專利名稱：氧化穩(wěn)定的蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于芽胞桿菌菌株衍生的蛋白酶領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及一種從新芽胞桿菌(Bacillas sp.)菌株衍生來的新蛋白酶，其特征在于在含有次氯酸鹽和/或其他氧化劑的溶液中可保持穩(wěn)定。此外，本發(fā)明還涉及該蛋白酶的制備方法，及所用水中含有次氯酸鹽的工藝中該蛋白酶的應(yīng)用。
蛋白酶上市已有20多年用于許多不同的目的，最重要是作為洗滌劑成分。
通過分離自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白酶而使蛋白酶得到了發(fā)展。商業(yè)供應(yīng)最多的蛋白酶是從芽胞桿菌屬得到的。目前，在各種特定條件下具有較好的價(jià)格/性能比的新型蛋白酶正在進(jìn)入市場(chǎng)。
芽胞桿菌蛋白酶商品的例子有Alcalase、Esperase、Pri-mase、Savinase、和Durazyme，〔Savinase的蛋白工程變體〕，這些都是丹麥Novo Nordisk A/S的產(chǎn)品。這些酶及從其他廠商得到的類似酶產(chǎn)品在洗滌劑溶液中具有活性，即在PH值為8-11，并有螫合劑、表面活性劑、及如硼酸鈉之類漂白劑存在下具有活性，但當(dāng)工藝中使用的水中含次氯酸鹽時(shí)，它們的活性就會(huì)下降。這個(gè)問題由于工業(yè)化國家中越來越多的水被氯化而變得更為突出。
本發(fā)明的目的是提供一種在含次氯酸鹽的溶液中具有改進(jìn)了的穩(wěn)定特性的新蛋白酶。
因此，本發(fā)明的首要方面是提供一種與從芽胞桿菌菌株DSM8473衍生來的蛋白酶具有相同的免疫化學(xué)特性的蛋白酶，該蛋白酶在含次氯酸鹽的溶液中可保持穩(wěn)定。
其次，本發(fā)明涉及一種新芽胞桿菌菌株的生物純培養(yǎng)物。更具體講，本發(fā)明涉及芽胞桿菌菌株DSM8473，或其突變株或變異株。
第三，本發(fā)明提供該蛋白酶的制備方法，該方法包括在含有碳源和氮源及無機(jī)鹽的適宜營養(yǎng)性培養(yǎng)基本上培養(yǎng)可產(chǎn)生蛋白酶的新芽胞桿菌菌株，然后回收所需的酶。更具體講，培養(yǎng)芽胞桿菌菌株DSM8473或編碼與從芽胞桿菌菌株DSM8473衍生來的蛋白酶具有相同免疫化學(xué)特性的蛋白酶的突變株或變異株。
第四，在使用含有次氯酸鹽的水的工藝中使用該蛋白酶。
本發(fā)明可通過附圖更好地加以闡明，其中

圖1表示溫度與本發(fā)明的新型蛋白酶的蛋白水解活性之間的關(guān)系(根據(jù)實(shí)施例1方法獲得蛋白酶制備物，用2％酪蛋白為底物，PH值9.5)。
圖2表示PH值與本發(fā)明的新型蛋白酶的蛋白水解活性之間的關(guān)系(根據(jù)實(shí)施例1的方法獲得蛋白酶制備物，在25℃下，用2％酪蛋白為底物，用Britten-Robinson緩沖液調(diào)節(jié)PH值至6-11范圍內(nèi)預(yù)定的PH值)。
微生物能產(chǎn)生本發(fā)明的酶的新微生物以從土壤樣品中分離出來的菌株為代表。
該新芽胞桿菌已于1993年8月23日，根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約保藏于Deutsche SammlungVon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，登記號(hào)為No.DSM8473。
本發(fā)明的微生物屬于芽胞桿菌屬的需氧產(chǎn)孢子細(xì)菌。其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)為能動(dòng)的棒狀菌，直徑0.6-0.8μm，長度1-3μm。孢子為圓筒形到橢圓形，不膨脹的孢子囊，居中到偏于一側(cè)。最適生長溫度為30-50℃，最適PH值為6-8，50℃時(shí)生長良好。只有在37℃生長時(shí)，菌落呈黃色，其他情況下無色，在營養(yǎng)性瓊脂斜面上為細(xì)小菌落，瓊脂中無色素?cái)U(kuò)散。微生物培養(yǎng)本發(fā)明的微生物可用含有可吸收的碳源、氮源及其他必需營養(yǎng)物質(zhì)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，按本領(lǐng)域已知原則配制培養(yǎng)基。
碳水化合物如蔗糖、葡糖糖、淀粉或含碳水化合物的材料如谷類、麥芽、稻及高粱為適宜的碳源。培養(yǎng)基中碳水化合物濃度的變化范圍很廣，如，最高可到25％，最低可到1-5％，但通常8-10％是比較適宜的，其百分比按葡萄糖當(dāng)量來計(jì)算。
營養(yǎng)培養(yǎng)基中的氮源可以是天然無機(jī)和/或有機(jī)物。硝酸鹽及銨鹽是適宜的無機(jī)氮源。有機(jī)氮源中有相當(dāng)一部分常用于細(xì)菌培養(yǎng)的發(fā)酵過程。例如黃豆粉、棉花籽粉、花生粉、酪蛋白、玉米、玉米浸出液、酵母提取物、尿素和白蛋白。此外，營養(yǎng)性培養(yǎng)基中還應(yīng)含有常規(guī)的微量物質(zhì)。
為在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，需進(jìn)行人工通氣。通氣速率與常規(guī)罐發(fā)酵所用的相似。
發(fā)酵完畢后，可通過從發(fā)酵液中除去粗糙物，或根據(jù)需要，通過在低溫下蒸發(fā)或反透析濃縮發(fā)酵液來獲得液態(tài)酶濃液。最后向濃液中加入防腐劑。
用鹽(如Na2SO4)或水溶性溶劑(如乙醇或丙酮)來沉淀提純的和/或濃縮的發(fā)酵液來制備固體酶制劑?？刹捎眠m宜的干燥方法如噴霧干燥法從發(fā)酵液中去除水份。蛋白水解活性測(cè)定以酪蛋白為底物測(cè)定蛋白水解活性。酪蛋白蛋白酶單位(CPU)定義如下在標(biāo)準(zhǔn)條件下即在25℃，PH9.5的情況下孵育30分鐘，每分鐘釋放1mM伯氨基(與絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)相比較而測(cè)定)所需酶的量。酶本發(fā)明的酶為新蛋白酶。它們是堿性蛋白酶，可通過在含有碳源和氮源及無機(jī)鹽的適宜的營養(yǎng)性培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物而獲得，芽胞桿菌DSM8473，或其突變株或變異株。也可通過重組DNA技術(shù)獲得這些酶。
以下特征可用來描述本發(fā)明的蛋白酶。物理-化學(xué)特征用SDS-PAGE法測(cè)定其分子量為30KD。在LKB Ampholine，PAG平板上用等電點(diǎn)聚焦法測(cè)定其等電點(diǎn)約為8.8。
用PMSF和土耳其-蛋-白(Turkey-egg-white)蛋白酶抑制劑可抑制該蛋白酶活性。EDTA和大豆蛋白酶抑制劑對(duì)該蛋白酶活性無影響。
用2％酪蛋白為底物，在PH9.5時(shí)測(cè)定溫度與活性的關(guān)系。使用前述測(cè)定蛋白水解活性的方法，但改變孵育溫度在15℃-70℃之間。新蛋白酶所得結(jié)果如圖1所示。從圖中可見該酶在15℃-70℃溫度范圍內(nèi)都具有蛋白水解活性，最適溫度為50℃-60℃，約60℃左右。
以同樣步驟測(cè)定蛋白酶活性對(duì)PH值的依賴性，用緩沖液調(diào)節(jié)PH值至6-11范圍內(nèi)的預(yù)定PH值，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見在此PH值范圍內(nèi)(6-11)的所有PH值下，該酶均具有蛋白水解活性。
在含次氯酸鹽的水中，本發(fā)明的蛋白酶具有特殊潛能。實(shí)施例2清楚的證明了這一點(diǎn)。在含有5ppm NaOCl時(shí)，這些酶通常至少可保存45％的活性，優(yōu)選高于60％，最優(yōu)選高于80％，在含有10ppmNaOCl時(shí)，至少可保存10％的活性，優(yōu)選可保存20％以上的活性。免疫化學(xué)特性可用免疫學(xué)方法交叉反應(yīng)一致性試驗(yàn)測(cè)定其免疫化學(xué)特性?？捎萌藗兪熘腛uchterlony雙向免疫擴(kuò)散法來進(jìn)行一致性試驗(yàn)，也可根據(jù)Gower醫(yī)學(xué)出版社1985年出版的I.M.Roitt的《免疫學(xué)》一書及Blackwell科學(xué)出版社1983年出版的N.H.Axelsen的《凝膠免疫沉淀技術(shù)手冊(cè)》一書中第5章和第14章的串聯(lián)(tandem)交叉免疫電泳進(jìn)行一致性試驗(yàn)，同一本書的第5、19及20章還對(duì)術(shù)語“抗原一致性”及“部分抗原一致性”作了描述。
用本發(fā)明的一種精制蛋白酶按上述方法免疫兔子可產(chǎn)生單特異性抗血清。將免疫原與Freund氏佐劑混合，每兩周給兔子皮下注射一次。在為期8周的免疫周期結(jié)束后，可獲得抗血清，并可由此按N.H.Axelsen(同上)的方法制備免疫球蛋白。
Ouchterlony雙向免疫擴(kuò)散的結(jié)果顯示本發(fā)明的蛋白酶與已知的堿性絲氨酸蛋白酶如Savinase，Esperase，Durazyme，Primase(從Novo Nordisk A/S獲得)及KazusaseTM(從SHOWA DENKO獲得)具有免疫化學(xué)非同一性。已證明它與從地衣芽胞桿菌得到的Alcalase具有部分免疫化學(xué)同一性。氧化劑本發(fā)明的蛋白酶對(duì)氧化劑如次氯酸鹽、過氧化氫、過氧化物前體(如過碳酸鹽、過硼酸鹽和過氧化羧酸如過乙酸)穩(wěn)定。應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶的典型應(yīng)用是作為洗滌劑組合物的成分。它們還可用來去除含蛋白質(zhì)的污垢。
此外，當(dāng)工藝過程所用的水中合有次氯酸鹽，尤其是當(dāng)其濃度在1-10ppm之間時(shí)，本發(fā)明的蛋白酶可用來處理蛋白質(zhì)。洗滌劑組合物本發(fā)明的蛋白酶可作為一種成分加入洗滌劑組合物中。因此，它可作為一種洗滌劑添加劑包括在洗滌劑組合物中。洗滌劑組合物和洗滌劑添加劑通常還含有一種或多種其他酶如脂肪酶，淀粉酶、角質(zhì)酶、纖維素酶和氧化還原酶。
在一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供一種洗滌劑添加劑。可通過加入多個(gè)含有一種或多種酶的分離式添加劑或加入一種含有所有這些酶的聯(lián)合式添加劑而將酶加入洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，即分離式添加劑或聯(lián)合式添加劑，可制成如粒狀、液態(tài)、漿液等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制品是顆粒狀的(尤其是非粉塵顆粒)、液態(tài)的(尤其是穩(wěn)定的液體)、漿狀或被保護(hù)酶的形式。
可按US4,106,991及4,661,452的方法(均為Novo IndustriA/S專利)生產(chǎn)非粉塵顆粒，并選擇性采用本領(lǐng)域中已知的方法對(duì)非粉塵顆粒進(jìn)行包被。蠟樣包被材料的例子有平均摩爾分子量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇；PEG)；含有16到50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；含有15到80個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化脂肪醇(其中的醇含有12-20個(gè)碳原子)；脂肪醇；脂肪酸；甘油單-，雙-及三脂肪酸酯。專利GB1483591中給出了適用于流化床技術(shù)的涂膜包被材料的例子。根據(jù)已建立的方法在液態(tài)酶制劑中加入多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸可達(dá)到穩(wěn)定作用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知其他酶穩(wěn)定劑。可按EP238,216的方法制備被保護(hù)酶。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可制成任何方便的形式，如粉狀、顆粒狀、糊狀或液態(tài)。液態(tài)洗滌劑可以是典型的含高達(dá)70％的水及0-30％有機(jī)溶劑的水樣洗滌劑，也可是非水樣的。
該洗滌劑組合物中含一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子、非離子、陽離子或兩性離子型。本洗滌劑中通常含有0-50％的陰離子表面活性劑，如線性烷基苯磺酸鹽(LAS)，a-烯屬磺酸鹽(AOS)，烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)(AS)，乙氧基化醇硫酸酯(AEOS或AES)，二級(jí)烷磺酸鹽(SAS)，α-磺基脂肪酸甲酯，烷基或鏈烯基琥珀酸或皂。還可以含0-40％的非離子表面活性劑，如醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧基化醇的乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚甘醇甙，烷基二甲胺氧化物，乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺，脂肪酸單乙醇酰胺，或多羥基烷基脂肪酸酰胺(如WO92/06154中所述)。
本洗滌劑組合物中還可含有一種或多種其他酶，如淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶和氧化還原酶。
本洗滌劑中可含有1-65％的洗滌劑助洗劑或配合劑，如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)盈B式硅酸鹽(如從Hoechst得到的SKS-6)。本洗滌劑還可以是不帶助洗劑的，即基本上不合洗滌劑助洗劑。
本洗滌劑可含一種或多種聚合物。例如，羧甲基纖維素(CMC)，聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)，聚(乙烯基醇)(PVA)，多羧基化合物如聚丙烯酸、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。
本洗滌劑可含有漂白系統(tǒng)，其中可包括H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，它們可以和過酸形成型漂白活化劑如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸鹽結(jié)合使用?；蛘?，漂白系統(tǒng)可含有如酰胺、酰亞胺或砜型的過氧酸。
本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可用常規(guī)的穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，如丙二醇或甘油之類的多羥基化合物、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳酯，此組合物可按WO92/19709和WO92/19708中所述方法配制。
該洗滌劑中還可含有基他常規(guī)洗滌劑組分，如包括粘土的織物調(diào)理劑、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、防污物再沉劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑或香味劑。
PH值(在使用濃度的水溶液中測(cè)定)通常為中性或堿性，如7-11。
本發(fā)明范圍內(nèi)的特定洗滌劑組合物包括1).配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒狀洗滌劑組合物含有
-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì)) 7-12％-乙氧基醇硫酸酯(如C12-18的醇，1-4％1-2EO)或烷基硫酸鹽(如C16-18)-醇乙氧基化物(如C14-15的醇，7EO) 5-9％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì)) 14-20％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 2-6％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 15-22％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì)) 0-6％-檸檬酸鈉/檸檬酸 0-15％(按C6H5Na3O7/C6H8O7計(jì))-過硼酸鈉(按NaBO3H2O計(jì)) 11-18％-TAED 2-6％-羧甲基纖維素 0-2％-聚合物(如馬來酸/ 0-3％丙烯酸共聚物，PVP，PEG)-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑，熒光增白劑，光漂白劑)0-5％2).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì)) 6-11％-乙氧基醇硫酸酯(如C12-18的醇，1-2EO) 1-3％或烷基硫酸鹽(如C16-18)-醇乙氧基化物(如C14-15的醇，7EO) 5-9％
-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì))15-21％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 1-4％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 24-34％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì))4-10％-檸檬酸鈉/檸檬酸 0-15％(按C6H5Na3O7/C6H8O7計(jì))-羧甲基纖維素0-2％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物PVP，PEG)1-6％-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑、香味劑)0-5％3).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))5-9％-醇乙氧基化物(如C12-15的醇，7EO) 7-14％-作為脂肪酸的皂類(如C16-22) 1-3％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì))10-17％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 3-9％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 23-33％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì))0-4％-過硼酸鈉(按NaBO3·H2O計(jì)) 8-16％-TAED2-8％-膦酸鹽(如EDTMPA)0-1％-羧甲基纖維素0-2％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸 0-3％
共聚物，PVP，PEG)-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑，熒光增白劑)0-5％4).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))8-12％-醇乙氧基化物(如C12-15的醇，7EO) 10-25％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì))14-22％-溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 1-5％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 25-35％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì))0-10％-羧甲基纖維素0-2％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物， 1-3％PVP，PEG)-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑)0-5％5).水樣液態(tài)洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))15-21％-醇乙氧基化物12-18％(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-作為脂肪酸的皂(如油酸) 3-13％-鏈烯基琥珀酸(C12-14)0-13％-氨基乙醇8-18％-檸檬酸 2-8％-膦酸鹽 0-3％
-聚合物(如PVP，PEG) 0-3％-硼酸鹽(按B4O7計(jì)) 0-2％-乙醇0-3％-丙二醇 8-14％-酶 0-5％-小成分(如分散劑，抑泡劑，香味劑，熒光增白劑)0-5％6).水樣結(jié)構(gòu)化液態(tài)洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))15-21％-醇乙氧基化物3-9％(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-作為脂肪酸的皂(如油酸) 3-10％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 14-22％-檸檬酸鉀9-18％-硼酸鹽(按B4O7計(jì)) 0-2％-羧甲基纖維素0-2％-聚合物(如PVP，PEG) 0-3％-結(jié)合聚合物(如甲基丙烯酸月桂基酯/0-3％丙烯酸共聚物，摩爾比25∶1，分子量3800)-甘油0-5％-酶 0-5％-小成分(如分散劑，抑泡劑，香味劑， 0-5％熒光增白劑)7).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-脂肪醇硫酸酯5-10％
-乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺3-9％-作為脂肪酸的皂 0-3％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì))5-10％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 1-4％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 20-40％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì))2-8％-過硼酸鈉(按NaBO3·H2O計(jì)) 12-18％-TAEP2-7％-聚合物(如馬來酸/丙烯酸共聚物，PEG) 1-5％-酶 0-5％-小成分(如熒光增白劑，抑泡劑，香味劑)0-5％8).配制成顆粒狀的洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))8-14％-乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺5-11％-作為脂肪酸的皂 0-3％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì))4-10％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 1-4％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 30-50％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì))3-11％-檸檬酸鈉(按C6H5Na3O7計(jì))5-12％-聚合物(如PVP，馬來酸/ 1-5％丙烯酸共聚物，PEG)-酶 0-5％-小成分(如抑泡劑，香味劑)0-5％9).配制成顆粒狀的洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))6-12％-非離子表面活性劑1-4％-作為脂肪酸的皂 2-6％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì))14-22％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 18-32％-硫酸鈉(按Na2SO4計(jì))5-20％-檸檬酸鈉(按C6H5Na3O7計(jì))3-8％-過硼酸鈉(按NaBO3·H2O計(jì)) 4-9％-漂白活化劑(如NOBS或TAED)1-5％-羧甲基纖維素0-2％-聚合物(如多羧基化合物或PEG) 1-5％-酶 0-5％-小成分(如熒光增白劑，香味劑)0-5％10).水樣液態(tài)洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì))15-23％-乙氧基醇硫酸酯(如C12-15的醇，2-3EO) 8-15％-醇乙氧基化物3-9％(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-作為脂肪酸的皂(如油酸) 0-3％-氨基乙醇1-5％-檸檬酸鈉5-10％-水溶助長劑(如甲苯磺酸鈉)2-6％-硼酸鹽(按B4O7計(jì)) 0-2％
-羧甲基纖維素 0-1％-乙醇 1-3％-丙二醇2-5％-酶0-5％-小成分(如聚合物，分散劑，香味劑， 0-5％熒光增白劑)11).水樣液態(tài)洗滌劑組合物含有-線性烷基苯磺酸鹽(按酸計(jì)) 20-32％-醇乙氧基化物 6-12％(如C12-15的醇，7EO或C12-15的醇，5EO)-氨基乙醇 2-6％-檸檬酸8-14％-硼酸鹽(按B4O7計(jì))1-3％-聚合物0-3％(如馬來酸/丙烯酸共聚物，結(jié)合聚合物如甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物和CMC)-甘油 3-8％-酶0-5％-小成分(如水溶助長劑， 0-5％分散劑，香味劑，熒光增白劑)12).配制成堆積密度至少為600g/L的顆粒狀洗滌劑組合物含有-陰離子表面活性劑 25-40％(如線性烷基苯磺酸鹽，烷基硫酸鹽，a-烯屬磺酸鹽，a-磺基脂肪酸甲酯，烷磺酸鹽，皂)
-非離子表面活性劑(如醇乙氧基化物) 1-10％-碳酸鈉(按Na2CO3計(jì)) 8-25％-可溶性硅酸鹽(按Na2O·2SiO2計(jì)) 5-15％-硫酸鈉(Na2SO4計(jì))0-5％-沸石(按NaAlSiO4計(jì)) 15-28％-過硼酸鈉(按NaBO3·4H2O計(jì)) 0-20％-漂白活化劑(TAED或NOBs)0-5％-酶0-5％-小成分(如香味劑，熒光增白劑) 0-3％13).如1)-12)中所述洗滌劑配方，其中的線性烷基苯磺酸鹽-或其一部分一被烷基硫酸鹽(C12-18)所取代。14).如1)-13)中所述洗滌劑配方，其中含有作為附加成分或已指定的漂白系統(tǒng)取代物的穩(wěn)定化的或包囊的過酸。15).如1)、3)、7)、9)及12)中描述的洗滌劑組合物，其中的過硼酸鹽被過碳酸鹽所取代。16).如1)、3)、7)、9)、及12)中所述洗滌劑組合物，其另外含有錳催化劑，如可為Nature，369，1994，pp.637-639中的文章《低溫漂白的高效錳催化劑》中所述化合物的一種。17.配制成含有液態(tài)非離子表面活性劑(如線性烷氧基化伯醇)、助洗系統(tǒng)(如磷酸鹽)、酶及堿的非水樣洗滌液的洗滌劑組合物。該洗滌劑中還可含有陰離子表面活性劑和/或漂白系統(tǒng)。
在以下實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明，但無意對(duì)所要求的本發(fā)明范圍進(jìn)行任何限制。實(shí)施例1.
在含100ml培養(yǎng)基的500ml加塞錐形瓶內(nèi)37℃搖床(300rpm)培養(yǎng)芽胞桿菌DSM8473，培養(yǎng)基的組成如下(每升)馬鈴薯淀粉 100g矮大麥 50g大豆粉 20gNa2HPO4×12H2O 9gPluronic0.1g酪蛋白鈉鹽 10g用α-淀粉酶液化培養(yǎng)基中的淀粉，將培養(yǎng)基加熱至120℃，45分鐘進(jìn)行消毒。
孵育3天后，用上述方法測(cè)定培養(yǎng)物的蛋白水解活性。
培養(yǎng)后，培養(yǎng)液中酶活度為120CPU/L。
分離出固體成分后，用常規(guī)色譜方法提純蛋白酶并凍干。凍干制劑的活性為7.4CPU/g。
根據(jù)本例制備的制劑的特征在本說明書的前一部分已經(jīng)提到，在此處作為參考。實(shí)施例2穩(wěn)定性在25℃，將1.1g/l的市售美國粉狀洗滌劑溶于含有不同濃度次氯酸鈉的約6°dH(德國硬度)的水中，保持恒溫60分鐘進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，蛋白酶濃度為0.3CPU/L。
表1顯示了試驗(yàn)結(jié)果
表1
表1顯示在含有次氯酸鈉的溶液中，新蛋白酶的穩(wěn)定性比已知蛋白酶高得多在含10ppm NaOCl的洗滌劑溶液中，新蛋白酶仍可保存30％的活性，而在相同條件下已知蛋白酶已絕對(duì)無活性。實(shí)施例3在25℃，將1.1g/L的市售美國粉狀洗滌劑溶于含1％Proxan(39.5％CH3COOOH，4.5％H2O2，44％CH3COOH，11.3％H2O，0.7％H2SO4)的約6°dH(德國硬度)的水中并保持恒溫60分鐘來進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，蛋白酶活性為0.3CPU/L。
表2顯示了該試驗(yàn)的結(jié)果。
表2
<p>表2顯示在含Proxan的溶液中，新蛋白酶較已知蛋白酶具有更高的穩(wěn)定性。實(shí)施例4洗滌性能20℃下，恒溫10分鐘洗滌被草污染的棉布來完成洗滌性能試驗(yàn)。
試驗(yàn)中所用酶濃度分別為0.0025，0.005，0.010，0.050，0.1，0.2及0.5CPU/L。
將2.0g/L的市售美國粉狀洗滌劑溶于約6°dH(德國硬度)的水中，并將PH值調(diào)到9.5?？椢?洗液比率為每升洗滌液中有6g織物。
洗滌后，用自來水沖洗衣物并晾干。在460nm處測(cè)定其反射率(％R)。
用加酶洗滌后的反射率減去不加酶洗滌后的反射率，得到反射率差ΔR，用來衡量洗滌性能。
表3顯示了該試驗(yàn)的結(jié)果(兩個(gè)試驗(yàn)的均數(shù))
表3
表3顯示新蛋白酶適于作為洗滌劑酶。
權(quán)利要求
1.一種蛋白酶，其特征在于它與從芽胞桿菌DSM8473衍生來的蛋白酶具有相同的免疫化學(xué)特性。
2．權(quán)利要求1的蛋白酶，該蛋白酶在25℃，5ppm次氯酸鹽中60分鐘后仍可保持至少80％的活性。
3．權(quán)利要求l的蛋白酶，其進(jìn)一步特征為(a)用SDS—PAGE法測(cè)得其表觀分子量 約為30KD；(b)在LKB Ampholine PAG平板上用等電點(diǎn)約聚焦法測(cè)定其等電點(diǎn)約為8.8；(c)以酪蛋白為底物，在PH9.5測(cè)得其達(dá)到最佳活性的溫度范圍為50℃C-60℃，約60℃左右；及(d)以酪蛋白為底物，在25℃測(cè)得在PH值6-11范圍內(nèi)具有80％以上的活性。
4．一種芽胞桿菌菌株的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其特征在于它能產(chǎn)生權(quán)利要求1的蛋白酶。
4．一種芽胞桿菌菌株的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其特征在于它能產(chǎn)生權(quán)利要求l的蛋白酶。
5．權(quán)利要求4的培養(yǎng)物，所述菌株為芽胞桿菌DSM8473或其突變株或變異株。
6．權(quán)利要求1—3任一項(xiàng)中蛋白酶的制備方法，該方法包括在含有碳源及氮源和無機(jī)鹽的適宜的營養(yǎng)性培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求4或5的產(chǎn)蛋白酶的芽胞桿菌，然后回收所需的酶。
7．權(quán)利要求6的方法，其中的菌株為芽胞桿菌DSM8473，或其變異株或突變株。
8．權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中的蛋白酶在含有次氯酸鹽的水中處理蛋白質(zhì)的用途。
9．權(quán)利要求8中蛋白酶的用途，其中次氯酸鹽的濃度為1—10ppm。
10．權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中的蛋白酶在去除含蛋白質(zhì)污垢中的用途。
11．一種洗滌劑組合物，它含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中的蛋白酶和表面活性劑。
12．權(quán)利要求11的洗滌劑組合物，它還含有一種或多種其他酶，尤其是淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、纖維素酶和/或氧化還原酶。
13．一種洗滌劑添加劑，其包括呈非粉塵顆粒、穩(wěn)定化液態(tài)、漿狀或被保護(hù)酶形式的、權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)中的蛋白酶。
14．一種洗滌方法，其包括使用權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)中的蛋白酶處理污染的織物。
15．權(quán)利要求1 4的洗滌方法，其包括權(quán)利要求13的洗滌劑添加劑。
全文摘要
在含有次氯酸鹽或其他氧化劑的溶液中具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的新芽胞桿菌蛋白酶。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1130403SQ9419331
公開日1996年9月4日 申請(qǐng)日期1994年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月9日
發(fā)明者H·奧特普 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司