專利名稱：一種新的核有絲分裂磷蛋白核分裂激素的制作方法
背景技術(shù)：
本申請是1993年10月22遞交的美國連續(xù)申請?zhí)?8/141,239的部分繼續(xù)申請，這一申請所有內(nèi)容引入本發(fā)明中作參考。
本發(fā)明是在國家健康研究院提供的政府資助(EYO5758)下完成的。因此，美國政府有本發(fā)明的法權(quán)。
貫穿本申請，各種公開出版物描述于括號內(nèi)。這些參考資料公開的內(nèi)容都引入說明書中作參考。
從一次細(xì)胞分裂到下一次細(xì)胞分裂發(fā)生的過程被編定為細(xì)胞周期。細(xì)胞周期由有絲分裂期(M期)，胞質(zhì)分裂(細(xì)胞分離)，G1或間隙期，合成期或S-期以及最后的G2期組成。
對細(xì)胞分裂進行控制是存在多細(xì)胞的最基本方面之一。未受控制的細(xì)胞生長和分裂產(chǎn)生了在不應(yīng)該進行分裂時發(fā)生分裂的細(xì)胞，結(jié)果產(chǎn)生了稱為腫瘤的相鄰接的細(xì)胞群，這樣的腫瘤是許多癌癥的基礎(chǔ)。
因此，有關(guān)控制或促進細(xì)胞分裂和增殖的機制的信息對于弄明白和征服包括癌癥的許多疾病是重要的。本發(fā)明提供了這樣的信息并且也提供了相關(guān)的優(yōu)點。本發(fā)明簡述本發(fā)明提供了命名為核分裂激素(mitosin)的新的純化蛋白質(zhì)，還提供了核分裂激素的生物活性片段。還提供了利用核分裂激素蛋白質(zhì)和片段的方法，例如制備單克隆抗體的方法。
本發(fā)明還提供了編碼核分裂激素的核酸分子，及其活性片段，該核酸分子可用于重組生產(chǎn)核分裂激素以及用作為探針。
本發(fā)明的組合物和方法是以下列即時發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，即細(xì)胞內(nèi)存在核分裂激素是真核細(xì)胞進入到有絲分裂的M期所必需的，以及核分裂激素的降解是細(xì)胞步入下一階段所必需的。因此，通過阻止細(xì)胞進入M期，抗核分裂激素的抗體，核分裂激素的突變體或其一種非功能類似物抑制了有絲分裂細(xì)胞周期，以及通過阻止細(xì)胞脫離M期，核分裂激素的過量表達(dá)或其功能等同物的過量表達(dá)將抑制該周期。通過加入蛋白質(zhì)或借助于基因治療釋放編碼蛋白質(zhì)的基因或其功能等同物可實現(xiàn)所述過量表達(dá)。附圖簡述

圖1以依賴于細(xì)胞周期的方式表達(dá)核分裂激素mRNA。
(A)利用核分裂激素，RB，E2F-1和Gβ類似物的cDNA作為探針進行RNA印跡分析。按實驗程序中描述的方法以猴腎CV1細(xì)胞作同步對照。按照說明用放射性標(biāo)記的cDNA對從每個樣品中提取的10μg總RNA進行Northern印跡分析。Gβ類似物的RNA的水平在細(xì)胞周期中變化很小，因此用作為內(nèi)對照。泳道1是在G1早期通過lovastatin捕獲的細(xì)胞的RNA(記為‘G0/G1’)。泳道2是在除去lovastatin8小時之后G1晚期細(xì)胞。泳道3是由羥基脲在G1/S分界線捕獲的細(xì)胞。泳道4是在除去羥基脲以及nocodazole雙重封阻之后S期的細(xì)胞。泳道5是在羥基脲以及nocodazole重封阻之后收集的有絲分裂細(xì)胞。泳道6是血清饑餓(0.5％胎牛血清)4天之后的G0細(xì)胞。(B)用光密度計定量檢測每種基因的相對mRNA水平。將各個單個mRNA譜帶規(guī)度化到Gβ因似物的mRNA量以證實細(xì)胞周期期間的表達(dá)模式。
圖2核分裂激素作為350kd的細(xì)胞蛋白質(zhì)遷移用抗核分裂激素的各個抗體(α10Bgl，α10Stu，或者α10C)將1×106旺盛生長的Hela細(xì)胞進行免疫沉淀。在3-12％梯度SDS-PAGE之后，在有(+)或沒有(-)相應(yīng)的抗原競爭劑或麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)(10μg/ml)存在下，將免疫沉淀物與同樣的抗體進行免疫吸印反應(yīng)以證明特異性。圖中顯示了用于生產(chǎn)抗體以及用作為競爭劑的抗原。將從兔骨骼肌制備的樣品也一起上樣。通過用抗伴肌動蛋白的單克隆抗體進行免疫印跡反應(yīng)(Kruger et al.，J.Cell Biol.11597-107(1991))觀察到該肌肉樣品中作為770kd標(biāo)記的伴肌動蛋白的位置。
圖3在M期進程中核分裂激素從核到著絲粒，紡錘體和中體進行重新分布。
猴腎CV1細(xì)胞直接生長于蓋玻片上。在甲醇固定以及用α10C和FITC結(jié)合的抗兔IgG抗體標(biāo)記之后，用激光掃描共焦顯微鏡進行間接免疫熒光顯微鏡觀察。分別疊加或記錄數(shù)字化的光學(xué)橫斷面(紅色)和Normarski微差干涉反襯(DIC)圖象(綠色)。(A1-A4)證實核分裂激素的免疫染色不受MBP(10μg/ml)的影響(A1)，但由相同量的抗原MBP-10消除(A3)。(A2)和(A4)代表相應(yīng)的DIC圖象。(B1-B8)為來自細(xì)胞周期的不同階段的典型細(xì)胞(B1)S或G2期；(B2)晚G2/早前期；(B3)前期；(B4)中期；(B5，B6)后期；(B7，B8)末期；(C1-C8)描述了核分裂激素的著絲粒染色。著絲粒染色不受MBP(10μg/ml)的影響(C1)，但被MBP-10消除(C3)。(C2)和(C4)是相應(yīng)的DIC圖象。將已轉(zhuǎn)至蓋玻片上的有絲分裂細(xì)胞的核分裂激素的免疫染色(C5)與相應(yīng)的由碘丙錠進行的染色體染色(C6)和DIC圖象(7)疊加以便證實其著絲粒的位置(C8)。(C5)和(C8)的非著絲粒背景是由胞質(zhì)部分的核分裂激素引起的。
圖4細(xì)胞周期內(nèi)核分裂激素的表達(dá)和修飾采用Western印跡方法分析從按實驗程序中描述的同步化的CV1制備的細(xì)胞裂解物。分別用抗核分裂激素α10C(A)，抗Rb mAb11D7(B)或抗類似Gβ的蛋白質(zhì)抗體(C)探測印跡的適當(dāng)部分(根據(jù)探測的蛋白質(zhì)的分子量決定)。以Rb的磷酸化狀態(tài)作為同步化性能的內(nèi)對照。以細(xì)胞周期內(nèi)固定表達(dá)的類似Gβ蛋白質(zhì)作為定量細(xì)胞裂解物的內(nèi)對照。(D)由流式細(xì)胞計量術(shù)對相應(yīng)的樣品中細(xì)胞周期的分布進行分析，結(jié)果顯示了細(xì)胞周期進展的狀態(tài)。
圖5對核分裂激素進行磷酸化修飾(A-B)分別是免疫印跡結(jié)果和相同印跡的放射自顯影。泳道1和4是由羥基脲在G1/S捕獲的細(xì)胞制備的核分裂激素。泳道2是用(32P)-正磷酸鹽標(biāo)記的，從晚S期的細(xì)胞免疫沉淀的核分裂激素。泳道3是用牛腸堿性磷酸酶(CIAP)處理的相同樣品。(C)示出通過用CIAP處理可將最慢遷移形式的核分裂激素(泳道5)轉(zhuǎn)變?yōu)樽羁斓倪w移形式(泳道6)。
圖5A到5C顯示的結(jié)果證明對核分裂激素的磷酸化作用進行調(diào)節(jié)是發(fā)揮其功能的關(guān)鍵，如對于p110RB(Ludlow et al.，Cell 5657-65(1989))的情況。這些結(jié)果還提示不能被磷酸化的核分裂激素的突變體可用作為細(xì)胞生長抑制劑；以及阻止核分裂激素磷酸化作用的試劑具有相似活性。采用蛋白質(zhì)或基因治療方法可將這些試劑用于抑制細(xì)胞生長。由于在染色體分離期間核分裂激素的重要性，核分裂激素的抑制劑可用于阻止配子形成。
圖6在M期核分裂激素與Rb的相互作用將在前中期由nocodazole同步化的3×106CV1細(xì)胞裂解并且用α10Bgl(泳道1)，抗Rb mAb 11D7(泳道3和5)或?qū)φ湛贵w抗GST(泳道2和4)進行共免疫沉淀。用α10Bgl(A)和抗Rb mAb 11D7(B)進行免疫印跡反應(yīng)來分析免疫沉淀物。將泳道2和泳道3中的免疫沉淀物洗三次，而泳道4和5中的沉淀物洗5次。
圖7核分裂激素的Rb-結(jié)合區(qū)的確定(A)用“Rb-夾心體”(泳道1-7)或用抗MBP的抗體(New England Biolabs)(泳道8-14)對含有7個純化MBP融合蛋白的兩個相同的印跡進行探測。僅共有核分裂激素的C-最末端區(qū)的211個氨基酸殘基的那些融合蛋白結(jié)合到“Rb-夾心體”上。泳道3中的微弱譜帶(MBP-10/H)是一種假象，因為它能再現(xiàn)地比全長產(chǎn)物更快地遷移(泳道10)。泳道1和8是用作陽性對照的MBP-T抗原，泳道2和9是MBP-10，泳道3和10是MBP-10/H，泳道4和11是MBP-10/NB，泳道5和12是MBP-10/KN，泳道6和13是MBP-10/NI，以及泳道7和14是單獨的MBP。(B)同樣，用“Rb-夾心體”(泳道15-17)或者用抗GST抗體(泳道18-20)探測純化的GST-融合蛋白的兩個相同印跡。泳道15和18是GST-T抗原，泳道16和19是單獨GST以及泳道17和20是結(jié)合到Rb-夾心體上的GST-1045。(C)在本實驗中使用的不同構(gòu)建體的圖譜。還包含了每種融合蛋白的Rb結(jié)合能力。(D)核分裂激素的Rb結(jié)合區(qū)和相鄰殘基與E2F-1的Rb結(jié)合區(qū)(粗字體)和相鄰殘基的序列比較。發(fā)現(xiàn)在這兩個序列之間存在51％同源性。虛飾線指示保守殘基和實心線指示相同殘基。
圖8核分裂激素的克隆和序列分析(A)圖解表示重疊的cDNA克隆和全長cDNA。實心條代表未轉(zhuǎn)譯區(qū)。采用“Rb-夾心體”方法分離克隆AP10和AP1。Clal，Blal和100克隆是從Y79 cDNA文庫中分離的。其余的是從K562 cDNA文庫中分離的。(B)核分裂激素的核苷酸序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列。底下劃線部分為假設(shè)的亮氨酸成七一套的重復(fù)；盒中給出的是保守的亮氨酸。推測代表二分核靶基序的基本殘基標(biāo)在環(huán)中。盒中給出了cDNA末端的聚腺苷化信號。(D)內(nèi)部重復(fù)序列的對比。相同殘基由直線條連接，類似的殘基由點線連接。
圖9圖解表示核分裂激素表達(dá)構(gòu)建體將附加型載體pCEP4(Invitrogen)用于起始構(gòu)建。每個構(gòu)建體以一個字母(A-E)表示，以便可在文中較方便地描述。列出了預(yù)期的亞細(xì)胞定位(N-核；C-胞質(zhì))以及預(yù)期的表達(dá)蛋白與α10C抗體的反應(yīng)性。
圖10核分裂激素在CV1細(xì)胞內(nèi)的瞬間表達(dá)在轉(zhuǎn)染三天之后將生長于100mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用甲醇固定，并用于進行三重?zé)晒馊旧?。?biāo)志表位被染成紅色(用得克薩斯紅染；泳道A1-E1)，核分裂激素的C-最末端被染成綠色(FITC方法，泳道A2-E2)，以及核DNA染成藍(lán)色(由DAPI法，泳道A3-E3)。泳道(A)-(E)是依次為從表達(dá)“A”-“E”構(gòu)建體的細(xì)胞獲得的典型結(jié)果。箭頭指示出在泳道(B3)，(C3)和(D3)中具染色質(zhì)橋的異常分裂的細(xì)胞。比例尺20μm本發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種命名為核分裂激素的純化的新的哺乳動物蛋白。Western印跡分析測定的核分裂激素的分子量為約350KD。核分裂激素是一種細(xì)胞蛋白，已發(fā)現(xiàn)它與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白相互作用。它也是依賴于細(xì)胞周期的，也就是說它是在G1/S交界首先合成，從S到M期被磷酸化，在有絲分裂期間與著絲粒/動粒和紡錘體兩極密切相連。核分裂激素具有許多以前描述的以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白為特征的性質(zhì)(Buchkovich et.al.，Cell 581097-1105(1989)；Chen et al.，Cell 581193-1198(1989)；de Caprio et al.，Cell 581085-1095(1989)；Ludlow et al.，Cell 60387-396(1990)；and Mihara et al.，Science 2461300-1303(1989).
本發(fā)明所述組合物和方法是以下列發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)存在核分裂激素是真核細(xì)胞進入有絲分裂M期所必需的，并且，核分裂激素的降解是細(xì)胞步入下一階段所必需的。因此，通過阻止細(xì)胞進入M期，抗核分裂激素抗體，核分裂激素的突變體或其一種非功能類似物抑制了有絲分裂細(xì)胞周期，以及通過阻止細(xì)胞脫離M期，核分裂激素或其功能等同物的過量表達(dá)抑制了細(xì)胞周期。通過加入蛋白質(zhì)或者借助于基因治療即釋放編碼蛋白質(zhì)的基因或其功能等同物可獲得所述過量表達(dá)。
已從猴和人來源純化出該蛋白質(zhì)。當(dāng)用于描述核分裂激素的狀態(tài)時，“純化”是指沒有在天然環(huán)境中通常與核分裂激素相結(jié)合或伴隨其出現(xiàn)的其它蛋白質(zhì)分子的一部分。如本文中使用的術(shù)語“天然”是指從天然分離的或者不含有內(nèi)部氨基酸取代的蛋白質(zhì)，多肽，抗體或其片段的形式。通常，預(yù)期核分裂激素功能的拮抗劑可阻止細(xì)胞生長；并且細(xì)胞中核分裂激素的存在是增殖的指數(shù)-過量增殖疾病例如癌癥的重要指示劑。
因此，這種新蛋白質(zhì)的拮抗劑可用于控制病源性的過量增殖細(xì)胞。如本文中使用的，術(shù)語“過量增殖細(xì)胞包括但不限于具有自主生長能力即不依賴于常規(guī)調(diào)節(jié)機制而生存和重復(fù)再生的細(xì)胞，可將過量增殖的疾病劃分為病理性的，即偏離了正常細(xì)胞，成為疾病的特性或組成疾病，或者可劃分為非病理性的，即偏離正常狀態(tài)并不與病態(tài)相關(guān)。病理性的過量增殖的細(xì)胞其特征在于下列疾病狀態(tài)，甲狀腺血漿過多-Grave疾病，牛皮癬，良性的前列腺肥大，Li-Fraumeni癥包括乳腺癌，肉瘤和其他腫瘤，膀胱癌，結(jié)腸癌，肺癌，各種白血病和淋巴瘤。例如在泌乳期間輸乳管上皮細(xì)胞以及在與傷口修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了非病理性過量增殖細(xì)胞的實例。病理性過量增殖細(xì)胞以喪失接觸抑制功能和選擇性粘附能力降低為特征，由于這些特性使細(xì)胞表面性質(zhì)發(fā)生變化并進而破壞細(xì)胞間聯(lián)系。這些變化包括刺激分裂和具有分泌蛋白水解酶的能力。而且，通過將該蛋白質(zhì)和編碼蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入到一種細(xì)胞中而重新導(dǎo)入和補充喪失的核分裂激素的功能可以重建有缺陷的染色體分離，這種分離是惡性狀態(tài)發(fā)展的標(biāo)志，從而停止了細(xì)胞的惡性增殖。
正如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指以特定的序列以肽鍵相連的氨基酸的線性聚合體。如本文使用的，除非另有特定命名，否則術(shù)語“氨基酸”是指氨基酸的D或L立體異構(gòu)體形式。具有純化的核分裂激素的生物學(xué)活性的等效的核分裂激素的蛋白質(zhì)或等效的核分裂激素肽也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！暗刃У牡鞍踪|(zhì)”和“等效的多肽”是指與自然存在的蛋白質(zhì)或多肽的線性序列不相同，但具有不會改變其生物學(xué)活性的氨基酸取代的化合物?！吧飳W(xué)活性”應(yīng)該指在天然條件下與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白的結(jié)合能力。這些等價物可以通過用相關(guān)的氨基酸例如帶類似電荷的氨基酸取代一個或多個氨基酸，或者取代或修飾側(cè)鏈或功能基團而與天然序列不同。
進一步可明白可以對核分裂激素的原始序列作有限的修飾，不會破壞其生物學(xué)功能，并且為了發(fā)揮其活性僅需要完整原始結(jié)構(gòu)的一部分，所述活性的一個方面是與p110RB結(jié)合的能力。這樣一種生物學(xué)活性片段是基本上具有該分子的約600個氨基酸殘基的C-末端區(qū)的分子，所述分子的序列顯示于圖1中。另一個生物學(xué)活性片段是基本上具有該分子的約200個氨基酸殘基的C-末端區(qū)的一個分子，所述分子的序列顯示于圖1。正如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員理解的，具有至少C-末端的200個氨基酸直到約C-末端的600個氨基酸的任何片段都是核分裂激素的生物學(xué)活性片段。沒有破壞該蛋白質(zhì)活性的對該序列的微小修飾也在核分裂激素定義的范圍內(nèi)以及在如此定義的蛋白質(zhì)定義的范圍內(nèi)。而且，具有顯示于圖1的氨基酸序列但并不包括前述的600-200個氨基酸片段，并保留了整個蛋白質(zhì)的功能的片段包含在所述定義范圍內(nèi)。通過對圖1的核酸分子進行限制酶消化并且重組表達(dá)得到的片段可以產(chǎn)生這些片段。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員還理解對原始氨基酸序列進行微小改變可以導(dǎo)致產(chǎn)生與圖1中列出的序列相比基本上具有等同功能或加強功能的蛋白質(zhì)。這些修飾可以是經(jīng)過嚴(yán)密設(shè)計的例如定位誘變法，或者可以是偶然發(fā)生的例如在作為核分裂激素的生產(chǎn)工具的宿主中進行突變。只要保留核分裂激素的功能，可包括所有的修飾。
“受抑制的活性”還應(yīng)指核分裂激素蛋白質(zhì)的片段和突變體(“突變蛋白”)，它以顯性負(fù)方式起作用，從而抑制該蛋白質(zhì)的正常功能，從而抑制了核分裂激素介導(dǎo)宿主細(xì)胞分裂和/或宿主細(xì)胞增殖的能力。這些蛋白質(zhì)可以是但不限于非磷酸化蛋白質(zhì)或磷酸化的蛋白質(zhì)，以便抑制了宿主細(xì)胞的細(xì)胞增殖。通過在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)核分裂激素蛋白質(zhì)的核酸或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)方法可以制備這些蛋白質(zhì)和片段，所述宿主細(xì)胞喪失了磷酸化的能力。這些突變蛋白和受抑制的活性片段可在治療學(xué)上用于抑制細(xì)胞的過量增殖以及生產(chǎn)診斷試劑例如抗核分裂激素的抗體。
本發(fā)明還提供了在細(xì)胞中抑制核分裂激素磷酸化的試劑。這些試劑包括但不限于牛腸堿性磷酸酶和其他調(diào)節(jié)磷酸酶。采用下文中描述的方法將細(xì)胞在體外或體內(nèi)與試劑接觸而將這些試劑用于抑制細(xì)胞的生長或增殖。因此，本發(fā)明還提供了通過將細(xì)胞與試劑接觸而抑制細(xì)胞例如一種過量增殖細(xì)胞的生長或增殖的方法。還提供了治療病理狀態(tài)的方法，將有效濃度的這些試劑供給合適的患者從而抑制細(xì)胞增殖。所述病理狀態(tài)是以細(xì)胞過量增殖生長例如癌癥為特征的。該方法中的合適患者包括但不限于脊椎動物，猿，鼠和人患者。
采用下文描述的方法將細(xì)胞在體外或體內(nèi)與該試劑接觸可將這些試劑用于阻止未成熟配子的配子形成。
含有上文中描述的物質(zhì)的任何組合物以及一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。藥物學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的并且包括水溶液例如生理學(xué)緩沖鹽水或其他溶劑或賦形劑例如甘油，乙二醇，植物油(例如棕櫚油)或可注射的有機酯?？捎盟幬飳W(xué)上可接受的載體將核分裂激素或其等效蛋白質(zhì)及其片段或突變體在體外供給細(xì)胞或供給患者體內(nèi)。
藥物學(xué)上可接受的載體可含有生理學(xué)上可接受的化合物，以用于例如使多肽穩(wěn)定或者提高或降低試劑的吸附作用。生理學(xué)上可接受的化合物可包括例如碳水化合物如葡萄糖，蔗糖或葡聚糖，抗氧化劑例如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質(zhì)或其他穩(wěn)定劑或賦形劑。其他生理學(xué)上可接受的化合物包括增濕劑，乳化劑，分散劑或防腐劑，這些都特別適用于阻止微生物的生長或作用。各種防腐劑是公眾熟知的，并且包括例如酚和抗壞血酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道藥物學(xué)上可接受載體包括生理學(xué)上可接受化合物的選擇取決于例如多肽的給藥途徑和特定多肽的特殊的理化特性。例如生理學(xué)上可接受的化合物例如單硬脂酸鋁或明膠特別適用于作為遲發(fā)劑，所述遲發(fā)劑延緩了供給患者的藥物組合物的吸收速率。在Martin，Remington’spharm. Sci.，15th Ed.(Mack prbl.Co.，Easton，1975)(引入本文作參考)中提供了載體，穩(wěn)定劑或佐劑的其他實例。如果需要，還可將藥物組合物也摻入到脂質(zhì)體，微球體或其他多聚體基質(zhì)(Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1984)(引入本文作參考)。例如由磷脂和其他脂組成的脂質(zhì)體是無毒的，生理學(xué)上可接受的以及可代謝的載體，這些載體的制造和給藥相對簡單。
通過將細(xì)胞與純化核分裂激素，含有這些多肽或蛋白質(zhì)的活性片段或組合物相接觸而將純化的核分裂激素或核分裂激素藥物組合物用于控制細(xì)胞的生長。
可在體內(nèi)、來自體內(nèi)或體外實現(xiàn)這種接觸而達(dá)到本發(fā)明的目的。當(dāng)在體外抑制細(xì)胞時，可通過將本發(fā)明的組合物或蛋白質(zhì)與細(xì)胞培養(yǎng)基混合并且然后培養(yǎng)細(xì)胞或者通過直接向培養(yǎng)基中加入組合物或蛋白質(zhì)而實現(xiàn)接觸。確定有效量的方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的。
還可用該方法體內(nèi)治療或防止患者的與不正常增殖細(xì)胞相關(guān)的病態(tài)。因此，當(dāng)在體內(nèi)實現(xiàn)接觸時，將有效量的本發(fā)明的組合物供給患者，以抑制患者的細(xì)胞增殖。含有上述成分的藥物組合物的有效量通常為約0.01-100mg/kg體重的范圍內(nèi)。利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定有效量。以單劑量，或者丸劑或者通過在相對短時期內(nèi)輸注而將總有效量供給患者，或者利用分極的治療方案將總有效量供給患者，其中在更延長的時間內(nèi)供給多個劑量。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員明白在患者體內(nèi)獲得有效劑量所需的本發(fā)明的組合物的量取決于許多因素，包括患者的年齡和總體健康水平以及給藥途徑和治療次數(shù)。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，“患者”是指任何脊椎動物，如動物，哺乳動物，人或大鼠。
給藥方法是本領(lǐng)域內(nèi)知道的，并且包括但不限于口服靜脈注射，肌內(nèi)注射或腹膜注射給藥，給藥可以連續(xù)進行或間歇進行以及根據(jù)不同患者而變化，如用其他治療用重組蛋白質(zhì)的病例(Landmann et al.，J.Interferon Res，12(2)103-111(1992)；Aulitzkyet al.，Eur.J.Cancer.27(4)462-467 (1991)；Lantz etal.，Cytokine 2(6)402-406(1990)；Supersaxo et al.，Pharm.Res.5(8)472-476(1988)；Demetri et al.，J.Clin.Oncol.7(10)1545-1553(1989)；and LeMaistre etal.，Lancet 3371124-1125(1991))。
本發(fā)明進一步提供了編碼對應(yīng)于純化哺乳動物核分裂激素蛋白質(zhì)，突變蛋白，及其活性片段，及其他本文中稱為“等效蛋白”或“等效多肽”和抗核分裂激素的抗體的氨基酸序列的分離的核酸分子。如本文所述，“核酸”應(yīng)指單鏈和雙鏈DNA，cDNA和mRNA。在一個方案中，編碼核分裂激素蛋白質(zhì)和片段的核酸分子具有圖1顯示的序列或其部分序列。本發(fā)明的范圍還包括在嚴(yán)格條件下與該核酸分子或其補體例如圖1顯示的序列相雜交的核酸分子。通過圖1核酸分子的缺口轉(zhuǎn)譯例如可以制備這種雜交的核酸分子或探針，其中所述雜交的核酸分子可以是該分子的隨機片段，所述分子序列顯示于圖1中。對于制備所述片段的方法，可參見Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，N.Y.(1989)，引入本文作參考。至少10個核苷酸的核酸片段可用作為雜交探針。也可將分離的核酸片段用于生產(chǎn)新的肽。這些肽又可用作為生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的免疫原。制備和使用探針及免疫原的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。
也可將核酸序列用于促進細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖。可將核酸分子插入到細(xì)胞中，使細(xì)胞在下述條件下生長。使該核酸編碼成有效濃度的核分裂激素蛋白質(zhì)從而抑制細(xì)胞生長。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，可用脂質(zhì)體或類脂質(zhì)的DNA或者采用在Sambrool等人，見上文(引入本文作參考)公開的其他基因載體如病毒載體將核酸插入。
僅為了闡述的目的，插入核酸的一個釋放系統(tǒng)是復(fù)制功能不全的反錄病毒載體。如本文使用的，術(shù)語“反錄病毒”包括，但不限于具有選擇性地靶擊和將核酸導(dǎo)入到正分裂細(xì)胞中的能力的載體或釋放載體。如本文使用的，術(shù)語“復(fù)制功能不全”的定義是不能產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)，排除了載體在受感染細(xì)胞中的傳播。
復(fù)制功能不全的反錄病毒載體的另一個例子是LNL6(Miller，A.D.et al.，BilTechniques 7980-990(1989))。已完善地建立了利用復(fù)制功能不全的反錄病毒作為反錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的基因標(biāo)志的方法(Correll.，P.H.et al.，PNAS USA868912(1989)；Bordignon，C.et al.，PNAS USA868912-52(1989)；Culuer，K.et al.，PNAS USA883155(1991)；Rill，D.R.et al.，Blood 79(10)2694-700(1991))。臨床調(diào)查已證實有很小或沒有與病毒載體相關(guān)的副作用(43Aanderson，Science256808-13(1992))。
其他載體也適用于本發(fā)明，并且從中選出有效地釋放編碼核分裂激素基因或其片段或突變體的核酸的載體。該核酸可以是DNA，cDNA或RNA。所述載體包括腺病毒載體，尤其是描述于Siegfned，W.，Exp.Clin.Endocrinol.，1017-11(1993)；Rosenfeld，M.A.et al.，Cell 68143-155(1992)；Rich，D.P.et al.，Human Gene Therapy，4460-476(1993)；和Lemarchand，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896482-6486(1992)中的缺失復(fù)制功能的重組腺病毒載體。
在另一個實施方案中，經(jīng)過操作加工將本發(fā)明的一種分離的核酸分子連接到RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子上。這些核酸分子可用于重組生產(chǎn)核分裂激素蛋白質(zhì)以及多肽或者用作為基因治療的載體。
本發(fā)明還提供了其中已插入了上述分離到的核酸分子的載體。例如，合適的載體可以是但不限于質(zhì)粒，粘?；虿《据d體。合適的載體的例子可參見Sambrook et al.，見上文，以及Zhu et al.，Science 261209-211(1993)，引入本文作參考。當(dāng)插入到一個合適的宿主細(xì)胞例如原核或真核細(xì)胞，可重組生產(chǎn)核分裂激素。合適的宿主細(xì)胞可包括哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。參見Sambrook等人，見上文，引入本文作參考。
本發(fā)明提供了將上面描述的宿主細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)，以表達(dá)編碼核分裂激素或其片段的核酸，而生產(chǎn)重組核分裂激素或其片段的方法。利用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法，可確定合適條件，參見例如Sambrooket al.，見上文，引入本文作參考。本發(fā)明也提供了以該方式生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽。
本發(fā)明還提供了能夠與核分裂激素蛋白質(zhì)或其片段特異地形成復(fù)合物的抗體。術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體和單克隆抗體。該抗體包括但不限于大鼠，兔或人單克隆抗體。
如本文中使用的“抗體或多克隆抗體”是指應(yīng)答免疫接種的抗原或受體而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。術(shù)語“單克隆抗體”是指來源于單個克隆的細(xì)胞的免疫球蛋白。來自該克隆的所有單克隆抗體其化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)是相同的并且特異于單個抗原決定簇。
生產(chǎn)多克隆抗體和單克隆抗體的實驗方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)，引入本文作參考。通過將核分裂激素或其片段導(dǎo)入到一種動物例如鼠或兔中可用生物學(xué)生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體。該方法的詳細(xì)操作是熟知的，在此不再重復(fù)。但是，其大體上包括將免疫原注射到小鼠或其它合適動物中。隨后殺死小鼠并將從其脾臟獲取的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。結(jié)果產(chǎn)生一種稱為“雜交瘤”的雜合細(xì)胞，它可在體外重復(fù)產(chǎn)生。篩查并操作雜交瘤群以便分離單個克隆，每個克隆分泌針對抗原的單個抗體種類。以這種方式獲得的單個抗體種類是從免疫動物為應(yīng)答特定抗原位點(在免疫物質(zhì)中鑒別)而產(chǎn)生的單個B細(xì)胞的產(chǎn)物。當(dāng)將免疫物質(zhì)導(dǎo)入到活宿主中時，通過產(chǎn)生針對該物質(zhì)上所有可鑒別位點的抗體，宿主免疫系統(tǒng)進行應(yīng)答。產(chǎn)生抗入侵者的抗體的這種“烏槍法”途徑導(dǎo)致產(chǎn)生與免疫物質(zhì)具有不同親合性和特異性的抗體產(chǎn)生。在對不同的雜交瘤細(xì)胞系進行篩查以便鑒別出那些產(chǎn)生針對所需抗原的抗體的細(xì)胞系之后，優(yōu)選地在選擇用于本發(fā)明之前對由單個雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體進行篩查以鑒別那些對刺激其原始產(chǎn)生的免疫物質(zhì)具最高親和力的細(xì)胞系。還提供了產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。以這種方式產(chǎn)生的單克隆抗體包括但不限于下文中描述的單克隆抗體。
因此，利用核分裂激素蛋白質(zhì)或其片段，以及本領(lǐng)域內(nèi)任一技術(shù)人員熟知的方法，可以產(chǎn)生和篩選本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞和抗體以選擇具有與核分裂激素相結(jié)合能力的抗體。
本發(fā)明還提供了上述多克隆和單克隆抗體的生物學(xué)活性片段。這些“抗體片段”保留了與其抗原或免疫原選擇性結(jié)合的一些能力。這些抗體片段包括但不限于(1)Fab，該片段含有抗體分子的單價抗原結(jié)合片段，所述片段是通過用木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生一個完整輕鏈和重鏈的一部分而得到的；(2)Fab’，通過用胃蛋白酶處理，隨后還原，以產(chǎn)生完整輕鏈和重鏈一部分而得到的一抗體分子片段，由每個抗體分子獲得兩個Fab’片段；(3)(Fab’)2，用胃蛋白酶處理之后不進行還原而獲得的抗體片段，F(xiàn)(ab’)2是通過兩個二硫鍵將兩個Fab’片段連在一起形成的二聚體。
(4)Fv，定義為一種遺傳工程的片段，包含有輕鏈可變區(qū)以及重鏈可變區(qū)，以兩條鏈形式表達(dá)；以及(5)SCA，定義為含有輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)的遺傳工程分子，所述兩個可變區(qū)通過合適的多肽接頭連接為遺傳上融合的單鏈分子。
制備這些片段的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，參見例如，Harlow和Lane，見上文，引入本文作參考。
“生物活性抗體片段”的特定例子包括抗體的CDR區(qū)。
本發(fā)明還提供了與所述抗體或其生物活性片段發(fā)生特異性反應(yīng)的抗獨特型的肽。如本文中使用的，“抗獨特型的肽”是來自一個種的純化抗體，所述的純化抗體被注射到一個遠(yuǎn)緣種并被識別為外源抗原，激發(fā)強烈的體液免疫應(yīng)答。對于一般性方法的討論，參見Harlow和Lane，見上文，引入本文作參考。
本發(fā)明還包括重組生產(chǎn)的、生化合成的、化學(xué)合成的或化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)或多肽，與相應(yīng)的天然多克隆或單克隆抗體相比，這些蛋白質(zhì)或多肽保留了與核分裂激素或其片段相結(jié)合的能力。采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的抗原結(jié)合分析法例如抗體捕獲分析法可測定與抗原或免疫原的結(jié)合能力。參見例如，Harlow和Lane，見上文，引入本文作參考。
在一個實施方案中，利用標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)技術(shù)例如由Halow和Lane，見上文(引入本文作參考)描述的免疫組織化學(xué)技術(shù)，將抗體連接到可檢測試劑上，用于檢測一個樣品中的核分裂激素蛋白質(zhì)和片段。
在另一個實施方案中，利用抗體與核分裂激素結(jié)合，從而抑制其在細(xì)胞內(nèi)的功能。采用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法以及有效濃度施用抗體，以便抑制核分裂激素的功能。也可在治療上將抗體用于抑制上文中描述的細(xì)胞生長或增殖。
本發(fā)明的另一方面是一種診斷方法，即利用本發(fā)明所述的抗體和核酸分子檢測和確定從患者獲得的細(xì)胞或樣品中是否存在核分裂激素。由于細(xì)胞中存在核分裂激素是增殖的一個參數(shù)，并因此是過量增殖疾病例如癌癥的一個重要指標(biāo)，核分裂激素的量過多表明細(xì)胞過量增殖和/或處于前惡性狀態(tài)。利用本發(fā)明抗體進行免疫檢測的類型例如EIA和RIA的實例是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。例如在C.P.Princl，D.J.Newman，editors，Principals and Practice of Immunoassay，Stockton Press，New York，1991(引入本文作參考)中描述了這些方法的例子。利用本發(fā)明核酸進行的核酸雜交檢測法描述于B.D.Hames和S.J.Higgins，editors，Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，1991，以及Larry，J.Kricka，editor，Nonisotopic DNA ProbeTechniques，San Diego，California，1992。
上述的蛋白質(zhì)、多肽、核酸、抗體及其片段可用于制備上文中概述的治療藥物。
參照下文中的實施例對本發(fā)明作更詳細(xì)的描述。這些實施例是為了描述而不是為了限制發(fā)明。
實驗程序?qū)嶒濱對核分裂激素進行克隆和測序按照Shan，B.et al.，Mol.Cell.Biol.，1.25620-5631(1992)(引入本文作參考)描述的方法，利用放射性標(biāo)記的核分裂激素cDNA作為探針將從不同細(xì)胞系Y79和K562提取的10μg總RNA進行Northern印跡分析。根據(jù)以前由Shan，B.etal.，見上文(引入本文作為參考)描述的方法完成RB相關(guān)的蛋白的cDNA的克隆，簡而言之，將由純化p56-RB，抗RB抗體0.47以及堿性磷酸酶綴合的二抗體形成的免疫復(fù)合物(“RB-夾心體”)用作為探針用于篩查表達(dá)λ-gtn的人cDNA文庫，而將沒有RB的“夾心體”用作為負(fù)對照。用另二個文庫重篩查(1)由Lee，W.-H.et al.Science2351394-1399(1987)，(引入本文作為參考)描述的方法制備一個Y79cDNA文庫；和(2)K562 cDNA文庫(由Dr.M.-L.Chu at ThomasJefferson University，Philadelphia，PA贈送)。通過對在合適區(qū)域內(nèi)重疊的克隆進行比較以及跨越完整EcoRI接頭進行直接測序而確定內(nèi)部EcoRI片段的定位。直接測序法還消除了失去其他小EcoRI片段的可能性。利用雙脫氧核苷酸終止方法(Sambrook etal.，見上文)對DNA進行測序，并且采用由DNASTAR(Madison，Wisconsin)提供的計算機程序?qū)υ撔蛄羞M行分析。
實驗II抗核分裂激素的多克隆抗體的制備為了制備抗核分裂激素的多克隆抗體，利用能夠表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或者麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的融合蛋白的載體(Riggs，P.，Current Protocols in Molecular Biology，Ausebel，F(xiàn).M.et al.(eds)，New York(1990)；Smith和Johnson，Gene6731-40(1988))制備具有核分裂激素的不同部分的三個融合蛋白，GST-10Bgl(含有圖1C的1128-1462位氨基酸殘基)，GST-10Stu(含有圖1C的1461-1856位氨基酸殘基)，或者MBP-10C(含有圖1C的1853-2482位氨基酸殘基)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，利用這些細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白質(zhì)皮下接種動物。利用結(jié)合到谷胱甘肽樹脂上的GSB或者結(jié)合到直鏈淀粉樹脂上的MBP，這取決于不同來源的抗原，在4℃將免疫血清(抗-10Bgl，抗-10Stu，和抗-10C)預(yù)吸附1小時，然后在4℃用預(yù)封阻(在PBS+1％BSA)的Immobilon-P膜(Millipore)將流出物保溫2小時，所述膜上含有通過電泳從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移的500μg融合蛋白。在用磷酸緩沖鹽水(PBS)徹底洗滌之后，用0.2M甘氨酸-HCl，pH2.3洗脫特異抗體，并將洗脫液用3MTris-HCl，pH8.0進行中和。利用相應(yīng)的抗原通過印跡分析進一步檢測這些抗體的特異性。
實驗III核分裂激素蛋白質(zhì)的鑒定為了鑒定核分裂激素的細(xì)胞基因產(chǎn)物，在煮沸的SDS-載樣緩沖液中將5×105旺盛生長的Hela細(xì)胞直接裂解，并且將該裂解液進行3-12％梯度SDS-PAGE分析以及電泳轉(zhuǎn)移到一個Immobilon-P膜(Millipore)。將具有相同樣品的三個相鄰接泳道切下并且用三種抗體之一分別探查每個泳道。將從兔骨骼肌制備的樣品與Hela細(xì)胞裂解物肩并肩一起點樣。用由Dr.K.Wang提供的單克隆抗體(德克薩斯大學(xué)，Austin，TX，其由Kruger，M.et al.J.Cell Biol.11597-107(1991)描述的方法(引入本文作參考)制備)進行探查可觀察到該樣品中作為770KD標(biāo)記的伴肌動蛋白的位置。
實驗IV細(xì)胞周期內(nèi)核分裂激素的分布猴腎細(xì)胞CV1細(xì)胞直接生長于玻璃蓋玻片上，并且按照下文實施例V描述以及圖4描述將細(xì)胞同步化。攜帶有樣品的蓋玻片用PSB洗滌并在冷無水甲醇中固定10分鐘。在TBST(0.1M Tris，pH7.4，0.15M NaCl，0.1％吐溫20)中水合之后用含有5％奶粉的TBST(TBST-M)封閉細(xì)胞。與在TBST-M中稀釋的兔抗-10C保溫一小時，隨后與用FITC結(jié)合的山羊抗兔IgG(1∶100)(Fisher Biotech)保溫30分鐘。在用TBST洗滌之后，將蓋玻片安放于Permafluor(Lipshaw-Immunonon，Inc.)。用裝備了Ar和HeNe激光器的Zeiss LSM III進行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。將光學(xué)橫斷面(0.25μm)數(shù)字化并疊加上Normarski微差干涉反襯成像圖并直接記錄到Ektachrome 10035mm膠片(FocusGraphics，Inc.)。
實驗V采用Western 跡法對同步化細(xì)胞群的細(xì)胞提取物進行分析用Lovastatin，羥基脲和nocodazole將正常猴腎CV1細(xì)胞同步化并在不同時期釋放以便在不同細(xì)胞周期階段獲得相當(dāng)一致的群體。從每個樣品制備在相同條件下同步生長的細(xì)胞的二塊平板，一塊用于免疫印跡分析而另一塊用于流式細(xì)胞計數(shù)。對于從早G1或G1/S釋放的樣品，在100mm培養(yǎng)皿中將1.5×106個細(xì)胞在添加了10％血清的新鮮的Dulbecco′s改良的Eagle完全培養(yǎng)基(DMEM)平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。加入Lovastatin(40μM)，保持36小時以便在早G1期捕獲細(xì)胞(Keyomarsi et al.，Cancer Res.513602-3609(1991))；然后通過加入3-羥-3-甲戊醛酸內(nèi)酯至終濃度為4mM而釋放細(xì)胞。對于在G1/S交界時進行同步化，加入羥基脲(0.5mM)(Adams和Lindsay，J.Biol.Chem.2421314-1317(1967))24小時，通過用PBS洗滌三次而從捕獲中釋放細(xì)胞。在預(yù)定的不同時間點收集樣品。對于從nocodazole(前中期)封阻中釋放的樣品，在羥基脲存在下在每塊150mm培養(yǎng)皿中將6×106個細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24小時。用PBS洗滌3次之后，加入添加了nocadazole(0.4μg/ml)的培養(yǎng)基。12小時之后緩慢振蕩有絲分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)動并重懸于PBS中。用PBS洗滌三次以上之后，將細(xì)胞樣品(1.5×106)重新鋪板培養(yǎng)并于不同時間點再收集。為了進行免疫印跡分析，利用橡膠淀帚從一套培養(yǎng)皿中將細(xì)胞收集到PBS中，然后沉淀并通過在100μl SDS載樣緩沖液中煮沸而直接裂解。將從另一套收集的細(xì)胞用胰蛋白酶酶解，沉淀，用PBS洗滌一次，并重懸于0.3ml的PBS中。將各個樣品緩慢地旋轉(zhuǎn)，同時滴加1ml甲醇以固定細(xì)胞進行流式細(xì)胞計數(shù)，將被固定的樣品貯存于4℃直到需要使用。
在補充了10％經(jīng)過滲析的胎牛血清的DME培養(yǎng)基中，用32P正磷酸鹽(0.25mCi/ml終濃度)對從G1/S交界期(羥基脲封阻)釋放了4小時的2×106CV1細(xì)胞標(biāo)記2小時。按圖4的說明中所述，在用羥基脲和nocodazole進行順序的雙重封阻之后擺脫有絲分裂而收集等量細(xì)胞。將這兩個不同細(xì)胞樣品在冷Ab緩沖液(20mM Tris-Hcl，pH7.4，50mM NaCl，50mMNaF，1mM EDTA，0.5％NP-40，0.5％脫氧膽酸鹽，0.5％SDS，添加了各1μg/ml的抑酶醛肽，抑蛋白酶肽，木瓜蛋白酶抑制劑)中裂解，簡單地超聲處理，通過離心使之澄清，然后用飽和量的抗-10Bgl進行免疫沉淀。由蛋白質(zhì)A-Sepharose珠將免疫復(fù)合物沉淀。然后用RIPA緩沖液(10mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，1％NP-40，1％脫氧膽酸鹽，0.1％SDS，添加蛋白酶抑制劑)將珠洗兩次，用高鹽緩沖液(10mM Tris，pH7.4，1MNaCl，1％NP-40，1％脫氧膽酸鹽，添加蛋白酶抑制劑)洗一次，用Tris緩沖的鹽水洗二次，以及用無菌去離子水洗三次。將從樣品得到的免疫沉淀物分裂為兩個等同樣品。將溶于25μl 工作緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.5，0.1mM EDTA)的20單位牛腸堿性磷酸酶(CIA)，20U/μl(Boehringer Mannheim Biochemica)加到一份樣品中，而剩余的那份樣品中僅加入25μl緩沖液(沒有CIAP)。將兩個混合樣品于37℃培養(yǎng)10分鐘。將樣品于SDS-載樣緩沖液中煮沸，通過3-12％梯度SDS-PAGE分離；并轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上。然后將該印跡進行免吸印跡分析和/或放射自顯影。
實驗VI用流式細(xì)胞計數(shù)法進行DNA含量分析將CV1細(xì)胞用胰蛋白酶消化并用PBS洗一次。在70％乙醇固定和RNase消化之后，用碘化丙錠將細(xì)胞染色以進行DNA含量分析。為了兩種顏色選擇，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞依次用70％甲醇和冷無水甲醇進行固定，用抗-標(biāo)記mAb M2(IBI)+結(jié)合二級抗體的FITC(Fisher Biotech)染色，然后用碘化丙錠染色。對FITC陽性細(xì)胞和FITC陰性細(xì)胞的DNA含量進行分析。
實驗VII共免疫沉淀按照以前描述的方法(Durfee et al.，Genes&Development7555-569(1993))利用從用nocodazole同步化的CV1群收集的有絲分裂細(xì)胞進行共免疫沉淀。
實驗VIII質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染通過將從cDNA文庫分離的合適的cDNA片段連接而獲得了核分裂激素的全長cDNA。在緊靠第一個ATG上游處插入一個人工BamHI位點。對所有cDNA連接點進行測序以確保正確連接和修飾。
為了將外源性表達(dá)的核分裂激素與內(nèi)源形式區(qū)分開，將含有ATG的一個序列(編碼標(biāo)記物-tag)(Hopp et al.，Biotech61205-1210(1988)插入到pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)的多克隆位點KpnI和HindIII之間以制備pCEP4F。然后將核分裂激素的全長cDNA(核苷酸543-8241)克隆到標(biāo)記抗原決定簇的下游以制備pCF-10。利用合適的限制性位點以這種方式還構(gòu)建了其他缺失突變體(pCF-10Acc，核苷酸543-6222；pCF-10RV，核苷酸543-3951；pCF-10NN，核苷酸4381-6582；以及pCF10×h，核苷酸3397-8241)。
采用以前描述的磷酸鈣DNA沉淀法(Shanet al.，Mol.Cell.Biol.125620-5631(1992))用CV1細(xì)胞完成轉(zhuǎn)染。對于每次轉(zhuǎn)染用10μg構(gòu)建的DNA與10g載體DNA(pGEM-3Z，Promega，Madison，Wisconsin)混合。在轉(zhuǎn)染之后收集細(xì)胞并將細(xì)胞固定三天以進行免疫熒光顯微鏡觀察，或者流式細(xì)胞計數(shù)。當(dāng)要求篩查菌落，在轉(zhuǎn)染之后將細(xì)胞稀釋并再平板培養(yǎng)兩天。在新霉素B(200μg/ml)存在下對抗藥性菌落選擇2周。
通過構(gòu)建和表達(dá)各個位點的融合蛋白而確定核分裂激素的Rb結(jié)合區(qū)的位置，所述融合蛋白含有該肽的C-末端區(qū)。對于體外Rb結(jié)合分析，從MBP-10構(gòu)建不同的缺失突變體。將AP10的3-’編碼序列缺失到HindIII位點即核苷酸位7427，或者NheI位點即核苷酸位6582，以表達(dá)MBP-10/H(氨基酸殘基1,853，-2,296)以及MBP-10/NB(1853-2041位殘基)。將AP10的5’編碼序列進行部分缺失以分別表達(dá)MBP-10KN(殘基2014-2482)和MBP-10NI(殘基2014-2482)以及MBP-10NI(殘基2271-2482)。將含有與E2F-1中的Rb結(jié)合區(qū)同源的序列的BspHI-NcoI片段(核苷酸7529-7664)克隆到一種來源于pGEX-2T載體(Pharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey)的pGEX-PK的唯一的NcoI位點以表達(dá)GST-1045(殘基2330-2375)。
通過將終濃度為0.1mM的IPTG加到指數(shù)生長期的細(xì)菌培養(yǎng)物中于30℃誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。在誘導(dǎo)1小時之后，收集細(xì)菌并且溫和超聲處理使之裂解。通過在SDS-PAGE之后電洗脫或者通過親和層析而純化融合蛋白。
實驗IX間接免疫熒光研究將CV1細(xì)胞于PBS中洗滌并于冷無水甲醇或溶于PBS的4％多聚甲醛分別固定10分鐘和20分鐘。兩種固定方式產(chǎn)生同樣的免疫染色模式。在TBST(100mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，0.1％吐溫20)中水合之后，將細(xì)胞于含有5％奶粉的TBST(TBST-M)中封阻。與在TBST-M中稀釋的合適抗體保溫一小時之后，洗滌3次，然后與熒光色素結(jié)合的二級抗體(1∶100)(Fisher Biotech)保溫另外一小時。然后用DAPI(0.5μg/ml)染色核DNA以指示M期的不同時期。通過加入競爭劑(GST-10Bgl，GST-10Stu，MBP-10或MBP；10μg/ml)稀釋抗體而完成競爭試驗。通過將由KCl吸收而腫脹的CV1細(xì)胞濃縮至蓋玻片(Earnshaw et al.，J.CellBiol.98352-357(1984))而制備染色體涂布片，然后按照上面所述進行加工，所不同的是在用RNase消化之后用碘化丙錠(1μg/ml；Sigma)染色染色體DNA。把樣品制成標(biāo)本固定于Permaflour(Lipshaw-Immunonon，Inc.)。用裝備了Ar和HeNe激光器的Zeiss LSM310進行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。將光學(xué)橫斷面數(shù)字化并疊加上Normarski微差干涉反射成像圖。實驗討論據(jù)認(rèn)為Rb對細(xì)胞生長和分化的功能是通過與細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮作用的(Goodrich andlee，Biochem.Biophys.Acta.115543-61(1993)；Weinberg，R.A.，Science2541138-1146(1991))。利用按前面描述的“Rb-夾心體”方法(Shan et al.Mol.Cell.Biol.125631(1992)獲得核分裂激素cDNA。由于Rb功能被調(diào)整為與細(xì)胞分裂周期相一致，因而對該基因在同步化的靈長類細(xì)胞中的表達(dá)模式進行檢查。在猴腎CV1細(xì)胞中核分裂激素的mRNA水平在G1是低的，在G1/S交界期之后逐漸增加，并且在M期達(dá)到峰值(圖1)。其表達(dá)概況不同于其他三個基因轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，它主要是在G1/S交界時表達(dá)；RB，其在整個細(xì)胞周期中都表達(dá)，而S期增高3-4倍(Shan et al.，Mol.Cell.Biol.14299-309(1994))，以及類似Gβ基因(Gullemont et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA864594-4598(1989))，它在整個細(xì)胞周期內(nèi)均勻表達(dá)(Shanet al.，Mol.Cell.Biol.125620-5631(1992))并用作為RNA載樣的內(nèi)對照。在所有檢測的人腫瘤細(xì)胞系包括Hela(子宮頸癌)，Molt4(白血病)，和Saos2(骨癌)中也檢測了核分裂激素mRNA，結(jié)果暗示該基因在人細(xì)胞中被廣泛地轉(zhuǎn)錄。
利用GST或MBP融合蛋白作為抗原(參見實驗步驟部分)在鼠或兔中飼養(yǎng)抗所推導(dǎo)出的基因產(chǎn)物的三個不同區(qū)的三個獨特的多克隆抗體。在用親和層析法純化之后，采用免疫印跡方法鑒別出在Hela細(xì)胞中所有這些稱為α10Bgl，α10Stu和α10C的抗體均識別一種具有分子量約為350Kd(千道爾頓)的細(xì)胞蛋白質(zhì)(圖2)。該蛋白質(zhì)的檢測由相應(yīng)的抗原競爭物特異性地消除(圖2)。在其他細(xì)胞系、包括猴腎CV1，人白血病Molt4和骨癌Saos-2中也檢測到相同蛋白。通過免疫染色(圖3A1)和亞細(xì)胞分級分離，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)定位于核中。α10C的免疫染色的模式不受MBP競爭物的影響(圖3A3)。當(dāng)利用其他抗核分裂激素抗體時獲得了同樣競爭結(jié)果，表明這些抗體產(chǎn)生的染色模式對核分裂激素是特異的。
令人感興趣的是，不管采用何種固定方法，僅20-30％的末同步化的群體是免疫陽性(圖3A1)，表明核分裂激素蛋白質(zhì)的水平也是依賴于細(xì)胞周期的。當(dāng)采用lovastatin處理在早G1將CV1細(xì)胞同步化(Keyomarsi et al.，Cancer Res.513602-3609(1991))，然后釋放1小時，所有細(xì)胞實質(zhì)上是核分裂激素陰性的。當(dāng)在G1/S交界期捕獲中釋放出羥基脲處理的細(xì)胞(Adam和Lindsay，J.Biol.Chem.2421314-1317(1967))，大于90％以上細(xì)胞顯示有核染色反應(yīng)。除核仁以外細(xì)胞核被均勻地標(biāo)記(圖3B1)，這種模式在其余的間期期間保持不變。但是在M期核分裂激素的定位急劇發(fā)生變化。在晚G2或早前期，開始出現(xiàn)亮的染色位置(圖3B2)。在染色體縮合之后，觀察到熒光點的更不連續(xù)區(qū)(圖3B3)。在中期，除紡錘體極區(qū)的某些標(biāo)記外在染色體的中節(jié)可觀察到亮的和不連續(xù)的染色點(圖3B4)。在后期熒光染色點強度減弱；紡錘體區(qū)的染色變?yōu)閮?yōu)勢(圖3B5，B6)。在末期期間，中體被標(biāo)記而細(xì)胞質(zhì)染色減弱(圖3B7，B8)。在胞質(zhì)分離完成之后，沒有觀察到免疫染色。通過對核DNA進行DAPI染色可確定上面描述的細(xì)胞的有絲分裂期。
為了證實核分裂激素定位于著絲粒，將從nocodazole捕獲的CV1細(xì)胞制備的染色體涂片用于進行免疫染色。如圖3C5-C8所示，在著絲粒區(qū)明確地發(fā)現(xiàn)核分裂激素。通過競爭性試驗(圖3，C1-C4)進一步證實著絲粒區(qū)特異性染色。用α10Bgl或α10Stu獲得了同樣的染色模式。這些結(jié)果證明在M期核分裂激素暫時與著絲粒結(jié)合。
為了確證免疫染色結(jié)果，采用Western印跡分析法對同步化的細(xì)胞群進行分析。利用lovastatin(Keyomarsi et al.，Cancer Res.513602-3609(1991))、羥基脲(Adams和Lindsay，J.Biol.Chem.2421314-1317(1967))，以及nocodazole(Zieve et al.，Exp.Cell Res.126397-405(1980))，在細(xì)胞周期的不同階段將CV1細(xì)胞同步化。根據(jù)Rb的表達(dá)模式(圖4B)(Buchkovich et al.，Cell 581097-105(1989)；Chen et al.，Cell 581193-1198(1989))，以及通過流式細(xì)胞計量法(圖4D)證實同步化程度。在G1期實際上沒有檢測到核分裂激素(泳道1-5，泳道14-16)，當(dāng)細(xì)胞進入S期時出現(xiàn)了核分裂激素，而在M期達(dá)到峰值(泳道6-13)并且然后快速消失(泳道14-15)。相反，在整個細(xì)胞周期內(nèi)類似Gβ的蛋白質(zhì)的含量保持不變(圖4C)。除蛋白質(zhì)量上有差異以外，在SDS-PAGE上核分裂激素的遷移率逐漸降低，表明可能發(fā)生了轉(zhuǎn)譯后的修飾。出現(xiàn)多種慢速遷移的核分裂激素異構(gòu)型意味著在S期和有絲分裂的早期之間逐步進行修飾。在早中期(nocodazole封阻點)之后，僅存在最慢的遷移形式并且此后很快消失。
推測類似于RB的核分裂激素的遷移性的變化是由于磷酸化作用引起的。為了驗證這種假設(shè)，用32P-正磷酸將在S期同步化的細(xì)胞進行放射性標(biāo)記。然后將核分裂激素進行免疫沉淀并用牛腸堿性磷酸酶(CIAP)進行處理。如圖5B所示，可用32P標(biāo)記核分裂激素并且通過與CIAP保溫可除去被標(biāo)記的基團。然后用抗核分裂激素的抗體吸印相同凝膠以證實是否存在末標(biāo)記的核分裂激素(圖5A)。用在M期同步化的細(xì)胞進行類似的試驗(圖5C)；這里通過用CIAP處理可將具有最慢遷移率的核分裂激素的異構(gòu)形式轉(zhuǎn)變?yōu)樽羁斓倪w移形式，因此證明磷酸化是遷移性改變的唯一原因。多個較慢遷移帶的存在表明磷酸化的程度或者特異性是有差異的。核分裂激素磷酸化作用的短暫的模式直接與其空間重建相一致。意味著磷酸化作用是這些動力學(xué)變化的關(guān)鍵。在細(xì)胞周期演變期間借助于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的磷酸化而調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)是公知的。雖然核分裂激素沒有CDKs的典型的保守磷酸化作用位點[即(ST)PX(KR)](Shenoy et al.，Cell 57763(1989))，但是有4個脯氨酸衍生物的激酶位點[即(ST)P(KR)]以及5個cAMP或cGMP依賴性激酶位點(Feramisco et al.，J.Biol.Chem.2554240-4245(1980)以及Glass et al.，J.Biol.Chem.261-2987-2993(1986))，表明有多個潛在的位點可發(fā)生磷酸化。
由于分離出的核分裂激素作為Rb結(jié)合蛋白的候選物，在哺乳動物細(xì)胞中檢測Rb與核分裂激素的相互作用。所述實施過程大多數(shù)安排在M期，因為(1)在G1期未檢測到核分裂激素；(2)在S期核分裂激素相對而言是不可溶的以及(3)在S期僅存在少量或不存在次級磷酸化的Rb，已證明所述次級磷酸化的Rb結(jié)合了細(xì)胞蛋白質(zhì)。利用在早中期用nocodazole處理而同步化的CV1細(xì)胞，與抗Rb單克隆抗體11D7發(fā)生免疫共沉淀以驗證所述作用。如圖6所示，核分裂激素與Rb蛋白質(zhì)發(fā)生共免疫沉淀(圖6泳道3和5)。在同樣條件下，由抗細(xì)菌GST的單克隆抗體形成的免疫沉淀中沒有檢測到核分裂激素(圖6泳道2和4)。
為了精確地定義對與Rb結(jié)合起作用的核分裂激素區(qū)，將含有C-末端區(qū)的約60Kd部分的原始分離到的克隆AP10與麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)相融合并在大腸桿菌中表達(dá)。將含AP10的缺失片段(圖7，泳道C)，和猴腎病毒40(SV40)的大T抗原的開頭300個氨基酸的四個其他構(gòu)建體與MBP融合并表達(dá)。將單獨的MBP用作負(fù)對照。將這七個MBP融合蛋白(圖7，泳道8-14)制成印跡并用“Rb-夾心體”探測(Shan et al.，Mol.Cell.Biol.125620-5631(1992))(圖7，泳道1-7)。僅含有核分裂激素的C-末端211個氨基酸的融合蛋白與R b相結(jié)合(圖7，泳道2，5，6)，用MBP-T抗原作為陽性對照(泳道1)。進行序列比較后結(jié)果表明核分裂激素的氨基酸殘基2328-2360與E2F-1的已知Rb結(jié)合區(qū)的周圍區(qū)具51％同源性并具27％等同性(Helin et al.，Cell 70337-350(1992)(圖7，泳道D)。
為了進一步證明核分裂激素的這一區(qū)域足以與Rb結(jié)合，將含有2,330-2,375的氨基酸殘基的核分裂激素片段與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合以表達(dá)融合蛋白GST-1045。如圖7所示，GST-T抗原(泳道15)和GST-1045(泳道17)都與Rb結(jié)合，而GST(泳道16)單獨不與Rb結(jié)合。因此，根據(jù)包含在細(xì)胞裂解液中的其免疫沉淀作用以及用“Rb-夾心體”直接探測含核分裂激素的Westerm印跡，表明核分裂激素可以與Rb結(jié)合。
為了進一步確定核分裂激素的特性，對全長cDNA全部進行測序并推導(dǎo)出其一級氨基酸序列。由“Rb-夾心體”篩選法(Shan et al.，Mol.Cell.Biol.125620-5631 (1992))原始分離的4個cDNA克隆共有約2kb的相同的3’序列。對幾個不同的cDNA文庫進行多次篩選分離到長為8,789kb的一系列重疊克隆(圖8A)。7,446bp的最長的開放式閱讀框架(ORF)編碼由2,482氨基酸殘基組成的酸性蛋白質(zhì)(pI4.8)。在第一個ATG的上游的所有三個開放式閱讀框架中存在多個終止密碼，明顯地表示由這些克隆定義的cDNA序列是完整長度(圖8B)。
所推導(dǎo)出的核分裂激素的氨基酸序列表明它具有新穎性。它與GENEBANK中的已知蛋白質(zhì)沒有明顯的同源性。令人感興趣的是，可預(yù)計該蛋白質(zhì)含有一組帶強電荷的串聯(lián)的重復(fù)區(qū)，該重復(fù)區(qū)由兩個脯氨酸殘基分隔開(圖8C)。第一重復(fù)區(qū)(從1,480-1,657殘基)與第二重復(fù)區(qū)(從1,662-1,839殘基)具62％等同性。這種內(nèi)部重復(fù)區(qū)的兩側(cè)為兩個由七個亮氨酸構(gòu)成的重復(fù)序列區(qū)域(Landschultz et al.，Science 2401759-1763(1988))。另外，發(fā)現(xiàn)兩個亮氨酸重復(fù)序列靠近N-末端區(qū)；另兩個緊靠C-末端區(qū)。可預(yù)言該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)幾乎呈α-螺旋形，除了最C端的220個殘基區(qū)。該C-末端區(qū)是堿性的(pI10.02)，富含脯氨酸，含有一個二分核靶信號(Dingwall和Laskey，TIBS 16478-481(1991))以及Rb結(jié)合區(qū)。
核分裂激素的細(xì)胞依賴性表達(dá)以及它與動粒/著絲粒的物理聯(lián)系表明在M期該蛋白質(zhì)起作用。為了進一步證實這種看法，利用pCEP4載體在CV1細(xì)胞中表達(dá)了在其N-末端(構(gòu)建體“A”到“E”，圖9)附加標(biāo)志表位(Hopp et al.，Biotech61205-1210(1988)的全長核分裂激素和被截短的突變核分裂激素。該載體利用CMV啟動子以啟動轉(zhuǎn)錄，攜帶用于選擇的新霉素抗性基因，并且可游離復(fù)制(Invitrogen，La Jolla，CA)。通過用(i)鼠單克隆抗標(biāo)志抗體和Texas Red結(jié)合的抗鼠IgG二級抗體以及(ii)兔多克隆抗核分裂激素抗體(α10C，用于鑒別核分裂激素的C-末端)以及結(jié)合了熒光素異硫氰酸鹽(FITC)的抗兔IgG二級抗體進行的間接免疫熒光分析可證實附加表位蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖10)?！癆”和“E”融合蛋白定位于核中，在胞質(zhì)中具有其他的可變的染色。但是所有三種C-末端被截短的突變體(“B”“C”，“D”)絕對地定位于胞質(zhì)，與在核分裂激素C-末端中發(fā)現(xiàn)的核靶信號相一致(圖8B)。
為了闡明過量表達(dá)對細(xì)胞周期演變的作用，在轉(zhuǎn)染三天之后采用兩種參數(shù)的流式細(xì)胞計數(shù)器對CV1細(xì)胞進行分析。如在表1中概括的，與非表達(dá)群相比，在表達(dá)五種構(gòu)建體中任何一種的細(xì)胞中，具4N DNA含量的細(xì)胞組分(G2/M期)大大地增高，而具S期DNA含量的細(xì)胞組分可變地降低。令人感興趣的是，在表達(dá)任何核分裂激素構(gòu)建體的細(xì)胞中G0/G1的百分?jǐn)?shù)沒有明顯差異。這些結(jié)果表明可能在G2/M期由這些蛋白質(zhì)抑制了細(xì)胞生長。
*列出了兩個單獨實驗(T1和T2)的結(jié)果；**對于每個構(gòu)建體轉(zhuǎn)染1×106CV1細(xì)胞；轉(zhuǎn)染三天之后收集樣品；表達(dá)核分裂激素蛋白的細(xì)胞標(biāo)記為FITC*，否則相反符號標(biāo)記。
對這些受感染細(xì)胞進行詳細(xì)的顯微鏡觀察分析顯示，數(shù)量逐漸增大的能表達(dá)外源核分裂激素“A”和“E”的細(xì)胞具有較大核(圖10A和E)，表明細(xì)胞被捕獲是在G2/M階段。另一方面，當(dāng)檢查表達(dá)B，C和D的細(xì)胞時，普遍存在不正確細(xì)胞分裂的信號。除多核化的細(xì)胞的數(shù)增加(圖10B，C和D)以外，當(dāng)與標(biāo)志陰性的細(xì)胞相比時，在兩個剛分裂開的細(xì)胞之間可以10-40倍以上的高頻率觀察到染色質(zhì)橋。
在選擇新霉素抗性14天之后在CV1集落中檢測到對細(xì)胞增殖的抑制(表2)。在用“A”，“B”，“C”或“E”構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的樣品中，不論集落大小如何，僅在幾個集落中發(fā)現(xiàn)1-4個標(biāo)志陽性細(xì)胞。通常這些陽性細(xì)胞相互之間呈完全相分隔開形式。表明它們實際不是分裂細(xì)胞?！癉”構(gòu)建體幾乎對細(xì)胞分裂沒有影響；在每個單個集落中，在大部分細(xì)胞中表達(dá)了附加表位。該結(jié)果可用作為“A”、“B”、“C”和“E”構(gòu)建體的有用的陰性對照；再者，意味著對細(xì)胞分裂的抑制是這些構(gòu)建體的特定作用。
*僅分析具有TR+細(xì)胞的集落近來，已經(jīng)克隆了具有相似功能和特性的蛋白質(zhì)。例如，一種具有類似激動素動力的胞質(zhì)蛋白CENP-E具有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的類似模式。在G1和早S期的細(xì)胞幾乎沒有可檢測到的CENP-E，但在晚S和G2/M該蛋白質(zhì)的水平迅速增高。在中板集合期間與動粒結(jié)合的CENP-E在后期重新定位于紡錘體中區(qū)，并且在細(xì)胞分裂末期被棄掉或降解。據(jù)認(rèn)為CENP-E用作為組織中心，促進微管-動粒相互作用，而CENP-E是裝備了激動素和微管-結(jié)合區(qū)的胞質(zhì)蛋白，但核分裂激素是一種具有串聯(lián)重復(fù)區(qū)和多個由七個亮氮酸組成的重復(fù)區(qū)的核蛋白?；诿庖呷旧Y料和核分裂激素的潛在的作用位點，結(jié)果顯示核分裂激素具有作為將染色體與動粒連接起來的橋的作用，從而允許染色體在有絲分裂期間移動。如果這樣，核分裂激素應(yīng)該與CENP，其他著絲粒蛋白/或DNA發(fā)生相互作用。
基于表達(dá)-篩查數(shù)據(jù)，在體外核分裂激素的C-末端的1/4與N-末端被截斷的p56-RB蛋白相結(jié)合。進一步確定核分裂激素的C-末端200個氨基酸殘基對上述結(jié)合起作用。
雖然已參照上述實施例對發(fā)明進行了描述，但應(yīng)該明白各種變化都不違背本發(fā)明精神，因此，本發(fā)明僅限于下文的權(quán)利要求范圍。
權(quán)利要求
1.一種名為核分裂激素的純化哺乳動物蛋白質(zhì)，它具有約350KD的分子量。
2.一種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化哺乳動物蛋白質(zhì)，其中哺乳動物蛋白質(zhì)是一種猴蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化哺乳動物蛋白質(zhì)，其中的哺乳動物蛋白質(zhì)是一種人蛋白質(zhì)。
5.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1的純化哺乳動物蛋白質(zhì)以及藥物學(xué)上可接受的載體。
6.一種分離的核酸分子，它編碼對應(yīng)于哺乳動物核分裂激素蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，其中哺乳動物蛋白質(zhì)是一種人蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，其中核酸分子是一種DNA分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，其中核酸分子是一種cDNA分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，其中核酸分子是一種可通過操作處理連接到RNA轉(zhuǎn)錄啟動子上的RNA分子，連接后又可將其包含于表達(dá)載體中。
11.一種用于生產(chǎn)氨基酸分子的宿主載體系統(tǒng)，該氨基酸分子是核分裂激素蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性片段，所述載體系統(tǒng)是在合適宿主細(xì)胞中含有權(quán)利要求10的載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主載體系統(tǒng)，其中的真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
13.一種能夠與核分裂激素蛋白質(zhì)特異性地形成復(fù)合物的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述抗體，其中的抗體是多克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述抗體，其中將抗體連接到可檢測試劑上。
16.一種與核分裂激素結(jié)合并抑制細(xì)胞分裂或增殖的試劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑，其中所述試劑與核分裂激素結(jié)合，從而抑制核分裂激素介導(dǎo)細(xì)胞分裂或增殖的能力。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑，其中所述試劑是抗核分裂激素抗體。
19.權(quán)利要求18所述抗體的生物學(xué)活性片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑，其中抗核分裂激素抗體是一種多克隆抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑，其中該試劑是一種與天然核分裂激素不同的被磷酸化的核分裂激素突變蛋白。
22.一種分離的核酸分子，它編碼權(quán)利要求16或21所述試劑。
23.一種分離的cDNA分子，它編碼對應(yīng)于權(quán)利要求13所述抗體或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的分離的核酸分子，通過操作后與RNA轉(zhuǎn)錄的啟動子相連。
25.一種表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求24所述的分離的核酸分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的載體，其中載體是質(zhì)驗，粘?；虿《?。
27.一種用于生產(chǎn)氨基酸分子的宿主載體系統(tǒng)，所述氨基酸分子是一種抗核分裂激素抗體或其生物活性片段，所述載體系統(tǒng)在合適宿主細(xì)胞中含有權(quán)利要求26的載體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主載體系統(tǒng)，其中真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
29.生產(chǎn)重組核分裂激素的方法，該方法包括在合適條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，以便使編碼核分裂激素的核酸進行表達(dá)并純化由此獲得的核分裂激素的步驟。
30.一種控制細(xì)胞生長的方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求1或2的純化核分裂激素接觸。
31.一種控制細(xì)胞生長的方法，該方法包括將權(quán)利要求8的核酸插入到細(xì)胞中，并在下列條件下培養(yǎng)細(xì)胞，即核酸分子編碼有效濃度的核分裂激素蛋白質(zhì)從而控制細(xì)胞生長。
32.控制細(xì)胞生長的方法，該方法包括將權(quán)利要求10所述載體插入到細(xì)胞中，并在下列條件下培養(yǎng)細(xì)胞，即使編碼核分裂激素的核酸編碼有效濃度的核分裂激素蛋白質(zhì)，以便控制細(xì)胞生長。
33.一種抑制宿主細(xì)胞分裂和/或增殖的方法，包括將細(xì)胞與權(quán)利要求16或21的試劑接觸。
34.一種抑制宿主細(xì)胞分裂和/或增殖的方法，該方法包括插入權(quán)利要求22所述核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種命名為核分裂激素的新的純化磷蛋白。還提供了對應(yīng)于核分裂激素蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及核酸分子。還提供了使用該蛋白質(zhì)和核酸分子的診斷和治療方法。本發(fā)明還提供了一種編碼核分裂激素的核酸分子及其活性片段。該核酸分子可用于重組生產(chǎn)核分裂激素并且用作為探針。本發(fā)明所述的組合物和方法是以即時的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，所述發(fā)現(xiàn)為對于真核細(xì)胞進入有絲分裂的M期，細(xì)胞內(nèi)需要存在核分裂激素，以及對于細(xì)胞步入下一階段必需要使核分裂激素降解。因此，一種抗核分裂激素的抗體，一種核分裂激素的突變體或非功能類似物通過阻礙細(xì)胞進入M期而抑制有絲分裂細(xì)胞周期，核分裂激素或其功能等同物的過量表達(dá)通過防止細(xì)胞脫離M期而抑制該細(xì)胞周期，通過加入該蛋白質(zhì)或通過基因治療即釋放編碼該蛋白質(zhì)的基因或其功能等同物可以實現(xiàn)所述過量表達(dá)。
文檔編號C12N15/09GK1133616SQ94193875
公開日1996年10月16日 申請日期1994年10月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月22日
發(fā)明者朱學(xué)良, 李文華 申請人:德克薩斯大學(xué)董事會