專利名稱：來自被真菌感染的藻類的α-1，4-葡聚糖裂解酶，其純化，基因克隆和在微生物中的表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶，特別是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)。本發(fā)明還涉及提取該酶的方法。本發(fā)明還涉及編碼該酶的核苷酸序列。
FR-A-2617502和Baute等在PhytochemistryVol.27No.11 pp3401-3403中報道了以明顯的酶促反應(yīng)在普通羊肚菌(Morchella vulgaris)中生產(chǎn)1，5-D-脫水果糖(“AF”)。AF的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)?。盡管提及了可能的酶促反應(yīng)，但這兩份文獻都沒有提供任何酶的任何氨基酸序列資料，更不用說任何核苷酸序列資料。這些文獻說到AF可作為制備抗生素羥基羥甲基吡喃酮的前體。
Yu等在Biochimica et Biophysica ActaVol.1156 pp313-320中報道了從紅海藻中制備GL和其降解α-1，4-葡聚糖以生產(chǎn)AF的用途。AF的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)?。盡管該文獻提及了GL酶，但未提供該酶的任何氨基酸序列，更不用說編碼該酶的任何核苷酸序列資料。該文獻還建議GL的來源就是藻類。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，它包含從被真菌感染的藻類分離該酶。
優(yōu)選使用不含被該酶降解的凝膠分離和/或進一步純化該酶。
優(yōu)選凝膠以糊精為基礎(chǔ)，優(yōu)選β-環(huán)糊精或其衍生物，優(yōu)選環(huán)糊精，更優(yōu)選β-環(huán)糊精。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種以本發(fā)明的方法制備的GL酶。
優(yōu)選該酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2，或其任意變異體。
術(shù)語“其任意變異體”指在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下對該序列的至少一個氨基酸的任意取代，改變，修飾，置換，缺失或增加。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，優(yōu)選其中的序列不存在于其天然環(huán)境中(即不構(gòu)成表達該酶的細胞生物體天然基因組的一部分)。
優(yōu)選的核苷酸序列是DNA序列。
優(yōu)選的DNA序列包含與SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一個相同，或互補，或基本上同源或含任意合適的密碼子取代的序列。
“基本上同源”的表達包含有關(guān)結(jié)構(gòu)和/或核苷酸成份和/或生物活性的同源性。
“含任意合適的密碼子取代”的表達包含用另一編碼相同氨基酸的密碼子進行的任何密碼子置換或取代或在使所得的酶具有裂解酶活性的前提下對其進行的任何增加或刪除。
換句話來說，本發(fā)明也包含修飾的DNA序列，其中至少一個核苷酸已缺失，取代或修飾，或者其中至少插入了一個額外的核苷酸以編碼具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，優(yōu)選酶具有增強的裂解酶活性的酶。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了制備α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表達本發(fā)明的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了使用β-環(huán)糊精來純化酶，優(yōu)選GL。
根據(jù)本發(fā)明還提供了一種核苷酸序列，其中的DNA序列包含與SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4中任意一個相同，或互補，或基本上同源，或含任意合適的密碼子取代的序列，優(yōu)選其中的序列是一種分離的形式。
本發(fā)明的一個關(guān)鍵的方面在于認(rèn)識到了GL來自被真菌感染的藻類。這是首次測定了GL的氨基酸序列并確定了編碼GL的核酸序列。因此，本發(fā)明的一個關(guān)鍵的優(yōu)勢是現(xiàn)在可用諸如重組DNA技術(shù)大量制備GL，從而使諸如抗生素羥基羥甲基吡喃酮的化合物能較容易地大量制備。
優(yōu)選分泌該酶以簡便其純化。為做到這一點，將編碼成熟酶的DNA與選定宿主的信號序列，啟動子和終止子融合。
為了在黑色曲霉(Aspergillus niger)中表達，將gpdA(來自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)啟動子和信號序列與編碼成熟裂解酶的DNA(例如SEQ.I.D.No.3或SEQ.ID.No.4)的5′端融合。將黑色曲霉trpC基因的終止子序列置于該基因的3′端(Punt.P.J.et al(1991)J.Biotech.17，19-34)。將該構(gòu)建體插入含E.coli復(fù)制起點和選擇起點及黑曲霉(A.niger)選擇標(biāo)記的載體中。黑曲霉選擇標(biāo)記的例子是用于選擇轉(zhuǎn)化子的amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因?？蓪⒃撡|(zhì)粒轉(zhuǎn)化黑色曲霉并可從轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中回收成熟的裂解酶。
可將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進蛋白酶缺陷型菌株中以減少培養(yǎng)基中對裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al(1992)Biotechnol.Lett.14，357-362)。
根據(jù)下面的描述，其它優(yōu)勢將會變得更明顯。
因此，本發(fā)明涉及從被真菌感染的藻類(優(yōu)選被真菌感染的紅藻，如可在中國收集到的類型例如Gracilariopsis lemaneiformis)分離α-1，4-葡聚糖裂解酶。被真菌感染的藻類的一個例子已根據(jù)布達佩斯條約進行了保藏(見下文)。
經(jīng)過使用原位雜交技術(shù)建立了在被真菌感染的紅藻Gracilariopsis lemaneiformis中檢測酶GL。支持這種觀察的進一步證據(jù)由Southern雜交實驗的結(jié)果提供。因此，GL的酶活性可從被真菌感染的藻類中獲得，而不是象以前認(rèn)為的就從藻類獲得。
令人特別感興趣的是，發(fā)現(xiàn)有兩種天然的DNA序列，每種編碼一種具有GL特征的酶。已測序了這些DNA的核酸序列，它們以SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4(在下文討論和提供)被提供。
可用Yu等(出處同上)所述的方法進行起始酶純化。然而，優(yōu)選的起始酶純化包括使用在純化步驟中不會分解的固態(tài)支持物。這種凝膠支持物具有與標(biāo)準(zhǔn)實驗室蛋白質(zhì)純化裝置相配伍的優(yōu)勢。優(yōu)選的純化方法的詳情在下文給出。使用已知的用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)終止純化。使用互補電泳技術(shù)確定酶的純度。
根據(jù)pI、最適溫度和最適pH鑒定純化的裂解酶。在這一方面，發(fā)現(xiàn)酶具有下列特征當(dāng)使用支鏈淀粉時具有最適底物特異性和3.5-7.5的最適pH，最適溫度為50℃，pI為3.9。
如上所述，測定了根據(jù)本發(fā)明的酶(以氨基酸測序技術(shù)部分測定)，其氨基酸序列在下文提供。同樣測定了編碼根據(jù)本發(fā)明的酶(即GL)的核苷酸序列并在下文提供該DNA序列。
根據(jù)布達佩斯條約下列樣品于1994年6月20日保藏在認(rèn)可的保藏單位(The National Collections of Industrial and MarineBacteria Limited(NCIMB)at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1RY)
含質(zhì)粒pGL1的E.coli(NCIMB 40652)-(參考DH5α-pGL1)；和含質(zhì)粒pGL2的E.coli(NCIMB 40653)-(參考DH5α-pGL2)。
根據(jù)布達佩斯條約下列樣品作為保藏品于1994年10月11日被認(rèn)可的保藏單位(藻類和原生動物培養(yǎng)物保藏中心(CCAP)，Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)接受被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis(CCAP 1373/1)-[參考GLQ-(青島)]。
因此本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案包括由作為保藏品NCIMB 40652或保藏品NCIMB 40653的主體的質(zhì)粒中提供的GL編碼序列表達獲得的GL酶和從作為保藏品CCAP 1373/1的主體的被真菌感染的藻類中獲得的GL酶。
現(xiàn)在本發(fā)明將僅以實施例的方式進行描述。
下面提供了實施例的參考附圖，其中

圖1顯示染色的被真菌感染的藻類；圖2顯示染色的被真菌感染的藻類；圖3顯示真菌菌絲切片；圖4顯示被真菌感染的藻類切片；圖5顯示被真菌感染的藻類切片；圖6顯示pGL1的質(zhì)粒圖譜；圖7顯示pGL2的質(zhì)粒圖譜；圖8顯示了以SEQ.ID.No.3所給出的氨基酸序列，顯示了測序的肽片段的位置；圖9顯示了SEQ.ID.No.1與SEQ.ID.No.2的序列對比；圖10是顯微照片；
更詳細地說，圖1顯示了鈣粉白(Calcoflour White)染色揭示的在Gracilariopsis lemaneiformis上部分和下部分中的真菌(108x和294x)。
圖2顯示了含真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/苯胺藍黑染色。真菌具有明顯較高的碳水化合物含量。
圖3的顯微照片顯示了生長于藻類細胞厚壁(w)之間的具2層薄壁的真菌菌絲(f)的縱剖面和擦傷切片。注意藻類葉綠體中的類囊體膜(箭頭)。
圖4顯示用克隆2探針進行的反義檢測(上排)似乎局限于通過鈣粉白染色連續(xù)切片(下排)所示的真菌(46x和108x)。
圖5顯示在Gracilariopsis lemaneiformis的真菌上發(fā)現(xiàn)以克隆2探針獲得的高強度反義檢測(294x)。
圖6顯示了質(zhì)粒pGL1的圖譜，它是一種pBluescript IISK，含有從被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis所構(gòu)建的基因組文庫中分離的3.8kb的片段。該片段含編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
圖7顯示了質(zhì)粒pGL2的圖譜，它是一種pBluescript IISK，含有從被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis所構(gòu)建的基因組文庫中分離的3.6kb的片段，該片段含有編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
圖9顯示了SEQ.ID.No.1(GL1)與SEQ.ID.No.2(GL2)的序列對比。GL1的殘基總數(shù)是1088個，GL2的殘基總數(shù)是1091。在進行比較進，使用了結(jié)構(gòu)-遺傳模型(打開缺口花費10；連接缺口花費2)。在圖9中，顯示兩個對比的殘基相同的符號是“∶”；顯示兩個對比的殘基相似的符號是“.”。說成是“相似”的氨基酸有A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W?？偣灿?45個氨基酸(即77.67％)相同；60個氨基酸(5.51％)相似。在GL1中插入的缺口數(shù)為3，在GL2中插入的缺口數(shù)為2。
圖10是生長于藻類細胞壁(w)之間的真菌菌絲(f)的顯微照片。注意藻類細胞中的紅藻淀粉顆粒(s)和類囊體(箭頭)。
下面序列資料用于制備下述PCR反應(yīng)的引物和用于檢測由各自的核苷酸序列產(chǎn)生的氨基酸序列。
從被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中的肽類裝配的氨基酸序列Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn AlaAla Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn AsnAsp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp GluAsn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln TrpTyr Lys Phe Gly Pro Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala用于制備引物A和B的氨基酸序列(27-34)(Met Tyr Asn AsnAsp Ser Asn Val)引物AATG TA(TC)AA(CT)AA(CT)GA(CT)TC(GATC)AA(CT)GT 128mix引物BATG TA(TC)AA(CT)AA(CT)GA(CT)AG(CT)AA(CT)GT 64mix用于生產(chǎn)引物C的氨基酸序列(45-50)(Gly Gly His AspGly Tyr)引物CTA(GATC)CC(GA)TC(GA)TG(GATC)CC(GATC)CC 256mix[與互補鏈相對應(yīng)的序列]用于生產(chǎn)引物E的氨基酸序列(74-79)(Gln Trp Tyr LysPhe Gly)引物EGG(GATC)CC(GA)AA(CT)TT(GA)TAC CA(CT)TG 64mix[與互補鏈相對應(yīng)的序列]用于生產(chǎn)引物F1和F2的氨基酸序列(1-6)(Tyr ArgTrp Gln Glu Val)引物F1TA(TC)CG(GATC)TGG CA(GA)GA(GA)GT 32mix引物F2TA(TC)AG(GA)TGG CA(GA)GA(GA)GT 16mix從第一PCR擴增獲得的序列(克隆1)ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGCGGC CACGACGGTT AMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly從第二PCR擴增獲得的序列(克隆1)ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGTGGA CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGGAGAATTCGAC CGAACGNGAA TTGTACTTGC CCGTGCTGAC CCAATGGTACAAATTCGGCC CMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr GluArg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro從第三PCR擴增獲得的序列(克隆2)TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGAATGCGGCTTT CGGGAAACCG ATTATCAAGG CAGCTTCCATGTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGACCACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGTGTGCACCTGT TGTGTGGGAG AATACAACCA GTCGCGATCTGTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCCTyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Gly LysPro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln AspAsp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val ValTrp Glu Asn Thr Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr LysPhe Gly1.Gracilariopsis lemaneiformis的細胞學(xué)研究1.1.1 Gracilariopsis lemaneiformis中真菌感染的檢測從中國收集到的Gracilariopsis lemaneiformis的切片可徒手切成或從石蠟包埋的材料切成。用光學(xué)顯微鏡仔細檢查切片的材料。在Gracilariopsis lemaneiformis中清楚地觀測真菌菌絲。
組成Gracilariopsis lemaneiformis葉狀體的細胞以高度有序且?guī)缀跏菍ΨQ的方式存在。G.lemaneiformis的管狀葉狀體由大型、無色的中央細胞組成，此中央細胞被伸長的、纖細的橢圓細胞和小而圓的含紅色色素的外周細胞包圍。所有藻類的細胞類型以具有厚的細胞壁為特征。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)真菌菌絲在大細胞的中間層和外周層之間的界面上。這些細胞可清楚地與藻類細胞區(qū)分開來，因為它們是長的圓柱狀的。觀察到菌絲在高度有序的藻類細胞間的不規(guī)則生長。菌絲最常見的方向是沿藻類葉狀體的主軸。在有些情況下觀測到指向中央和外周的側(cè)枝。菌絲不會與藻類內(nèi)部/附生的第二世代混淆。
已知鈣粉白可以染含幾丁質(zhì)和纖維素的組織。與幾丁質(zhì)的反應(yīng)需要四個共價連接的末端N-乙酰氨基葡糖殘基。普遍認(rèn)為纖維素幾乎局限于高等植物，盡管在一些藻類中可能出現(xiàn)微量的纖維素。還已知在Gracilaria(江蘺屬)中不含幾丁質(zhì)。
在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中發(fā)現(xiàn)鈣粉白的染色與真菌菌絲細胞壁相對應(yīng)的區(qū)域。
當(dāng)在紫外燈下觀察時在江蘺屬組織的淺蘭色的背景中，菌絲顯示出亮白色(見圖1)。幾丁質(zhì)是大多數(shù)真菌的主要細胞壁成份，但在江蘺屬中缺乏幾丁質(zhì)。根據(jù)這些觀察我們得出結(jié)論所研究的藻類被真菌感染。在研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中，發(fā)現(xiàn)40％的下部材料被真菌菌絲感染。在藻類頂部材料中，發(fā)現(xiàn)25％的所研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片被感染。
用希夫過碘酸(PAS)和苯胺藍黑染色切片的Gracilariopsislemaneiformis顯示與藻類細胞相比真菌細胞內(nèi)的碳水化合物含量明顯要高(見圖2)。番紅O和孔雀綠顯示出與在被真菌感染的高等植物中所發(fā)現(xiàn)的真菌細胞相同的顏色反應(yīng)。
吖啶橙與切片的Gracilariopsis lemaneiformis之間的反應(yīng)清楚地顯示出真菌的無規(guī)則生長。1.1.2電子顯微鏡檢術(shù)2％ OsO4固定的、用鈣粉白檢測到真菌的15μm厚切片，用水洗滌并在二甲氧丙烷和無水乙醇中脫水。往載玻片上的每個切片滴一滴丙酮與spurr樹脂1∶1的混合物，1小時后換作一滴純樹脂。將充滿樹脂的明膠包埋的膠囊面朝下放在切片上并在4℃過夜。在55℃聚合8小時后，浸入液氮，可以從載玻片上分離出附著在樹脂塊上的厚切片。
修塊并在切片機上用鉆石刀切成100nm厚的切片。切片在含水乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛中染色。在電子顯微鏡下以80KV檢查切片。
檢查證實了光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果。并為產(chǎn)生裂解酶的G。lamneiformis的中國品種被真菌寄生物或共生物感染提供了進一步的證據(jù)。
真菌菌絲由50至100μm長且直徑僅幾微米的管狀細胞構(gòu)成。細胞順序排列且相鄰細胞間有隔壁。偶爾也可看見分枝。菌絲在藻類葉狀體厚細胞壁之間生長而不會穿透細胞壁或損傷細胞。已知這種稱為真菌植物共生物的共生關(guān)系也出現(xiàn)在一些絲狀海洋真菌和大型海洋藻類之間(Donk and Bruning，1992-Ecology of aquatic fungi inand on algae.In Reisser.W.(ed.)Algae and SymbiosesPlants，Animals.Fungi，Viruses，Interactions Explored.Biopress Ltd.，Bristol.)。
檢查圖10的顯微照片，可注意到藻類和真菌細胞之間的一些區(qū)別。與藻類幾μm厚的細胞壁相反，真菌細胞壁僅100-200nm厚。在藻類細胞中可見典型的植物細胞器，如具有類囊體膜的葉綠體及紅藻淀粉粒，但真菌沒有。
紅藻細胞間連接的特征是稱為紋孔栓或紋孔連結(jié)的特殊結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是凸出的電子密集核心，它們是藻類分類學(xué)中的重要特征(Pueschet，C.M.An expanded survey of the ultrastructureof Red algal pit plugs.J.Phycol.25，625，(1989))。在我們的材料中，在藻類葉狀體中常觀察到這種連結(jié)，但在真菌細胞間觀察不到。1.2原位雜交實驗原位雜交技術(shù)根據(jù)的原理是與mRNA的反義核糖核酸序列雜交。該技術(shù)用于觀察顯微切片中所說mRNA存在的區(qū)域。在該特定情況下，該技術(shù)用于定位Gracilariopsis lemaneiformis切片中的α-1，4-葡聚糖裂解酶。1.2.1制備用于原位雜交的35S標(biāo)記的探針將來自稱為克隆2(見上文)的第三PCR擴增的238bp PCR片段克隆進pGEM-3Zf(+)載體(Promega)。反義RNA的轉(zhuǎn)錄由SP6啟動子驅(qū)動，正義RNA由T7啟動子驅(qū)動。使用具有下述修改的核糖核酸酶保護試驗試劑盒(Ambion)。在6％測序凝膠上電泳轉(zhuǎn)錄子以去掉未摻入的核苷酸并用由T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)提供的洗脫緩沖液洗脫。反義轉(zhuǎn)錄子含23個非編碼核苷酸，而正義轉(zhuǎn)錄子含39個。如進行雜交，使用107cpm/ml35S標(biāo)記的探針。
基本上按Langedale等(1988)的描述進行原位雜交。發(fā)現(xiàn)雜交溫度在45℃最佳。在45℃洗滌后，用Kodak K-5照相乳膠覆蓋切片并在5℃黑暗中放置3天(參考Langedale，J.A.，Rothermel，B.A.and Nelson，T.(1888)，Genes and development 2106-115，Cold Spring Harbour Laboratory)。
用針對α-1，4-葡聚糖裂解酶的核糖探針進行的原位雜交實驗顯示在檢測的Gracilariopsis lemaneiformis中真菌菌絲上和周圍有強烈的雜交信號(見圖4和5)。這被當(dāng)作是α-1，4-葡聚糖裂解酶產(chǎn)生的明顯證據(jù)。在兩種Gracilariopsis lemaneiformis藻類組織中檢測到微弱的隨機背景反應(yīng)。應(yīng)在用正義和反義探針時都觀察到該反應(yīng)。僅在用反義探針時獲得了真菌菌絲的強烈染色。
在45℃的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下的雜交和洗滌步驟中獲得了這些結(jié)果。在50℃下觀察不到對真菌的染色，而背景染色仍相同。將溫度升高到55℃，明顯地且同等地降低了正義和反義探針的背景染色。
根據(jù)使用互補染色方法的細胞學(xué)檢查得出結(jié)論Gracilariopsislemaneiformis被真菌感染。在藻類組織的下部感染最顯著。
在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中，原位雜交結(jié)果清楚地表明雜交局限于發(fā)現(xiàn)真菌感染的區(qū)域(見圖4)。結(jié)果表明α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA似乎局限于Gracilariopsislemaneiformis中被真菌感染的區(qū)域。
根據(jù)這些觀察我們推斷在被真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis中檢測到α-1，4-葡聚糖裂解酶活性。2.酶的純化和鑒定從被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis材料中純化α-1，4-葡聚糖裂解酶可按下述進行2.1材料和方法經(jīng)過濾收獲藻類并用0.9％ NaCl洗滌。經(jīng)勻漿接著在50mM檸檬酸鹽-NaOH pH6.2(緩沖液A)中，冰浴，超聲處理6×3分鐘來破碎細胞。在25,000×g下離心40分鐘去掉細胞碎片。該步驟中獲得的上清認(rèn)為是無細胞提取物并在8-25％梯度凝膠上分離后用于活性染色和Western印跡。2.2用β-環(huán)糊精Sepharose凝膠分離將無細胞提取物直接上樣到用緩沖液A預(yù)先平衡的β-環(huán)糊精Sepharose凝膠4B柱(2.6×18cm)上。用3體積緩沖液A與2體積的含1M NaCl的緩沖液A洗柱。用加入2％糊精的緩沖液A洗脫α-1，4-葡聚糖裂解酶。集中活性組分并將緩沖液變?yōu)?0mM Bis-tris丙烷-HCl(pH7.0，緩沖液B)。
將活性組分上樣到用緩沖液B預(yù)先平衡的Mono Q HR5/5柱上。用含0.3M NaCl的緩沖液B線性梯度洗脫真菌裂解酶。
另外可將經(jīng)過β-環(huán)糊精Sepharose層析后獲得的裂解酶制品濃縮到150μl并上樣到在EPLC條件下操作的Superose 12柱上。2.3α-1，4-葡聚糖裂解酶活性分析和測定底物特異性、最適pH和溫度的條件用于分析α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反應(yīng)混合物含10mgml-1支鏈淀粉和25mM Mes-NaOH(pH6.0)。反應(yīng)在30℃下進行30分鐘并經(jīng)加入3，5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)。在室溫靜置10分鐘后，在550nm下測量光密度。3.來自被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸測序3.1該裂解酶的氨基酸測序使用來自溶組織梭狀芽孢桿菌(Clostridium histolyticum)的內(nèi)蛋白酶Arg-C或來自Lysobacter enzymogenes的內(nèi)蛋白酶Lys-C消化裂解酶，兩者都是測序級，購自德國Boehringer Mannheim。為了用內(nèi)蛋白酶Arg-C進行消化，將凍干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH7.6的溶液中，充入N2并加入10μl 50mM DTT和5mW EDTA后使蛋白質(zhì)變性并在N2中下50℃還原10分鐘。接著，加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH8.0的內(nèi)蛋白酶Arg-C，充入N2并在37℃下消化6小時。為了隨后衍生半胱氨酸，可加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，將溶液在N2中避光室溫保溫15分鐘。
為了用內(nèi)蛋白酶Lys-C消化，可將凍干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH8.4中。充入N2并加入5μl 45mM DTT后，蛋白質(zhì)在50℃變性和還原15分鐘。冷卻到室溫后，加入5μl 100mM碘乙酰胺N2中避光室溫處理15分鐘以衍生半胱氨酸。
隨后，加入90μl水和溶于50μl 50mM麥黃酮和10mM EDTA pH8.0中的5μg內(nèi)蛋白酶Lys-C并在37℃ N2中消化24小時。
使用溶劑A0.1％ TFA水溶液和溶劑B0.1％TFA乙腈溶液經(jīng)在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separations GroapCaliformia)上經(jīng)反向HPLC分離所得的多肽。在使用脈沖液體快速循環(huán)在Applied Biosystems 476A測序儀上測序前，使用相同的溶劑系統(tǒng)將所選的肽類在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schon，Novo Nordisk，Denmark)上再層析。
來自被真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的酶的氨基酸序列信息如下所示，具體地為SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2。SEQ.ID.No.1具有殘基數(shù)1088.氨基酸組成(包括信號序列)＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝61 Ala15 Cys 19 His34 Met 78 Thr51 Arg42 Gln 43 Ile53 Phe 24 Trp88 Asn53 Glu 63 Leu51 Pro 58 Tyr79 Asp 100 Gly 37 Lys62 Ser 77 ValSEQ.ID.No.2具有殘基數(shù)1091.氨基酸組成(包括信號序列)＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝58 Ala 16 Cys14 His34 Met68 Thr57 Arg 40 Gln44 Ile56 Phe23 Trp84 Asn 47 Glu69 Leu51 Pro61 Tyr81 Asp102 Gly50 Lys60 Ser76 Val3.2N-末端分析研究表明天然葡聚糖裂解酶1 N-末端序列被封閉。基本上按照LeGendre等(1993)[Purification of proteins and peptidesby SDS-PAGE；InMatsudaira，P.(ed.)A practical guide toprotein and peptide purification for microsequencing，2ndedition；Academic Press Inc.，San Diego；pp.74-101]的描述用無水TFA在40℃處理印跡到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶1 30分鐘來去封閉。所得的序列是TALSDKQTA，它與來自葡聚糖裂解酶1的克隆之序列(SEQ.I.D.No.1從位置51至59的序列)相匹配，表明葡聚糖裂解酶1的N末端殘基是N-乙酰蘇氨酸。SEQ.I.D.No.1位置1至50的序列表述信號序列。4.編碼來自被直菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因的DNA測序4.1分子生物學(xué)方法按Saunders(1993)所述，經(jīng)下述修改來分離DNA以ELUTIP-d(Schleicher & Schuell)純化代替凝膠純化從DNA中去掉多糖。(參見Saunders，G.W.(1993).Gel Purification of redalgal genomic DNAAn inexpensive and rapid method for theisolation of PCR-friendly DNA.Journal of phycology 29(2)251-254 and Schleicher & SchuellELUTIP-d.Rapid Methodfor Purification and Concentration of DNA。)4.2PCR使用Gene Amp DNA擴增試劑盒(Perkin Elmer Cetus，美國)并按照廠商說明書制備有關(guān)DNA分子，不同的是Taq聚合酶較晚加入(見PCR循環(huán))并將溫度循環(huán)變成如下方式PCR循環(huán)循環(huán)次數(shù) C 時間(分)198 560 5加入Taq聚合酶和油35 94 147 272 3172 204.3PCR片段的克隆按照提供者的說明將PCR片段克隆進pT7Blue(來自Novagen)。4.4DNA測序基本上按照Sanger等(1979)的雙脫氧法使用自動閱讀測序試劑盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA序列儀測序雙鏈DNA.(參見Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467.)。
序列如SEQ.I.D.No.3和4所示，其中SEQ.I.D.No.3具有總堿基數(shù)為3267DNA序列組成850A；761C；871G；785TSEQ.I.D.No.4具有總堿基數(shù)3276DNA序列組成889A；702C；856G；829T4.5文庫的篩選除了預(yù)雜交和雜交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml變性鮭精DNA中進行外，按照廠商說明書對來自Stratagene的λZap文庫進行篩選。向雜交溶液中加入32P標(biāo)記的變性探針。在55℃進行雜交過夜。濾膜在2×SSC，0.1％SDS中洗兩次在1×SSC，0.1％SDS中洗兩次。4.6探針經(jīng)過用合適的限制性酶消化從pT7 blue載體中分離已克隆的PCR片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離片段并用Agarase(BoehringerMannheim)從瓊脂糖中純化片段。由于片段僅為90-240bp長，因此在使用Prime-It隨機引物試劑盒(Stratagene)或Ready to GoDNA標(biāo)記試劑盒(Pharmacia)以32P-dCTP標(biāo)記前要對分離的片段進行連接反應(yīng)。4.7結(jié)果4.7.1編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的PGR DNA片段的產(chǎn)生來自α-1，4-葡聚糖裂解酶的三個重疊的胰酶消化肽的氨基酸序列可用于產(chǎn)生混合的寡核苷酸，該寡核苷酸可用作PCR引物(見上面給出的序列)。
在第一次PCR擴增中，引物A/B(見上面)用作上游引物，引物C(見上面)用作下游引物。預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小為71堿基對。
在第二次PCR擴增中，引物A/B用作上游引物，引物E用作下游引物。預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小為161個堿基對。
在第三次PGR擴增中，引物F1(見上面)和F2(見上面)用作上游引物，引物E用作下游引物。預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小為238個堿基對。在2％ LMT瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，從凝膠上切下預(yù)期大小的片段并用Agarase(Boehringer Manheim)處理，克隆進pT7blue載體(Novagen)并測序。
來自第一次和第二次PCR擴增的克隆片段編碼相應(yīng)于測序肽的氨基酸(見上面)。來自第三次擴增的克隆(見上面)與測序肽僅有大約87％的同源性。4.7.2用克隆的PCR片段篩選基因組文庫用上述克隆篩選文庫得到了兩個克隆。一個克隆含核苷酸序列SEQ.I.D.No.4(基因2)。另一克隆含SEQ.I.D.No.3的一些序列(從堿基對1065往下)(基因1)。
使用Gibco BRL的5′race系統(tǒng)以RACE(cDNA末端的快速擴增)方法(Michael A.F.，Michael，K.D.& Martin，G.R.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858998-99002.)獲得SEQ.I.D.No.3的5′末端(即從堿基對1064往上)。根據(jù)Collinge等的方法(Collinge，D.B.，Milligan D.E，Dow，J.M.，Scofield，G.& Daniels，M.J.(1987)，Plant Mol Biol 8405-414)分離總RNA。根據(jù)廠商的方案，使用1μg總RNA進行5′race。根據(jù)廠商的方案將第二次擴增的PCR產(chǎn)物克隆進Novagen的pT 7blue載體。測序三種獨立的PCR克隆以補正PCR錯誤。
進行另一次PCR以給剛描述的克隆在緊接ATG起始密碼子前面增補XbaI和NdeI限制性位點，該PCR使用下述寡核苷酸作為上游引物GCTCTAGAGCATGTTTTCAACCCTTGCG，使用含序列GL1(即SEQ.I.D.No.3)中bp 1573-1593的互補序列的引物作為下游引物。
基因1(即SEQ.I.D.No.3)的完整序列的產(chǎn)生是經(jīng)過將基因組克隆中作為BamHI-HindIII片段的基因3′端克隆進Stratagene的pBluescriptII KS+載體中并再將PCR產(chǎn)生的作為XbaI-BamHI片段的該基因的5′端克隆到3′端前面。
以HindIII平整末端片段的形式將基因2克隆進StratagenepBluescriptII SK+載體的EcoRV位點。經(jīng)SacI消化去掉部分3′非翻譯序列，接著重新連接。經(jīng)過用HindIII和NarI消化并在下述退火寡核苷酸存在的條件下重新連接將HindIII和HpaI限制性位點導(dǎo)入緊靠起始ATG之前處。
AGCTTGTTAACATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGGACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC在測序的克隆中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子。
克隆1類型(SEQ.ID.No.3)與所有10個肽序列(見圖8)的序列對比表現(xiàn)出100％相同性。由從被真菌感染的藻類Gracilariopsis lemaneiformis中分離的基因編碼的兩種蛋白質(zhì)序列對比表現(xiàn)出約78％的相同性，表明兩種基因都編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶。5.GL基因在微生物中的表達(例如畢赤氏酵母屬裂解酶轉(zhuǎn)化子和曲霉屬裂解酶轉(zhuǎn)化子的分析)將編碼GL的DNA序列導(dǎo)入微生物中以生產(chǎn)高比活性和高產(chǎn)量的酶。
在這點上，將基因1(即SEQ.I.D.No.3)以NotI-HindIII平整末端(使用Amersham International的DNA平整末端形成試劑盒)片段的形式克隆進用EcoRI消化且平整末端化(使用AmershamInternational的DNA平整末端形成試劑盒)的畢赤氏酵母屬表達載體pHIL-D2(含AOX1啟動子)中以便在Pichia pastoris中表達(根據(jù)Invitrogen提供的畢赤氏酵母屬表達試劑盒中描述的方案進行)。
在另一實施方案中，將基因1(即SEQ.I.D.No.3)以NotI-HindIII鈍端化片段的形式(使用Amersham International DNA鈍端形成試劑盒)克隆進用SmaI消化的曲霉屬表達載體pBARMTE1(含有來自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性啟動子)中以便在黑色曲霉中表達(Pall et al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40Page 59-62)。根據(jù)Daboussi等(Curr Genet(1989)vol.15pp453-456)的方法使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制備原生質(zhì)體。隨后根據(jù)Buxton等(Gene(1985)Vol.37pp207-214)所述的方案進行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，除了使用了Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)描述的方案進行涂布轉(zhuǎn)化了的原生質(zhì)體并使用0.6％滲透穩(wěn)定的上層瓊脂糖。
結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化的Pichia pastoris和黑色曲霉中觀測到裂解酶活性。5.1一般方法無細胞提取物的制備。
以9000rpm離心5分鐘收獲細胞，用0.9％ NaCl洗滌并重懸于破碎緩沖液(50mM磷酸鉀鹽，pH7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和渦旋處理破碎細胞。破碎緩沖液含1mM PMSF(蛋白酶抑制劑)。以9000rpm離心5分鐘后接著以20,000×g離心5分鐘獲得裂解酶提取物(上清)。
以堿性3，5-二硝基水楊酸試劑(DNS)測試裂解酶的活性。
將1體積的裂解酶提取物與等體積4％的支鏈淀粉溶液混合。然后在控制的溫度下保溫反應(yīng)混合物，以特定的間隔取樣并分析AF。
也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
反應(yīng)混合物含10μl14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反應(yīng)混合物在25℃放置過夜，然后在常規(guī)TLC系統(tǒng)中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)檢測產(chǎn)生的放射活性AF。
電泳和Western印跡。
使用8-25％梯度凝膠和Phast System(Pharmacia)進行SDS-PAGE。也在PhastSystem的Semidry轉(zhuǎn)移單位上進行Western印跡。
1∶100稀釋第一抗體，此抗體是抗純化的從青島(中國)收集的紅海藻中分離的裂解酶的。與堿性磷酸酶連接的豬抗兔IgG(DakoA/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗體并以1∶1000的稀釋度被使用。I部分，含上述構(gòu)建體的畢赤氏酵母屬轉(zhuǎn)化子的分析結(jié)果1.誘導(dǎo)5天后測定裂解酶活性(根據(jù)手冊)并證實B系列的所有樣品活性都是細胞內(nèi)的。B系列樣品11 12 13 15 26 27 28 29 30比活 139 81 122 192 151 253 199 198 150*比活定義為在含2％(w/v)糖原，1％(w/v)甘油，10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)的反應(yīng)混合物中每mg蛋白質(zhì)每分鐘釋放的AFnmol數(shù)。反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時間為60分鐘。
樣品B27時間進程如下。該資料也在圖1中提供。時間(分) 0 10 20 30 40 50 60比活 0 18 54 90 147 179 253除時間改變外，試驗條件如上。2.Western-印跡分析。
所有樣品的CFE顯示出具有與天然裂解酶相應(yīng)分子量的帶。在Pichia pastoris中細胞內(nèi)表達的MC-裂解酶培養(yǎng)物名稱 比活*A1810A2032A218A228A246II部分.曲霉屬轉(zhuǎn)化子結(jié)果I.培養(yǎng)(含0.2％酪蛋白的酶水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)5天后測定裂解酶活性，以堿性3，5-二硝基水楊酸試劑分析。1).培養(yǎng)基裂解酶活性的分析在生長于含0.2％支鏈淀粉的培養(yǎng)基中的35個培養(yǎng)物中，僅在兩個培養(yǎng)物中可檢測到AF。5.4+和5.9+培養(yǎng)基分別含0.13g AF/升和0.44g AF/升。結(jié)果表明細胞分泌了有活性的裂解酶。在無細胞提取物中也可測出裂解酶活性。2).在無細胞提取物中分析裂解酶活性培養(yǎng)物名稱比活*5.4+ 515.9+ 1485.13 995.15 255.19 37*比活定義為在25℃每mg蛋白質(zhì)每分鐘產(chǎn)生的AF nmol數(shù)。+表示加入0.2％支鏈淀粉。
結(jié)果表明GL的基因1在黑色曲霉細胞內(nèi)表達。
轉(zhuǎn)化的E.coli實驗(使用Qiagen的Qia表達載體試劑盒的克隆載體pQE30)表明，表達出了能被抗從真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis中純化的酶的抗體識別的酶。
除了黑色曲霉作為宿主外，也可使用已知具有良好表達系統(tǒng)的其它重要的工業(yè)微生物，如米曲霉，曲霉屬種類，木霉屬種類，啤酒糖酵母，克魯維氏酵母屬種類，漢遜氏酵母屬種類，畢赤氏酵母屬種類，枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，芽孢桿菌屬種類，鏈霉屬種類或大腸桿菌。
本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方案包括下列之任一個一種由于導(dǎo)入本文所述的DNA序列而具有產(chǎn)生AF能力的轉(zhuǎn)化的宿主生物體；這種轉(zhuǎn)化的宿主生物體是一種微生物，其中優(yōu)選宿主生物體選自由細菌，霉菌，真菌和酵母組成的類群中；優(yōu)選宿主生物體選自由糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，曲霉屬，漢遜氏酵母屬，畢赤氏酵母屬，芽孢桿菌屬，鏈霉菌屬，大腸桿菌屬組成的類群中，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，大腸桿菌；一種制備1，5-D-脫水果糖的方法，包含將α-1，4-葡聚糖(例如淀粉)與轉(zhuǎn)化宿主生物體表達的α-1，4-葡聚糖裂解酶接觸。該生物體含有編碼該酶的核苷酸序列，其中優(yōu)選核苷酸序列是DNA序列，優(yōu)選其中的DNA序列是上文所述的序列之一；一種插入了上文所述核苷酸序列的載體，優(yōu)選其中載體是一種復(fù)制載體，優(yōu)選其中的載體是含有在啟動子序列下游的核苷酸序列的表達載體，該載體優(yōu)選含有一個標(biāo)記(如抗性標(biāo)記)；用該載體轉(zhuǎn)化的細胞生物體，或細胞系；一種產(chǎn)生α-1，4-葡聚糖裂解酶或編碼該酶的任意核苷酸序列或其部分之產(chǎn)物的方法，包含培養(yǎng)用該載體轉(zhuǎn)染的該生物體(或來自細胞系的細胞)并回收該產(chǎn)物。
不偏離本發(fā)明的范圍對本發(fā)明進行的其它修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。
序列描述(1)一般資料(i)申請人(A)名稱DANISCO A/S(B)街道Langebrogade 1(C)城市Copenhagen(D)州Copenhagen K(E)國家丹麥(F)郵編(編碼)DK-1001(ii)發(fā)明題目酶(iii)序列號20(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容性(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version#1.25(EPO)(v)本申請資料申請?zhí)朩O PCT/EP94/03399(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度1088氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Thr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala20 25 30Phe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val35 40 45Ser Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr50 55 60Asp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val65 70 75 80Trp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser85 90 95Ser Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn100 105 110Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln115 120 125Val Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn130 135 140Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln145 150 155 160Gln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp Pro165 170 175Gly Met Thr Phe Thr Ser Glu Gly Phe Leu Thr Phe Glu Thr Lys Asp180 185 190Leu Ser Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg Lys195 200 205Ser Asp Gly Lys Val Ile Met Glu Asn Asp Glu Val Gly Thr Ala Ser210 215 220Ser Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr Gly225 230 235 240Asn Ala Ile Ala Ser Val Asn Lys Asn Phe Arg Asn Asp Ala Val Lys245 250 255Gln Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Lys Tyr Gln Asp260 265 270Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr275 280 285Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Leu Arg Pro Pro His His Asp290 295 300Gly Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr Tyr Ala Ala Pro305 310 315 320Trp Leu Ile Val Asn Gly Cys Ala Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Tyr325 330 335Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met Asn Thr Gly Asp340 345 350Thr Thr Trp Asn Ser Gly Gln Glu Asp Leu Ala Tyr Met Gly Ala Gln355 360 365Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Ala Gly Gly Gly Met370 375 380Glu Cys Val Val Thr Ala Phe Ser Leu Leu Gln Gly Lys Glu Phe Glu385 390 395 400Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro Lys Tyr Val Phe405 410 415Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Thr Ser Ser Leu Leu Arg Ala His420 425 430Met Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Glu Glu Ile Val Glu Gly435 440 445Tyr Gln Asn Asn Asn Phe Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val Asp Val Asp450 455 460Met Gln Asp Asn Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Gly Glu Phe Trp Thr465 470 475 480Ala Asn Arg Val Gly Thr Gly Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ser Val Phe485 490 495Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn Ile Thr Cys500 505 510Phe Leu Arg Asn Asp Asn Glu Gly Gln Asp Tyr Glu Val Asn Gln Thr515 520 525Leu Arg Glu Arg Gln Leu Tyr Thr Lys Asn Asp Ser Leu Thr Gly Thr530 535 540Asp Phe Gly Met Thr Asp Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly His545 550 555 560Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp Trp565 570 575Gly Arg Pro Asp Val Ala Glu Trp Trp Gly Asn Asn Tyr Lys Lys Leu580 585 590Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met Thr Val Pro Ala595 600 605Met Met Pro His Lys Ile Gly Asp Asp Ile Asn Val Lys Pro Asp Gly610 615 620Asn Trp Pro Asn Ala Asp Asp Pro Ser Asn Gly Gln Tyr Asn Trp Lys625 630 635 640Thr Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp Met Arg Tyr Glu Asn His645 650 655Gly Arg Glu Pro Met Val Thr Gln Arg Asn Ile His Ala Tyr Thr Leu660 665 670Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val Glu Asn Ala Asp Thr Leu675 680 685Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Gly690 695 700Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly Asp Asn Ser Thr Thr Ser705 710 715 720Asn Tyr Ile Gln Met Met Ile Ala Asn Asn Ile Asn Met Asn Met Ser725 730 735Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Asp740 745 750Asn Glu Asn Gln Arg Thr Pro Cys Thr Gly Asp Leu Met Val Arg Tyr755 760 765Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His Tyr Asp Arg770 775 780Trp Ile Glu Ser Lys Asp His Gly Lys Asp Tyr Gln Glu Leu Tyr Met785 790 795 800Tyr Pro Asn Glu Met Asp Thr Leu Arg Lys Phe Val Glu Phe Arg Tyr805 810 815Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe820 825 830Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn835 840 845Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly850 855 860Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg865 870 875 880Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro Asp885 890 895Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala Met Asn Gly Gly Asp Arg Ile900 905 910Tyr Asn Tyr Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Pro Ile Phe Val Arg Glu915 920 925Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asn Gly Glu Asn Lys Ser930 935 940Leu Asn Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro945 950 955 960Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp Asp Gly Gly965 970 975Val Thr Thr Asn Ala Glu Asp Asn Gly Lys Phe Ser Val Val Lys Val980 985 990Ala Ala Glu Gln Asp Gly Gly Thr Glu Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asp995 10001005Cys Tyr Glu Tyr Val Phe Gly Gly Pro Phe Tyr Val Arg Val Arg Gly101010151020Ala Gln Ser Pro Ser Asn Ile His Val Ser Ser Gly Ala Gly Ser Gln1025103010351040Asp Met Lys Val Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ala Leu Phe Asn Asp104510501055Gly Glu Asn Gly Asp Phe Trp Val Asp Gln Glu Thr Asp Ser Leu Trp106010651070Leu Lys Leu Pro Asn Val Val Leu Pro Asp Ala Val Ile Thr Ile Thr107510801085(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度1091氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Tyr Pro Thr Leu Thr Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Arg1 5 10 15Thr Phe Thr Cys Val Gly Ile Phe Arg Ser His Ile Leu Ile His Ser20 25 30Val Val Pro Ala Val Arg Leu Ala Val Arg Lys Ser Asn Arg Leu Asn35 40 45Val Ser Met Ser Ala Leu Phe Asp Lys Pro Thr Ala Val Thr Gly Gly50 55 60Lys Asp Asn Pro Asp Asn Ile Asn Tyr Thr Thr Tyr Asp Tyr Val Pro65 70 75 80Val Trp Arg Phe Asp Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly85 90 95Ser Ser Thr Pro Gly Asp Ile Asp Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val100 105 110Asn Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Phe Thr Leu Glu Lys Pro Val115 120 125Gln Val Gln Val Thr Ser Tyr Lys Asn Asn Cys Phe Arg Val Arg Phe130 135 140Asn Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Asp Arg Gly Pro Ile Leu Gln145 150 155 160Gln Gln Leu Asn Trp Ile Arg Lys Gln Glu Gln Ser Lys Gly Phe Asp165 170 175Pro Lys Met Gly Phe Thr Lys Glu Gly Phe Leu Lys Phe Glu Thr Lys180 185 190Asp Leu Asn Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg195 200 205Lys Arg Asp Gly Lys Gly Ile Met Glu Asn Asn Glu Val Pro Ala Gly210 215 220Ser Leu Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr225 230 235 240Gly Thr Ala Ile Ala Ser Val Asn Glu Asn Tyr Arg Asn Asp Pro Asp245 250 255Arg Lys Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Glu Phe Trp260 265 270Asp Ser Glu Gln Asn Arg Asn Lys Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile275 280 285Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp290 295 300Leu Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro A5n Phe Tyr Ile Pro Met305 310 315 320Tyr Phe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser325 330 335Asp Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr340 345 350Tyr Met Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu355 360 365Ala Tyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr370 375 380Gly Asp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu385 390 395 400Gln Gly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met405 410 415Pro Pro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala420 425 430Ser Leu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val435 440 445Gln Glu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly450 455 460Leu Ala Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr465 470 475 480Lys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser485 490 495Asn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys500 505 510Gln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp515 520 525Tyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn530 535 540Asp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Ser545 550 555 560Asp Ala Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp565 570 575Ala Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly580 585 590Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln595 600 605Asp Met Thr Val Pro Ala Met Met Pro His Lys Val Gly Asp Ala Val610 615 620Asp Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Trp Pro Asn Glu Asn Asp Pro Ser Asn625 630 635 640Gly Arg Tyr Asn Trp Lys Ser Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp645 650 655Met Arg Tyr Glu Asn His Gly Arg Glu Pro Met Phe Thr Gln Arg Asn660 665 670Met His Ala Tyr Thr Leu Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val675 680 685Ala Asn Ala Asp Thr Leu Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser690 695 700Arg Gly Gly Tyr Ile Gly Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly705 710 715 720Asp Asn Ser Ser Ser Gln Arg Tyr Leu Gln Met Met Ile Ala Asn Ile725 730 735Val Asn Met Asn Met Ser Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly740 745 750Gly Phe Thr Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Val Cys Pro Gly Asp Leu Met755 760 765Val Arg Phe Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His770 775 780Tyr Gly Arg Leu Val Glu Gly Lys Gln Glu Gly Lys Tyr Tyr Gln Glu785 790 795 800Leu Tyr Met Tyr Lys Asp Glu Met Ala Thr Leu Arg Lys Phe Ile Glu805 810 815Phe Arg Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn820 825 830Ala Ala Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn835 840 845Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly850 855 860His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr865 870 875 880Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe885 890 895Gly Pro Asp Tyr Asp Thr Lys Arg Leu Asp Ser Ala Leu Asp Gly Gly900 905 910Gln Met Ile Lys Asn Tyr Ser Val Pro Gln Ser Asp Ser Pro Ile Phe915 920 925Val Arg Glu Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Gly Ser930 935 940Asn Lys Ser Met Asn Thr Tyr Thr Asp Lys Asp Pro Leu Val Phe Glu945 950 955 960Val Phe Pro Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp965 970 975Asp Gly Gly Ile Thr Thr Asp Ala Glu Asp His Gly Lys Phe Ser Val980 985 990Ile Asn Val Glu Ala Leu Arg Lys Gly Val Thr Thr Thr Ile Lys Phe995 10001005Ala Tyr Asp Thr Tyr Gln Tyr Val Phe Asp Gly Pro Phe Tyr Val Arg101010151020Ile Arg Asn Leu Thr Thr Ala Ser Lys Ile Asn Val Ser Ser Gly Ala1025103010351040Gly Glu Glu Asp Met Thr Pro Thr Ser Ala Asn Ser Arg Ala Ala Leu104510501055Phe Ser Asp Gly Gly Val Gly Glu Tyr Trp Ala Asp Asn Asp Thr Ser106010651070Ser Leu Trp Met Lys Leu Pro Asn Leu Val Leu Gln Asp Ala Val Ile107510801085Thr Ile Thr1090(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度3267堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGTTTTCAA CCCTTGCGTT TGTCGCACCT AGTGCGCTGG GAGCCAGTAC CTTCGTAGGG 60GCGGAGGTCA GGTCAAATGT TCGTATCCAT TCCGCTTTTC CAGCTGTGCA CACAGCTACT 120CGCAAAACCA ATCGCCTCAA TGTATCCATG ACCGCATTGT CCGACAAACA AACGGCTACT 180GCGGGTAGTA CAGACAATCC GGACGGTATC GACTACAAGA CCTACGATTA CGTCGGAGTA 240TGGGGTTTCA GCCCCCTCTC CAACACGAAC TGGTTTGCTG CCGGCTCTTC TACCCCGGGT 300GGCATCACTG ATTGGACGGC TACAATGAAT GTCAACTTCG ACCGTATCGA CAATCCGTCC 360ATCACTGTCC AGCATCCCGT TCAGGTTCAG GTCACGTCAT ACAACAACAA CAGCTACAGG 420GTTCGCTTCA ACCCTGATGG CCCTATTCGT GATGTGACTC GTGGGCCTAT CCTCAAGCAG 480CAACTAGATT GGATTCGAAC GCAGGAGCTG TCAGAGGGAT GTGATCCCGG AATGACTTTC 540ACATCAGAAG GTTTCTTGAC TTTTGAGACC AAGGATCTAA GCGTCATCAT CTACGGAAAT 600TTCAAGACCA GAGTTACGAG AAAGTCTGAC GGCAAGGTCA TCATGGAAAA TGATGAAGTT 660GGAACTGCAT CGTCCGGGAA CAAGTGCCGG GGATTGATGT TCGTTGATAG ATTATACGGT 720AACGCTATCG CTTCCGTCAA CAAGAACTTC CGCAACGACG CGGTCAAGCA GGAGGGATTC 780TATGGTGCAG GTGAAGTCAA CTGTAAGTAC CAGGACACCT ACATCTTAGA ACGCACTGGA 840ATCGCCATGA CAAATTACAA CTACGATAAC TTGAACTATA ACCAGTGGGA CCTTAGACCT 900CCGCATCATG ATGGTGCCCT CAACCCAGAC TATTATATTC CAATGTACTA CGCAGCACCT 960TGGTTGATCG TTAATGGATG CGCCGGTACT TCGGAGCAGT ACTCGTATGG ATGGTTCATG1020GACAATGTCT CTCAATCTTA CATGAATACT GGAGATACTA CCTGGAATTC TGGACAAGAG1080GACCTGGCAT ACATGGGCGC GCAGTATGGA CCATTTGACC AACATTTTGT TTACGGTGCT1140GGGGGTGGGA TGGAATGTGT GGTCACAGCG TTCTCTCTTC TACAAGGCAA GGAGTTCGAG1200AACCAAGTTC TCAACAAACG TTCAGTAATG CCTCCGAAAT ACGTCTTTGG TTTCTTCCAG1260GGTGTTTTCG GGACTTCTTC CTTGTTGAGA GCGCATATGC CAGCAGGTGA GAACAACATC1320TCAGTCGAAG AAATTGTAGA AGGTTATCAA AACAACAATT TCCCTTTCGA GGGGCTCGCT1380GTGGACGTGG ATATGCAAGA CAACTTGCGG GTGTTCACCA CGAAGGGCGA ATTTTGGACC1440GCAAACAGGG TGGGTACTGG CGGGGATCCA AACAACCGAT CGGTTTTTGA ATGGGCACAT1500GACAAAGGCC TTGTTTGTCA GACAAATATA ACTTGCTTCC TGAGGAATGA TAACGAGGGG1560CAAGACTACG AGGTCAATCA GACGTTAAGG GAGAGGCAGT TGTACACGAA GAACGACTCC1620CTGACGGGTA CGGATTTTGG AATGACCGAC GACGGCCCCA GCGATGCGTA CATCGGTCAT1680CTGGACTATG GGGGTGGAGT AGAATGTGAT GCACTTTTCC CAGACTGGGG ACGGCCTGAC1740GTGGCCGAAT GGTGGGGAAA TAACTATAAG AAACTGTTCA GCATTGGTCT CGACTTCGTC1800TGGCAAGACA TGACTGTTCC AGCAATGATG CCGCACAAAA TTGGCGATGA CATCAATGTG1860AAACCGGATG GGAATTGGCC GAATGCGGAC GATCCGTCCA ATGGACAATA CAACTGGAAG1920ACGTACCATC CCCAAGTGCT TGTAACTGAT ATGCGTTATG AGAATCATGG TCGGGAACCG1980ATGGTCACTC AACGCAACAT TCATGCGTAT ACACTGTGCG AGTCTACTAG GAAGGAAGGG2040ATCGTGGAAA ACGCAGACAC TCTAACGAAG TTCCGCCGTA GCTACATTAT CAGTCGTGGT2100GGTTACATTG GTAACCAGCA TTTCGGGGGT ATGTGGGTGG GAGACAACTC TACTACATCA2160AACTACATCC AAATGATGAT TGCCAACAAT ATTAACATGA ATATGTCTTG CTTGCCTCTC2220GTCGGCTCCG ACATTGGAGG ATTCACCTCA TACGACAATG AGAATCAGCG AACGCCGTGT2280ACCGGGGACT TGATGGTGAG GTATGTGCAG GCGGGCTGCC TGTTGCCGTG GTTCAGGAAC2340CACTATGATA GGTGGATCGA GTCCAAGGAC CACGGAAAGG ACTACCAGGA GCTGTACATG2400TATCCGAATG AAATGGATAC GTTGAGGAAG TTCGTTGAAT TCCGTTATCG CTGGCAGGAA2460GTGTTGTACA CGGCCATGTA CCAGAATGCG GCTTTCGGAA AGCCGATTAT CAAGGCTGCT2520TCGATGTACA ATAACGACTC AAACGTTCGC AGGGCGCAGA ACGATCATTT CCTTCTTGGT2580GGACATGATG GATATCGCAT TCTGTGCGCG CCTGTTGTGT GGGAGAATTC GACCGAACGC2640GAATTGTACT TGCCCGTGCT GACCCAATGG TACAAATTCG GTCCCGACTT TGACACCAAG2700CCTCTGGAAG GAGCGATGAA CGGAGGGGAC CGAATTTACA ACTACCCTGT ACCGCAAAGT2760GAATCACCAA TCTTCGTGAG AGAAGGTGCG ATTCTCCCTA CCCGCTACAC GTTGAACGGT2820GAAAACAAAT CATTGAACAC GTACACGGAC GAAGATCCGT TGGTGTTTGA AGTATTCCCC2880CTCGGAAACA ACCGTGCCGA CGGTATGTGT TATCTTGATG ATGGCGGTGT GACCACCAAT2940GCTGAAGACA ATGGCAAGTT CTCTGTCGTC AAGGTGGCAG CGGAGCAGGA TGGTGGTACG3000GAGACGATAA CGTTTACGAA TGATTGCTAT GAGTACGTTT TCGGTGGACC GTTCTACGTT3060CGAGTGCGCG GCGCTCAGTC GCCGTCGAAC ATCCACGTGT CTTCTGGAGC GGGTTCTCAG3120GACATGAAGG TGAGCTCTGC CACTTCCAGG GCTGCGCTGT TCAATGACGG GGAGAACGGT3180GATTTCTGGG TTGACCAGGA GACAGATTCT CTGTGGCTGA AGTTGCCCAA CGTTGTTCTC3240CCGGACGCTG TGATCACAAT TACCTAA3267(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度3276堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4ATGTATCCAA CCCTCACCTT CGTGGCGCCT AGTGCGCTAG GGGCCAGAAC TTTCACGTGT 60GTGGGCATTT TTAGGTCACA CATTCTTATT CATTCGGTTG TTCCAGCGGT GCGTCTAGCT 120GTGCGCAAAA GCAACCGCCT CAATGTATCC ATGTCCGCTT TGTTCGACAA ACCGACTGCT 180GTTACTGGAG GGAAGGACAA CCCGGACAAT ATCAATTACA CCACTTATGA CTACGTCCCT 240GTGTGGCGCT TCGACCCCCT CAGCAATACG AACTGGTTTG CTGCCGGATC TTCCACTCCC 300GGCGATATTG ACGACTGGAC GGCGACAATG AATGTGAACT TCGACCGTAT CGACAATCCA 360TCCTTCACTC TCGAGAAACC GGTTCAGGTT CAGGTCACGT CATACAAGAA CAATTGTTTC 420AGGGTTCGCT TCAACCCTGA TGGTCCTATT CGCGATGTGG ATCGTGGGCC TATCCTCCAG 480CAGCAACTAA ATTGGATCCG GAAGCAGGAG CAGTCGAAGG GGTTTGATCC TAAGATGGGC 540TTCACAAAAG AAGGTTTCTT GAAATTTGAG ACCAAGGATC TGAACGTTAT CATATATGGC 600AATTTTAAGA CTAGAGTTAC GAGGAAGAGG GATGGAAAAG GGATCATGGA GAATAATGAA 660GTGCCGGCAG GATCGTTAGG GAACAAGTGC CGGGGATTGA TGTTTGTCGA CAGGTTGTAC 720GGCACTGCCA TCGCTTCCGT TAATGAAAAT TACCGCAACG ATCCCGACAG GAAAGAGGGG 780TTCTATGGTG CAGGAGAAGT AAACTGCGAG TTTTGGGACT CCGAACAAAA CAGGAACAAG 840TACATCTTAG AACGAACTGG AATCGCCATG ACAAATTACA ATTATGACAA CTATAACTAC 900AACCAGTCAG ATCTTATTGC TCCAGGATAT CCTTCCGACC CGAACTTCTA CATTCCCATG 960TATTTTGCAG CACCTTGGGT AGTTGTTAAG GGATGCAGTG GCAACAGCGA TGAACAGTAC1020TCGTACGGAT GGTTTATGGA TAATGTCTCC CAAACTTACA TGAATACTGG TGGTACTTCC1080TGGAACTGTG GAGAGGAGAA CTTGGCATAC ATGGGAGCAC AGTGCGGTCC ATTTGACCAA1140CATTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGTCTT GAGGATGTTG TCCAAGCGTT CTCTCTTCTG1200CAAGGCAAAG AGTTTGAGAA CCAAGTTCTG AACAAACGTG CCGTAATGCC TCCGAAATAT1260GTGTTTGGTT ACTTTCAGGG AGTCTTTGGG ATTGCTTCCT TGTTGAGAGA GCAAAGACCA1320GAGGGTGGTA ATAACATCTC TGTTCAAGAG ATTGTCGAAG GTTACCAAAG CAATAACTTC1380CCTTTAGAGG GGTTAGCCGT AGATGTGGAT ATGCAACAAG ATTTGCGCGT GTTCACCACG1440AAGATTGAAT TTTGGACGGC AAATAAGGTA GGCACCGGGG GAGACTCGAA TAACAAGTCG1500GTGTTTGAAT GGGCACATGA CAAAGGCCTT GTATGTCAGA CGAATGTTAC TTGCTTCTTG1560AGAAACGACA ACGGCGGGGC AGATTACGAA GTCAATCAGA CATTGAGGGA GAAGGGTTTG1620TACACGAAGA ATGACTCACT GACGAACACT AACTTCGGAA CTACCAACGA CGGGCCGAGC1680GATGCGTACA TTGGACATCT GGACTATGGT GGCGGAGGGA ATTGTGATGC ACTTTTCCCA1740GACTGGGGTC GACCGGGTGT GGCTGAATGG TGGGGTGATA ACTACAGCAA GCTCTTCAAA1800ATTGGTCTGG ATTTCGTCTG GCAAGACATG ACAGTTCCAG CTATGATGCC ACACAAAGTT1860GGCGACGCAG TCGATACGAG ATCACCTTAC GGCTGGCCGA ATGAGAATGA TCCTTCGAAC1920GGACGATACA ATTGGAAATC TTACCATCCA CAAGTTCTCG TAACTGATAT GCGATATGAG1980AATCATGGAA GGGAACCGAT GTTCACTCAA CGCAATATGC ATGCGTACAC ACTCTGTGAA2040TCTACGAGGA AGGAAGGGAT TGTTGCAAAT GCAGACACTC TAACGAAGTT CCGCCGCAGT2100TATATTATCA GTCGTGGAGG TTACATTGGC AACCAGCATT TTGGAGGAAT GTGGGTTGGA2160GACAACTCTT CCTCCCAAAG ATACCTCCAA ATGATGATCG CGAACATCGT CAACATGAAC2220ATGTCTTGCC TTCCACTAGT TGGGTCCGAC ATTGGAGGTT TTACTTCGTA TGATGGACGA2280AACGTGTGTC CCGGGGATCT AATGGTAAGA TTCGTGCAGG CGGGTTGCTT ACTACCGTGG2340TTCAGAAACC ACTATGGTAG GTTGGTCGAG GGCAAGCAAG AGGGAAAATA CTATCAAGAA2400CTGTACATGT ACAAGGACGA GATGGCTACA TTGAGAAAAT TCATTGAATT CCGTTACCGC2460TGGCAGGAGG TGTTGTACAC TGCTATGTAC CAGAATGCGG CTTTCGGGAA ACCGATTATC2520AAGGCAGCTT CCATGTACGA CAACGACAGA AACGTTCGCG GCGCACAGGA TGACCACTTC2580CTTCTCGGCG GACACGATGG ATATCGTATT TTGTGTGCAC CTGTTGTGTG GGAGAATACA2640ACCAGTCGCG ATCTGTACTT GCCTGTGCTG ACCAAATGGT ACAAATTCGG CCCTGACTAT2700GACACCAAGC GCCTGGATTC TGCGTTGGAT GGAGGGCAGA TGATTAAGAA CTATTCTGTG2760CCACAAAGCG ACTCTCCGAT ATTTGTGAGG GAAGGAGCTA TTCTCCCTAC CCGCTACACG2820TTGGACGGTT CGAACAAGTC AATGAACACG TACACAGACA AAGACCCGTT GGTGTTTGAG2880GTATTCCCTC TTGGAAACAA CCGTGCCGAC GGTATGTGTT ATCTTGATGA TGGCGGTATT2940ACTACAGATG CTGAGGACCA TGGCAAATTC TCTGTTATCA ATGTCGAAGC CTTACGGAAA3000GGTGTTACGA CGACGATCAA GTTTGCGTAT GACACTTATC AATACGTATT TGATGGTCCA3060TTCTACGTTC GAATCCGTAA TCTTACGACT GCATCAAAAA TTAACGTGTC TTCTGGAGCG3120GGTGAAGAGG ACATGACACC GACCTCTGCG AACTCGAGGG CAGCTTTGTT CAGTGATGGA3180GGTGTTGGAG AATACTGGGC TGACAATGAT ACGTCTTCTC TGTGGATGAA GTTGCCAAAC3240CTGGTTCTGC AAGACGCTGT GATTACCATT ACGTAG 3276(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度90氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala1 5 10 15Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser20 25 30Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp35 40 45Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu50 55 60Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro65 70 75 80Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala85 90(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征
(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵Misc_區(qū)別(B)位置取代(6，″″)(D)其它資料/注意＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(9，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(12，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(15，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(18，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(21，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO6ATGTANAANA ANGANTCNAA NGT 23(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(6，″″)(D)其它資料/注意＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(9，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(12，″″)
(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(15，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(18，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(21，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO7ATGTANAANA ANGANAGNAA NGT 23(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別
(B)位置取代(3，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(6，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(9，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(12，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(15，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A或T或C”(xi)序列描述SEQ ID NO8TANCCNTCNT GNCCNCC 17(2)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(3，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(6，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(9，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(12，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(18，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO9GGNCCNAANT TNTACCANTG 20(2)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(3，″″)(D)其它資料/注意＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(6，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(12，″″)(D)其它資料/注意＝“N是C或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(15，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO10TANCGNTGGC ANGANGT 17(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(3，″″)(D)其它資料/注意＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(6，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(12，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置取代(15，″″)(D)其它資料/注意＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO11TANAGNTGGC ANGANGT 17(2)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長度71個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGCGGC 60CACGACGGTT A 71(2)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe1 5 10 15Leu Leu Gly Gly His Asp Gly20(2)SEQ ID NO14資料(i)序列特征(A)長度160個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGTGGA 60CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG AGAATTCGAC CGAACGGAAT 120TGTACTTGCC CGTGCTGACC CAATGGTACA AATTCGGCCC 160(2)SEQ ID NO15資料(i)序列特征(A)長度54個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe1 5 10 15Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val20 25 30Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln35 40 45Trp Tyr Lys Phe Gly Pro50(2)SEQ ID NO16資料(i)序列特征(A)長度238個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO16TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA ATGCGGCTTT CGGGAAACCG 60ATTATCAAGG CAGCTTCCAT GTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC 120CACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT GTGCACCTGT TGTGTGGGAG 180AATACAACCA GTCGCGATCT GTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC 238(2)SEQ ID NO17資料(i)序列特征(A)長度79個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala1 5 10 15Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg20 25 30Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp35 40 43Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr Thr Ser50 55 60Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe Gly65 70 75(2)SEQ ID NO18資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18GCTCTAGAGC ATGTTTTCAA CCCTTGCG28(2)SEQ ID NO19資料(i)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO19AGCTTGTTAA CATGTATCCA ACCCTCACCT TCGTGG 36(2)SEQ ID NO；20資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO20ACAATTGTAC ATAGGTTGGG AGTGGAAGCA CCGC 3權(quán)利要求
1.一種制備α-1，4-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包含從被真菌感染的藻類中分離該酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的酶是使用不會被該酶降解的凝膠來分離和/或進一步純化的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的凝膠是以糊精或其衍生物為基礎(chǔ)的，優(yōu)選環(huán)糊精，更優(yōu)選β-環(huán)糊精。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項的方法制備的GL酶。
5.一種包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2或其任一變異體的酶。
6.一種編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的核苷酸序列，其中的序列是DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的核苷酸序列，其中的DNA序列包含與SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.4中任一個相同，或互補，或基本同源，或含任意合適的密碼子取代的序列。
9.一種制備α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，包含表達根據(jù)權(quán)利要求6至8任意一項的核苷酸序列。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求中任意一項的方法，其中的藻類是Gracilariopsis lemaneiformis。
11.β-環(huán)糊精在純化一種酶，優(yōu)選GL中的應(yīng)用。
12.一種核苷酸序列，其中的DNA序列包含與SEQ.ID.NO.3或SEQ.ID.NO.4中任一個相同，或互補，或基本同源，或含任意合適的密碼子取代的序列。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種制備α-1，4-葡聚糖裂解酶的方法，該方法包含從被真菌感染的藻類中分離該酶。測定了該酶的氨基酸序列。還測定了編碼該酶的核酸序列。
文檔編號C12R1/685GK1141062SQ94193792
公開日1997年1月22日 申請日期1994年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月15日
發(fā)明者于書, K·波森, K·M·克拉, M·波科, J·尼爾森, J·馬庫森 申請人:丹尼斯科有限公司