專利名稱：丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿-l-肉毒堿代謝基因及其在微生物法生成l-肉毒堿中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿-L-肉毒堿基因的重組遺傳物質(zhì)，含有該遺傳物質(zhì)的微生物和這類微生物在生物法生產(chǎn)L-肉毒堿中的用途。
L-肉毒堿是一種在人體代謝過程中具有重要意義的天然、類維生素物質(zhì)。在脂肪酸的利用中，L-肉毒堿可以作為線粒體膜的遞質(zhì)并由此作為代謝能的轉(zhuǎn)運(yùn)因子，因此是必需的。如果人體L-肉毒堿合成不足，就必須在飲食中進(jìn)行添加以避免缺乏癥。特別是在仍無法合成其自身的L-肉毒堿的嬰兒的飲食中，L-肉毒堿是一種必需營養(yǎng)素。
L-肉毒堿被用作藥物的有效成分。在肉毒堿缺乏癥和其它癥狀，特別是心臟病等疾病的治療方法中需補(bǔ)充L-肉毒堿。
高等生物中的L-肉毒堿的生物合成是已知的，它在代謝中的其它功能和重要性是更加深入的研究課題。除了對(duì)于已描述的微生物、特別是Pseudomonas屬的代謝途徑(羥基酶催化，Lindstedt等，Bio-chemistry 16，2181-2188，1977)，L-肉毒堿在某些微生物如Agrobac-terium(土壤桿菌)/Rhizobium(根瘤菌屬)的代謝中被作為中間體合成。
EP-A-O158194揭示了一種以例如γ-丁內(nèi)銨鹽為起始物的用微生物生產(chǎn)L-肉毒堿的方法，其中，利用常規(guī)微生物選擇法得到一L-肉毒堿?；?L-carnityl)脫氫酶陰性生產(chǎn)突變株，使用它已經(jīng)可以在20至30小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)得到較好的L-肉毒堿產(chǎn)率。但是，利用常規(guī)的微生物方法不可能進(jìn)一步優(yōu)化該方法的體積/時(shí)間比率。
所以，本發(fā)明的目的是提供一種更為經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)L-肉毒堿的生物技術(shù)法，該方法可在大大縮短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)得到更好產(chǎn)率的L-肉毒堿。
就γ-丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿代謝的研究鑒定出5個(gè)基因，bcoA/B，bcoC，bcoD，bcoE和bcoT，它們編碼γ-丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿代謝途徑中的酶并含于一個(gè)稱為丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子(bco)的操縱子中。本文中，縮寫具有如下定義bcoA/Bγ-丁內(nèi)銨鹽-CoA(輔酶A)合成酶(bcoA)/巴豆甜菜堿-CoA合成酶(bcoB)基因，即，編碼既具有γ-丁內(nèi)銨鹽-CoA合成酶活性又具有巴豆甜菜堿-CoA合成酶活性的一種酶產(chǎn)物的單個(gè)基因。
bcoCγ-丁內(nèi)銨鹽-CoA脫氫酶基因bcoD巴豆甜菜堿-CoA水解酶基因bcoEL-肉毒堿?；摎涿富騜coT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的潛在基因。
已發(fā)現(xiàn)，bcoA/B，bcoC和bcoD基因的產(chǎn)物負(fù)責(zé)L-肉毒堿的生物合成，而bcoE編碼將代謝中間體L-肉毒堿?；鵆oA降解為甜菜堿的肉毒堿脫氫酶。bcoT可能是一個(gè)編碼丁內(nèi)銨鹽代謝轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。該基因?qū)-肉毒堿的生物合成來說不是必需的。
本發(fā)明因而涉及DNA片段和載體，它們含有編碼γ-丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿代謝中用于L-肉毒堿合成的酶類的bcoC、bcoA/B和bcoD基因及可選的、另外的潛在轉(zhuǎn)運(yùn)基因bcoT中一個(gè)或多個(gè)。
本發(fā)明還涉及含有這些DNA片段和/或載體的微生物。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明中的微生物生產(chǎn)L-肉毒堿的生物技術(shù)方法。
如同所定義的，本文的說明書和權(quán)利要求中所用的表示法bcoA/B，bcoC，bcoD和bcoT既包括編碼具有上述酶活性的γ-丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿代謝的酶的野生型生物的基因，特別是丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子基因，也包括它們的功能相當(dāng)?shù)倪z傳變異體和突變體，即由野生型生物的基因衍生而來的基因，且其基因產(chǎn)物的生物活性基本不變。所以，這些功能相當(dāng)?shù)倪z傳變異體和突變體包括，例如已知的遺傳密碼的簡并化過程中的堿基置換，例如為了將基因序列改變成某種進(jìn)行表達(dá)的微生物所利用的優(yōu)選密碼子可人工生成的那些。變異體和突變體還包括了堿基或密碼子的刪除、插入和替換，這些作用的程度使它們產(chǎn)生的經(jīng)修飾過的基因的產(chǎn)物的生物功能基本不變。在此包括，例如與野生型序列高度同源，如同源性大于70％，并可在嚴(yán)緊雜交條件下，例如50至70℃的溫度和0.5至1.5M的鹽濃度，與野生型序列的互補(bǔ)序列雜交的基因序列。
本文中的轉(zhuǎn)錄單位應(yīng)被理解為指基因以單個(gè)轉(zhuǎn)錄方向排列并在一般轉(zhuǎn)錄調(diào)控下被轉(zhuǎn)錄成一連續(xù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的DNA序列，除基因外還含有基因表達(dá)所必需的遺傳調(diào)控元素，如啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
以下附圖更為具體地說明了本發(fā)明。


圖1顯示了γ-丁內(nèi)銨鹽-或巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝途徑中的酶。
圖2顯示了具有bco操縱子的取自Rhizobium/Agrobaterium的一段1.6kb的DNA片段的限制性酶切圖。
圖3和圖4顯示了質(zhì)粒pVK1011和pAZ101；箭頭指示出bco基因和beu基因(甜菜堿利用基因；EP-A-O543344)的位置和方向。用黑體顯示質(zhì)粒的插入位置。
圖5顯示了用于生產(chǎn)recA宿主株的可能起始物的質(zhì)粒pCC49。
圖6顯示了質(zhì)粒pVK1011、pAZ101、pVKiooq和pAZ7的構(gòu)建圖。
圖7顯示了一recA-宿主株的構(gòu)建圖。
用于分離γ-丁內(nèi)銨鹽-/巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝途徑中的基因bcoA/B，bcoC，bcoD和bcoT的起始物可以是進(jìn)行如圖1所示的丁內(nèi)銨鹽和/或巴豆甜菜堿代謝的所有微生物。合適的菌株是Es-cherichia，Pseudomonas，Agrobacterium，Rhizobium和Agrobac-terium/Rhizobium屬的微生物，優(yōu)選的是后者。Agrobacterium/Rhizobium屬微生物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是Agrobacterium/Rhizobiumsp.HK4(DSM2938)，EP-A-O158194中已對(duì)其有所描述。特別優(yōu)選使用那些呈肉毒堿脫氫酶陰性的微生物，即例如沒有或只有一個(gè)缺陷型的bcoE基因(后文中也被表示為bcoE′)。優(yōu)選的肉毒堿脫氫酶陰性微生物的實(shí)例是已在EP-A-O158194中有所描述的A-grobacterium/Rhizobium sp.HK13(DSM2903)和HK1331b(DSM3225)，或在EP-A-O543344中有所描述的Agrobacterium/Rhizobium sp.HK1349(DSM3944)。
通過例如對(duì)微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)座子插入誘變并由此以合適的標(biāo)記，如卡那霉素抗性標(biāo)記γ-丁內(nèi)銨鹽-/巴豆甜菜堿-L-肉毒堿基因來在微生物的染色體上定位γ-丁內(nèi)銨鹽-/巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝基因bcoA/B，bcoC，bcoD和bcoT。然后就可分離得到經(jīng)如此標(biāo)記的不能再利用丁內(nèi)銨鹽代謝中間體的突變體。以此方式，可進(jìn)行γ-丁內(nèi)銨鹽-/巴豆甜菜堿-L-肉毒堿代謝基因的鑒定并與它們的功能關(guān)聯(lián)起來。標(biāo)記過的基因可以繼而被克隆并用合適的限制酶進(jìn)行更為詳細(xì)的鑒定。然后，本發(fā)明的完整基因或DNA片段的分離可從一相應(yīng)的未誘變過的微生物的基因庫開始，通過已知方式用以上得到的誘變株的克隆基因與之雜交來從中分離和鑒定出bco基因或其片段。所得到的基因可被克隆入合適的載體并利用限制酶進(jìn)行酶切分析。
只有基因bcoA/B，bcoC和bcoD負(fù)責(zé)L-肉毒堿的生物合成。所以，只有這些基因的存在才是生產(chǎn)L-肉毒堿所必需的。根據(jù)選定的起始條件，例如選定的起始物或生產(chǎn)菌株，用于L-肉毒堿生產(chǎn)的DNA片段和載體可含有一個(gè)或多個(gè)L-肉毒堿生物合成基因。
如有必要，除了基因bcoA/B，bcoC和bcoD，本發(fā)明的DNA片段和載體還可包括潛在轉(zhuǎn)運(yùn)基因bcoT。
L-肉毒堿酰基脫氫酶基因，即bcoE基因的存在是不合要求的，因?yàn)橛兴嬖跁r(shí)會(huì)發(fā)生L-肉毒堿的降解。但是，缺陷型bcoE基因(bcoE′)的存在是無妨的。
最好，用于L-肉毒堿生產(chǎn)的基因，即bcoC，bcoA/B和bcoD和可選的潛在轉(zhuǎn)運(yùn)基因bcoT一起位于一個(gè)DNA片段或載體分子中，例如最好在基因調(diào)控元素的常規(guī)的5′-3′-方向下游，其順序?yàn)閎coC，bcoA/B和bcoD或bcoC，bcoA/B，bcoD和bcoT，并在如上所述的單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中，對(duì)應(yīng)于丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子中的天然排列方式?？衫脠D2的限制性酶切圖的相應(yīng)部分來對(duì)這樣一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的bcoC，bcoA/B，bcoD和bcoT基因進(jìn)行鑒定。
bco基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)最好在一個(gè)合適的、最好是強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行。啟動(dòng)子的選擇取決于要求的表達(dá)情況，如要求是組成型表達(dá)還是誘導(dǎo)型表達(dá)，或進(jìn)行表達(dá)的微生物。合適的啟動(dòng)子是，例如天然丁內(nèi)銨鹽-L-肉毒堿操縱子中的啟動(dòng)子Pbco。如果從例如具有缺陷型bcoE基因(bcoE′)的微生物中分離負(fù)責(zé)L-肉毒堿生物合成的bco基因，可較好地分離并克隆整個(gè)bco操縱子，而這些微生物的bcoE′基因及相關(guān)的基因調(diào)控元素可一起被分離及克隆，然后用在L-肉毒堿生產(chǎn)的合適微生物中。這種類型有一個(gè)如分離自例如A-grobacterium/Rhizobium sp.HK1349的突變的bcoE基因的轉(zhuǎn)錄單位也可以利用圖2所示的限制性酶切圖來進(jìn)行鑒定，如果bcoE的缺陷將只是因?yàn)槔缫粋€(gè)點(diǎn)突變而與限制性酶切位置無關(guān)。另外，適用于表達(dá)的啟動(dòng)子是，例如PNm、PSl啟動(dòng)子(M.Labes等，Gene，89，37-46，1990)，trp啟動(dòng)子(Amann等，Gene，25，167-178，1983)，lac啟動(dòng)子(Amann等，Gene，25，167-178，1983)和tac啟動(dòng)子，可使用所述的trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的雜交體作為組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Russell和Bennett，Gene，20，231-243，1982)。
為了用于在合適的生產(chǎn)菌株中生產(chǎn)L-肉毒堿，包含所述的最好是一起存在于單個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中的bco基因的本發(fā)明中的DNA片段最好借助于已知技術(shù)來插入已知的合適載體，特別是表達(dá)載體，如噬菌體或質(zhì)粒。所用的載體可以是自主和自身復(fù)制載體或所謂的整合載體。整合載體在本文中應(yīng)被理解為以質(zhì)粒為例，具有至少一段與接受株的基因組序列同源的序列并可通過該序列的同源重組在接受株的基因組中插入外源基因的載體。優(yōu)選使用自主和自身復(fù)制載體。
根據(jù)所選載體的特性，L-肉毒堿生物合成酶的基因可在多種微生物中表達(dá)。合適的載體可以是具有特異性宿主譜的，也可以是具有廣宿主譜(較廣的宿主范圍)的，及上述整合載體。
所用的廣譜宿主載體可以是所有適用于革蘭氏陰性菌的載體。這種廣譜宿主載體的實(shí)例為pVK100(Kneuf和Nester，Plasmid，8，45-54，1982)，pME285(Haas和Itoh，Gene，36，27-36，1985)和pKT240(Bagdasarian等，Gene，26，273-282，1983)或其衍生物?？捎玫膒VK100的衍生物為例如pVK1001，可用的pME285的衍生物為例如pAZ10，可用的pKT240的衍生物為例如pLO32(如EP-A-O543344中所述的)。
用于Agrobacterium/Rhizobium sp.株的整合載體可以是基于pACYC184或pBR322(Comai等，Plasmid，10，21-30，1983)而構(gòu)建的。
以這種方式可得到質(zhì)粒pVK100q、pVK1011(圖3)、pAZ7∷beu、pAZ101(圖4)和pLO41。質(zhì)粒pVK100q于1993年11月16日保藏于German Collection for Microorganisms and Cell CultureGmbH，D-38124 Braunschweig，Mascheroderweg 1b，Rhizobium/AgrobacteriumHK.1349中，保藏號(hào)為DSM8726。
為了得到發(fā)酵用生產(chǎn)菌株，即L-肉毒堿生產(chǎn)菌株，必須將本發(fā)明的DNA片段或載體整合入合乎要求并適于表達(dá)的宿主菌株中。最好，為此目的用含有本發(fā)明DNA片段的載體轉(zhuǎn)化微生物。微生物可由此含有在載體分子上或與其自身的染色體整合的本發(fā)明DNA片段。
合適的生產(chǎn)菌株可以是所有能由巴豆甜菜堿和/或γ-丁內(nèi)銨鹽生產(chǎn)L-肉毒堿而其L-肉毒堿降解(分解代謝)能力被完全或部分抑制的微生物。L-肉毒堿的降解能力被抑制的微生物是，例如肉毒堿脫氫酶陰性株，即由突變或缺失造成肉毒堿脫氫酶基因bcoE缺失的菌株，和/或L，D-肉毒堿消旋酶陰性和L-肉毒堿脫水酶陰性的菌株。
合適的宿主菌株，最好是具有高底物和起始物耐受性的菌株，例如Escherichia，Pserdomonas，Agrobacterium，Rhizobium、Coma-monas和Rhizobium/Agrobacterium屬的微生物，優(yōu)選的是后者。前文已對(duì)Rhizobium/Agrobacterium sp.HK13、HK1331b和HK1349進(jìn)行了描述，HK1349.4(如EP-A-O543344中所述)仍是特別優(yōu)選的。
還發(fā)現(xiàn)，如果降低宿主菌株的重組能力，即重組傾向和重組頻率，可以進(jìn)一步提高L-肉毒堿的產(chǎn)率。因?yàn)橛纱艘种屏嘶谌旧w同源性的與載體的重組。例如，可通過recA基因的定點(diǎn)突變(recA突變)以已知方式來降低宿主菌株的重組能力。特別優(yōu)選的重組能力受損的微生物是Rhizobium/Agrobacterium sp.，例如后文中所描述的本發(fā)明的Rhizobium/Agrobacterium HK1349.49菌株。
所以，合適的生產(chǎn)菌株是，例如微生物Rhizobium/Agrobacteri-um HK1349、HK1349.4和HK1349.49，它們均含有質(zhì)粒pVK100q、pVK1001、pAZ7、pAZ7∷beu、pAZ101或pLO41。
由一選擇培養(yǎng)基分離得到經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株(生產(chǎn)株)，該培養(yǎng)基中加有菌株因具有一位于載體或DNA片段上的標(biāo)記基因而具抗性的抗生素。如果將EP-A-O543344所述的微生物用作生產(chǎn)株，即其編碼甜菜堿利用的染色體基因是突變過的而以含有編碼甜菜堿利用的基因的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的微生物，就甜菜堿的利用而言，它們也可被選用。就甜菜堿的利用而被選用的微生物實(shí)例為上述HK1349.4和HK1349.49，它們含有例如質(zhì)粒pLO41、pAZ101、pAZ7∷beu或pVK1011。
使用含有本發(fā)明DNA片段或載體的微生物來進(jìn)行L-肉毒堿的生物技術(shù)生產(chǎn)。L-肉毒堿的生產(chǎn)過程以已知方法進(jìn)行，例如EP-A-O158,194中所述，在合適的碳源和氮源存在下，從γ-丁內(nèi)銨鹽開始。所用的碳源和氮源可以是例如谷氨酸鹽、乙酸鹽和甜菜堿或甘油和甜菜堿。如果是利用就甜菜堿的利用而被選用的微生物進(jìn)行生物技術(shù)生產(chǎn)，甜菜堿被用作唯一的氮源。
可利用類似于EP-A-O158194中所述的方法進(jìn)行發(fā)酵和其后的分離。
通過改變培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，及通過改變發(fā)酵條件以適應(yīng)特定的微生物，可進(jìn)一步提高L-肉毒堿的產(chǎn)率。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)座子插入突變體(Tn5)的制備及其表型的鑒定利用選擇壓力來產(chǎn)生野生型菌株Rhizobium/AgrobacteriumHK4(DSM2938，EP-B-O158194)對(duì)鏈霉素(Sm，1000μg/ml)的自發(fā)抗性?？勺C明，該抗性可在不加選擇的情況下穩(wěn)定保持50代，并可作為選擇標(biāo)記。
將0.2ml的Tn5供體培養(yǎng)物E.coli S17-1/pSUP2021(R.Simon等，Biotechnology，1983，1，784-790〕與2ml受體培養(yǎng)物HK4混合并離心。在0.9％的生理鹽水(NaCl溶液)中洗滌細(xì)胞并重懸于100μl 0.9％的生理鹽水中。在30℃，干的營養(yǎng)瓊脂上將供體株與受體株的接合進(jìn)行過夜。將收獲的細(xì)胞稀釋倒平皿在受體(SmR)和轉(zhuǎn)座子(新霉素抗性(NmR))選擇培養(yǎng)基上。
使用Sm(1000μg/ml)和Nm(100μg/ml)可在營養(yǎng)瓊脂上得到Tn5突變體。通過檢測其在基本培養(yǎng)基上并不象圖1那樣利用丁內(nèi)銨鹽代謝中間體，可進(jìn)行突變體的表型鑒定。
實(shí)施例2得自HK4基因組的Tn5-標(biāo)記過的DNA片段的克隆用EcoRI(4U/μg)徹底消化分離自Tn5-突變的HK4(5μg)的基因組DNA片段。pBR325(2.5μg)在用EcoRI徹底消化后用堿性磷酸酯酶處理(Gene，1977，2，95-133)。在400μl的連接緩沖液(20mMtris-HCl，pH7.2，10mM DTT(二硫蘇糖醇)，10mM MgCl2，0.6mMATP)中將基因組DNA和pBR325及T4-DNA連接酶混合并在12℃溫育過夜，然后可得重組雜交質(zhì)粒。
將連接混合物的等分物用于轉(zhuǎn)化E.coli ED 8654(Barek等，Mol，Gen.Genet.，146，199-207，1976)(Cohen等，1972，PNAS69，2110-2114)。在營養(yǎng)培養(yǎng)基中利用其氨芐青霉素(Ap100μg/ml)抗性和卡那霉素(Km25μg/ml)抗性篩選出轉(zhuǎn)化子。所有篩選出的雜交質(zhì)粒均帶有以Tn5標(biāo)記的一個(gè)HK4插入片段。根據(jù)限制性酶切圖2以各種限制性酶進(jìn)行這些插入體的酶切分析。限制性酶切圖的比較可確定一系列具有不同表型的Tn5突變體中的相同基因組片段中轉(zhuǎn)座子的插入。
可通過利用均一酶切的DNA質(zhì)粒的Southern blot雜交(“基因技術(shù)方法”，(基因工程方法)，S.Bertram和H.G.Gassen，G.Fischer Verlag編，1991，219f.)和其后的電泳分離來證實(shí)上述結(jié)果。所用的探針是得自轉(zhuǎn)座子突變體的克隆DNA的小片段。
實(shí)施例3在lambda噬菌體中構(gòu)建HK4基因組庫為了使DNA可被lambda噬菌體包裝，其長度須為40-52kb并有一個(gè)“cos位點(diǎn)”。為了在lambda噬菌體中構(gòu)建HK4基因組庫，可使用長度為23kb的cos質(zhì)粒載體pVK100(Knauf和Naster，1982，Plasmid 8，45-54)，由此可允許克隆17-29kb的DNA片段。
以Eco RI消化pVK100，脫磷酸作用后并與被Eco RI部分消化的HK4 DNA連接。通過測試0.58U/μgDNA或0.02U/μl反應(yīng)混合物的消化度來測定理想的部分消化HK4 DNA的Eco RI濃度，反應(yīng)混合物中含8.5μg的HK4 DNA。由瓊脂糖電泳分離出大于17kb的DNA片段。在含有100μgcos質(zhì)粒載體和400ng運(yùn)載DNA的10微升(μl)體積溶液中進(jìn)行連接反應(yīng)。根據(jù)Promega Biotec.提供的方案和在其混合試劑中進(jìn)行“體外包裝”，在25℃進(jìn)行2小時(shí)。在轉(zhuǎn)染E.coli S17-1后，利用Km抗性篩選帶cos質(zhì)粒載體。一批可獲得5500個(gè)克隆(單個(gè)菌落)。將基因庫保藏于-70℃，各含1000克隆的5批冷凍培養(yǎng)基(營養(yǎng)酵母培養(yǎng)基，NYB，Oxoid和50％甘油)中。每批取50μl在10ml NYB中培養(yǎng)過夜來進(jìn)行基因庫的擴(kuò)增，并進(jìn)行分份。
實(shí)施例4HK4cos質(zhì)?；驇斓暮Y選，利用克隆雜交、點(diǎn)雜交或HK4突變體的互補(bǔ)來進(jìn)行的攜帶bco基因質(zhì)?？寺〉蔫b定可以直接使用克隆的，Tn5標(biāo)記過的DNA片段作為雜交探針。
具有合適的DNA序列的克隆表現(xiàn)出雜交信號(hào)并對(duì)每一種HK4突變體的缺陷型基因形成互補(bǔ)。來自各種突變體的DNA的雜交確定了一個(gè)10.6kb的DNA上的幾個(gè)丁內(nèi)銨鹽代謝基因的“簇”(圖2)。
以常規(guī)方法進(jìn)行克隆雜交(S.Bertram和H.G.Gassen，1991，ibid，221f.)。點(diǎn)雜交也以已知方法進(jìn)行(S.Bertram和H.G.Gassen，1991，ibid，217f.)。
實(shí)施例5HK突變體的互補(bǔ)在根據(jù)已鑒定的肽鏈進(jìn)行了各丁內(nèi)銨鹽代謝基因的準(zhǔn)確定位并考慮其分子大小后，就可以利用特定的基因片段來獲得各種突變體的互補(bǔ)。
通過與E.coli S17-1的接合將特定的表達(dá)載體pVK100∷HK-DNA引入實(shí)施例1中的Rhizobium/Agrobacterium sp.HK4菌株中，其中含有不同代謝步驟(圖1)的突變體。根據(jù)對(duì)供體的脯氨酸(pro)營養(yǎng)缺陷型的彌補(bǔ)和載體的抗生素抗性(KmRTc(四環(huán)素)R)進(jìn)行篩選。
實(shí)施例66.1得自HK1349菌株的bco片段及其衍生物的克隆為了獲得生產(chǎn)菌株中基因的量效作用和生產(chǎn)能力的提高，對(duì)取自HK1349(DSM3944，EP-A-O543344)的bco操縱子進(jìn)行克隆。在這種菌株中，含有完全形式的完整bco操縱子，但第一個(gè)基團(tuán)，即，編碼肉毒堿-CoA脫氫酶的bcoE基因是突變過的。所以，由于表達(dá)載體的高拷貝數(shù)，得自這種菌株并具有bco操縱子的DNA片段對(duì)提高生產(chǎn)能力是十分理想的。
根據(jù)EP-A-O534344的實(shí)施例3，以已知方法在E.coli S17-1中進(jìn)行克隆。為此，從HK1349基因庫中分離出10.6kb的bco操縱子并將它連接入pVK100。由此制得質(zhì)粒pVK100q(參見構(gòu)建圖，圖6)。在NYB Km(25μg/ml)培養(yǎng)基上在E.coli S17-1中進(jìn)行篩選。根據(jù)實(shí)施例5所述的方法在HK突變體中鑒定正確插入。電泳分離被EcRI酶切的得自HK1349的DNA，并從凝膠上分離得10.6kb的片段。將分離得的片段連入EcRI酶切的pVK100載體。利用該雜交質(zhì)?；旌衔铮D(zhuǎn)化E.coli S17-1(脯氨酸營養(yǎng)缺陷型)，并在含Km(25μg/ml)的營養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。在以0.2％(w/v)的丁內(nèi)銨鹽作為C源和N源的基本培養(yǎng)基上的含丁內(nèi)銨鹽-CoA脫氫酶陰性突變體(HK4V)的膜上進(jìn)行“片狀雜交”以鑒定出由載體和帶bco操縱子的10.6kbDNA形成的正確的雜交質(zhì)?？寺?。在將正確的克隆接合轉(zhuǎn)入突變體后，可在對(duì)該C源的利用上與細(xì)胞互補(bǔ)。由此鑒定的克隆pVK100q可直接用作生產(chǎn)質(zhì)?；蜃鳛閹co操縱子的DNA片段保存以用于以后的次級(jí)克隆。
6.2pAZ101、pAZ7、pVK1011和pVK100q，pLO41和pAZ7∷beu的構(gòu)建根據(jù)構(gòu)建6構(gòu)建pAZ101、pAZ7、pVK1011和pVK100q。將bco基因(10.6kb的Eco RI/Eco RI片段)插入pLO32(EP-A-O543344)來構(gòu)成pLO41，將beu基因(3kb PstI/PstI片段，EP-A-O543344)插入pAZ7(圖6)來構(gòu)成pAZ7∷beu質(zhì)粒。根據(jù)制造商提供的細(xì)節(jié)，相應(yīng)的限制性酶的用量為3-5U/μgDNA。將bco基因插入pVK100(Knauf和Nester，ibid)來構(gòu)成pVK100q。由質(zhì)粒pVK100s(EP-A-O543344)的EcoRI缺失克隆來制備起始質(zhì)粒pVK100sl(構(gòu)建圖6)。
實(shí)施例7在HK1349.4中引入recA突變7.1編碼recA的基因庫克隆的鑒定利用菌落雜交的方法(S.Bertram和H.G.Gassen，1991，ibid.211f.)在基因組HK4cos質(zhì)?；驇熘胁檎襯ecA編碼克隆。將得自Rhizobinm leguminosarum的克隆recA基因用作雜交探針(W.Selbitschka等，Mol.Gen.Genet，.299，1991，86-95)。分離出標(biāo)記過的cos質(zhì)?？寺?，用EcoRI消化后得到的EcoRI DNA插入片段與recA探針進(jìn)行Southern blot雜交來查找recA同源序列(S.Bertram和H.G.Gassen，1991，ibid，219f.)。將以這種方式標(biāo)記的EcoRI片段連入進(jìn)行了相同程度酶切的載體pVK100。用由此得到的雜交質(zhì)粒pVK100rl轉(zhuǎn)化E.coli S17-1細(xì)胞來進(jìn)行DNA復(fù)制。
7.2在HK1349.4中引入一個(gè)卡那霉素抗性基因以滅活染色體re-cA基因從pVK100rl上切取11.0kb的EcoRI片段，重新克隆入以EcoRI酶切的pACYC184(A.C.Y.Chang和S.N.Cohen，J.Bacteriol.，134，1978，1141-1156)。
根據(jù)測得的限制性酶切圖，一個(gè)3.1kb的BglII-NruI酶切片段，該片段在Southern blot雜交中被recA探針標(biāo)記過，被克隆入BglII-HindlII酶切過的載體pWS233。pWS233是一個(gè)“基因置換”載體，其描述可見W.Selbitschka等，Ap-pl.Microbiol.Biotechnol.38，1993，615-618。
得自Tn5(pSUP2021，R.Simon等，Biotechnology，1，1983，ibid)的、編碼Km抗性的一段XhoI DNA片段被克隆入pCC45質(zhì)粒的XhoI酶切位置，由此制得pCC49質(zhì)粒。與W.Selbitschka等，1993，ibid中所述的相似，如下進(jìn)行“基因置換”將3ml指數(shù)期的HK1349.4培養(yǎng)物與1ml指數(shù)期的供體培養(yǎng)物(S17-1/pCC49)混合，離心并用0.9％的NaCl溶液洗滌。將細(xì)胞在30℃，在50μlNYB營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)過夜。然后將重懸于0.9％的NaCl溶液中的細(xì)胞適當(dāng)稀釋后涂布在選擇培養(yǎng)基上。用Sm(100μg/ml)和Nm(150μg/ml)，在營養(yǎng)瓊脂上可得到Sm抗性受體HK1349.4轉(zhuǎn)移接合體，它們對(duì)復(fù)合培養(yǎng)基中5％的葡萄糖敏感，這與“置換”載體上的sacRB基因有關(guān)。
將選得的轉(zhuǎn)移接合體在營養(yǎng)瓊脂上不加選擇壓力地進(jìn)行培養(yǎng)后，可獲得低頻(10)-8雙重組。約1周后，可分離出可耐受培養(yǎng)基中5％葡萄糖的細(xì)胞，它們?nèi)匀痪哂蠳m抗性，但已變得對(duì)艮它霉素敏感(載體標(biāo)記)。
這種表現(xiàn)型證實(shí)了等位的標(biāo)記交換并指示出其為HK1349.4的recA突變體?？梢杂^察到典型的recA突變體的表現(xiàn)型(如UV敏感性等)。
在由此制得的HK1439.49菌株中，帶有同源序列的質(zhì)粒插入染色體的傾向(同源重組)顯然被降低了。所以，這種菌株極適合作為實(shí)施例6.2中的雜交質(zhì)粒的宿主。
實(shí)施例8生物轉(zhuǎn)化在搖瓶(100ml)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使用無氮源培養(yǎng)基(MM；Kul-la等，Arch.Microbiol.，1983，135，PP.1-7)，其中含有0.2％(w/v)的γ-丁內(nèi)銨鹽(起始物)和作為碳源的0.4％(w/v)的甘油。加入0.2％(w/v)的L-谷氨酸鹽(對(duì)甜菜堿利用陰性菌而言)或0.2％(w/v)的甜菜堿作為氮源或附加碳源。
所用的生產(chǎn)菌是本發(fā)明的HK1349.4/pLO41、HK1349.4/pVK1011、HK1349.4/pAZ7∷beu、HK1349.4/pAZ101、HK1349/pVK100q和HK1349/pAZ7。
結(jié)果以與從EP-A-O543344中已知的HK13的衍生物HK1349(DSM3944)和HK1349.4的比較形式列于表1。
用Bergmeyer(H.K.Bergmeyer，1974，Methoden der enzyma-tischen Analyse(酶分析法)，Verlag Chemie，Weinheim，1810f.)中描述的DTNB(5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸酯)法來測得由γ-丁內(nèi)銨鹽開始的L-肉毒堿的形成。
表權(quán)利要求
1.分離的DNA片段，其特征在于，它含有在γ-丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿代謝中L-肉毒堿生物合成的各種酶的編碼基因bcoC、bcoA/B和bcoD中一個(gè)或多個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征還在于，它還含有編碼γ-丁內(nèi)銨鹽/巴豆甜菜堿代謝中潛在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因bcoT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的DNA片段，其特征還在于，其中的基因bcoC、bcoA/B、bcoD和可選的bcoT來自Es-cherichia，Pseudomonas，Agrobacterium，Rhizobium和Agrobac-terium/Rhizobium種屬的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的DNA片段，其特征還在于，其中的基因與表達(dá)所必需的基因調(diào)控元素操作性連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的DNA片段，其特征還在于，其中的L-肉毒堿生物合成的基因的排列順序?yàn)閎coC、bcoA/B和bcoD或者，如果合適，bcoC、bcoA/B、bcoD和bcoT，并位于一個(gè)單轉(zhuǎn)錄單位中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5中任一項(xiàng)所述的DNA片段，其特征還在于，其中的基因調(diào)控元素含有天然bco操縱子的啟動(dòng)子，Pbco。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的DNA片段，其特征還在于，其中的基因bcoC、bcoA/B、bcoD和bcoT可分別或一起由以下限制性酶切圖所描述
8.載體，其特征在于，它含有根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的DNA片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體，其特征還在于，它就是保藏在Rhizobium/Agrobacterium HK1349中的，保藏號(hào)為DSM8726的質(zhì)粒pVK100q，質(zhì)粒pVK1011，質(zhì)粒pAZ7，質(zhì)粒pAZ7∷beu，質(zhì)粒pAZ101和質(zhì)粒pLO41。
10.微生物，其特征在于，它含有根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的一段DNA片段或載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的微生物，其特征還在于，其L-肉毒堿的分解代謝能力被完全或部分抑制。
12.根據(jù)權(quán)利要求10和11中任一項(xiàng)所述的微生物，其特征還在于，它的重組能力被破壞。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的微生物，其特征還在于，它選自Escherichia，Pseudomonas，Agrobacterium，Rhizobi-um，Comamonas和Rhizobium/Agrobacterium種屬的微生物。
14.微生物Rhizobium/Agrobacterium HK1349，它含有保藏號(hào)為DSM8726的質(zhì)粒pVK100q或質(zhì)粒pVK1011，質(zhì)粒pAZ7，質(zhì)粒pAZ7∷beu，質(zhì)粒pAZ101和質(zhì)粒pLO41，和源于這些微生物的具有L-肉毒堿生物合成能力的遺傳變異體和突變體。
15.微生物Rhizobium/Agrobacterium HK1349.4，它含有質(zhì)粒pVK100q、質(zhì)粒pVK1011，質(zhì)粒pAZ7，質(zhì)粒pAZ7∷beu，質(zhì)粒pAZ101和質(zhì)粒pLO41，和源于這些微生物的具有L-肉毒堿生物合成能力的遺傳變異體和突變體。
16.微生物Rhizobium/Agrobacterium HK1349.49，它含有質(zhì)粒pVK100q、質(zhì)粒pVK1011，質(zhì)粒pAZ7，質(zhì)粒pAZ7∷beu，質(zhì)粒pAZ101或質(zhì)粒pLO41，和源于這些微生物的具有L-肉毒堿生物合成能力的遺傳變異體和突變體。
17.生產(chǎn)L-肉毒堿的生物技術(shù)方法，其特征在于，利用根據(jù)權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)所述的微生物在合適的碳源和氮源存在下進(jìn)行巴豆甜菜堿和/或γ-丁內(nèi)銨鹽的發(fā)酵，及分離出L-肉毒堿。
全文摘要
本發(fā)明描述了含有L-肉毒堿生物合成的酶的編碼基因的DNA片段和載體，含有這些DNA片段或載體的微生物以及使用所述微生物的L-肉毒堿的微生物生產(chǎn)法。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1133066SQ94193701
公開日1996年10月9日 申請(qǐng)日期1994年10月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月8日
發(fā)明者T·齊默爾曼, J·韋爾朗 申請(qǐng)人:瑞士隆薩股份公司