷銨(LonzaBarquat MB-50)處理，而成為透性細(xì)胞。用5％NaOH將混合物的pH調(diào)到8.3。在5℃和40psig氧氣壓力下，750轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杌旌衔?，通過渦輪高速攪拌機(jī)使氧氣鼓泡經(jīng)過混合物。為了監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行情況，定期取樣(反應(yīng)混合物)0.2mL，用10,000NMWLFilter Unit的Millipore ULTRAFREE(Millipore公司，McClean，VA，USA)進(jìn)行過濾，用高壓液相色譜分析過濾液。1.5小時之后，二羥乙酸、草酸和甲酸的得率分別為90.0％，3.1％和1.8％，羥乙酸的回收率為5.0％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是其透性化之后起始值的146％和113％。
微生物細(xì)胞催化劑按上述方式，通過離心自反應(yīng)混合物中回收。不需任何進(jìn)一步的處理，這些細(xì)胞沉淀物可與100mL新的反應(yīng)混合物混合，進(jìn)行新的反應(yīng)。1.5小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是84.3％、4.9％和9.9％，羥乙酸回收率是1.7％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是其透性化之后起始值的143％和104％，經(jīng)兩輪使用之后的回收細(xì)胞的提取物中，過氧化氫酶T和多形漢遜酵母過氧化氫酶在總過氧化氫酶中所占百分比分別是46％和54％。
實(shí)施例2重復(fù)實(shí)施例1中描述的反應(yīng)，用4.6g多形漢遜酵母單轉(zhuǎn)化株G01(NRRL No.Y-21065)(194IU羥基乙酸氧化酶，440,000IU多形漢遜酵母內(nèi)源性過氧化氫酶，不含過氧化氫酶T)，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)過0.1％氯化芐烷胺(Lonza Barquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。1.5小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是59.3％、2.9％和34.4％，羥乙酸的回收是4.9％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的191％和116％。
實(shí)施例3(比較)
重復(fù)例1中描述的反應(yīng)，利用10.0g pastoris畢赤酵母單轉(zhuǎn)化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(391IU羥基乙酸氧化酶，457,000 IU pastoris畢赤酵母內(nèi)源性過氧化氫酶，無過氧化氫酶T)該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％“Triton”X-100/1凍融處理成為透性細(xì)胞。在5℃，120psig氧氣壓力下，攪拌反應(yīng)混合物1000轉(zhuǎn)/分。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是45.5％、2.9％和37.1％，羥乙酸的回收是8.2％。
實(shí)施例4在15℃重復(fù)實(shí)施例1所描述的反應(yīng)。利用多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株G02(NRRL No.Y-21003)(402IU羥基乙酸氧化酶以及588,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T，50％多形漢遜酵母過氧化氫酶)該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是83.2％、6.7％和9.5％，羥乙酸回收率是1.0％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的132％和127％。
實(shí)施例5在30℃重復(fù)上述例1中描述的反應(yīng)。利用10.0g多形漢遜酵母GO2雙轉(zhuǎn)化株(NRRL No.Y-21113)(699IU羥基乙酸氧化酶以及1,007,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T，50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(LonzaBarquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是65.5％、5.7％和23.0％，羥乙酸的回收率是5.5％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的100％和103％。
實(shí)施例6重復(fù)實(shí)施例1中描述的反應(yīng)。使用10.0g多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株GO2(NRRL No.Y-21113)(699IU羥基乙酸氧化酶和1,007,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T和50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已用0.1％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是89.4％、4.4％和1.6％，羥乙酸的回收2.5％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總催化酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的84％和98％。
實(shí)施例7重復(fù)例1中描述的反應(yīng)。使用2.0g多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株G02(NRRL No.Y-21113)(140IU羥基乙酸氧化酶和201,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T和50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已用0.1％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。1.75小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是76.0％、2.8％和14.0％，羥乙酸的回收是5.8％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的155％和126％。
實(shí)施例8重復(fù)例1中的反應(yīng)。在70psig氧氣壓力下，不加FMN，使用5.0g多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株GO2(NRRL No.Y-21113)(383IU羥基乙酸氧化酶以及602,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T，50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.2％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理，成為透性細(xì)胞。1.75小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是85.0％、4.3％和7.4％，羥乙酸的回收是4.1％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的104％和99％。
實(shí)施例9重復(fù)實(shí)施例1中的反應(yīng)。在70psig氧氣壓力下，不加FMN，利用5.0g的多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株GO2(NRRL No.Y-21113)(383IU羥基乙酸氧化酶和602,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T和50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.2％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理，成為透性細(xì)胞。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是87.2％、6.8％和5.0％，羥乙酸的回收是2.3％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的110％和105％。
實(shí)施例10上述例1反應(yīng)按下列條件進(jìn)行。在120psig氧氣壓力下，不加FMN，利用5.0g的多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株GO2(NRRL No.Y-21113)(383IU羥基乙酸氧化酶和602,000IU總過氧化氫酶(50％過氧化氫酶T和50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.2％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。0.8小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是91.3％、5.6％和1.5％，羥乙酸的回收是3.6％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的100％和100％。
實(shí)施例11向一個3盎司Fisher-Porter玻璃的噴霧反應(yīng)容器中，放一個磁攪拌棒和10mL含有下列組成的水溶液羥乙酸(0.25M)、AMPA(0.25M)、FMN(0.01M)和異丁酸(0.10M，高效液相色譜的內(nèi)標(biāo)物)，pH8.3(用50％NaOH調(diào)節(jié)pH)。然后將溶液冷卻到5℃。加入0.50g的多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株G02(NRRL No.Y-21113)(35.0IU羥基乙酸氧化酶和50,300IU總過氧化氫酶(50％啤酒酵母過氧化氫酶T和50％多形漢遜酵母過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理，成為透性細(xì)胞。將此反應(yīng)混合物用5％NaOH調(diào)pH到8.3。密封反應(yīng)容器，在攪拌情況下，用70psig壓力的氧氣，5次掠過反應(yīng)容器，放人大氣中。然后保持容器內(nèi)氧氣壓力70psig，并維持5℃，進(jìn)行攪拌。為了監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程，定期用注射器自取樣處取樣0.1mL(不降低反應(yīng)容器中的壓力)，經(jīng)Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL過濾器過濾后用高壓液相色譜法分析。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是89.7％、9.1％和1.6％，殘留有0.8％的羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的94％和117％。
實(shí)施例12重復(fù)實(shí)施例11的反應(yīng)。采用0.50M羥乙酸和0.15M AMPA。4.5小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是87.6％、6.4％和3.8％，殘留有2.0％的羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的111％和134％。
實(shí)施例13
重復(fù)實(shí)施例11中的反應(yīng)。利用0.50M羥乙酸和0.525M AMPA。5.5小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是85.3％、6.7％和6.7％，殘留1.5％的羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的137％和138％。
實(shí)施例14重復(fù)實(shí)施例11的反應(yīng)。利用0.50M羥乙酸和0.75M AMPA。26個小時之后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是50.9％、0.9％和1.7％，殘留有43.1％的羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的117％和144％。
實(shí)施例15(比較)重復(fù)實(shí)施例11的反應(yīng)。利用0.50M羥乙酸、0.375M AMPA和0.47g多形漢遜酵母單轉(zhuǎn)化株G01(NRRL No.Y-21065)(10IU羥基乙酸氧化酶、22,100IU內(nèi)源性多形漢遜酵母過氧化氫酶，沒有過氧化氫酶T)，該轉(zhuǎn)化株已用0.1％“Triton”X-100/1凍融而成為透性細(xì)胞。16小時之后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是57.6％、2.6％和32.5％，回收8.9％羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的60％和378％。
實(shí)施例16(比較)例11中的反應(yīng)按下面條件進(jìn)行。采用0.50M羥乙酸、0.375MAMPA和0.75g pastoris畢赤酵母單轉(zhuǎn)化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(13.2IU羥基乙酸氧化酶、21,200IU pastoris畢赤酵母內(nèi)源性過氧化氫酶，無過氧化氫酶T)，該轉(zhuǎn)化株已用0.1％“Triton”X-100/1凍融而成為透性細(xì)胞。9小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是30.5％、10.7％和59.2％，殘留羥乙酸0.8％。
實(shí)施例17裝有Dispersimax高速攪拌機(jī)(Autoclave Engineers)的300mL EZE-密封高壓釜反應(yīng)器，內(nèi)盛100mL下列組成的溶液羥乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、異丁酸(0.100M，高壓液相色譜分析用內(nèi)標(biāo)物)、黃素單核苷酸(0.01M)，pH8.3(用5％NaOH調(diào)節(jié)pH)。溶液冷卻到5℃。加入0.5g多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株G02(NRRL No.Y-21113)(655IU羥基乙酸氧化酶和596,000IU總過氧化氫酶(49％過氧化氫酶T，51％多形漢遜酵母內(nèi)源性過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)過0.2％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理，成為透性細(xì)胞。用5％NaOH調(diào)混合物的pH到8.3。在5℃、40psig氧氣壓力下，攪拌700轉(zhuǎn)/分，通過渦輪高速攪拌機(jī)使氧氣鼓泡通過混合物。為監(jiān)測反應(yīng)過程，定期取樣0.20mL，用Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL過濾器過濾后，進(jìn)行高壓液相色譜分析。0.9小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是90.6％、7.4％和2.8％，殘留2.0％的羥乙酸。
如前面所述，通過離心，回收微生物細(xì)胞催化劑。不經(jīng)任何處理，回收的催化劑即可加入100mL新鮮的反應(yīng)混合物中，重復(fù)使用。利用此相同的工藝，加入相同的5.0g多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株催化劑，連續(xù)進(jìn)行30批反應(yīng)。圖1描述了每批反應(yīng)反應(yīng)時間，二羥乙酸產(chǎn)率、透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活力的回收率(以它們透性化之后的起始值為基準(zhǔn))。
實(shí)施例18
重復(fù)實(shí)施例17中的反應(yīng)。采用7.1g多形漢遜酵母雙轉(zhuǎn)化株G03(NRRL No.Y-21114)(465IU羥基乙酸氧化酶和770,000IU總過氧化氫酶(27％啤酒酵母過氧化氫酶T，73％多形漢遜酵母內(nèi)源性過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(LonzaBarquat MB-50)處理，成為透性細(xì)胞。反應(yīng)混合物中不加FMN。1.25小時以后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是86.8％、3.8％和6.0％，回收羥乙酸.3.5％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的酶活分別是透性化之后起始值的92％和106％。
同上面介紹的一樣，通過離心，將微生物細(xì)胞催化劑自反應(yīng)混合物中分出。上清液(0.434M二羥乙酸/0.375M AMPA)通過0.2μm的醋酸纖維素過濾，再連續(xù)通過AMICON YM30、YM10和YMI膜過濾器(W.R.Grace和Co.，New York，NY)。得到的濾液置于300mL EZE-密封的帶Dispersimax高速攪拌機(jī)(Autoclave Engineers)的高壓反應(yīng)釜中，同時放入1.0g的5％載于炭上的鈀。反應(yīng)器中充滿氮，然后通入275psig的氫，27℃下，攪拌1000轉(zhuǎn)/分。6小時后，N-(甲基膦酰)甘氨酸的產(chǎn)率是99.9％(相對于AMPA，用高壓液相色譜法測定)。
實(shí)施例19裝有Dispersimax高速攪拌機(jī)(Autoclave.Engineers)的300mL EZE-密封的高壓釜反應(yīng)器，內(nèi)裝含有下列組成的100mL溶液羥乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、異丁酸(0.100M，高壓液相色譜分析用的內(nèi)標(biāo)物)和FMN(0.01mM)，pH8.3(用5％NaOH調(diào)節(jié))。溶液冷卻到5℃。然后加入0.5g pastoris畢赤酵母雙轉(zhuǎn)化株MSP8.6(NRRL No.Y-21117)(234IU羥基乙酸氧化酶和543,000IU總過氧化氫酶(13％啤酒較過氧化氫酶T，87％pastoris畢赤酵母內(nèi)源過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理成為透性細(xì)胞。用5％NaOH調(diào)pH到8.3。在5℃、70psig氧氣壓力下，通過渦輪高速攪拌機(jī)，使氧氣鼓泡通過反應(yīng)混合物，攪拌速度為750轉(zhuǎn)/分。為了監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，定期取樣0.20mL，以Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL過濾器過濾(Millipore Corp.，Bedford，MA)，濾液用高壓液相色譜分析。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是90.0％、4.9％和4.4％，回收羥乙酸3.6％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終酶活分別是透性化之后起始值的125％和160％。
實(shí)施例20(比較)重復(fù)實(shí)施例19描述的反應(yīng)。利用3.1g pastoris畢赤酵母單轉(zhuǎn)化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(284IU羥基乙酸氧化酶，554,000IU pastoris畢赤酵母內(nèi)源過氧化氫酶，無過氧化氫酶T)，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(Lonza Barquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是78.8％、3.2％和12.2％，回收羥乙酸4.8％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活分別是它們在透性化之后起始值的101％和139％。
實(shí)施例21一個裝有Dispersimax高速攪拌機(jī)(Autoclave Engineers)的300mL EZE-密封高壓釜反應(yīng)器，內(nèi)盛100mL下列組成的溶液羥乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、異丁酸(0.100M，高效液相色譜的內(nèi)標(biāo)物)和FMN(0.01mM)，pH8.3(用5％NaOH調(diào))。溶液冷卻到5℃。然后加入7.5g pastoris畢赤酵母雙轉(zhuǎn)化株MSP-8.6(NRRL No.Y-21187)(368IU羥基乙酸氧化酶和1,166,800IU總過氧化氫酶(12％啤酒酵母過氧化氫酶T，88％pastoris畢赤酵母內(nèi)源過氧化氫酶))，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(LonzaBarquat MB-50)處理成為透性細(xì)胞。用5％NaOH調(diào)混合物的pH到8.3。在5℃、750psig氧氣壓力下，攪拌750轉(zhuǎn)/分，通過渦輪高速攪拌機(jī)的作用，使氧氣鼓泡通過混合物。為了監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程，定期取樣0.2mL，經(jīng)Millipore“ULTRAFREE-MC”10,000NMWL過濾器(Bedford，MA)過濾后，用高效液相色譜分析。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是92.4％、7.8％和0.3％，回收1.8％羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和總過氧化氫酶的最終活性是它們在透性化之后起始值的118％和91％。
通過離心，將微生物細(xì)胞催化劑自反應(yīng)混合物中分出，無需進(jìn)一步處理，即可投入100mL反應(yīng)混合物中，重復(fù)使用。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是85.0％、5.2％和10.0％；回收羥乙酸2.6％。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活是它們在透性化之后起始值的116％和65％。經(jīng)兩輪使用之后的回收細(xì)胞提取物中，過氧化氫酶T和多形漢遜酵母過氧化氫酶在總過氧化氫酶中所占百分比分別是8.0％和92％。
實(shí)施例22(比較)重復(fù)實(shí)施例19中反應(yīng)。采用5.0g pastoris畢赤酵母單轉(zhuǎn)化株GS115-MSP10(NRRL No.Y-21001)(400IU羥基乙酸氧化酶、1,720,000IU pastoris畢赤酵母內(nèi)源過氧化氫酶，無過氧化氫酶T)，該轉(zhuǎn)化株已經(jīng)0.1％氯化芐烷銨(LonzaBarquat MB-50)處理而成為透性細(xì)胞。1小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是78.1％、7.2％和11.7％，回收2.7％羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶活力分別是其透性化之后起始值的105％和87％。
通過離心回收混合物中的微生物細(xì)胞催化劑。無需進(jìn)一步的處理，即可投入100mL反應(yīng)混合物中，重復(fù)使用。1.5小時后，二羥乙酸、草酸和甲酸的產(chǎn)率分別是52.8％、4.0％和39.1％，回收3.0％羥乙酸。透性細(xì)胞的羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶的最終酶活是它們在透性化之后起始值的107％和44％。
對本發(fā)明已作描述，并舉例說明，使之具有一定程度的具體化。下面的權(quán)利要求雖然并不局限于此，但卻提出了一個與各條權(quán)利要求機(jī)器等同物的相應(yīng)的范圍。
權(quán)利要求
1.一個改進(jìn)的二羥乙酸和氨甲基膦酸混合物的制備方法，包括在有氨甲基膦酸以及羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶存在的水溶液里，用氧氣氧化羥乙酸的步驟，其中的改進(jìn)包括利用微生物雙轉(zhuǎn)化株細(xì)胞催化劑，表達(dá)外源性羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶，該外源性過氧化氫酶由于不受氨甲基膦酸的抑制而被選擇。
2.權(quán)利要求1的方法，其中外源性過氧化氫酶由啤酒酵母或黑曲霉產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的微生物雙轉(zhuǎn)化株細(xì)胞，是一個甲醇營養(yǎng)酵母。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說的甲醇營養(yǎng)酵母是自包括多形漢遜酵母和pastoris畢赤酵母的類群中選擇的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所說的微生物雙轉(zhuǎn)化株細(xì)胞是多形漢遜酵母(NRRL NosY-21113或Y-21114)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所說的微生物雙轉(zhuǎn)化株細(xì)胞是pastoris畢赤酵母(NRRL NoY-21187)。
全文摘要
一個改進(jìn)的二羥乙酸和氨甲基膦酸混合物的制備方法，包括在有氨甲基膦酸以及羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶存在的水溶液里，用氧氣氧化羥乙酸的步驟，其中的改進(jìn)包括利用微生物雙轉(zhuǎn)化株細(xì)胞催化劑，表達(dá)外源性羥基乙酸氧化酶和過氧化氫酶，該外源性過氧化氫酶由于不受氨甲基膦酸的抑制而被選擇。
文檔編號C12N1/19GK1130404SQ9419325
公開日1996年9月4日 申請日期1994年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月1日
發(fā)明者D·L·安郭, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司