專(zhuān)利名稱(chēng)：幾丁質(zhì)酶、編碼它的dna及含有它們的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自植物的幾丁質(zhì)酶、編碼它的DNA和轉(zhuǎn)化的植物，這些植物含有并表達(dá)所述重組多核苷酸產(chǎn)生或過(guò)量產(chǎn)生所述的幾丁質(zhì)酶。本發(fā)明還提供保護(hù)植物免受病原體攻擊的方法和由此可得到的植物。本發(fā)明還包括抗病原體組合物，其含有本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶作為活性成分。
植物對(duì)于象病原體攻擊、化學(xué)物質(zhì)處理以及損傷等刺激的反應(yīng)，要積累大量的蛋白。其中研究較多的一種反應(yīng)就是所謂“與疾病發(fā)生有關(guān)的蛋白”即PR-蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(Bowles.D. 1990.Annu.Rev.Biochem.59，873-907)；Linthorst，H.J.M.，1991，Crit.Rev.Plant Sci.10.123-150)。
根據(jù)結(jié)構(gòu)和/或活性，PR-蛋白至少可以分為5簇(PR-1到PR-5)。對(duì)煙草植物，每簇PR-蛋白中又可分別出細(xì)胞內(nèi)(I類(lèi))和細(xì)胞外(II類(lèi))兩種異構(gòu)體。
幾丁質(zhì)酶屬于PR-蛋白，構(gòu)成PR-3簇(Legrand M.，等.1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,6750-6754)。I類(lèi)幾丁質(zhì)酶具有抗真菌活性(Broe Kaert W.F等，1988，physiol.Mol，PlantPathol.33，319-331)，特別是與定為PR-2簇的β-1，3-葡聚糖酶合用時(shí)更有抗真菌活性(Schlumbaum A.等，1986，Nature 324，365-367)、(Kauffmann S.等，1987，EMBO.J.6 3209-3212)。
對(duì)許多種植物，包括雙子葉植物和單子葉植物，都介紹過(guò)出現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶和相應(yīng)的cDNA克隆(最近一篇綜述，Vide CollingeD. B.等，1993，The Plant Journal3(1)，31-40)。根據(jù)幾丁質(zhì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，又將它們分為3類(lèi)(Shinshi H.等，1990，plant Mol.Biol.14，357-368)。最近，人們發(fā)現(xiàn)有些幾丁質(zhì)酶不宜作這樣的分類(lèi)，提出把它們稱(chēng)為第IV類(lèi)。第I類(lèi)幾丁質(zhì)酶以具有大約40個(gè)氨基酸的富含半胱氨酸功能區(qū)為特征。第II類(lèi)幾丁質(zhì)酶類(lèi)似于第I類(lèi)，特別是它們的氨基酸序列同源性，但第II類(lèi)缺乏富含半胱氨酸的功能區(qū)。第III類(lèi)幾丁質(zhì)酶和第I類(lèi)或第II類(lèi)都沒(méi)有序列相似性。如上述由Collinge等人提出的第IV類(lèi)幾丁質(zhì)酶包括糖甜菜幾丁質(zhì)酶IV(Mikkelsen J.D.等，1992，在“幾丁質(zhì)和脫乙酰殼多糖進(jìn)展”一書(shū)(Aolvances in chitin and chitosan(Brine，C.J.Sandford，P.A.and Zikakis.J.P.等Amsterdam Elsevier，inpress))和堿性油菜幾丁質(zhì)酶ChB4(Rasmussen U.等，1992，Planta，187，328-334)以及酸性蠶豆PR4幾丁質(zhì)酶(Margis—Pinheiro M.等，1991Plant Mol.Biol，17，247-253)，顯示出和I類(lèi)幾丁質(zhì)酶有序列相似性，都含有N-末端富含半胱氨酸的功能區(qū)，但由于缺失一些氨基酸，比I類(lèi)幾丁質(zhì)酶要小。植物幾丁質(zhì)酶的分子量范圍平均在26～36KDa左右。
通過(guò)克隆編碼PR-蛋白的基因，并把它們放在非天然的調(diào)控序列之下(如組成型的，調(diào)控元件)，再把這些重組子引進(jìn)植物中，改變它們的表達(dá)方式，就可能減小植物對(duì)病原體攻擊的易感性，特別是對(duì)真菌的攻擊(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0440304A1；EP0460753)。轉(zhuǎn)基因植物中、I類(lèi)幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶同時(shí)表達(dá)，可明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗真菌的能力，顯示出聯(lián)合使用抗病原體蛋白的價(jià)值。
仍然需要不斷鑒定新的幾丁質(zhì)酶，以便用于抗真菌組合物中和/或克隆編碼這些幾丁質(zhì)酶的基因或cDNA研究這些cDNA或基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效果，并評(píng)價(jià)上述植物對(duì)病原體攻擊，特別是對(duì)真菌攻擊的易感性。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的抗病原體蛋白，編碼它們的DNA以及含有和表達(dá)這些DNA的植物，使得這些植物對(duì)病原體攻擊，特別是真菌的攻擊易感性降低。
本發(fā)明提供一種不含其他植物蛋白的蛋白、它具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性、抗真菌活性，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定分子量約為40-43KDa。更優(yōu)選的蛋白是可從TMV誘導(dǎo)的煙草植物葉中得到的一種蛋白。一種更優(yōu)選的蛋白是具有SEQIDNO2或8中所示的氨基酸序列的一種蛋白，或它的具有幾丁質(zhì)酶活性的片段。本發(fā)明還提供了一些本發(fā)明的蛋白，其中有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被取代、缺失或插入，但都不消除幾丁質(zhì)酶活性。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案是一種抗真菌組合物，它含有本發(fā)明蛋白作為活性成分。優(yōu)選的組合物是除含有上述蛋白外還含有與上述蛋白一起對(duì)真菌有協(xié)同作用的另一種蛋白的組合物。進(jìn)一步優(yōu)選的組合物含有β-1，3-葡聚糖酶，特別是堿性β-1，3-葡聚糖酶和/或幾丁質(zhì)酶，特別是I類(lèi)幾丁質(zhì)酶，更優(yōu)選來(lái)自煙草的。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案是一種分離出來(lái)的DNA序列，它含有編碼本發(fā)明蛋白的開(kāi)放讀碼框架，優(yōu)選具有SEQIDNO2或8中所示的序列或在嚴(yán)格條件下能與之雜交的DNA序列。
本發(fā)明還包括一種植物可表達(dá)的重組DNA序列，它含有編碼本發(fā)明蛋白的DNA序列、或上述蛋白前體的DNA序列，此序列有效地連接到為在植物中表達(dá)上述DNA序列所必需的調(diào)節(jié)元件上，使之產(chǎn)生上述蛋白。優(yōu)選的植物可表達(dá)重組DNA序列是編碼具有SEQIDNO2或7中所示氨基酸序列的蛋白前體的DNA序列。另一優(yōu)選的植物可表達(dá)重組DNA序列含有SEQIDNO1或7中所示的DNA序列。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種DNA序列的克隆載體，含有這種克隆載體的細(xì)菌菌株。還提供農(nóng)桿菌屬的菌株，它們含有適宜把本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞和植物中去的載體。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括植物基因組、含有這種基因組的植物細(xì)胞，以及由這種植物細(xì)胞繁殖的植物，其結(jié)果是能產(chǎn)生或過(guò)量產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白。理想的話(huà)，優(yōu)化編碼本發(fā)明蛋白DNA的表達(dá)使植物對(duì)病原體攻擊，特別是對(duì)真菌的攻擊易感性更小。
本發(fā)明還包括諸如鱗莖、花、果、葉、花粉、根或根的培養(yǎng)物，種子、主莖、塊莖、或微塊莖等植物材料，其包括有其中已插入植物可表達(dá)的本發(fā)明DNA的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種對(duì)真菌的易感性降低的植物變種的育種方法，其特征是至少一個(gè)親代品系含有本發(fā)明重組DNA基因組。本發(fā)明還提供一種在栽培條件下減少植物損害的方法。本發(fā)明的其他方面、實(shí)施本發(fā)明的各種方法及某些優(yōu)點(diǎn)都在詳細(xì)描述部分闡明。
通過(guò)下列


本發(fā)明。
圖1Cluster-A基因和同源cDNA克隆的核苷酸序列?；蚪MCluster-A克隆的全部核苷酸序列和氨基酸序列分別顯示在b行和c行中。此核苷酸序列上面的核苷酸只是cDNA克隆中不同的核苷酸，在a行中標(biāo)出。同樣，在Cluster-A蛋白序列下面的只是在cDNA克隆的氨基酸序列中不同的氨基酸，在d行中標(biāo)出。通過(guò)蛋白測(cè)序確定的氨基酸序列下面劃了線(xiàn)。推定的信號(hào)肽切割位點(diǎn)(位于Ser(S)和Gln(Q)殘基之間)用箭頭表示。
圖2含有同煙草Cluster-A基因同源的序列的三個(gè)克隆的Southern印跡分析。純化3個(gè)煙草基因組克隆(克隆-56；59；66)、并用BamHI，HindIII，PstI、SstI或XbaI酶切，分別見(jiàn)1～5電泳道，在0.8％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。將凝膠印跡下來(lái)并和Cluster-A cDNA雜交，并用0.1×SSPE、1％SDS在65℃下洗滌。
圖3不同形式刺激后煙草Cluster-A mRNAs的Northern印跡分析H為末受刺激的健康煙草葉子中分離出來(lái)的總RNA，T為由TMV感染的煙草葉子中分離出來(lái)的總RNA，E為噴灑eptephon的煙草葉子中分離出來(lái)的總RNA，W為被刀割受傷煙草葉子中分離出來(lái)的總RNA，U為紫外線(xiàn)照射過(guò)煙草葉子中分離出來(lái)的總RNA，都用等量與Cluster-A cDNA探針雜交。
圖4煙草N.tabacum的Cluster-A與環(huán)狀芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、褶皺鏈霉菌，Brugiamalayic(線(xiàn)蟲(chóng)綱)和Mus musculus小鼠的外切幾丁質(zhì)酶的排列比較黑框表示按Schuter G.D等人(1991，Protein Struct.Funct.Genet.9.180-190)多重排列比較分析具有高度一致性的區(qū)域。
圖5Cluster-A在在腸桿菌中過(guò)量產(chǎn)生(A)為不同樣品在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分析結(jié)果，T為全部組分、D為細(xì)胞碎片、S為可溶性組分。(B)同一蛋白膠用Cluster-A蛋白特異檢測(cè)的免疫印跡分析結(jié)果。
圖6由TMV-感染的煙草葉中純化的Cluster-A蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示不同純化組分的蛋白圖。A為粗制葉提取物的脫鹽樣品，B為過(guò)S-Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱后的蛋白合并物，C為過(guò)螯合Seperose柱后的蛋白合并物、D為凝膠過(guò)濾層析后的純化Cluster-A。“Mr”泳道表示予先染色的分子量標(biāo)記物，各分子量如圖所示。
圖7Cluster-A在細(xì)胞中的定位。用抗Cluster-A蛋白的抗血清來(lái)檢測(cè)煙草Cluster-A的細(xì)胞內(nèi)定位。分析了健康未被感染和被TMV感染過(guò)的煙草植物。a道為總蛋白組分樣品，b道為無(wú)細(xì)胞外洗液的葉組分，c道為EF-組分，它們?cè)?2.5％的SDS-凝膠中分離并電轉(zhuǎn)印列PVDF膜上，用此檢測(cè)Cluster-A蛋白。
圖8Cluster-A和I類(lèi)β-1，3-葡聚糖酶蛋白協(xié)同活性對(duì)腐皮鐮孢的生長(zhǎng)抑制作用。通過(guò)把Cluster-A或單獨(dú)或與I類(lèi)β-1，3-葡聚糖酶一起加到予先使其發(fā)芽的腐皮鐮孢孢子上，用來(lái)試驗(yàn)Cluster-A在體外對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響。標(biāo)明了每孔的蛋白量(以μg表示)。在20℃培養(yǎng)3天后，通過(guò)用乳糖酚棉蘭染色來(lái)觀察菌絲體。
圖9載體pMOG183的示意圖，它是pMOG181的一個(gè)衍生體，其中EcoR1的識(shí)別位點(diǎn)被一個(gè)SstI位點(diǎn)所取代，這個(gè)載體從MOGEN Iatenational N.V經(jīng)請(qǐng)求可自由得到。
圖10載體pMOG185的示意圖，它是pMOG183的一個(gè)衍生體，其中EcoR1識(shí)別位點(diǎn)變成一個(gè)XbaI識(shí)別位點(diǎn)。
圖11，pMOG800質(zhì)粒、它是一個(gè)適宜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的雙元載體，含有一個(gè)植物可表達(dá)的卡那霉素抗性基因(用于篩選轉(zhuǎn)化子)和一個(gè)多克隆位點(diǎn)(用于插入表達(dá)盒)。
本發(fā)明提供一種可從植物分離出的新幾丁質(zhì)酶，特別是提供一種來(lái)自TMV-誘導(dǎo)的煙草葉的大約40～43KDa的蛋白。發(fā)現(xiàn)這種蛋白是由一個(gè)非常相似于以前稱(chēng)為Claster-A的cDNA的開(kāi)放讀碼框架所編碼(Hooft Van Huijsduijnen等、(Hooft VanHuijsduigene R.A.M等，The EMBO.Journal 5(9).2057-2061)。在這篇文獻(xiàn)中介紹了6種Cluster(A到F)的mRNA，它們?cè)跓煵葜卸伎杀籘MV-和水楊酸鹽所誘導(dǎo)。作者通過(guò)雜種選擇體外翻譯鑒定了6種cluster的mRNA。與最大的Cluster-A cDNA克隆相應(yīng)的雜種選出的mRNA，其翻譯產(chǎn)物產(chǎn)生一組復(fù)雜的蛋白，分別為40、35、31和25KDa分子大小(見(jiàn)Hooft VanHuijsduijnen等的上述文獻(xiàn)中圖3第6泳道)。實(shí)際上，由這種cDNA序列產(chǎn)生的這種蛋白從來(lái)就沒(méi)有測(cè)列過(guò)。既沒(méi)有純化出這種蛋白的片段，也沒(méi)有測(cè)定出這些片段任一種結(jié)構(gòu)。對(duì)這些蛋白的任一種片段的物理活性也一無(wú)所知。
根據(jù)本發(fā)明，從TMV-誘導(dǎo)的煙草葉子中用一種抗血清純化出均一的和Cluster-A cDNA相應(yīng)的蛋白，所用抗血清是由可與PROB40雜交的來(lái)自煙草的cDNA克隆轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中產(chǎn)生的一種純化蛋白免疫獲得的。已知PROB40克隆和Cluster-AcDNA能交叉雜交(Hooft Van Huijsduinen等同上)。
在鑒定和純化過(guò)程中使用這種抗血清，就可以從TMV-感染的煙草葉子中分離出足夠量的Cluster-A蛋白，來(lái)研究它的生理活性和抗病原體活性。根據(jù)對(duì)煙草中這種蛋白的測(cè)序得到了這種分離蛋白的部分氨基酸序列；它與由圖1中的cDNA推演出來(lái)的氨基酸序列幾乎完全一致。
發(fā)現(xiàn)C luster-A蛋白對(duì)氚標(biāo)記的幾丁質(zhì)底物具有較低的幾丁質(zhì)酶活性，大約要比來(lái)自煙草的I類(lèi)幾丁質(zhì)酶活性低250～500倍。但是，當(dāng)用一種可溶性幾丁質(zhì)作底物，以比色法檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它的活性又比J類(lèi)幾丁質(zhì)酶活性大約高出2倍。未能測(cè)到外切幾丁質(zhì)酶活性或溶菌酶活性。雖然其結(jié)論是Cluster-A代表一種內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，但又與屬于I類(lèi)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的那些有些不同特點(diǎn)?？傻贸鲞@樣的結(jié)論Cluster-A是植物中一類(lèi)全新幾丁質(zhì)酶的第一個(gè)成員。發(fā)現(xiàn)Cluster-A蛋白主要分布在細(xì)胞內(nèi)。
Cluster-A蛋白在一個(gè)體外抗真菌綠色木霉的試驗(yàn)中顯示出具有抗真菌活性。與β-1，3-葡聚糖酶結(jié)合，通過(guò)用許多試驗(yàn)真菌的敏感性來(lái)評(píng)價(jià)得出這種活性協(xié)同提高。當(dāng)把Cluster-A蛋白和β-1，3-葡聚糖酶聯(lián)合一起測(cè)試時(shí)，能夠檢測(cè)出它們對(duì)腐皮鐮抱和根鏈格孢兩種真菌具有裂解和生長(zhǎng)抑制兩種作用。
用PROB40篩選cDNA文庫(kù)后得到的cDNA被用作篩選基因文庫(kù)的探針以分離編碼Cluster-A蛋白的基因。鑒定出了一個(gè)雜交克隆并測(cè)定了它的核苷酸序列。Cluster-A基因的完整序列以及起動(dòng)子區(qū)部分都描繪在圖1(SEQIDNO7)中。分析推演的氨基酸序列顯示，Cluster-A蛋白可能是以一個(gè)較大的前體產(chǎn)生出來(lái)的，從前體切下一個(gè)信號(hào)肽(大約25個(gè)氨基酸)推定的切割位點(diǎn)以箭頭標(biāo)出。Southern分析表明(圖2)Cluster-A基因是大約由4個(gè)基因組成的小基因家族中一個(gè)部分。
這種新型的幾丁質(zhì)酶，以下稱(chēng)作Cluster-A蛋白，可能適宜用作抗病原體(特別是抗真菌)組合物的活性組分，優(yōu)選與能與其協(xié)同作用的其他蛋白，如β-1、3-葡聚糖酶聯(lián)合應(yīng)用。Cluster-A蛋白的合適濃度范圍大約為0.01μg/ml到100μg/ml，優(yōu)選0.1μg/ml到10μg/ml。從廣泛的意義上說(shuō)，本發(fā)明的抗真菌組合物可用于農(nóng)業(yè)以抗植物致病真菌；例如在園藝，樹(shù)木栽培、觀賞植物園藝、家庭園藝以及鮮花栽培等等方面的應(yīng)用。同樣，Cluster-A蛋白的抗真菌作用在其他工業(yè)領(lǐng)域，如飲料、食品、化妝品等的保存上可能也是有用的。
另外，編碼Cluster-A蛋白的DNA，不管是cDNA還是基因組序列，都可以克隆在這種DNA在植物中表達(dá)所需調(diào)控序列的后面，以便在用上述DNA轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生或過(guò)量產(chǎn)生Cluster-A蛋白。必需的調(diào)控元件至少包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和一個(gè)在植物中有功能的翻譯起始區(qū)。調(diào)控序列還可以包括象啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。增強(qiáng)子可以提高組成型的、或組織特異型的或發(fā)育型的或環(huán)境調(diào)節(jié)型的表達(dá)。
本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)方式是一種主要相對(duì)組成型表達(dá)形式，可優(yōu)選高水平表達(dá)(為本發(fā)明的目的，在葉子中大約0.1％的可溶性蛋白被看作是相對(duì)高的表達(dá)水平)。相對(duì)組成型的表達(dá)方式意味著它不隨植物發(fā)育階段而被劇烈調(diào)節(jié)，也不是組織特異性的。被本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員看作是相對(duì)組成型而不受發(fā)育階段劇烈調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是CaMV35s啟動(dòng)子。一個(gè)優(yōu)選的這種啟動(dòng)子含有一個(gè)所謂的雙增強(qiáng)子。其他適用于與本發(fā)明結(jié)合的相對(duì)組成型啟動(dòng)子可從植物病毒中得到(如CaMV 19s啟動(dòng)子，F(xiàn)igwort花葉病毒啟動(dòng)子等等)以及從植物基因中得到。相對(duì)組成型啟動(dòng)子還可從農(nóng)桿菌(Agrobacterium)Ti-和Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域里衍化出來(lái)，側(cè)翼有或無(wú)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列。從文獻(xiàn)中人們知道CaMV35s啟動(dòng)子的-343和-90之間的序列會(huì)提高CaMV 35s啟動(dòng)子的活性(KayR.等1987，Sciencl236.1299-1302)，還可推測(cè)它提高其他組成型啟動(dòng)子的活性(如甘露氨酸合成酶啟動(dòng)子美國(guó)專(zhuān)利5,106,739)。
光誘導(dǎo)型高水平表達(dá)的啟動(dòng)子例子是核糖雙磷酸羧化酶小亞單位(rbcSSU)啟動(dòng)子和葉綠素a/b結(jié)合蛋白(Cab)啟動(dòng)子，本發(fā)明中可以使用這兩種啟動(dòng)子。
理想的情況是把所引入嵌合基因的表達(dá)限制在一個(gè)或幾個(gè)預(yù)先選定的器官或組織中，如那些真菌攻擊的靶子，如根、表皮細(xì)胞等。組織特異性啟動(dòng)子了解比較清楚的一個(gè)例子就是patatinII類(lèi)啟動(dòng)子。還可使用根特異性啟動(dòng)子。適宜在本發(fā)明方法中使用的啟動(dòng)子也可以是傷害誘導(dǎo)型的。
本發(fā)明還包括使用雜合啟動(dòng)子，即包含從不同基因調(diào)控元件所衍化元件的啟動(dòng)子。
植物可表達(dá)基因通常包括一個(gè)所謂的終止子序列。它包括一個(gè)poly(A)信號(hào)，也可以用本發(fā)明基因的終止子，這并不重要。
這里所用的“基因”一詞意味著包括cDNA的及基因組序列中的轉(zhuǎn)錄區(qū)，這兩者可以是合成的或是部分合成的。為了用在象單子葉植物宿主或非植物宿主中，需要的活，密碼子的使用可以改變。“植物可表達(dá)基因”意指一段DNA序列，它可有效地連接到在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列上，并隨轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，轉(zhuǎn)錄加工后能被翻譯成蛋白。假如一個(gè)基因至少在一個(gè)組織里在植物生活周期的一特定階段里表達(dá)，這個(gè)基因就是“植物可表達(dá)基因”。即使一個(gè)基因在植物發(fā)育的所有階段都不表達(dá)，或僅在某些內(nèi)部或外部刺激誘導(dǎo)后才表達(dá)也可被理解為植物可表達(dá)基因。
本發(fā)明的植物可表達(dá)重組DNA序列意指包括至少兼有兩個(gè)不是自然發(fā)生聯(lián)系的序列的任何DNA序列。如植物可表達(dá)重組DNA序列包括那些含有真核基因下列功能區(qū)的結(jié)合物如增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄/翻譯起始區(qū)，編碼區(qū)、非翻譯前導(dǎo)序列、信號(hào)序列、空泡靶序列、終止序列，內(nèi)含子、外顯子等或化們的部分序列組成的基因。本發(fā)明設(shè)想這些元件之一的任何缺失、增加或取代以產(chǎn)生不同于自然狀態(tài)下的表達(dá)水平或表達(dá)型式。修飾并不一定要提高表達(dá)水平。例如，本發(fā)明清楚設(shè)計(jì)在本發(fā)明蛋白的C-末端部分截短，以便使其積累轉(zhuǎn)到非原質(zhì)體(細(xì)胞外)空間中，這是抗病原體蛋白一個(gè)優(yōu)選的分布位置。象這樣的截短修飾可能是基因的僅有修飾，而未觸及開(kāi)放讀碼框架的其余部分，象決定其功能的其他序列(如啟動(dòng)子，終止子，內(nèi)含子，外顯子等)，仍使編碼本發(fā)明蛋白的DNA落在植物可表達(dá)的重組DNA的定義之內(nèi)。
據(jù)信抗真菌蛋白保護(hù)轉(zhuǎn)化植物抗植物病原性真菌的一個(gè)有效位點(diǎn)是非原質(zhì)體空間。因此可用編碼本發(fā)明植物表達(dá)性基因的重組DNA分子轉(zhuǎn)化植物，此基因就可在植物的非原質(zhì)體空間中發(fā)揮它的作用，或?yàn)樘烊坏幕驗(yàn)榭窟z傳修飾的作用。
修飾編碼在植物細(xì)胞空泡中自然發(fā)生之蛋白的基因以使翻譯產(chǎn)物中都沒(méi)有靶向空泡所涉及的C-末端氨基酸(如通過(guò)把一個(gè)翻譯終止密碼子引進(jìn)到本基因的編碼區(qū)的C-末端，或其他方式)。這種截短的影響是把空泡蛋白引導(dǎo)到非原質(zhì)體空間中去了(此程序的細(xì)節(jié)見(jiàn)EP440304A1)。
上述每一項(xiàng)操作對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員都是熟知的，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易評(píng)價(jià)其對(duì)表達(dá)水平、靶向作用及對(duì)疾病的抗性的影響。
通常，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化的植物是否存在目標(biāo)性狀及其所表達(dá)的目標(biāo)性狀的程度。第一個(gè)評(píng)價(jià)可能包括新引入基因的表達(dá)水平、轉(zhuǎn)化植物抵抗真菌的水平、目標(biāo)性狀的穩(wěn)定遺傳力、以及田間試驗(yàn)等。
第二，需要時(shí)可把轉(zhuǎn)化的植物與其他變種雜交育種，如與有較高商業(yè)價(jià)值的變種，或其中已經(jīng)引進(jìn)了其他目標(biāo)性狀的變種，或用以創(chuàng)造新的雜交種子，或進(jìn)行另一輪的轉(zhuǎn)化等。
Cluster-A蛋白和煙草β-1，3-葡聚糖酶合用在體外產(chǎn)生一種協(xié)同抗真菌作用。同樣，這兩種蛋白在植物中產(chǎn)生和過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，預(yù)計(jì)也會(huì)有這種協(xié)同抗真菌作用。這是從幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶聯(lián)合使用在體外可產(chǎn)生協(xié)同作用推衍出來(lái)的，它們?cè)隗w內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生這種作用(EP440304A1)可以與本發(fā)明的抗真菌蛋白合用的蛋白例子包括但不限于β-1，3-葡聚糖酶和其他象來(lái)自大麥(Swegle M.等1989，PlantMol.Biol.12，403～412；Balance G.M等1976，Can.J.Plant Sci56，459-466；Hoj P.B.等，1988，F(xiàn)EBS Lett，230，67-71；HojP.B等1989，Plant Mol.Biol.，13，31-42，1989)、菜豆(BollerT.等，1983，Planta 157，22-31，Broglie K.E.等，1986.proc，Natl.Acad.Sci.USA83，6820-6824；V-geliu.等1988 Plant174，364-372；Mauch F.和Staehelin L.A.1989.Plant-Cell 1，447-457)、黃瓜(Metraux J.P.和Boller T.(1986).Physiol Mol.Plant Pathol.28，161-169)、韭蔥(Spanu P.等1989，Planta177，447-455)、玉米(Nasser W.等，1988，Plant Mol，Biol.11，529-538)、燕麥(Fink.w，等1988，Plant Physiol，88，270-275)、豌豆(Mauch F.等1984，Plant Physiol.76，607-611；Mauch.F等1988.Pl ant Physiol，87，325-333)、白楊(Parsons T.J.等1989，P.N.A.S.86，7895-7899)、馬鈴薯(Gaynor J.J.1988，Nucl.Acids Res.16，5210，Kombrink E.等，1988，Proc.Natl.Acad.sci，USA85，782-786；Laflamme D.和Roxby R.，1989，Plant Mol.Biol.13，249-250)，煙草(如Legrand M.等，1987，Proc，Natl.Acad.Sci，USA84、6750-6754；Shinshi H等.1987.Proc，Natl.Acad.Sci.USA 84.89-93)、番茄(Joosten M.H.A和De Wit P.J.G.M，1989.Plant Physiol，89，945-951)、小麥(Molano J.等.1979，J.Biol，Chem.254，4901-4907)等等的幾丁質(zhì)酶。
適合與編碼本發(fā)明抗真菌蛋白基因合用的相應(yīng)蛋白的植物基因的克隆。在轉(zhuǎn)基因植物中這些基因的過(guò)量表達(dá)、以及表達(dá)的遺傳操作(包括靶向控制)和植物中對(duì)疾病抗性的評(píng)價(jià)等都是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所掌握的范圍，特別在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0440304A1和0460753A2中舉出了實(shí)例。這兩件申請(qǐng)并入本文作為參考。
含有一種以上嵌合抗真菌基因的轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)多種方法得到，包括A使用一種帶有多個(gè)修飾基因的重組多聚核苷酸如質(zhì)粒，這些修飾基因與一個(gè)選擇標(biāo)記基因有效地偶聯(lián)；B已經(jīng)能表達(dá)一種或幾種與一選擇標(biāo)記編碼基因偶聯(lián)的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物，與來(lái)自含有1個(gè)或幾個(gè)與另一選擇標(biāo)記偶聯(lián)的基因重組子的轉(zhuǎn)基因植物的花粉進(jìn)行交叉授粉，之后根據(jù)有無(wú)這兩種選擇標(biāo)記選出用這種雜交方法得到的種子。以后就可以用從選出的種子所得到的植物再進(jìn)行雜交；C用許多重組多聚核苷酸，如質(zhì)粒，每個(gè)都有1個(gè)或幾個(gè)嵌合基因和1個(gè)不同的選擇標(biāo)記。假如共轉(zhuǎn)化頻率高，那末僅用一個(gè)選擇標(biāo)記就足夠了。在其他情況下，優(yōu)選用幾個(gè)標(biāo)記來(lái)篩選；D用新的、另外的嵌合基因和選擇標(biāo)記基因來(lái)連續(xù)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物；E上述方法聯(lián)合起來(lái)使用。實(shí)際方法對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)是不重要的。
對(duì)任何一種易受某種形式真菌攻擊的植物都可以供以一種或幾種本發(fā)明的植物可表達(dá)基因重組子。同樣，任何一種易受某種形式真菌攻擊的植物都可以用含有本發(fā)明的抗真菌蛋白的組合物來(lái)處理。
因此，本發(fā)明意義上的“植物”應(yīng)指裸子植物及被子植物、雙子葉植物和單子葉植物，它們被用于農(nóng)業(yè)，園藝、林業(yè)、(室內(nèi))園藝、或涉及植物的活動(dòng)，不管是直接被用作食物或飼料，還是用于在各種工業(yè)中進(jìn)行進(jìn)一步加工、用于提取物質(zhì)、用于裝飾、繁殖、雜交育種或任何其他用途。
原則上，可用任何轉(zhuǎn)化方法把本發(fā)明的植物可表達(dá)基因引進(jìn)選定的植物中。通常實(shí)用的方法有用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Kreus，F(xiàn).A.等.1982，Nature296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)，原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等，1985Bio/Tichnol.3，1099-1102)，微注射到植物材料中(Crossway A.等，1986 Mol.Gen.Genet，202，179-185)，(DNA或RNA包被的)粒子轟擊各種植物材料(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)，用病毒感染等。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移法。特別優(yōu)選的是使用象在EP-A120516和美國(guó)專(zhuān)利4,940,838中介紹的所謂雙元載體技術(shù)。
通常，轉(zhuǎn)化后通過(guò)用與本發(fā)明的植物可表達(dá)基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因編碼的一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)記物的存在來(lái)篩選出植物細(xì)胞或外植體，此后再把轉(zhuǎn)化的材料繁殖成整株植物。
雖然認(rèn)為單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化多少更難以對(duì)付，但單子葉植物也能被轉(zhuǎn)化。能從轉(zhuǎn)化細(xì)胞或原生質(zhì)體再生出有繁殖力的轉(zhuǎn)基因植物。目前，對(duì)單子葉植物優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法是外殖體或懸浮細(xì)胞的微型射彈轟擊和直接攝取DNA或電穿孔法(Shimamoto.等，1989，Nature 338，274-276)。通過(guò)把吸水鏈霉菌bar基因(它編碼phosphinothricin乙?；D(zhuǎn)移酶—一種滅活除莠劑phosphinothricin的酶)以微型射彈轟擊法引進(jìn)玉米懸浮培養(yǎng)的胚發(fā)生細(xì)胞里而得到轉(zhuǎn)基因玉米植物(Gordon-Kamm，1990，Plantcell 2，603-618)。已有報(bào)導(dǎo)把遺傳物質(zhì)引進(jìn)到其他單子葉作物如小麥和大麥中的籽朊粒原生質(zhì)體中(Lee，1989，Plant Mol.Biol.13，21-30)。通過(guò)只選擇成年結(jié)實(shí)和有結(jié)節(jié)的胚發(fā)生愈傷組織(穎托)以便建立胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)(Vasil，1990 Bio/Technol.8，429—434)，而從中已再繁殖出小麥植物。對(duì)這些植物聯(lián)合使用轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，能把本發(fā)明應(yīng)用于單子葉植物。
單子葉植物，包括象谷物、水稻這樣的重要經(jīng)濟(jì)作物都能通過(guò)農(nóng)桿菌株很容易地轉(zhuǎn)化(Gould J.Michael D.Hasegawa O.UlianEC.Peterson G.Smift RH.1991，Plant physiol.95，426-434，Hieiy等，1994，Plant Journal 6.待出版)。
可用能產(chǎn)生和過(guò)量產(chǎn)生本發(fā)明的新幾丁質(zhì)酶(無(wú)論是單獨(dú)還是與其能發(fā)揮協(xié)同作用的其他抗真菌基因編碼的蛋白質(zhì)一起)的植物和植物部分來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)病原體的抗性，特別是對(duì)真菌的抗性。然后，在育種計(jì)劃中，使用多個(gè)抗性品系來(lái)產(chǎn)生增強(qiáng)抗致病菌(特別是抗真菌)的上市變種。
可在田間或溫室使用對(duì)病原體或真菌攻擊易感性降低的植物，然后用作動(dòng)物飼料或人類(lèi)(直接)消耗，用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，用于食品或其他工業(yè)加工等。本發(fā)明這些植物或它的組成部分的優(yōu)點(diǎn)是不太需要?dú)⒄婢幚?，降低了材料成本勞?dòng)力以及環(huán)境污染，或延長(zhǎng)了這種植物的產(chǎn)品(如果實(shí)、種子等)的儲(chǔ)存期。
而且，由于有本發(fā)明的幾丁質(zhì)酶等高水平存在，可以降低收割后的損失。
這里沒(méi)有詳細(xì)敘述的本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員都可以想象得到，而且這種優(yōu)點(diǎn)不脫離本發(fā)明的范圍。
下面的實(shí)施例僅僅是用作進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的，這些例子和對(duì)其所作的任何說(shuō)明都不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例 1Cluster-A相應(yīng)的DNA的分離已報(bào)導(dǎo)過(guò)Cluster-A mRNA是由TMV-感染煙草N.tabacum的Samsun NN品系后強(qiáng)誘導(dǎo)出來(lái)的(Hooft VanHuijsduijnen等，1986，Supra)。用從PROB40(一個(gè)部分Cluster-A cDNA克隆)衍化來(lái)的探針篩選TMV感染的Samsunn NN煙草植物的λZAP cDNA文庫(kù)(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)，結(jié)果分離了11個(gè)陽(yáng)性雜交克隆。限制性?xún)?nèi)切酶分析和(部分)序列分析表明，所有克隆都是一致的。結(jié)論是這些克隆都與Cluster-A cDNA對(duì)應(yīng)。測(cè)定了其中一個(gè)克隆(cA-3)的核苷酸序列(實(shí)驗(yàn)部分)并表示在SEQIDNO1和2中。這個(gè)克隆缺本開(kāi)放讀碼框架5’端部分的7個(gè)密碼子。
實(shí)施例2以細(xì)菌表達(dá)型載體克隆完整的cDNA克隆用b下列引物T75’-AATACGACTCACTATAG-(SEQIDNO3)和引物P1 5’-GTTTCCTTCTCCATGGAACTAGTTTGCAC(SEQIDNO4)對(duì)克隆CA-3進(jìn)行PCR反應(yīng)(實(shí)驗(yàn)部分)來(lái)完成cDNA克隆。
用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和XhoI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并從中分離片段，把這個(gè)片段連接到NcoI/XhoI酶切的中間載體pGV84上，再轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a中。然后再把由這種轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的陽(yáng)性克隆的NcoI/xhoI酶切片段連接到一個(gè)NcoI/SalI酶切的細(xì)菌表達(dá)載體(pJLA602，Medac.Hamburg，Germany)上，并用以轉(zhuǎn)化E.coli DH5a。通過(guò)和標(biāo)記的克隆cA-3雜交來(lái)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并用限制性?xún)?nèi)切酶分析來(lái)測(cè)定插入片段的正確大小和方向。得到的質(zhì)粒pJLA-A53，含有推測(cè)的Cluster-A開(kāi)放讀碼框架(ORF)，該讀碼框架包括20-377密碼子，處于串聯(lián)排列的λ-噬菌體可抑制PR和PL啟動(dòng)子和高度有效的E.coli翻譯起始區(qū)的下游。最后用質(zhì)粒pJLA-A53轉(zhuǎn)化E.coli菌株KA1092(trp65.Lon，sFiA-1，malB)(Jahnson.B.F.等，1977.Mol.Gen.Genet.157，91-97)〔protease-〕用此菌株產(chǎn)生Cluster-A蛋白并產(chǎn)生抗體。含有pJLA-A53的菌株KA1092于1993年8月12日保藏在Centraal Bureav Voor Schimmelcultures.登記號(hào)為CBS415,93。
實(shí)施例3Cluster-A cDNA在E.Coli中的表達(dá)及抗推定的cluster-A蛋白抗體的產(chǎn)生。
把Cluster-A cDNA基因(20～377密碼子)放在λ噬菌體PR和PL啟動(dòng)子的控制之下(Schauder B.等.1987.Gene56，279-283)，以便讓這個(gè)基因在E.Coli中過(guò)量表達(dá)。圖5顯示的是在E.Coli KA1092菌株中過(guò)量產(chǎn)生的推定的40KDa的Cluster-A蛋白。通過(guò)超聲破碎細(xì)胞后，經(jīng)離心把Cluster-A蛋白聚集物與細(xì)胞碎片分離出來(lái)(圖5，D道)。通過(guò)培養(yǎng)物在30℃生長(zhǎng)3小時(shí)后轉(zhuǎn)換到42℃水溶中再孵育3小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)推定的Cluster-A cDNA基因在KA1092菌株中表達(dá)。離心收細(xì)菌并溶解在樣品緩沖液(25mM Tris，192mM甘氨酸，6M尿素，2.5％SDS，10％甘油，5％β-巰基乙醇)中，純化在E.Coli中產(chǎn)生的推定的Cluster-A蛋白并用以制備抗體(實(shí)驗(yàn)部分)。
圖5表示圖5中所示的類(lèi)似蛋白組分的Western印跡分析結(jié)果，證實(shí)分離出來(lái)的抗體是特異性針對(duì)推定的Clnster-A蛋白的。在含有Cluster-A表達(dá)重組子的誘導(dǎo)大腸桿菌中，其總組分(T道)和細(xì)胞碎片組分(D道)都發(fā)現(xiàn)有Cluster-A蛋白的強(qiáng)信號(hào)。S道中出現(xiàn)的弱信號(hào)表明，在可溶性蛋白組分中存在著少量的Cluster-A蛋白。
100℃加熱3分鐘后，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品(實(shí)驗(yàn)部分)并用考馬斯亮蘭染色觀察蛋白。用冰冷的1M KCl染色相似的凝膠，并切出含有過(guò)量產(chǎn)生的40KDa的凝膠部分。水洗后，磨碎丙烯酰胺并和福氏完全佐劑混合、和大約200ng推定的Cluster-A做成懸浮液，皮下注射給兔子。以2周間隔在不完全福氏佐劑中的相似懸浮液中再免疫接種3次后、從兔子中采集50ml血液，試驗(yàn)其血清部分抗推定的Cluster-A蛋白的抗體活性。
實(shí)施例4煙草中的推定Cluster-A蛋白的分離與鑒定用實(shí)施例3中介紹的方法得到的抗血清，通過(guò)免疫檢測(cè)測(cè)試由TMV感染的煙草葉中推定Cluster-A蛋白的純化(實(shí)驗(yàn)部分)推定的C luster-A蛋白顯出吸附到陽(yáng)離子交換S-Sepharose層析柱上、表明這種蛋白呈堿性。在S-Sepharose柱的穿過(guò)峰里沒(méi)發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)蛋白。推定的Cluster-A蛋白是用75到140mM NaCl從S-Sepharose柱中洗脫下來(lái)的。仔細(xì)檢查SDS-聚丙烯酰胺凝膠和免疫印跡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有2種分子量大約相同(41KDa和43KDa)的蛋白同上述抗血清有交叉反應(yīng)。顯然，這兩種蛋白是相關(guān)的。由于在其cDNA序列中(3個(gè)潛在糖基化位點(diǎn))和gDNA序列中(4個(gè)潛在糖基化位點(diǎn))都有潛在的糖基化位點(diǎn)，這就促使我們研究推定的Cluster-A蛋白同Con-A、S epharose柱的結(jié)合。因此把蛋白對(duì)含有1.15M NaCl的50mM Tris-HCl(pH68)緩沖液透析并讓它吸附到con-A Sepharose柱上。結(jié)果絕大部分41KDa的Cluster-A蛋白穿過(guò)Con-A柱，而在結(jié)合的蛋白中存在43KDa推定的Cluster-A蛋白。這表明后一種蛋白至少是部分糖基化的。在純化推定的Cluster-A蛋白不用Con-ASepharose柱。而是使用螯合的Sepharose色譜法、從S-Sepharose層析柱上洗脫下來(lái)的含有推定的Cluster-A蛋白的流份對(duì)含150mM NaCl的50mM Tris Hcl pH8.0緩沖液透析，讓其吸附到用Zn{2+}離子活化的螯合Sepharose柱上、并用上述緩沖液平衡。通過(guò)這種活化基質(zhì)，可以滯留大約20％的總蛋白。并顯示主要由Cluster-A蛋白組成。第2次穿過(guò)這種螯合Sepharose柱得到幾乎純的蛋白制品(圖5、D道)。通過(guò)隨后的凝膠過(guò)濾層析就可把推定的Cluster-A蛋白純化到勻一程度。表觀天然分子量在約40至43KDa之間。
實(shí)施例5推定的Cluster-A蛋白氨基酸序列的闡明用12.5％S DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離41KDa和43KDaCluster-A蛋白的混合物。并電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上。然后以Edma降解法(實(shí)驗(yàn)部分)，用這種混合物進(jìn)行N-末端氨基酸序列測(cè)定、但是N-末端被封閉了，沒(méi)有得到序列信息。由于存在一個(gè)對(duì)酸水解敏感的唯一位點(diǎn)，使我們從相同材料中測(cè)定出一個(gè)中間序列P-V-N-H-X1-S-G-S-D-X2-I-N-A-X3-I-Q(SEQID NO4)X1＝V/I，X2＝G，X3＝W；這一序列前面的氨基酸最可能是Asp(D)殘基，因?yàn)樗玫乃鈱?duì)Asp-Pro鍵是特異的(Landon，1977.Sub)。用羥胺切割推定的Cluster-A蛋白之后，得到了另一些序列信息。這造成分子量大致相同的兩種肽形式，它們?cè)谝黄鸨挥≯E到PVDF膜上。對(duì)這個(gè)樣品測(cè)序得出下列序列G-L-N-Y-P-V-E-S-V-A-R-N-L-N-W(SEQID NO5)和S-H-A-Q-L-F-D-P-V-N-H-X-S-G-S-D-G-I-N-A-W-I-Q-A-G-V(SEQID NO6)，其中X＝I/V。
這些多肽序列和由cDNA克隆推衍出來(lái)的氨基酸序列是完全一致的(圖1；SEQID NO1和2)。從這些相配的資料得出的結(jié)論是，由煙草中純化的這兩種蛋白是和由部分Cluster-A開(kāi)放讀碼框架轉(zhuǎn)化的E.Coli KA1092菌株產(chǎn)生的蛋白相一致。與233位的密碼子相應(yīng)的多肽序列顯示，兩種氨基酸(V/I)在這一位置上是以1∶1比例出現(xiàn)的。可能純化出兩種高度一致的Clustet-A蛋白，它們?cè)跍y(cè)定序列的范圍里有1個(gè)氨基酸位置不同。
將Cluster-A蛋白和與一數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配蛋白相比較表明它們分別來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌及粘質(zhì)沙雷氏菌的細(xì)菌幾丁質(zhì)酶ChiA和ChiB是同源的。雖然Cluster-A同chiA一致性為31％，同chiB的一致性為26％，都是比較低的，但在這三種氨基酸序列中都高度保留有特異區(qū)域，如圖4中所示。此外，還發(fā)現(xiàn)與來(lái)自褶皺鏈霉菌、Brujia malayi(線(xiàn)蟲(chóng)綱)的幾丁質(zhì)酶以及來(lái)自MuS musculus(Murinae)的一種分泌蛋白都有同源性。與4類(lèi)不同植物幾丁質(zhì)酶沒(méi)發(fā)現(xiàn)有結(jié)構(gòu)上的同源性(Lawton k.等，1992.plant Mol.Biol.19，735-743；collinye，1993 Supre)。
實(shí)施例6Cluster-A的細(xì)胞內(nèi)定位及酶活性煙草Clustet-A蛋白和細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的同源性提示，這種蛋白有可能催化幾丁質(zhì)(一種N-乙?；?P葡糖胺的a-1，4-連接的聚合物)水解。用抗體從煙草材料中有可能純化Clustet-A蛋白，使我們能去驗(yàn)證這種假說(shuō)。試驗(yàn)了Cluster-A的幾丁質(zhì)酶活性。在內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)中，用氚標(biāo)的幾丁質(zhì)作為底物(Molano J.等1977 Anal Biochem.83.648～656)，Clustet-A蛋白顯示比活性為每μg蛋白40±6 cpm，這比I類(lèi)幾丁質(zhì)酶的比活性大約低250～500倍(Legrand.M.等1987.proc.Natl.Acad.Sci，USA 84 6750-6754；Sela-Buur-lage M.B.等1993 plantphysiol.101.857-863)。但是，用可溶性幾丁質(zhì)染料作底物，由比色法測(cè)定的Clustet-A的幾丁質(zhì)酶活性(wirfh和woff.1990J.Microbiol、Mefhol、12.197-205)，要比I類(lèi)幾丁質(zhì)酶活性高出2倍(表1)。檢測(cè)Cluster-A其他酶活性表明這種蛋白不具有外切幾丁質(zhì)酶活性、殼二糖酶活性以及β-1，3-葡聚糖酶或溶菌酶活性。
用TMV感染的煙草植物不同葉子組分來(lái)分析Cluster-A細(xì)胞內(nèi)定位，包括用(a)葉子總組分，(b)去掉細(xì)胞外液體(EF)的葉子材料，(c)EF部分。Western分析表明Cluster-A蛋白主要是細(xì)胞內(nèi)分布，如圖6所示。(a)、(b)組分都發(fā)現(xiàn)有很強(qiáng)的Cluster-A蛋白信號(hào)。在TMV感染的葉子細(xì)胞外液中(C組分中)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Cluster-A蛋白。
表1Cluster-A蛋白幾丁質(zhì)酶活性幾丁質(zhì)酶活性(以每g表示)蛋白 氚標(biāo)幾丁質(zhì) 檢測(cè)CM-幾丁質(zhì) 檢測(cè)PR-3a(PR P)1180 ± 57 cpm36.2±1.10 0DePR-3b(PR Q)1087 ± 35 cpm30.9±1.90 0De32kDA(Chi-I) 11471 ± 347 cpm 1.0±0.03 0DeCluster-A40 ±6 cpm 2.1±0.03 0De外切幾丁質(zhì)酶# 746 ± 60 cpm 7.0±0.34 0De
CM-幾丁質(zhì)與Remazol亮紫結(jié)合的羥甲基幾丁質(zhì)。
&氚標(biāo)記的幾丁質(zhì)底物(Molano等，1977)。
$對(duì)硝基苯釋放試驗(yàn)，底物為對(duì)硝基苯基殼二糖(Roberts和Selitrennikoff，1988)。
#來(lái)自S.griseus的外切幾丁質(zhì)酶(Sigma c-1650)。根據(jù)Roberts W.K.和Selitrenni Koff C.P.(1988.J.Gen，Micro-biol.134.169-176)介紹的方法，用對(duì)硝基苯基殼二糖作底物，以對(duì)硝基苯釋放試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)所有幾丁質(zhì)酶的外切幾丁質(zhì)酶活性。對(duì)于PR-3a、PR-3b、32KDa Chi-I和Cluster-A，它們釋放出的對(duì)硝基苯量小于0.05nmole，相反對(duì)于外切幾丁質(zhì)酶可釋放出4.50＋0.1nmole(表中未表示)。試驗(yàn)都是在37℃、pH6.0下進(jìn)行的。保溫時(shí)間通常是30分鐘，但在低的溶菌酶活性情況下，要延長(zhǎng)保溫時(shí)間。分別以釋放的cpm值和以O(shè)D值增加測(cè)定的所釋放蘭色底物表示此活性。實(shí)施例7，Cluster-A蛋白體外抗真菌活性。
在以前的報(bào)導(dǎo)中，有人證實(shí)I類(lèi)幾丁質(zhì)酶(chi-I)和β-1，3-葡聚糖酶(Glu-I)體外都能抑制真菌生長(zhǎng)(Maach等，1988，Sela-Buurlage等、1993)。這兩種水解酶在植物抗真菌侵襲的防衛(wèi)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)試驗(yàn)這種蛋白單獨(dú)或與chi-I或Glu-I聯(lián)合使用對(duì)不同真菌的裂解活性來(lái)研究Cluster-A的抗真菌活性。濃度為12μg/ml的Cluster-A蛋白單獨(dú)可引起木霉屬viride的裂解和生長(zhǎng)抑制。對(duì)植物致病真菌根鏈格孢Cluster-A在每ml30到60μg濃度下會(huì)抑制其生長(zhǎng)。對(duì)腐皮鐮孢菌即使在高濃度下(600μg/ml)也無(wú)效。但是，Cluster-A蛋白與I類(lèi)β-1，3-葡聚糖酶(和幾丁質(zhì)分解酶)蛋白協(xié)同使用表現(xiàn)出對(duì)腐皮鐮孢菌強(qiáng)抗真菌作用。這些蛋白的協(xié)同作用會(huì)引起腐皮鐮抱菌芽前孢子裂介和生長(zhǎng)抑制的雙重作用，見(jiàn)圖7。Cluster-A蛋白對(duì)植物致病性真菌番茄殼針孢和致病疫霉沒(méi)有顯示出效果(資料未顯示)。
表2Cluster-A蛋白的抗真菌活性Cluster-A對(duì)腐皮鐮孢和根鏈格抱的裂解活性腐皮鐮孢根鏈格孢Cluster AChi-I Glu-I Chi-I Glu-Iμg/孔 00.1 0.50.1 0.5 0.1 0.5 0.1 0.50000 5 560042542000 26950045345005 349500453810005 959500353010 den0-- - - --- -
表3不同蛋白制品的核真菌活性，以裂解百分率及生長(zhǎng)抑制(GI)率表示腐皮鐮孢 根鏈格孢蛋白 加入蛋的量 ％ GI ％GI(μg/孔) 裂解 裂解Clu-A 5-10 0％ 0 ND4Clu-A 100 0％ 0 NDND葡聚糖酶 0.1 0％ 0 NDNDClu-A＋葡聚糖酶 10∶0.1 0％ 2-3 NDND幾丁質(zhì)酶 0.1 0％ 0 NDNDClu-A＋幾丁質(zhì)酶 10∶0.1 5％ 1 NDND變性對(duì)照樣品的結(jié)果放在括號(hào)里，但只在它們不是0％裂解和/或Gi-0時(shí)。實(shí)施例8分離編碼Cluster-A蛋白的基因組克隆。
用Cluster-A c DNA的cA-3克隆的插入片段作探針來(lái)篩選煙草N.tabacum的基因組文庫(kù)、純化出3個(gè)重組λ-噬菌體而每個(gè)都含有與Cluster-A cDNA雜交的不同內(nèi)切酶片段。用相應(yīng)于LS42編碼區(qū)5’端的特異性寡核苷酸引物5’-TCTCCGGCAACTAGTTTGCAC-3’(SEQID NO10)和Cluster-A cDNA LS42 3’端非編碼區(qū)的引物5’-GTCATAGTTCACATATCTGTTGCC-3’(SEQ ID NO11)、通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增同cA-3同源的基因組Cluster-A。用這兩種引物、3個(gè)噬菌體中只有1個(gè)表現(xiàn)出特異序列有明顯的擴(kuò)增。挑出這個(gè)噬菌體以便作進(jìn)一步分析。Cluster-A cDNA的完整的核苷酸序列，包括推衍的Cluster-A蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和基因5側(cè)翼及3’-側(cè)翼的序列顯示在SEQID NO7和8中。把這一cDNA克隆和Cluster-A基因比較表明，兩者序列具有高度一致性(94％)。在5’端上游區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了“CAAT”(位于391)和“TATAAT”(位于428)基元。在3’端非編碼區(qū)2971位上存在一個(gè)潛在的poly(A)信號(hào)(5’-AATAAA-3’)。在兩個(gè)外顯子中含有Cluster-A基因的編碼區(qū)，該編碼區(qū)產(chǎn)生一個(gè)377個(gè)氨基酸的前體蛋白。Cluster-A前體蛋白含有一個(gè)25個(gè)氨基酸的推定信號(hào)肽(在穿過(guò)內(nèi)織網(wǎng)膜運(yùn)輸時(shí)涉及到它)以及4個(gè)潛在的N相連糖基化位點(diǎn)(N-X-S/T)。預(yù)期成熟蛋白的理論分子量為39.033Da。在密碼子151和364之后分別有952bp和349bp長(zhǎng)的插入序列。為了確定在煙草中編碼Cluster-A樣蛋白的基因數(shù)目，用這一cDNA克隆探測(cè)了基因組Southern印跡。在嚴(yán)格條件下與這一探針雜交的帶型表明Cluster-A至少有4個(gè)成員的小基因家族的一部分(圖2)。為測(cè)定Cluster-A基因表達(dá)的誘導(dǎo)，用不同刺激條件處理煙草植物并作Northern印跡分析。接種TMV后3天、損傷后2天、ethphon處理后1天以及紫外光照射后1天取不同處理的樣品。以前Brederode和其同事報(bào)告過(guò)在這樣的時(shí)間里，PR-基因(PR-1到PR-5)有最大的表達(dá)(1991.plant Mol，Biol.17，1117-1125)，這里用其研究Cluster-A基因的表達(dá)。圖3顯示在未刺激的煙草葉中沒(méi)有檢測(cè)到Cluster-A基因表達(dá)。TMV感染并加之ethephon(為產(chǎn)生乙烯)或紫外光處理的煙草葉子，兩者都造成Cluster-AmRNA大大增加(圖3，E和U道)。相反，葉子受傷后。Cluster-A表達(dá)的誘導(dǎo)較低。綜上結(jié)果表明可以把Cluster-A歸類(lèi)為煙草的一種與致病相關(guān)的新基因。
實(shí)施例9表達(dá)結(jié)構(gòu)和二元載體的構(gòu)建Cluster-A基因是以大約5.5kb的SstI-酶切片段被克隆的。整個(gè)開(kāi)放讀碼框架位于該片段中并約占這個(gè)片段的2/3。這個(gè)ORF的5’端大約起始于1個(gè)SstI位點(diǎn)的453位上。按下列方法，用PCR技術(shù)把BamHI位點(diǎn)引入到ORF5’端的緊上游。把原來(lái)的序列(圖1)(406位)5’-TTTAAACTCGAAGTCACAAATTAAA-3’(SEQIDNO12)(432位)、改變?yōu)?406位)5’-TTTAAACTCGGATCCACAAATTAAA-3’(SEQIDNO13(432位)。
與此相似，在PCR反應(yīng)中，用下列接頭序列把質(zhì)粒pMOG183(圖9)上的EcoRI位點(diǎn)更換成xbaI-位點(diǎn)5’-AATTGTCTAGAC-3’(SEQIDNO14)。修飾的克隆載體命名為pMOG185，它含有CaMV35s啟動(dòng)子和nos-終止子以及在兩者之間是為插入Cluster-A基因的BamHI位點(diǎn)。為此，利用Cluster-A基因片段上新引進(jìn)的BamHI位點(diǎn)，將作為約5.1Kb BamHI-SstI片段的Cluster-A基因ORF克隆到修飾過(guò)的表達(dá)載體pMOG185的BamHI位點(diǎn)上。這樣，上游接有帶有雙重增強(qiáng)子的35sCaMV啟動(dòng)子且下游接有NOS-終止子的Cluster-A基因就被定位到一個(gè)xbaI-SstI片段上。隨后把這一片段再克隆到二元載體pMOG800(圖10)中。二元載體pMOG800含有一個(gè)植物可表達(dá)的卡那霉素抗性基因(它位于T-DNA左右邊界之間)和一個(gè)能插入多種內(nèi)切酶片段的多克隆位點(diǎn)。含有這種載體的E.coli菌株于1993年8月12日保藏在荷蘭Baarn的Centraal BureauVoor Schi mml cultures.登記號(hào)為(CBS414，93)，借助于適當(dāng)合成的雙鏈、部分互補(bǔ)的接頭序列(如5’-AGCTCACG-3’和3’-GT G CTTAA-5’)，這樣得到的二元載體含有主要組成型可表達(dá)Cluster-A基因和定位在T-DNA左右邊界序列間的作為標(biāo)記的植物可表達(dá)的NPTII基因。
借助于質(zhì)粒pRK2013，把這種pMOG800衍化出來(lái)的二元載體從E.coli DH 5a菌株中移進(jìn)到含有Vir-功能的輔助質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌菌株MOG101中。在含有40mg/L利福平，250mg/L壯觀霉素和100mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上、從這些交配物中分離出轉(zhuǎn)移結(jié)合子(細(xì)節(jié)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)。用接受了這種二元載體的農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物。
實(shí)施例10植物的轉(zhuǎn)化及表達(dá)分析a.番茄用含有pMOG800衍化的二元載體的農(nóng)桿菌MOG101菌株轉(zhuǎn)化番茄(lycopersicon esculentum cv.Moneymaker)，基本按Mccormick等(1986，Plant Cell Rep.5、81-84)介紹的方法進(jìn)行。b.煙草為轉(zhuǎn)化煙草，使用葉圓片浸漬法(leat-disc dip method)(1985，Horsch等，Science227，1229-1231)。葉圓片和含有二元載體的農(nóng)桿菌MOG101株一起培養(yǎng)，并長(zhǎng)在含100mg/ml卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)基因幼芽再長(zhǎng)成整株植物，并分析新轉(zhuǎn)進(jìn)基因的表達(dá)，用Western印跡進(jìn)行這種分析，其中使用針對(duì)Cluster-A蛋白和/或葡聚糖酶的抗血清。c.馬鈴薯cv.Kardal馬鈴薯塊莖必須保存在+4℃，轉(zhuǎn)化前7天，塊莖必須轉(zhuǎn)移到室溫下。第1天，把新鮮培養(yǎng)板中的農(nóng)桿菌株接種到10ml LB＋100mg/L卡那霉素+20mg/L利福平中，29℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基+100mg/L卡那霉素按1∶10稀釋農(nóng)桿菌懸液，29℃培養(yǎng)過(guò)夜。用1號(hào)培養(yǎng)液鋪平板。第3天，用不含抗生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基把農(nóng)桿菌懸液稀釋到OD600+0.15、并讓其長(zhǎng)到OD600 0.30-0.70(約需4小時(shí))。離心培養(yǎng)物，用MS30R3按1∶10稀釋。削去馬鈴薯皮?！?0％酒精洗一分鐘?！?∶5稀釋的Teepol＋0.1％Tween20洗20分鐘?！脽o(wú)菌水再洗一次。——加入約100ml 1∶1混合的RK∶KI(蘭色必須保持2分鐘)?！脽o(wú)菌水洗去蘭色?！褖K莖切成約2mm薄片?！勉@孔器將此脈管組織切成小園片?！獙⑿@片收集在盛有液體MS30R3的大平皿(15cm)(每平皿約400個(gè))?！跓o(wú)菌濾紙上干燥40個(gè)小園片，并把它們放在1號(hào)培養(yǎng)基上作為對(duì)照(2個(gè)平皿)。——用吸管去掉MS30R3培養(yǎng)液，并用農(nóng)桿菌懸液替換這種培養(yǎng)液。——20分鐘后，用液體MS30R3替換農(nóng)桿菌懸液?！跓o(wú)菌濾紙上干燥小園片，并把它們轉(zhuǎn)移到含有1號(hào)培養(yǎng)液的平皿中(每板20個(gè)園片)。——用封閉膜封住小園片，并把它們放到再生室中。——第4天用2號(hào)培養(yǎng)液鋪平板。——第5天，把園片轉(zhuǎn)移到含有2號(hào)培養(yǎng)液的平板中(每板20個(gè))。——第8天，用3號(hào)培養(yǎng)液鋪平板?！?天，把園片轉(zhuǎn)移到含有3號(hào)培養(yǎng)液的平板中(每板10個(gè)園片)。由第3天沒(méi)有浸漬的園片作以下對(duì)照1.沒(méi)浸漬和不選擇的(2個(gè)平板，20個(gè)園片)2.沒(méi)浸漬而選擇的(2個(gè)平板20個(gè)園片)又作一個(gè)附加對(duì)照3.浸漬了而不選擇的(2個(gè)平板，20個(gè)園片)。每3周把園片轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。3周后，可見(jiàn)第一批幼芽。當(dāng)這些幼芽足夠大時(shí)，切下它們并把它們放到含有4號(hào)培養(yǎng)液的試管里(長(zhǎng)根可能需要3周時(shí)間)。
所需的無(wú)菌培養(yǎng)基制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基每升MS30R3100ml 10*MS鹽
10ml 100*R3維生素30g葡萄糖8g Diachin瓊脂用KOH調(diào)pH5.8，110℃滅菌20分鐘。
馬鈴薯塊莖收集培養(yǎng)基的制備每升1/2 MS20R350ml 10*MS鹽5ml 100*MS維生素30g葡萄糖8g Daichin瓊脂用KOH調(diào)pH5.8，110℃滅菌20分鐘。
含有適宜激素和抗生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1. MS30R3＋3.5mg/L玉米素核糖苷，每500ml加500μl儲(chǔ)液(3.5mg/ml)；+0.03mg/L I.A.A.，每500ml加15μl儲(chǔ)液(1.0mg/ml)。2. MS30R3＋3.5mg/L玉米素核糖苷0.03mg/L I.A.A200mg/L cefotaxime，每500ml加500μl儲(chǔ)液(200mg/ml)100mg/L萬(wàn)古霉素，每500ml加500μl儲(chǔ)液(100mg/ml)。3. MS30R3＋3.5mg/L玉米素核糖苷0.03mg/L I.A.A200mg/L cefotaximl100mg/L萬(wàn)古霉素100mg/L卡那霉素，每500ml加500μl儲(chǔ)液(100mg/ml)。
含有適宜激素和抗生素的塊莖收集培養(yǎng)基4. 1/2MS30R3＋100mg/L cefotaxime
50mg/L萬(wàn)古霉素100mg/L卡那霉素d，基因表達(dá)的分析對(duì)Cluster-A，可用一種抗Custer-A的抗血清在Western印跡試驗(yàn)中分析轉(zhuǎn)基因植物的Cluster-A蛋白。如果要對(duì)mRNA水平作Northern印跡分析，就要用Cluster-A的適宜cDNA片段作探針。用提高了Cluster-A蛋白產(chǎn)量的植物進(jìn)行提高抗真菌性的分析。同時(shí)表現(xiàn)出提高Cluster-A和β-1，3-葡聚糖酶水平的植物可望具有更高的抗真菌感染的能力。實(shí)驗(yàn)聚合酶鏈反應(yīng)在50μl含有1ng Cluster-A DNA.0.2μM T7引物、0.2μM P 1引物和2單位的棲熱水生菌DNA聚合酶(perkin-Elmer cetus，Gouda，荷蘭)的反應(yīng)混合液中，連續(xù)在94℃0.5分鐘，50℃2分鐘，72℃1.5分鐘孵育35個(gè)循環(huán)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行部分反應(yīng)產(chǎn)物(4％)的電泳，以證實(shí)合成了一條正確大小的DNA片段。其余PCR DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用酒精沉淀并洗去過(guò)量的鹽份。cDNA基因文庫(kù)的合成和分析從TMV感染的煙草中分離Poly(A)+-RNA；合成cDNA并構(gòu)建cDNA文庫(kù)，在λ-載體Uni-2AP XR上進(jìn)行單向克隆，均根據(jù)廠(chǎng)家說(shuō)明(Stratagene，La Joua Ca.)來(lái)進(jìn)行。用32p標(biāo)記的插入cDNA克隆pROB40作為探針篩選重組噬菌體(Hooft VanHnijsduijnen.R.A.M.等，1986 EMBO.J.5，22057-2061)。通過(guò)和輔助噬菌體R408(Stratagene)共感染從分離的λ-噬菌體中挽救出含有cDNA的pBluesclipt質(zhì)粒后，把Cluster-A的cDND插入片段再克隆到M13衍生物中并用M13引物和一個(gè)基于M13引生物所得到的cDNA序列的引物進(jìn)行測(cè)序。或者，用T3或T7引物(Promega，Madison WI；chen和Seeburg.1985，DNA4，165～170)由變性質(zhì)粒DNA直接對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序。蛋白質(zhì)純化從被煙草花葉病毒感染7天后的煙草葉中提取蛋白質(zhì)。并通過(guò)一個(gè)用40μM NaOAc pH5.2平衡過(guò)的G-25柱脫鹽(Woloshuk C.P.等，1991，The Plant Cell3.619-628)。脫鹽的蛋白溶液在冰浴中停留過(guò)夜，然后20.000g離心50分鐘。得到的上清液上樣于一個(gè)用40mM NaOAc.pH5.2平衡過(guò)的S-Sepphrose(快流速.Pharmacia)柱(5×5cm)。用0-0.3M NaCl在上述緩沖液中的線(xiàn)性鹽梯度洗脫吸附的蛋白。每隔2個(gè)流份進(jìn)行免疫印跡分析，將含有Cluster-A的流份合并，并對(duì)50mM Tris.Hcl pH8.0透析。把這種溶液通過(guò)一個(gè)用0.1MZnCl2(pH＝5.4)微酸性溶液(50ml)活化的螯合Sepharose柱(HR10/2；Pharmacia)。使用前，此柱先用水(500ml)徹底洗過(guò)，然后再用上述Tris-緩沖液平衡。含有Cluster-A的混合液分幾次上樣每次含有3到4mg蛋白。把阻滯的蛋白峰混合，再進(jìn)行螯合Sepharose層析。雖然用Cu2+—離子活化螯合Sepharose柱后觀察到較緊密的結(jié)合，但在這樣的條件下純化效果較差(資料未表示出)。最后一步純化是通過(guò)一個(gè)用含有200mM NaCl的50mM K2HPO4pH7.0緩沖液平衡過(guò)的Se perdex-75柱(HR10/30，Pharmacia)進(jìn)行凝膠過(guò)濾。以每分鐘0.5ml的流速進(jìn)行凝膠過(guò)濾，每0.5ml收集一份。用SDS-PAA凝膠電泳和免疫印跡試驗(yàn)來(lái)分析這些流份。SDS-凝膠電泳，免疫印跡試驗(yàn)和序列測(cè)定按Laemmli介紹的方法(Laemmlil u.k.1970，Naterle227.680-685)，用12.5％SDS-PAA凝膠分離蛋白樣品。根據(jù)Amersham(uk)提供的ECL Western印跡方法進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)和測(cè)定。用煙草(PR-P2)同質(zhì)的PR-4a、b的抗血清由MatthieuJoosten(Wageningen荷蘭)惠贈(zèng)。為進(jìn)行免疫檢測(cè)，把針對(duì)推定的cluster-A蛋白的抗血清稀釋1∶2000倍。
為了測(cè)序、按Moos介紹的方法(Moos M等，1988 J.Biol.Chem.263，6005-6008)分離這種蛋白并按Matsudaira等介紹的方法把它電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上(Matsudaira等，1987.S.Biol.Chem.262，10035-10038)。通過(guò)考馬斯亮蘭R-250染色來(lái)觀察蛋白帶(Matsudaira等，1987，同上)。因?yàn)檫@種推定的Cluster-A蛋白是N-末端被封閉的，所以用Landon介紹的方法在PVDF膜上對(duì)它進(jìn)行酸性水解(Landon M，1977.Methods of Enz.147.145-149)。在應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)477A蛋白測(cè)序儀上，以Edman降解法通過(guò)Eurosequence(Groningen，荷蘭)對(duì)水解產(chǎn)物(由兩個(gè)肽組成的)進(jìn)行測(cè)序。酶活性試驗(yàn)按Molano等介紹的方法進(jìn)行常規(guī)幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)(1977，同上)。也用過(guò)象Wirfh和Wolf(Wirfh S.J和WoffG.A.1990.J.Microbiol Meth，12，197-205)介紹的蘭色底物試驗(yàn)和Roberts及Selitcenni koff(Roberts W.K和Selitcenni koff c.p.1988.J.Gen.Miccobiol.134，169-176)所介紹的對(duì)硝基苯釋放試驗(yàn)和Mccreath及Gooday(MeCreath K.J.Gooday G.W.1991.J.Miccobiol，Meth，14，229-237)所介紹的4-甲基傘形酮釋放試驗(yàn)。按Selsteal和Marfinez(1980.Anal.Biochem.109，67-70)介紹的方法，在50mM KH2PO4緩沖液pH6.0中測(cè)定溶菌酶活性。幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定離心10ml培養(yǎng)物收集誘導(dǎo)表達(dá)cA-3蛋白的細(xì)菌和對(duì)照菌，并把沉淀懸浮在1ml TBS(20mM Tris-HCl.pH7.5，150mMNaCl)緩沖液中。超聲破碎后，懸液于-20℃保存。幾丁質(zhì)酶活性檢測(cè)前加入1％Triton x-100。按如下方法獲得TMV感染或健康的煙草葉子總蛋白提取物在5ml TBS中勻漿簡(jiǎn)單離心勻漿物去掉不溶物，于-20℃保存。用水(nanopure)真空滲透葉子來(lái)獲得細(xì)胞外蛋白，把滲透的葉子放進(jìn)一個(gè)注射器里，用臺(tái)式離心機(jī)3000rpm離心5分鐘。含有細(xì)胞外蛋白的無(wú)色洗滌物于-20℃保存。在含有50μl徹底洗過(guò)的3H-標(biāo)記幾丁質(zhì)懸液、50μl細(xì)菌或植物提取液及100μl 50mM磷酸鉀pH6.4的200ml反應(yīng)混合液中測(cè)定幾丁質(zhì)水解活性，30℃保溫30分鐘后加入0.5ml10％的三氯乙酸，離心混合液去掉沉淀物，取出0.5ml上清液，用玻璃毛過(guò)濾。在液閃計(jì)數(shù)儀中測(cè)定流入的放射活性。RNA和DNA印跡分析在提取緩沖液(1M Tris-HCl、0.1M LiCl、10mM EDTA1％SDS，pH9.0)中通過(guò)勻漿冰凍葉—組織，從受刺激或未受刺激的煙草葉—組織中提取總RNA。用酚—氯仿萃取勻漿物，用2MLiCl沉淀RNA。乙醛酸化(glyoxylateien)后，在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳RNA，并印跡到尼龍膜上(Genesvceen.NewenglandNaclear or Hybond-N，Amersham)。按已介紹的方法(Cornelissen等，1987，Nvcl，Acids Res，15 6799-6811)，分離煙草基因組DNA，進(jìn)行酶解、電泳以及印跡試驗(yàn)。在5xSSc、2％SDS.50％甲酰胺、100μg/ml鯡魚(yú)精DNA中，42℃下與{32}P-標(biāo)記的Cluster-A cDNA插入片段進(jìn)行煙草核酸雜交(1xSDS，在50℃下進(jìn)行)，并進(jìn)行放射自顯影。農(nóng)桿菌菌株MOG101的獲得從章魚(yú)氨酸Ti-質(zhì)粒pTiB6衍生構(gòu)建了一種帶給根瘤農(nóng)桿菌毒性功能的輔助質(zhì)粒，MOG101。MOG101是帶有非致癌基因Ti-質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌菌株，這種非致癌Ti-質(zhì)粒中整個(gè)Ti-區(qū)被來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn1831的細(xì)菌壯觀霉素標(biāo)記基因所取代，(Hooykaas等，1980.plasmiol 4.64-75)。
Ti-質(zhì)粒pTiB6含有兩個(gè)鄰近的T-區(qū)TL(T-左側(cè)區(qū))和TR(T-右側(cè)區(qū))。為了得到缺乏TL-和TR區(qū)的衍生質(zhì)粒，我們構(gòu)建了中介載體pMOG579。質(zhì)粒pMOG621是一個(gè)pBR322的衍生體，它含有兩個(gè)定位在T-區(qū)外面左右側(cè)的Ti-質(zhì)粒片段(圖2)。在質(zhì)粒pMOG579中，這兩個(gè)片段內(nèi)一個(gè)帶有壯觀霉素抗性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)座子Tn1831中的2.5kbBamHI-HindIII片段分隔開(kāi)(以黑色表示)(圖2)。這一質(zhì)粒被引入根瘤農(nóng)桿菌株LBA1010中(C58-C9(pTiB6)＝一個(gè)清除的C58菌株)，其中用HB1018(pRKZO13作輔助質(zhì)粒已通過(guò)E.Coli三親交配引入了pTiB6質(zhì)粒(Koekman等(1982)，Plasmiol(7.119-132)。篩選出抗利福平(20mg/L)和壯觀霉素(250mg/L)的轉(zhuǎn)移結(jié)合子。pMOG579和pTiB6之間的雙重重組導(dǎo)致失去羧芐青霉素抗性(pBR322標(biāo)記物)并缺失整個(gè)T-區(qū)。從鋪到羧芐青霉素(100mg/L)板上的5000個(gè)壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)移結(jié)合子復(fù)制物，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)是敏感的。Southern分析表明雙重雜交偶然地缺失了整個(gè)T-區(qū)(未表示出來(lái))。產(chǎn)生的菌株稱(chēng)作MOG101。這種菌株和它的構(gòu)建同GV2260菌株是類(lèi)似的(Deblaere等1985，Nacl.Acid，Res.13，4777-4788)。MOG101在Hood E.Gelviu.SB.Melchers L.S和Hoe-Kema A.1993.Transgene Research2.208-218中有更詳細(xì)的介紹，并經(jīng)請(qǐng)求可從MOGE International N.N.自由得到。
序列表(1).一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)MDGEN International N.V.
(B)街道Einsteinweg97(C)城市LEIDEN(D)州Zuid-Holland(E)國(guó)家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)NL-2333CB(G)電話(huà)31.71.258282(H)傳真31.71.221471(A)名稱(chēng)Rijksuniversiteit te Leiden(B)街道stationsueg46(C)城市LEIDEN(D)州Zuid-Holland(E)國(guó)家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)NL-2312AV(ii)發(fā)明的題目植物幾丁質(zhì)酶，編碼它的DNA和含有它們的植物(iii)序列數(shù)14(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)
(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件patentin Recease#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1253個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型同mRNA互補(bǔ)的DNA(iii)假擬非(vi)原始來(lái)源(A)生物體煙草N.tabacum(B)品系Samsun NN.
(D)發(fā)育階段TMV-誘導(dǎo)的(vii)直接來(lái)源(B)克隆Cluster-A(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置14…1126(D)其他信息/部分(xi)SEQ ID NO1的序列描述CGAGTTTTTT TTT TTT TCT ATT ATT TTC TCA TGT TTC CTT CTC CGG CAA 49Phe Ser Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Leu Arg Gln1 5 10CTA GTT TGC ACA AAT AGC CAA AAT GTT ATT AAG GGA GGG TAC TGG TTT97Leu Val Cys Thr Asn Ser Gln Asn Val Ile Lys Gly Gly Tyr Trp Phe15 20 25AAG AAC AGT GGA TTA GCA TTA AAC AAC ATA GAC TCA ACA CTT TTC ACT145Lys Asn Ser Gly Leu Ala Leu Asn Asn Ile Asp Ser Thr Leu Phe Thr30 35 40CAT CTA TTT TGT GCA TTT GCT GAT CTT AAT CCA CAA TCA AAT CAG TTA193His Leu Phe Cys Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Ser Asn Gln Leu45 50 55 60ATC ATT TCG CCA GAA AAT CAA GAT TCA TTC AGC CAA TTT ACA AGT ACA241Ile Ile Ser Pro Glu Asn Gln Asp Ser Phe Ser Gln Phe Thr Ser Thr65 70 75GTT CAA AGG AAA AAT CCT TCA GTC AAG ACT TTC TTG TCT ATA GCT GGA289Val Gln Arg Lys Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile Ala Gly80 85 90GGA AGA GCT GAT ACA ACT GCC TAT GGA ATT ATG GCT AGA CAA CCA AAT337Gly Arg Ala Asp Thr Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln Pro Asn95 100 105TCA AGA AAA AGT TTT ATT GAT TCA TCA ATA AGA TTG GCT AGA CAA TTT385Ser Arg Lys Ser Phe Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg Gln Phe110 115 120GGA TTT CAT GGC CTT GAT CTT GAT TGG GAA TAT CCA TTA TCA GCT ACA433Gly Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Thr125 130 135 140GAT ATG ACA AAC TTA GGG ATC CTT TTG AAT GAG TGG CGC ACC GCT ATC481Asp Met Thr Asn Leu Gly Ile Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala Ile145 150 155AAC ATG GAG GCG AGA AAT TCC GGC AGG GCG GCA CTG CTT CTC ACG GCG529Asn Met Glu Ala Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala160 165 170GCG GTT TCC TAC TCA CCC CGA GTC AAT GGA TTG AAC TAC CCA GTT GAA 577Ala Val Ser Tyr Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu175 180 185TCG GTG GCA AGA AAC TTA AAC TGG ATT AAC CTT ATG GCA TAT GAC TTC 625Ser Val Ala Arg Asn Leu Asn Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe190 195 200TAT GGA CCA AAT TGG TCA CCA TCA CAA ACC AAT TCA CAT GCA CAA TTA 673Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser His Ala Gln Leu205 210 215 220TTT GAT CCT GTG AAC CAT ATT AGT GGA AGC GAT GGA ATT AAT GCA TGG 721Phe Asp Pro Val Asn His Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn Ala Trp225 230 235ATT CAA GCT GGT GTT CCA ACA AAA AAA TTG GTA CTT GGA ATT CCA TTT 769Ile Gln Ala Gly Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile Pro Phe240 245 250TAT GGC TAT GCG TGG CGA TTG GTT AAC CCG AAT ATC CAC GAT CTT AGA 817Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu Val Asn Pro Asn Ile His Asp Leu Arg255 260 265GCA CCT GCC GCC GGA AAA TCA AAT GTA GGT GCG GTC GAT GAT GGG TCG 865Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser270 275 280ATG ACT TAT AAC AGA ATT AGA GAT TAT ATA GTG CAG AGT CGC GCC ACA 913Met Thr Tyr Asn Arg Ile Arg Asp Tyr Ile Val Gln Ser Arg Ala Thr285 290 295 300ACT GTG TAT AAT GCT ACT ATT GTT GGA GAT TAT TGT TAC TCT GGA AGT 961Thr Val Tyr Asn Ala Thr Ile Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser305 310 315AAT TGG ATT AGC TAT GAT GAT ACT CAA AGT GTT AGA AAT AAG GTT AAT 1009Asn Trp Ile Ser Tyr Asp Asp Thr Gln Ser Val Arg ASn Lys Val Asn320 325 330TAT GTT AAA GGT AGA GGA TTG CTA GGT TAC TTT GCA TGG CAC GTT GCA 1057Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala335 340 345GGG GAT CAA AAT TGG GGA CTT TCT CGT ACA GCT TCA CAA ACA TGG GGA 1105Gly Asp Gln Asn Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gln Thr Trp Gly350 355 360GTG TCA TCT CAA GAG ATG AAG TGATGGATTA CGTAATTGTG TGTGTCAAGT 1156Val Ser Ser Gln Glu Met Lys365 370ATACTACTTA TAATAAGGCA ACAGATATGT GAACTATGAC ATAAATAAAT AAACAATAAA 1216TTGTGGTCTC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1253(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度371氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Phe Ser Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Leu Arg Gln Leu Val Cys Thr1 5 10 15Asn Ser Gln Asn Val Ile Lys Gly Gly Tyr Trp Phe Lys Asn Ser Gly20 25 30Leu Ala Leu Aan Asn Ile Asp Ser Thr Leu Phe Thr His Leu Phe Cys35 40 45Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Ser Asn Gln Leu Ile Ile Ser Pro50 55 60Glu Asn Gln Asp Ser Phe Ser Gln Phe Thr Ser Thr Val Gln Arg Lys65 70 75 80Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile Ala Gly Gly Arg Ala Asp85 90 95Thr Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln Pro Asn Ser Arg Lys Ser100 105 110Phe Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg Gln Phe Gly Phe His Gly115 120 125Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Thr Asp Met Thr Asn130 135 140Leu Gly Ile Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala Ile Asn Met Glu Ala145 150 155 160Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Tyr165 170 175Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Val Ala Arg180 185 190Asn Leu Asn Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn195 200 205Trp Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser His Ala Gln Leu Phe Asp Pro Val210 215 220Asn His Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn Ala Trp Ile Gln Ala Gly225 230 235 240Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala245 250 255Trp Arg Leu Val Asn Pro Asn Ile His Asp Leu Arg Ala Pro Ala Ala260 265 270Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn275 280 285Arg Ile Arg Asp Tyr Ile Val Gln Ser Arg Ala Thr Thr Val Tyr Asn290 295 300Ala Thr Ile Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser Asn Trp Ile Ser305 310 315 320Tyr Asp Asp Thr Gln Ser Val Arg Asn Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly325 330 335Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala Gly Asp Gln Asn340 345 350Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gln Thr Trp Gly Val Ser Ser Gln355 360 365Glu Met Lys370(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc-特征(B)位置1…29(D)其他信息/功能＝“pcn引物”(xi)SEQ ID NO3的序列描述GTTTCCTTCT CCATGGAACT AGTTTGCAC(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假擬非(vi)原始來(lái)源
(A)生物體煙草N.tabacum(B)品系Samsun NN.
(D)發(fā)育階段TMV-誘導(dǎo)的(F)組織類(lèi)型葉(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置15(D)其他信息/標(biāo)記＝x/注釋?zhuān)健皻埢荲al或Ile”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置10(D)其他信息/標(biāo)記＝x/注釋?zhuān)健翱赡転镚ly”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置14(D)其他信息/標(biāo)記＝x/注釋?zhuān)健拔粗獨(dú)埢?xi)SEQ ID NO4的序列描述Pro Val Asn His Xaa ser Gly ser Asp Xaa Ile Asn Ala Xaa Ile Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假擬非(vi)原始來(lái)源(A)生物體煙草N.tabacum(D)發(fā)育階段TMV-誘導(dǎo)的(F)組織類(lèi)型葉(xi)SEQ ID NO5的序列描述Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu ser Val Ala Arg Asn Leu Asn Trp1 5 10 15(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型肽(iii)假擬非(vi)原始來(lái)源(A)生物體煙草N.tabacum(D)發(fā)育階段TMV-誘導(dǎo)的
(F)組織類(lèi)型葉(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞肽(B)位置12(D)其他信息/標(biāo)記＝x/注釋?zhuān)健癡al和lle都存在”(xi)SEQ ID NO6的序列描述Ser His Ala Gln Leu Phe Asp Pro Val Asn His Xaa Ser Gly Ser Asp1 5 10 15Gly Ile Asn Ala Trp Ile Gln Ala Gly Val20 25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3155個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(iii)假擬非(vi)原始來(lái)源(A)生物體煙草N.tabacum(B)品系Samsun NN(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子
(B)位置454…907(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1859…2497(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置2847…2884(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞內(nèi)含子(B)位置908…1858(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞內(nèi)含子(B)位置2498…2846(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置join(454…907，1859…2497，2847…2884)(xi)SEQ ID NO7的序列描述GAGCTCTGTT AATAATTTTG ACGTAACTAG TCATCAGGTC GCAGTTCAAG TCATCAGGTA60GCAGTTCAAG TCATGAAAAT AGTCTCTTGC AGGTAAGGTT GCGTACAACA GATCCTTGTG 120GTCCGGCCCT TTCCGAACTT CGCTTGTAGC TGGAGCTTAG TCACCGGAAT ACCCGTTGTT 180CCGTTAATAA CAAGAACACA TACAAGACGA TTTGCTAACA AAAATATATA TATAAACCAA 240AAGTGTAACG ATGATAAAAT TGCACAATTC TGAAGGATAT ACAGGAAAAT TTTGACCTTT 300TCTCTATTTA GAAATATTGA GAGATTCAAC CACTTTCTAA TGGAGTAGTA AATGTATCGC 360AAACTAAAAG CCGCCGGTAG ACAGTAAACT CAAATCTTCA AACTTATTTA AACTCGAAGT 420CACAAATTAA ATAAGCTATC AACCTTCAAT TTA ATG GCT AAT TCT GTC ACT CTT474Met Ala Asn Ser Val Thr Leu1 5TTC GCC ATT ATT TTC TCA TGT TTC CTC CTC CAG CAA CTA GTT TGC ACA 522Phe Ala Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu Leu Gln Gln Leu Val Cys Thr10 15 20AAT AGC CAA AAT GTT AAG GGA GGA TAC TGG TTT AAG GAC AGT GGA TTA 570Asn Ser Gln Asn Val Lys Gly Gly Tyr Trp Phe Lys Asp Ser Gly Leu25 30 35GCA TTA AAC AAC ATA GAT TCA ACA CTT TTC ACT CAT CTA TTT TGT GCA 618Ala Leu Asn Asn Ile Asp Ser Thr Leu Phe Thr His Leu Phe Cys Ala40 45 50 55TTT GCC GAT CTT AAT CCT CAA TTA AAT CAG TTA ATT ATT TCG CCG GAA 666Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Leu Asn Gln Leu Ile Ile Ser Pro Glu60 65 70AAT CAA GAT TCA TTC AGG CAA TTT ACA AGT ACA GTT CAA AGG AAA AAT 714Asn Gln Asp Ser Phe Arg Gln Phe Thr Ser Thr Val Gln Arg Lys Asn75 80 85CCT TCG GTC AAG ACT TTC TTG TCT ATA GCT GGA GGA AGA GCT AAT TCA 762Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile Ala Gly Gly Arg Ala Asn Ser90 95 100ACT GCC TAT GGA ATT ATG GCT AGA CAA CCA AAT TCA AGA AAA AGT TTT 810Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln Pro Asn Ser Arg Lys Ser Phe105 110 115ATT GAT TCA TCA ATA AGA TTG GCT AGA CAA TTA GGA TTT CAT GGC CTT 858Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg Gln Leu Gly Phe His Gly Leu120 125 130 135GAT CTT GAT TGG GAA TAT CCA TTA TCA GCT GCA GAC ATG ACA AAC TTA G 907Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser Ala Ala Asp Met Thr Asn Leu140 145 150GTATTATTGA CAAACATATA TTTTCTTCAT TTGTTTTACA CATATGGATG GCCCTTACAT 967GAATTTATTT TTGGACAAAT ATAGCTAGTT GTGAATTTAG GAGAGGCAAT CGGGCGGGTC 1027GTGTCGGATA TGGGATGGAT TGAAAATGGA TAATGAAAAA ATGGATAAAG TATCCGACCC 1087GATTCATATT TAATACGGAT AATAAACCGG TCCATGACTT CTTGAATATG ATCCCTTTTG 1147GGAGAATTTC TATTTTCCCA AACTTACCCC CAATTTGAAG CTTTATAAAT GCAAAAGTTA 1207AACTCATTAG TTATCCATTG ATTATCCATT TTCCAAATGG ATAATATGAT TCTTATTTAT 1267ATTTGACCCG TTTTTAAAAA GTTCATTATC CAACCCATTT TTAGTGGATA ATATGGGTGG 1327TTAATTCTTT TCTTTTAACC ATTTTGCCAT CACTAGTTGT GATATTTGAA CTCTCATCTG 1387TCTGTTCAGA TATTATATTG AATTATGTGA CAACAGTATT TGAAATTAGA AATTATTATA 1447CACATAATAT ATTTTTATTT ACTTAATTAT CATATCTCTG ACTGCAATAC TAGGTTCTTG 1507ATACTAGACA CATTATATGT AACTTTTGCA AATTATGGGT CTATGATATT TTCGAAAATA 1567ATAACAATTT TTTCACTCTC CTCACAGTTA TATATAATCT CGAAAGGGGA AAGATCCCTC 1627AGAGAATCAC TCGATTATAT TGACAAGTTC AAAAAACTGA TCATAATATG ATGGCGATTG 1687CAAGCAGGCC CCCATCATCT CATAACAACT GATAGGTTTC GTTAAACCTG CTCATTATAT 1747CCATATGTCT ACTATGATAC CATACAATAT GAATTGTGTA ATCACTCCAT CTAGCTAACA 1807ATTTAAACTG TTGAAGAGTA CACTTTTATT TACTTACCTG TTAATTAAAC A GG ACC 1863Gly ThrCTT TTG AAT GAG TGG CGC ACC GCT ATC AAC ACG GAG GCG AGA AAT TCC1911Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr Ala Ile Asn Thr Glu Ala Arg Asn Ser155 160 165GGT AGG GCG GCA CTA CTT CTC ACG GCG GCG GTT TCC AAC TCA CCC CGA1959Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Asn Ser Pro Arg170 175 180 185GTC AAT GGG TTG AAC TAC CCA GTT GAA TCA TTG GCA AGA AAC TTA GAC2007Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro Val Glu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Asp190 195 200TGG ATT AAC CTT ATG GCC TAT GAT TTC TAT GGA CCA AAT TGG TCA CCA2055Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro205 210 215TCA CAA ACC AAT TCA CAT GCA CAA TTA TTT GAT CCT GTG AAC CAT GTT2103Ser Gln Thr Asn Ser His Ala Gln Leu Phe Asp Pro Val Asn His Val220 225 230AGT GGA AGT GAT GGA ATT AAT GCA TGG ATT CAA GCT GGT GTT CCA ACA2151Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn Ala Trp Ile Gln Ala Gly Val Pro Thr235 240 245AAA AAA TTG GTG CTT GGA ATT CCA TTT TAT GGC TAT GCG TGG CGA TTA2199Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu250 255 260 265GTT AAC GCG AAT ATT CAC GGT CTT AGA GCA CCT GCT GCC GGA AAA TCA2247Val Asn Ala Asn Ile His Gly Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser270 275 280AAT GTT GGT GCG GTC GAT GAT GGG TCG ATG ACT TAT AAC AGA ATT AGG2295Asn Val Gly Ala Val Asp Asp Gly Ser Met Thr Tyr Asn Arg Ile Arg285 290 295GAT TAT ATA GTG GAG AGT CGC GCC ACG ACT GTG TAT AAC GCT ACC ATT2343Asp Tyr Ile Val Glu Ser Arg Ala Thr Thr Val Tyr Asn Ala Thr Ile300 305 310GTT GGA GAT TAT TGT TAC TCT GGT AGT AAT TGG ATT AGC TAT GAT GAT2391Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser Gly Ser Asn Trp Ile Ser Tyr Asp Asp315 320 325ACT CAA ACT GTT AGA AAT AAG GTT AAT TAT GTT AAA GGT AGA GGA TTG2439Thr Gln Thr Val Arg Asn Lys Val Asn Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu330 335 340 345CTT GGT TAT TTT GCA TGG CAC GTT GCA GGG GAT CAA AAT TGG GGA CTT2487Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His Val Ala Gly Asp Gln Asn Trp Gly Leu350 355 360TCT CGT ACA G GTTAGACGTA GTTTTTCTTT GTTTTTTTTT TTAATTCTGG 2537Ser Arg ThrTATTTATATT TTTGTATGGA TAACACGTAA TTTTGTCGAA TACATAATTG TCAAAATACA 2597TCATTTTTAT TGGTGCATGT TTTCTCATGA ATTCTTAGGA AAGCATGACT ATGCTATTTG 2657GTCGATAGTC TTGTGAAATT TTATACATAA TCAATGCTTT TAAGGTCGGA ATTATTAGAC 2717AATTGTCTTT CTCAATTAAT TATTATTATT ATTATTATTA TTATTATTAT TATTATTATT 2777ATTATTATTA TTATTATTAT TATTATTATT ATTATTATTA TTTACATTTC CCCCACTTGT 2837GTCTTGCAG CT TCA CAA ACA TGG GGA GTG TCA TTT CAA GAG ATG AAG 2884Ala Ser Gln Thr Trp Gly Val Ser Phe Gln Glu Met Lys365 370 375TGATGGATTA CGTAATTGTG TTTGTCAAGT ATCCTACTTA TAATAAGGTG ACAGATATGT2944GAACTATGAC ATAAATAAAA TAAATATAAA TCGGGTTCCC CAATTTTATT TTTCTACGAA3004TAATATATTT CTTCCCCCTT TGGAGTACAT TAGGTTTATT ATTGTTATTA TTGTTGTTGT3064TGTTGTTTGT ACTAATAATA TATTTCTTCG TTCCAAAATA GTTGATGCTT TTTGTTTTTC3124GATATTATTT TCTCGTTTTC AATTAATTAA A 3155(2)SEQID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度377個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO8的序列描述Met Ala Asn Ser Val Thr Leu Phe Ala Ile Ile Phe Ser Cys Phe Leu1 5 10 15Leu Gln Gln Leu Val Cys Thr Asn Ser Gln Asn Val Lys Gly Gly Tyr20 25 30Trp Phe Lys Asp Ser Gly Leu Ala Leu Asn Asn Ile Asp Ser Thr Leu35 40 45Phe Thr His Leu Phe Cys Ala Phe Ala Asp Leu Asn Pro Gln Leu Asn50 55 60Gln Leu Ile Ile Ser Pro Glu Asn Gln Asp Ser Phe Arg Gln Phe Thr65 70 75 80Ser Thr Val Gln Arg Lys Asn Pro Ser Val Lys Thr Phe Leu Ser Ile85 90 95Ala Gly Gly Arg Ala Asn Ser Thr Ala Tyr Gly Ile Met Ala Arg Gln100 105 110Pro Asn Ser Arg Lys Ser Phe Ile Asp Ser Ser Ile Arg Leu Ala Arg115 120 125Gln Leu Gly Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Leu Ser130 135 140Ala Ala Asp Met Thr Asn Leu Gly Thr Leu Leu Asn Glu Trp Arg Thr145 150 155 160Ala Ile Asn Thr Glu Ala Arg Asn Ser Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu165 170 175Thr Ala Ala Val Ser Asn Ser Pro Arg Val Asn Gly Leu Asn Tyr Pro180 185 190Val Glu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Asp Trp Ile Asn Leu Met Ala Tyr195 200 205Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Trp Ser Pro Ser Gln Thr Asn Ser His Ala210 215 220Gln Leu Phe Asp Pro Val Asn His Val Ser Gly Ser Asp Gly Ile Asn225 230 235 240Ala Trp Ile Gln Ala Gly Val Pro Thr Lys Lys Leu Val Leu Gly Ile245 250 255Pro Phe Tyr Gly Tyr Ala Trp Arg Leu Val Asn Ala Asn Ile His Gly260 265 270Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gly Lys Ser ASn Val Gly Ala Val Asp Asp275 280 285Gly Ser Met Thr Tyr Asn Arg Ile Arg Asp Tyr Ile Val Glu Ser Arg290 295 300Ala Thr Thr Val Tyr Asn Ala Thr Ile Val Gly Asp Tyr Cys Tyr Ser305 310 315 320Gly Ser Asn Trp Ile Ser Tyr Asp Asp Thr Gln Thr Val Arg Asn Lys325 330 335Val Asn Tyr Val Lys Gly Arg Gly Leu Leu Gly Tyr Phe Ala Trp His340 345 350Val Ala Gly Asp Gln Asn Trp Gly Leu Ser Arg Thr Ala Ser Gln Thr355 360 365Trp Gly Val Ser Phe Gln Glu Met Lys370 375(2)SEQID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是(xi)SEQ ID NO9的序列描述AAT ACGACTC ACT AT AG(2)SEQID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是(xi)SEQ ID NO10的序列描述TCTCCGGCAA CTAGTTTGCAC(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是(xi)SEQ ID NO11的序列描述GTCATAGTTC ACATATCTGT TGCC(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是(xi)SEQ ID NO12的序列描述TTTAAACTCG AAGTCACAAA TTAAA(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是
(xi)SEQ ID NO13的序列描述TTTAAACTCG GATCCACAAA TTAAA(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬是(xi)SEQ ID NO14的序列描述AATTGTCTAG AC
權(quán)利要求
1.一種與其他植物蛋白分離的植物蛋白，所述植物蛋白具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性、抗真菌活性，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得其分子量大約為40～43KDa。
2.權(quán)利要求1的與其他植物蛋白分離的植物蛋白，它可從TMV感染誘導(dǎo)的煙草植物葉子中得到。
3.權(quán)利要求1的分離蛋白，其含有SEQIDNO1或7所示的氨基酸序列或其具有幾丁質(zhì)酶活性的片段。
4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)中的蛋白，其中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失或加入而不消除幾丁質(zhì)酶活性。
5.一種含有權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的蛋白作為活性成分的抗真菌組合物。
6.權(quán)利要求5的抗真菌組合物，它還含有β-1，3-葡聚糖酶和/或幾丁質(zhì)酶。
7.權(quán)利要求5的抗真菌組合物，它除含有所述蛋白外還含有與所述蛋白對(duì)真菌有協(xié)同作用的蛋白。
8.一種分離的DNA序列，它含有編碼權(quán)利要求1蛋白的開(kāi)放讀碼框架。
9.一種含有編碼SEQIDNO1或7中氨基酸序列的開(kāi)放讀碼框架的分離DNA序列，和在嚴(yán)格條件下與其雜交的DNA序列。
10.一種植物可表達(dá)的重組DNA序列，它含有編碼權(quán)利要求1的蛋白或所述蛋白之前體的DNA序列，所述DNA序列被有效地連接到在植物中以上述蛋白形式表達(dá)上述DNA序列所必須的調(diào)控元件上。
11.權(quán)利要求10的植物可表達(dá)的重組DNA序列，其中所述DNA序列編碼一種具有SEQIDNO1或7所示的氨基酸序列的蛋白前體。
12.權(quán)利要求10的植物可表達(dá)的重組DNA序列，它含有SEQIDNO1或7中所示的DNA序列。
13.一種含有權(quán)利要求10的DNA序列的克隆載體。
14.一種含有權(quán)利要求13的克隆載體的細(xì)菌菌株。
15.一種含有權(quán)利要求13的載體的農(nóng)桿菌菌株。
16.一種植物基因組，其中已插入了權(quán)利要求10的植物可表達(dá)重組DNA序列。
17.一種有權(quán)利要求16的重組植物基因組的植物細(xì)胞或這種細(xì)胞的原生質(zhì)體。
18.一種植物或它的部分材料，如鱗基、花、果、葉、花粉、根或根培養(yǎng)物、種子、莖、塊莖或微塊莖等，其含有一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求20的細(xì)胞。
19.一種植物或它的部分材料，如鱗莖、花、果、葉、花粉、根或根的培養(yǎng)物、種子、主莖、塊莖或微塊莖等，其中基本上所有細(xì)胞都含一種權(quán)利要求16的重組植物DNA基因組。
20.權(quán)利要求19的植物或其部分材料，這種植物或其部分材料對(duì)真菌感染的易感性較低。
21.一種對(duì)真菌易感性降低了的植物變種的育種方法，其特征在于至少一個(gè)親代品系含有權(quán)利要求16的重組DNA基因組。
22.一種抑制真菌生長(zhǎng)和/或發(fā)芽的方法，其中將真菌或使真菌與有效量的權(quán)利要求1的幾丁質(zhì)酶接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的幾丁質(zhì)酶，其具有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性、抗真菌活性，且經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺電泳測(cè)定的分子量約為40-43KDa。本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明幾丁質(zhì)酶作為活性成分的抗真菌組合物；提供含編碼新幾丁質(zhì)酶的開(kāi)放讀碼框架的分離DNA序列；提供含編碼本發(fā)明幾丁質(zhì)酶的DNA序列的植物可表達(dá)重組DNA序列，以及已將這種重組DNA插入其基因組的植物細(xì)胞和植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1131439SQ94193448
公開(kāi)日1996年9月18日 申請(qǐng)日期1994年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月17日
發(fā)明者M·阿伯泰克-德·格勞特, J·F·博爾, B·J·C·科尼里森, H·J·M·林索斯特, L·S·梅爾徹斯, A·S·龐斯坦, M·B·塞拉-博拉吉 申請(qǐng)人:莫根國(guó)際公司, 萊頓國(guó)立大學(xué)