專利名稱：突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其基因，和氨基酸的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，編碼它的基因，及氨基酸的生產方法，更詳細地說它涉及一種具有使天冬氨酸的反饋抑制失敏的突變的基因及其應用。
背景技術：
磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是一種見于大部分細菌和所有植物的酶。本酶的作用在于天冬氨酸和谷氨酸的生物合成，并為檸檬酸循環(huán)提供C4二羧酸以維持其流動。然而，在使用衍生物發(fā)酵生產氨基酸的過程中，對該酶的效果報導很少，其重要性尚不明確(Atsushi Yokotaand Isamu Shiio，Agric.Biol.Chem.，52，455-463(1988)，Josef Cremer et al.，Appl.Environ.Microbiol.，57，1746-1752(1991)，Petra，G.Peters-Weintisch，F(xiàn)EMS Microbiol.Letters，112，269-274(1993))。
另外，氨基酸是一種作為蛋白質成分廣泛存在于細胞內的化合物，然而，為了經(jīng)濟的能量代謝和物質代謝，其生產被嚴格控制。該控制主要是反饋控制；其中代謝途徑的最終產物抑制催化該途徑前面步驟的一種酶的活性。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在其活性表達方面亦受各種調節(jié)。
例如，就屬于棒狀桿菌屬和埃希氏桿菌屬的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶來說，其活性被天冬氨酸抑制。因此，前面提及的，有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶參予的氨基酸生物合成，也被天冬氨酸抑制。
在先有技術中，開發(fā)了多種技術以在氨基酸發(fā)酵中進行有效生產，通過使用轉化為對反饋控制失敏的突變株已實施亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等的發(fā)酵生產。然而，迄今為止，既沒有轉化為對天冬氨酸抑制失敏的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，也沒有試圖使用它進行天冬氨酸族和谷氨酸族氨基酸的發(fā)酵生產。
另一方面，ppc基因，即一種編碼大腸埃希桿菌(EscherichiaColi)的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因已被克隆，并已測定其堿基順序(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))，然而，即或在同種酶中，也還無對天冬氨酸的抑制失敏的變異型的報導。
本發(fā)明基于前面提及的觀點，其目的是提供一種對天冬氨酸的反饋抑制基本失敏的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，編碼它的基因，和它的應用。
發(fā)明的公開為完成前面提及的目的，本發(fā)明者進行了勤奮研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過用其他氨基酸置換大腸埃希桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的特殊位點上的氨基酸，可以使天冬氨酸的抑制基本失敏，成功地得到了編碼該突變型敏的基因，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明在于一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，它來源于一種屬于埃希桿菌屬的衍生物，其特征在于其中具有使天冬氨酸的反饋抑制失敏的突變，以及編碼該突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列。
本發(fā)明進一步提供包含該DNA片段的屬于埃希桿菌屬或棒狀桿菌的微生物，以及生產氨基酸的方法，其特征在于在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些微生物的任何一種，并將選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的氨基酸從培養(yǎng)基中分離出來。
另外，在本說明書中，編碼該變異體磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列或除此之外還包含啟動子的DNA序列有時僅稱為“本發(fā)明的DNA序列”，“突變型基因”或“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因”。
本發(fā)明在下文中將被詳細說明。<1>突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶本發(fā)明的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下簡稱為“變異型酶”)為屬于埃希桿菌屬的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，它具有使天冬氨酸的反饋抑制失敏的突變。
該突變可為任一使前面提及的反饋抑制基本失敏而不丟失磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的酶活性者。例如，當具有突變的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶存在于埃希桿菌屬微生物的細胞中時，這樣的突變可使細胞對具有下述特性的化合物具有抗性對產生野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的屬于埃希桿菌屬的微生物表現(xiàn)生長抑制作用；在L-谷氨酸或者L-天冬氨酸存在下前述生長抑制作用恢復；并且抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
更具體地說，從磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端計算，可有列舉(1)用賴氨酸置換625位谷氨酸的突變；(2)分別用組氨酸置換222位精氨酸并用賴氨酸置換223位谷氨酸的突變；(3)分別用苯丙氨酸置換288位絲氨酸，用賴氨酸置換289位谷氨酸，用異亮氨酸置換551位蛋氨酸并用賴氨酸置換804位谷氨酸的突變；(4)用蘇氨酸置換867位丙氨酸的突變；(5)用半胱氨酸置換438位精氨酸的突變；和(6)用絲氨酸置換620位賴氨酸的突變。
此外，作為屬于埃希桿菌屬的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，從大腸埃希桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因推定的氨基酸序列(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))，示于序列表2中。另外，包含大腸埃希桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的質粒pT2的完整核苷酸序列，與氨基酸序列一同示于序列表1中。
前述突變型酶被下述本發(fā)明的DNA序列編碼，通過在大腸埃希桿菌等中表達該DNA序列而生產該酶。<2>本發(fā)明的DNA序列和包含它的微生物本發(fā)明的DNA序列是編碼前述突變型酶的DNA序列，并且在編碼屬于埃希桿菌屬的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA片段中，在編碼區(qū)具有使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶對天冬氨酸的反饋抑制失敏的突變。
具體地說，可列舉編碼具有前述(1)至(6)突變的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA序列，例如，在堿基順序表1中，可列舉具有如下之一的DNA序列i)將堿基2109-2111的GAA轉變?yōu)锳AA或AAG的突變；ii)將堿基900-902的CGC轉變?yōu)镃AT或CAC，并將903-905的GAA轉變?yōu)锳AA或AAG的突變；iii)分別將堿基1098-1100的TCT轉變?yōu)門TT或TTC，1101-1103的GAA轉變?yōu)锳AA或AAG，1887-1889的ATG轉變?yōu)锳TT、ATC或ATA，并將2646-2648的GAA轉變?yōu)锳AA或AAG的突變；iv)將堿基2835-2837的GCG轉變?yōu)锳CT、ACC、ACA和ACG中任何一個的突變；v)將堿基1548-1550的CGT轉變?yōu)門GT或TGC的突變；和vi)將堿基2094-2096的AAA轉變?yōu)門CT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC中任何一種的突變。
·將野生型的酶基因或具有其他突變的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因與宿主可接受的載體DNA連接取得的重組DNA進行突變處理，用重組DNA從轉化體實施篩選，這樣得到這樣的突變型基因。也可將產生野生型酶的微生物進行突變處理，產生一個產生突變型酶的突變型株，然后從突變株中篩選突變型基因?？墒褂昧u胺等對重組DNA進行突變處理。另外，當對微生物本身進行突變處理時，可使用通常用于人工突變的藥物或方法。
此外，按照重疊延伸法(overlapping Extension)(Ho，S.N.，Hunt，H.D.Horton，R.M.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.，Gene.77，51-59(1989))，位點特異突變法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth，in Enzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.et al.，Meth，in Enzymol.，154，367(1987))等方法，還可通過向野生型酶基因或具有其他突變的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因中引入例如氨基酸置換、插入及缺失等突變而取得前述突變型基因。這些方法基于一個原則，即非突變的基因DNA被用作一條模板，而在突變位點包含一個失配的合成DNA被用作引物之一，用以合成前述基因DNA的互補鏈，從而引入突變。通過使用這些方法，可在目標位點引起所需的突變。
此外，合成在兩個末端都有限制性酶切端，并包含突變點的兩側的序列，并替換非突變基因的相對應部分，從而引入突變(盒突變方法)。
用于引入突變的，野生型酶基因或具有另一突變的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，可為編碼屬于埃希桿菌屬的微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的任一種。該基因優(yōu)選地測定堿基序列及克隆。如未被克隆，可用PCR等方法將含該基因的DNA片段擴增并分離，然后使用適當?shù)妮d體進行克隆。
作為如上所述的基因，例如，可例舉已被克隆并被測定堿基序列的大腸埃希桿菌的基因。(Fujita，N.Miwa，T.Ishijima，S.，Izui，K.和Katsuki，H.，J.Biochem.，95，909-916(1984))。該基因的編碼區(qū)的序列如SEQ ID NO1(堿基號237-2888)中所示。
可通過使用天冬氨酸的類似物化合物進行載有含突變基因的宿主的篩選。該類似物化合物優(yōu)選具有下列特性。即，它對產野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的屬于埃希桿菌屬的微生物表現(xiàn)生長抑制作用，前述生長抑制作用在存在L-谷氨酸或L-天冬氨酸下恢復，并且它抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。
如果使用微生物的生長抑制作為一項指標，從屬于埃希桿菌屬的微生物例如產野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大腸埃希桿菌HB101中選擇上述類似物化合物抗性的突變株，則更易得到對天冬氨酸的反饋抑制失敏的產磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的宿主微生物。
推薦必須提供一個C4二羧酸結構作為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶抑制劑的基本結構。基于這一觀點，本發(fā)明者篩查了多種化合物。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸埃希桿菌HB101，然后轉至含有DL-2-氨基-4-膦?；宜?、溴琥珀酸、內消旋-2，3-二溴琥珀酸、2，2-二氟琥珀酸、3-溴丙酮酸、α-酮酪酸、α-酮己二酸、DL-蘇-β-羥天冬氨酸、L-天冬氨酸-β-甲酯、α-甲基-DL-天冬氨酸、2，3-二氨基琥珀酸或天冬氨酸-β-肼中任何一種的M 9培養(yǎng)基(含硫胺素20μg/ml及亮氨酸和脯氨酸各3μg/ml)，然后隨時間推移而測定在660nm處培養(yǎng)基的吸光率從而監(jiān)測生長情況。
更進一步，研究了當這些化合物以它們的生長抑制濃度存在時是否可通過加入核酸(尿苷，腺苷各10mg/dl)、谷氨酸或天冬氨酸族氨基酸(天冬氨酸0.025％，蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸各0.1％)使其抑制作用恢復。
作為結果，三種化合物3-溴丙酮酸鹽(3BP)(1)，天冬氨酸鹽-β-肼(AHY)(2)，和D L-蘇-β-羥天冬氨酸鹽(βHA)(3)被選擇。
這些類似物化合物對大腸埃希桿菌的生長抑制作用顯示于
圖1-3。更進一步，在單獨加入前述抑制恢復物質或2或3種前述抑制恢復物質的混合物情況下，大腸埃希桿菌的生長恢復顯示于圖4-6。另外，作為對照，在加入抑制恢復物質而缺乏抑制物質情況下的生長顯示于圖7。順便提及在圖4-7中，添加劑1、2和3分別表示核酸，谷氨酸或天冬氨酸族的氨基酸。
更進一步，研究了類似物化合物對磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性的抑制。按照The Journal of Biochemistry，Vol，67，No.4(1970)中所述方法從大腸埃希桿菌HB101株制備粗制的酶，并按照Eur.J.Biochem.，202，797-803(1991)中所述的方法測定酶的活性。
使在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸埃希桿菌破碎，并將懸液離心取得上清液，該上清液被用作粗制的酶溶液。通過測量在340nm處吸光率的下降進行酶活性的測定，測定系統(tǒng)中含2mM磷酸烯醇丙酮酸鉀，0.1mM NADH，0.1M Tris-乙酸(pH8.5)，1.5U蘋果酸脫氫酶和粗制酶，允許已知能影響該酶活性的乙酰輔酶A以0.1mM的濃度存在。結果顯示于圖8。
根據(jù)上述結果，顯然前述3種化合物抑制大腸埃希桿菌的生長，該抑制作用不能單被核酸恢復，但該抑制作用可通過加入谷氨酸或天冬氨酸族的氨基酸被恢復。因此，這些類似物化合物被假定為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的選擇性抑制劑。
如下述實施例中所述，通過應用這些化合物，本發(fā)明成功地選擇了產突變型磷酸烯醇丙酮酸鹽的大腸埃希桿菌。
當使用前述化合物篩選具有目標突變型酶基因的轉化子并且取得重組DNA時，則得到了該突變型酶基因。另一種方案是，在對微生物本身的突變處理情況下，當使用前述化合物篩選具有目標突變型酶基因的突變株時，含該目標突變型酶基因的DNA片段被從該株分離，并與適當?shù)妮d體連接，從而取得該突變型酶基因。
另一方面，作為本發(fā)明者注意到精氨酸殘基在大腸埃希桿菌的天冬氨酸鹽結合蛋白中的重要性(Krikos，A.，Mouth，N.，Boyd，A，and Simon，M.I.Cell，33，615-622(1983)，Mowbray，S.Land Koshlan，D.E.J.Biol.Chem.，264，15638-15643(1990)，Milburn，M.V.，Prive，G.G.，Milligan，D.L.，Scott，W.G.，Yeh，J.Jancarik，J.，Koshland，D.E.and Kim，S.H.，Science，254，1342-1347(1991))勤奮研究的結果，發(fā)現(xiàn)通過將磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的438位的精氨酸轉變?yōu)榘腚装彼幔於彼岬囊种谱饔没臼?。為?38位精氨酸轉化為半胱氨酸，可將編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的438位精氨酸的密碼子轉變?yōu)榘腚装彼岬拿艽a子。例如，在SEQ ID NO1中，1548-1550序號核苷酸的CGT可被轉變?yōu)門GT或TGC。
更進一步，本發(fā)明者應用2，4，6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)(TNBS)對磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的賴氨酸殘基進行化學修飾，該TNBS是一種用于化學修飾蛋白質的賴氨酸殘基的化合物。在修飾反應中，允許能被用作磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制劑的蘋果酸一起存在。即，可假定在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的結合位點附近的賴氨酸殘基可被結合的蘋果酸保護而不被化學修飾。作為結果，假定620位賴氨酸殘基對于蘋果酸結合于磷酸烯醇丙酮酸鹽是重要的，并發(fā)現(xiàn)通過將620位賴氨酸殘基轉變?yōu)榻z氨酸殘基使天冬氨酸的反饋抑制失敏而維持磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。為將620位賴氨酸殘基轉變?yōu)榻z氨酸殘基，可將編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因的620位賴氨酸的密碼子轉變?yōu)榻z氨酸的密碼子。例如，在SEQ ID NO1中，具有核苷酸序列2094-2996的AAA或被TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC置換。
按照諸如重疊延伸方法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.and Pease，L.R.，Gene，77，51-59(1989))，位點特異突變方法(Kramer，W.and Frits，H.J.，Meth.inEnzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.et al.，Meth inEnzymol.，154，367(1987))等方法，密碼子的轉變可通過向作為野生型酶基因或具有另一突變的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因中引入諸如氨基酸置換、插入、缺失等突變而達到。這些方法基于這樣一個原則，即將非突變的基因DNA用作模板，而在突變點包含一處失配的合成DNA用作引物之一以合成前述基因DNA的互補鏈，從而引入突變。使用這些方法，有可能在目標位點引起所希望的突變。
另一種方案是，即合成在兩末端均有限制性酶末端并包含突變點兩側的一段序列，并替換非突變基因的對應部分，從而可引入突變(盒突變方法)。
該編碼帶按上述引入的突變的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA片段使用適當?shù)乃拗?載體系統(tǒng)表達，因而能夠產生突變型酶。另一種方案是，甚至通過將本發(fā)明的DNA片段整合入宿主染色體DNA，可產生目標突變型酶。
作為宿主，可例舉屬于埃希桿菌屬的微生物，例如，大腸埃希桿菌、棒狀桿菌等。棒狀桿菌包括屬于棒桿菌屬的桿菌，迄今一直分類于短桿菌屬，但現(xiàn)在已統(tǒng)一入屬于棒桿菌屬的桿菌的屬于短桿菌屬的桿菌，和與屬于棒桿菌屬的桿菌緊密相關的屬于短桿菌屬的桿菌。順便提及，優(yōu)選地用于氨基酸生產的宿主將敘述如下。
另一方面，作為載體DNA，優(yōu)選質粒載體，并且優(yōu)選那些在宿主細胞中能自我復制的。當宿主是大腸埃希桿菌時，例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等被例舉。另外，也可應用噬菌體DNA載體。
進一步，當宿主為棒狀桿菌時，可用的載體及包含它們的宿主例舉如下。順便提及，國際保藏中心的保藏號顯示于括號中。
pAJ655大腸埃希桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒桿菌SR8201(ATCC 39135)pAJ844大腸埃希桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒桿菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611大腸埃希桿菌AJ11884(FERMBP-138)pAJ3148谷氨酸棒桿菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440枯草桿菌AJ11901(FERM BP-140)可按下述方法從保藏的微生物取得這些載體。使用溶菌酶和SDS使在對數(shù)生長期收集的細胞被溶菌，在30000g離心以從溶解產物取得上清液，向其中加入聚乙二醇以分離和提純載體，使用氯化銫-溴化乙錠平衡密度梯度離心法。
為了用將本發(fā)明的DNA序列插入前述載體得到的重組載體轉化大腸埃希桿菌，可以使用通常用于大腸桿菌的轉化的方法，例如一種將細胞用氯化鈣處理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M.and HigaA.，J.Mol.Biol.，53，159(1977))或類似方法。
更進一步，作為轉化棒狀桿菌的方法，還有前述的將細胞用氯化鈣處理的方法，或者一種在特定的，可以參入DNA的生長期實現(xiàn)參入的方法。(Duncan，C.H.et al與枯草桿菌相關的報告)。更進一步，參入細菌細胞可通過形成易于參入質粒DNA的DNA接受體的原生質體或原生質球來完成。這些對枯草桿菌，放線菌和酵母是公知的(Chang，S et al.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)，Bibb et al.，Natuer，274，398(1978)，Hinnen，A et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929(1978))。另外，一種轉化棒狀桿菌的方法公布在日本公開專利2-207791號。
為表達前述宿主中本發(fā)明的DNA序列，可使用在微生物中有效地起作用的啟動子例如lac，trp，PL等，或者當本發(fā)明的DNA序列包含一個磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的啟動子時，可將它用作啟動子。換言之，將棒狀桿菌用作宿主時，也可能使用來源于屬于短桿菌屬的公知的trp啟動子(日本公開專利62-244382號)及其同類物。
更進一步，如上所述，將本發(fā)明的DNA序列插入能自我復制的載體DNA并引入宿主，以使宿主將其作為質粒包含是可接受的，也可接受通過使用轉座子(transposon)方法(Berg，D.E and Berg，C.M.，Bi o/Technol.，1，41 7(1 983))，Mu噬菌體(日本公開專利2-109985號)或同源重組(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))將本發(fā)明的DNA序列整合一種微生物的染色體。另外，為將本發(fā)明的DNA整合入棒狀桿菌，使用公開在日本公開專利5-7491號的溫度敏感質粒是可能的。
當如上所述用本發(fā)明的DNA序列轉化的微生物被培養(yǎng)，并且DNA序列被表達時，即得到突變型酶。通過在酶反應系統(tǒng)中加入天冬氨酸測定活性，可明確是否該突變型酶得到了對天冬氨酸的失敏的反饋抑制。有可能使用分光光度測定法(Yoshinage，T.，Izui，K.and katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))和類似方法測定酶活性。
更進一步，本發(fā)明的DNA序列編碼對天冬氨酸的反饋抑制失敏的突變型酶，因而包含該DNA序列的微生物可用于發(fā)酵生產如下所述的天冬氨酸族和谷氨酸族的氨基酸。
在如下的實施例中描述的包含該突變型酶基因的大腸埃希桿菌AJ12907、AJ12908、AJ12909和AJ12910于1993年8月3日以保藏號FERM P-13774、FERM P-13775、FERM P-13776、FERM P-13777保藏于工業(yè)科學與技術院全國生物科學和人類技術研究所(National Institute of Bioscience and HumanTechnology of Agency of Industrial Science andTechnology(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaraki-Ken，日本；郵編305)，于1994年7月11日從初始保藏中心轉移至基于布達佩斯條約的國際保藏中心，并按這一順序分別以保藏號FERM BP-4734、FERM BP-47345、FERM BP-4736、FERM BP-4737入藏。<3>氨基酸的生產方法可通過在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)包含本發(fā)明的DNA序列的微生物生產氨基酸，并分離所產生的氨基酸。作為這樣的氨基酸，可例舉L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸。
被引入本發(fā)明的DNA序列以用于生產各種氨基酸的優(yōu)選宿主，及培養(yǎng)方法將例舉如下。(1)本發(fā)明的氨基酸生產方法優(yōu)選的宿主(i)L-賴氨酸生產優(yōu)選的宿主作為用于按照本發(fā)明的L-賴氨酸生產的宿主，可例舉屬于埃希桿菌屬的桿菌，優(yōu)選產L-賴氨酸的大腸埃希桿菌。具體地，可例舉一種對賴氨酸類似物具有抗性的突變株。這樣的賴氨酸類似物是那些抑制屬于埃希桿菌屬的微生物生長，但在培養(yǎng)基中有L-賴氨酸共存時該抑制作用全部或部分失敏者。例如，有草酸賴氨酸，賴氨酸氧肟酸鹽，S(2-氨基乙基)-半胱氨酸(下文簡稱為“AEC”)，γ-甲基賴氨酸、α-氯己內酰胺和類似物質?？赏ㄟ^對屬于埃希桿菌屬的微生物施予常規(guī)的人工突變處理取得對這些賴氨酸類似物具有抗性的突變株。具體地，作為用于L-賴氨酸生產的細菌株，可例舉大腸埃希桿菌AJ11442(入藏號為FERM P-5084，見日本公開專利56-18596號第471頁左下欄)。
另一方面，已被用作產L-賴氨酸菌的各種棒狀桿菌的人工突變株也可用于本發(fā)明。這些人工突變株如下AEC抗性的突變株；其生長需要氨基酸如L-高絲氨酸的突變株(日本專利出版物第48-28078和56-6499號)；表現(xiàn)AEC抗性并需要氨基酸如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸等的突變株(美國專利第3708395和3825472號)；表現(xiàn)對DL-α-氨基-ε-己內酰胺、α-氨基-十二烷內酰胺、醌式和N十二烷亮氨酸抗性的產L-賴氨酸突變株；表現(xiàn)對草酰乙酸鹽脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶的抑制劑抵抗的產L-賴氨酸突變株(日本公開專利第50-53588、50-31093、52-102498、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、56-39778號，及日本專利出版物第53-43591和53-1833號)；需要環(huán)己六醇或乙酸的產L-賴氨酸突變株(日本公開專利第55-9784和56-8692號)；表現(xiàn)對氟丙酮酸鹽或不低于34℃的溫度敏感的產L-賴氨酸突變株(日本公開專利第55-9783和53-86090號)；表示對乙二醇抗性并產L-賴氨酸的短桿菌屬或棒桿菌屬的突變株(見美國專利申請編號333455)。
下面列舉的是用于賴氨酸生產的具體的棒狀桿菌乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12031(FERM-BP277)，見日本公開專利60-62994號第525頁；
乳酸發(fā)酵短桿菌ATCC39134，見日本公開專利60-62994號第473頁右下欄；乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3463(FERM-P 1987)，見日本專利出版物第51-34477號。
另外，下述棒狀桿菌的野生株也可以同樣方式用于本發(fā)明。
嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870乙酰谷氨酸棒桿菌ATCC15806帚石南棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13032ATCC13060(分枝短桿菌)ATCC14020(乳酸發(fā)酵短桿菌)ATCC13869(百合棒桿菌)ATCC15990棲糖蜜棒桿菌ATCC17965解糖短桿菌 ATCC14066immariophilum短桿菌 ATCC14068玫瑰色(roseum)短桿菌ATCC13825暗黃短桿菌 ATCC13826thiogenitalis短桿菌 ATCC19240嗜氨細桿菌 ATCC15354(ii)L-蘇氨酸生產優(yōu)選的宿主大腸埃希桿菌B-3996(RIA 1867)，見日本公開專利第3-501682(PCT)；大腸埃希桿菌AJ12349(FERM-P 9574)，見日本公開專利第2-458號第887頁左上欄；
大腸埃希桿菌AJ12351(FERM P-9576)，見日本公開專利第2-458號第887頁右下欄；大腸埃希桿菌AJ12352(FERM P-9577)，見日本公開專利第2-458號第888頁左上欄；大腸埃希桿菌AJ11332(FERM P-4898)，見日本公開專利第2-458號第889頁左上欄；大腸埃希桿菌AJ12350(FERM P-9575)，見日本公開專利第2-458號第889頁左上欄；大腸埃希桿菌AJ12353(FERM P-9578)，見日本公開專利第2-458號第889頁右上欄；大腸埃希桿菌AJ12358(FERM P-9764)，見日本公開專利第2-458號第890頁左上欄；大腸埃希桿菌AJ12359(FERM P-9765)，見日本公開專利第2-458號第890頁左上欄；大腸埃希桿菌AJ11334(FERM P-4900)，見日本公開專利出版物第1-29559號第201頁第6欄；大腸埃希桿菌AJ11333(FERM P-4899)，見日本公開專利出版物第1-29559號第201頁第6欄；大腸埃希桿菌AJ11335(FERM P-4901)，見日本公開專利出版物第1-29559號第202頁第7欄。
下面的細菌株系作為棒狀桿菌而例舉乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11188(FERM P-4190)，見日本公開專利第60-87788號第473頁右上欄；谷氨酸棒桿菌AJ11682(FERM BP-118)，見日本公開專利出版物第2-31956號第230頁第8欄；
暗黃短桿菌AJ11683(FERM BP-119)，見日本公開專利出版物第2-31956號第231頁第10欄；(iii)L-蛋氨酸生產優(yōu)選的宿主用于L-蛋氨酸生產的菌株例舉如下大腸埃希桿菌AJ11457(FERM P-5175)，見日本公開專利第56-35992號第552頁右上欄；大腸埃希桿菌AJ11458(FERM P-5176)，見日本公開專利第56-35992號第552頁右上欄；大腸埃希桿菌AJ11459(FERMP-5177)，見日本公開專利第56-35992號第552頁右上欄；大腸埃希桿菌AJ11539(FERM P-5479)，見日本公開專利第56-144092號第435頁左下欄；大腸埃希桿菌AJ11540(FERM P-5480)，見日本公開專利第56-144092號第435頁左下欄；大腸埃希桿菌AJ11541(FERM P-5481)，見日本公開專利第56-144092號第435頁左下欄；大腸埃希桿菌AJ11542(FERM P-5482)，見日本公開專利第56-144092號第435頁左下欄。(iv)L-天冬氨酸生產優(yōu)選的宿主用于L-天冬氨酸生產的菌株例舉如下暗黃短桿菌AJ3859(FERM P-2799)，見日本公開專利第51-61689號第524頁左上欄；乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3860(FERMP-2800)，見日本公開專利第51-61689號第524頁左上欄；嗜乙酸乙酸棒桿菌AJ3877(FERM P-2803)，
見日本公開專利第51-61689號第524頁左上欄；谷氨酸棒桿菌AJ3876(FERM P-2802)，見日本公開專利第51-61689號第524頁左上欄；(v)L-異亮氨酸優(yōu)選的宿主大腸埃希桿菌KX141(VKPM-B 4781)(見日本公開專利第4-33027號第45段)被作為屬于埃希桿菌屬的桿菌例舉，而乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12404(FERM P-10141)(見日本公開專利第2-42988號第603頁左下欄)和暗黃短桿菌AJ12405(FERM P-10142)(見日本公開專利第2-42988號第524頁左下欄)則被作為棒狀桿菌例舉。(vi)L-谷氨酸生產優(yōu)選的宿主下列菌株被作為屬于埃希桿菌屬的菌株例舉大腸埃希桿菌AJ12628(FERMP-12380)，見法國專利出版物第2 680 178號(1993)；大腸埃希桿菌AJ12624(FERM P-12379)，見法國專利出版物第2 680 178號(1993)；下列菌株被作為棒狀桿菌例舉乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12745(FERM BP-2922)，見日本公開專利第3-49690號第561頁右下欄；乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12746(FERM BP-2923)，見日本公開專利第3-49690號第561頁左上欄；乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12747(FERM BP-2924)，見日本公開專利第3-49690號第562頁左上欄；乳酸發(fā)酵短桿菌AJ12748(FERM BP-2925)，見日本公開專利第3-49690號第562頁左上欄；
暗黃短桿菌ATCC14067，見日本公開專利第5-3793號第3頁表1；谷氨酸棒桿菌ATCC21492，見日本公開專利第5-3793號第3頁表1。(vii)L-精氨酸生產優(yōu)選的宿主下列菌株被作為屬于埃希桿菌屬的細菌例舉大腸埃希桿菌AJ11593(FERM P-5616)，見日本公開專利第57-5693號第468頁左上欄；大腸埃希桿菌AJ11594(FERM P-5617)，見日本公開專利第57-5693號第468頁右上欄；下列菌株被作為棒狀桿菌例舉暗黃短桿菌AJ12144(FERM P-7642)，見日本公開專利出版物第5-27388號第174頁第4欄；谷氨酸棒桿菌AJ12145(FERM P-7643)，見日本公開專利出版物第5-27388號第174頁第4欄；暗黃短桿菌ATCC21493，見日本公開專利第5-3793號第3頁表1；谷氨酸棒桿菌ATCC21659，見日本公開專利第5-3793號第3頁表1。(viii)L-脯氨酸生產優(yōu)選的宿主下列菌株被作為屬于埃希桿菌屬的細菌例舉大腸埃希桿菌AJ11543(FERM P-5483)，見日本公開專利第56-144093號第425頁左下欄；大腸埃希桿菌AJ11544(FERM P-5484)，見日本公開專利第56-144093號第435頁左下欄。
下列菌株被作為棒狀桿菌例舉乳酸發(fā)酵短桿菌AJ11225(FERM P-4370)，見日本公開專利第60-87788號第473頁左上欄；暗黃短桿菌AJ11512(FERM P-5332)，見日本公開專利出版物第62-36679號第185頁第2欄；暗黃短桿菌AJ11513(FERMP-5333)，見日本公開專利出版物第62-36679號第185頁第2欄；暗黃短桿菌AJ11514(FERM P-5334)，見日本公開專利出版物第62-36679號第185頁第2欄；谷氨酸短桿菌AJ11522(FERM P-5342)，見日本公開專利出版物第62-36679號第185頁第2欄；谷氨酸短桿菌AJ11523(FERM P-5343)，見日本公開專利出版物第62-36679號第185頁第2欄。(2)培養(yǎng)方法培養(yǎng)前述宿主的方法與在先技術中產氨基酸微生物的培養(yǎng)方法無特殊區(qū)別。即，使用含碳源，氮源和無機離子的普通培養(yǎng)基，可任選有機的微量營養(yǎng)素例如氨基酸、維生素等。
作為碳源、葡萄糖、蔗糖、乳糖及其同類物質，以及淀粉水解酶、乳清、糖蜜和含有它們的同類物質可被應用。作為氮源、氨氣、銨鹽水溶液、銨鹽和類似物質可被應用，順便提及，當對氨基酸或類似物質營養(yǎng)需求的突變株被用作宿主時，需要向培養(yǎng)基中適當添加該菌株需要的營養(yǎng)素如氨基酸或類似物質。賴氨酸生產用的培養(yǎng)基的一個實例顯示于下面表1作為用于氨基酸生產的一種培養(yǎng)基。順便提及，碳酸鈣是在另外消毒后加至其它成分的。
表1培養(yǎng)基成分 混合量葡萄糖 5g/dl硫酸銨 2.5g/dl磷酸二氫鉀 0.2g/dl7水硫酸鎂 0.1g/dl酵母提取物 0.05g/dl鹽酸硫胺 1μg/l生物素 300μg/l7水硫酸亞鐵1mg/dl4水硫酸錳 1mg/dl碳酸鈣 2.5g/dl(pH7.0)培養(yǎng)在有氧條件下進行，適當?shù)乜刂婆囵B(yǎng)基的pH值和溫度，直至氨基酸的產生和積累基本停止。為收集培養(yǎng)基中這樣積累的氨基酸，可使用常規(guī)的方法。
圖的簡要描述圖1顯示3-溴丙酮酸鹽的生長抑制作用。
圖2顯示天冬氨酸鹽-β-肼的生長抑制作用。
圖3顯示DL-蘇-β-羥天冬氨酸鹽的生長抑制作用。
圖4顯示抑制恢復物質對3-溴丙酮酸鹽的作用。
圖5顯示抑制恢復物質對天冬氨酸鹽-β-肼的作用。
圖6顯示抑制恢復物質對DL-蘇-β-羥天冬氨酸鹽的作用。
圖7顯示生長恢復因子對生長的影響。
圖8顯示生長抑制物質對磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制。
圖9顯示天冬氨酸對本發(fā)明的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制。
圖10顯示天冬氨酸對本發(fā)明磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制。
圖11顯示向磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因引入突變的一種方法。
圖12顯示天冬氨酸對野生型和從N-末端計算第438位精氨酸被半胱氨酸替換的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性的影響。
圖13顯示天冬氨酸對野生型和從N-末端計算第620位賴氨酸被絲氨酸替換的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性的影響。
實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方法參照實施例本發(fā)明將在下面被更具體地闡述。
實施例1突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的獲得使用通過將已被克隆并測定堿基序列的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因插入載體質粒pBR322的SalI位點獲得的質粒pS2制備突變型基因。pS2有一個氨芐青霉素抗藥基因做為一個抗藥標記基因(Sabe，H.etal.，Gene，31，279-283(1984))。pS2所含的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列與前述質粒pT2中所含的相同。
pS2 DNA用羥胺處理溶液(20μg pS2 DNA 0.05M磷酸鈉(pH6.0)，1mM EDTA，0.4M羥胺)在75℃處理2小時。由于羥胺處理受pH的影響，將用氫氧化鈉調pH值至6.0的80μl 1M鹽酸羥胺和1mM EDTA溶液，100μl 0.1M磷酸鈉(pH6.0)和1mMEDTA溶液，和含2μg pS2 DNA的TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA)緩沖液混合，最后加水至200μl。
上述條件是當用處理后的pS2轉化大腸埃希桿菌HB101時，轉化子在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中在處理前狀態(tài)下具有0.2％生存率的條件。
用經(jīng)羥胺處理的pS2轉化大腸埃希桿菌HB101，將大腸埃希桿菌鋪在含氨芐青霉素的固體平板培養(yǎng)基上以獲得約10000克隆的轉化子。將它們懸溶于液體培養(yǎng)基中，并鋪在含有作為天冬氨酸類似物化合物的3-溴丙酮酸鹽(3BP)、天冬氨酸鹽-β-氧肟酸鹽(AHX)、天冬氨酸鹽-β-肼(AHY)和D L-蘇-β-羥天冬氨酸鹽(βHA)中任意一種的固體板狀培養(yǎng)基上，濃度接近最小抑制濃度，以使每個平板具有103-105個細胞，然后篩選生長的克隆。
從這樣得到的100株類似物化合物抗性株，它們中的每一株產生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶均按照The Journal of Biochemistry，Vol 67，No.4(1970)中所述方法被部分提純，并研究類似物化合物對酶活性的抑制作用。酶活性的測定按照上述同樣的方法進行。
更進一步，從產具有不被類似物化合物抑制的活性的突變型酶的菌株中分離出質粒，并將其引入作為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶缺乏株的大腸埃希桿菌pCR1(Sabe，H.et al.，Gene，31，279-283(1984))，以證實突變型酶的產生。
這樣得到了5個含有突變型酶基因的轉化子。作為測定這些基因的堿基序列的結果，2株具有同樣的突變，得到4種突變基因。含有它們的轉化子被稱為AJ12907、AJ12908、AJ12909和AJ12910，于1993年8月3日被保藏于工業(yè)科技院全國生物科學和人類技術研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本；郵編305)，入藏號FERM P-13774、FERM P-13775、FERM P-13776和FERM P-13777，于1 994年7月11日從初始保藏中心轉移至基于布達佩斯條約的國際保藏中心，并按這一順序分別以保藏號FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737入藏。更進一步，含有它們的質粒按此順序分別被稱為pBP5、pHA19、pBP122和pR6。每一質粒中包含的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因所含有的突變顯示于表2。表中的數(shù)值代表SEQ ID NO1中的核苷酸序號或氨基酸序號。
表2轉化子 質粒突變 與突變相關的氨基酸置換AJ12907 pBP52109G→A625Glu→LysAJ12908 pHA19901G→A222Arg→His903G→A223Glu→LysAJ12909 pBP1221099C→T288Ser→Phe1101G→A289Glu→Lys1889G→A551Met→Ile2646G→A804Glu→LysAJ12910 pR62835G→A867Ala→Thr附帶說明對AJ12907和AJ12909在含有500μg/ml 3BP的培養(yǎng)基中進行選擇，對AJ12908在含1000μg/ml βHA的培養(yǎng)基中而對AJ12910在含500μg/ml AHY的培養(yǎng)基中進行選擇。
實施例2突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶研究了前述4種轉化子產生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶對天冬氨酸的敏感性。這些菌株缺乏來源于宿主的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，因而所產生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶來源于質粒。
按照公知的方法研究對天冬氨酸的敏感性(Yoshinaga，T.，Izui，K.and Katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))。即，作為每一種轉化子或含有pS2的大腸埃希桿菌在乙酰輔酶A存在下產生的酶活性的測定結果，對天冬氨酸的敏感性測定的結果如圖9和10中。其中乙酰輔酶A公知在0.1mM或1mM濃度下在活性測定系統(tǒng)中可影響該活性。
按照該結果，顯然當天冬氨酸以高濃度存在時野生型酶失去其活性，而本發(fā)明的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶則基本繼續(xù)維持其活性。
實施例3用引入突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大腸埃希桿菌發(fā)酵生產L-蘇氨酸作為大腸埃希桿菌的產蘇氨酸菌，B-3996株(日本公開專利第3-501682號(PCT))在迄今已知者中具有最高的生產能力。因此在評價突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶時，B-3996被用作宿主。該B-3996株被保藏在遺傳學和工業(yè)微生物培養(yǎng)研究所(ResearchInstitute for Genetics and Industrial MicroorganismBreeding)，登記號為RIA1867。進一步，選擇pBP5作為被評價的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，對其進行一項實驗。
按照Hanahan的方法(J.Mol.Biol.，Vol.106，p577(1983))，將具有突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的質粒pBP5引入大腸桿菌B-3996，并將轉化子分離。作為對照，用同樣的方法用作為表達野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的質粒的pS2轉化大腸埃希桿菌B-3996將大腸埃希桿菌B-3996和從那里得到的轉化子分別接種于裝入20ml具有表3中的成分的培養(yǎng)基的500ml Sakaguchi燒瓶中，并在37℃培養(yǎng)40小時以研究L-蘇氨酸的產量，即得到表4中所示的結果。順便說明，前述培養(yǎng)基分為兩部分葡萄糖和MgSO4·7H2O，和其它成分，并用KOH調節(jié)pH為7.0，隨后在115℃壓熱滅菌10分鐘，而后，在將它們混合后，加入30g/L另外滅菌的CaCO3。
表3成分 混合量(g/l)葡萄糖40硫酸銨16磷酸二氫鉀17水硫酸鎂 17水硫酸亞鐵 0.015水硫酸錳 0.01酵母提取物(Difco) 2L-蛋氨酸 0.5碳酸鈣30表4菌株 蘇氨酸產量(g/l)大腸埃希桿菌B-3996 15.7大腸埃希桿菌B-3996/pS2 15.8大腸埃希桿菌B-3996/pBP516.8如從結果所闡明，包含具有本發(fā)明的DNA序列的突變型酶表達質粒的大腸埃希桿菌B-3996/pBP5與含有表達野生型酶的質粒的大腸埃希桿菌B-3996/pS2相比，具有提高的產蘇氨酸能力。
實施例4使用引入突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大腸埃希桿菌發(fā)酵生產L-谷氨酸作為大腸埃希桿菌的產谷氨酸菌，日本公開專利第4-11461號中所述的大腸埃希桿菌AJ-12628在迄今已知者中具有最高的生產能力。因此在評價突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶時，AJ-12628被用作宿主。
該AJ-12628株已以登記號FERM BP-385入藏工業(yè)科學與技術院全國生物科學和人類技術研究所。進一步，pBP5被選作被評價的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并對其進行一項實驗。
該具有突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的質粒pBP5按照Hanahan的方法(J.Mol.Biol.，Vol，106，p 577(1983))被引入大腸埃希桿菌AJ-12628，并分離出轉化子。以同樣方式，使用pS2的大腸埃希桿菌轉化子被分離。
將大腸埃希桿菌AJ-12628和從那里得到的轉化子分別接種于注入20ml具有表5中的成分培養(yǎng)基的500ml Sakaguchi燒瓶中，并在37℃培養(yǎng)36小時以研究L-谷氨酸的產量，即得到表6中顯示的結果。附帶要說明的是，前述培養(yǎng)基被分為兩部分葡萄糖和MgSO4·7H2O，和其它成分，并用KOH調節(jié)pH為7.0，隨后在115℃壓熱滅菌10分鐘，而后，在將它們混合后，加入30g/L另外滅菌的CaCO3。
表5成分混合量(g/l)葡萄糖 40硫酸銨 16磷酸二氫鉀 17水硫酸鎂 17水硫酸亞鐵 0.015水硫酸錳 0.01酵母提取物(Difco) 2碳酸鈣 30
表6菌株 谷氨酸產量總量(g/l)大腸埃希桿菌AJ-12628 18.0大腸埃希桿菌AJ-12628/pS2 18.3大腸埃希桿菌AJ-12628/pBP519.6如該結果所闡示，含有具有本發(fā)明的DNA序列的突變型酶表達質粒的大腸埃希桿菌AJ-12628/pBP5與含有表達野生型酶的質粒的大腸埃希桿菌AJ-12628/pS2相比較，具有提高的產谷氨酸鹽能力。
實施例5使用引入突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的棒狀桿菌生產L-賴氨酸為在棒狀桿菌中引入和表達該突變型基因，先取得一個來源于屬于短桿菌屬的桿菌的啟動子，再將其與突變型基因連接以制備表達型質粒。更進一步，將它引入屬于短桿菌屬的桿菌以進行L-賴氨酸的生產。<1>來源于屬于短桿菌屬的桿菌的天冬氨酸激酶(AK)基因的獲得。
按照常規(guī)方法從乳酸發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)野生株(ATCC13869)制備染色體DNA。通過PCR(多聚酶鏈反應polymerase Chainreaction；見White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))將A K基因從染色體DNA中擴增。對于用于擴增的DNA引物，一段23聚體的寡核苷酸(SEQ ID NO3)和一段21聚體的寡核苷酸(SEQ ID NO4)被合成，以擴增一個約1643bp的編碼基于一段在谷氨酰棒桿菌中已知序列的AK基因的區(qū)域(見MolecularMicrobiology(1991)5(5)，1197-1204，Mol.Gen.Genet.(1990)224，317-324)。
按照常規(guī)的phosphoamidite方法(見Tetrahedron letters(1981)，22，1859)使用Biosystems Co.提供的DNA合成儀380B型進行DNA的合成。在PCR反應中，使用Takara Shuzo Co.Ltd.生產的PJ2000型DNA熱循環(huán)儀(Thermal Cycler)，并按照廠家指定的方法使用Taq DNA多聚酶進行基因擴增。
被擴增的1643bp的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳法證實，然后用常規(guī)方法提純從凝膠上切下的片段，并用限制性酶Nru I(由TakaraShuzo Co.Ltd.生產)和Eco RI(由Takara Shuzo CO.，Ltd.生產)剪切。為基因片段的克隆載體使用pHSG399(見Takeshita，S.等；Gene(1987)，61，63-74)。將pHSG399用限制性酶Sma I(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產)和限制性酶Eco RI剪切，并與被擴增的AK基因片段連接。
使用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生產)按指定的方法連接DNA。用這種方法，制造出一種pHSG399與從短桿菌染色體擴增的AK基因片段連接而成的質粒。具有來自作為野生株的ATCC13869的AK基因的該質粒被稱為p399AKY。<2>確定乳酸發(fā)酵短桿菌的AK基因的堿基序列AK質粒p399AKY被制備，并且AK基因的堿基序列被測定。堿基序列的測定按照Sanger等人的方法(F.Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)等)進行。結果顯示于SEQID NO5和SEQ ID NO7。該DNA片段具有兩個開放閱讀框(open reading frames)分別對應于A K的α-亞單位和β-亞單位。在SEQ ID NO5和SEQ ID NO7中對應于每一個開放閱讀框的氨基酸序列與核苷酸序列一同顯示。進一步，只有對應于每一個開放閱讀框的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO6和SEQ ID NO8。<3>磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表達載體的制備從作為具有野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的質粒的pS2和從作為具有所得到的該突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的質粒pBP5提含磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的約4.4kb的Sal I片段，將該片段插入被廣泛用于大腸埃希桿菌的質粒載體pHSG399的Sal I位點。制造的質粒對野生型稱為pHS2而對突變型稱為pHBP5。
為將pHS2和pHPB5轉變?yōu)樵诙虠U菌中表達的質粒，在短桿菌中起作用的質粒啟動子和復制起點被引入。作為啟動子，從p399AKY提取一段含有從Nru I位點第1位至Apa LI位點第207位的堿基序列的基因片段，該片段被推定是被克隆的AK基因的啟動子區(qū)，將其插入位于pHS2和pHBP5的結構基因前約60bp的一個Ava I位點使轉錄按常規(guī)方向進行。
進一步，一段使短桿菌中質粒能自主復制的基因片段，即質粒的復制起點被引入位于載體上的一個位點。一個含有質粒的復制起點的基因片段被從用于短桿菌的載體pHC4中提取(見日本公開專利第5-7491號第10段，含同樣質粒的大腸埃希桿菌AJ 12039被保藏在工業(yè)科學與技術院全國生物科學和人類技術研究所，保藏號為FERM P12215)，通過引入連接子(Linker)使兩個末端的限制性酶位點被修飾為Pst I位點。
這個片段被引入已被加上來源于短桿菌的啟動子的質粒的載體部分中的Pst I位點。所構建的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表達質粒分別對于來源于pS2的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶質粒命名為pHS2B，和對來源于pBP5的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶質粒命名為pHBP5B。<4>通過使用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表達型質粒生產L-賴氨酸已被制備的pHS2B和pHBP5B被分別引入作產L-賴氨酸菌的乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3467(見日本專利出版物第51-34477號)。為引入該基因，使用一種采用電脈沖的轉化方法(見日本公開專利第2-207791號)。宿主株和轉化子在31.5℃在含具有表7中成分的賴氨酸生產培養(yǎng)基中搖動培養(yǎng)72小時。上述培養(yǎng)基如此制備將表中除CaCO3外所列成分加水至1升，并用KOH調至pH8.0，繼以在115℃壓熱滅菌15分鐘，然后再將已經(jīng)過熱滅菌的CaCO3加入。培養(yǎng)后在培養(yǎng)基中L-賴氨酸的積累量顯示于表8。
表7成分1升中的混合量葡萄糖 100g硫酸銨 55g大豆?jié)饪s物*35ml磷酸二氫鉀 1g7水硫酸鎂 1g維生素B120g生物素 5g尼克酰胺5mg7水硫酸亞鐵 0.01g5水硫酸錳 0.01g碳酸鈣 50g*Aj i nomoto Co.，Ltd，產品(商品名Mamenou)
表8菌株 賴氨酸產量總量(g/l)乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3463 20.0乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3463/pHS2B22.0乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3463/pHBP5B 25.0如該結果所示，含有具有本發(fā)明的DNA序列突變型酶表面質粒的乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3463/pHBP5B與含有表達野生型酶的質粒的乳酸發(fā)酵短桿菌AJ3463/pHS2B比較，具有提高的賴氨酸生產能力。
實施例6本發(fā)明的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其基因的其它實例<1>突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的制備在制備編碼突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的DNA時，克隆在質粒pT2中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因被用作材料。
用于包含(harbor)質粒pT2的宿主優(yōu)選缺乏磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的，以便只檢出來自質粒的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。大腸埃希桿菌F1 5(Hfr，recAl，met，△(ppc-argECBH)，Tn10)被用作這種缺乏株。大腸埃希桿菌AJ-12873，即F15株中被允許包含pT2者，以FERM P-13752保藏于工業(yè)科學與技術院全國生物科學和人類技術研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shiIbaraki-ken，日本；郵編305)入藏日1993年7月15日，于1994年7月11日從初始保藏處轉移至基于布達佩斯條約的國際保藏中心，并以保藏號FERM BP-4732保藏。另外，pT2的完整堿基序列在SEQUENCE ID NO1中被顯示。
為通過使用pT2將磷酸烯醇丙酮酸羧化酶438位精氨酸的密碼子置換為半胱氨酸的密碼子，使用PCR(多聚酶鏈反應)方法的重疊延伸法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.andPease，L.R.，Gene，77，51-59(1989))被采用。
順便說明，PCR方法是一種方法，其中的擴增循環(huán)包括雙鏈DNA熱變性為單鏈DNA，將對應于被擴增位點雙末端序列的寡核苷酸引物與前述熱變性DNA退火，并且重復前述以寡核苷酸為引物的多聚酶反應，因而前述DNA序列以指數(shù)函數(shù)方式擴增。
通過PCR方法受到位點特異性突變的區(qū)顯示于圖11。用于本發(fā)明的4種引物是具有鄰近438位精氨酸的密碼子的序列的引物c(SEQUENCE ID NO11，對應于SEQUENCE ID NO1中第1535-1545位堿基)，具有與引物c互補的序列的引物b(SEQUENCE IDNO10)，具有從那里向上游的一段序列的引物a(SEQUENCE IDNO9，對應于SEQUENCE ID NO1中第1185-1200位堿基)，以及具有與一段下游序列互補的序列的引物d(SEQUENCE ID NO12，對應于SEQUENCE ID NO1中第2327-2342號堿基)。
在引物b和引物c中，第438位精氨酸的密碼子(CGT)被半胱氨酸的密碼子(TGT)置換。這一置換還可使用半胱氨酸的另一種密碼子TGC。更進一步，第435位天冬氨酸的密碼子的第3個字母C可被T置換，從而可在內部引入一個Eco RI位點而無氨基酸的置換，這樣可用它作為一個指標選擇一種突變型質粒。盡管如此，該突變對本發(fā)明來說不是主要的。
當使用pT2 DNA作為模板并且引物a和引物b作為引物進行PCR反應時，從突變位點上游至突變位點的一個片段(圖11中的AB片段)被擴增。進一步，當使用引物c和引物d進行PCR反應時，位于突變位點下游的一個片段(圖11中CD片段)被擴增。當擴增產物的每一種(AB、CD)在熱變性后再次退火以進行PCR時，它們連接成為一個片段(圖11中的AD片段)。順便說明，該PCR反應是通過重復30次循環(huán)進行的，每一次包括在94℃加熱1分鐘繼以變性(94℃，1.5分鐘)，退火(50℃，2分鐘)，和多聚酶的延長反應(72℃，3.5分鐘)。另外，反應成分顯示于表9。
表9成分 PCR片段(()終濃度 AB CD ADH2O 53.553.553.510倍反應緩沖液10 10 101.25mM dNTP的混合物 16 16 1620μM引物a(1μM) 5 - 520μM引物b(1μM) 5 - -20μM引物c(1μM) - 5 -20μM引物d(1μM) - 5 510μg/μl pT2(0.1μg) 10 10 -PCR片段AB*- - 5PCR片段CD*- - 52.5U/μl Taq多聚酶0.5 0.5 0.5總量 100μl 100μl 100μl*PCR片段AB和CD被如此制備在PCR反應后，通過將其從聚丙酰胺凝膠上回收10μl，并將其溶解于5μl的TE(10mMTris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))。
在按上面所述得到的AD片段中，在上游一側存在一個Bss HII位點(SEQ ID NO1中1231-1236)并在下游一側存在一個Sol I位點，因而使用這些酶進行完全的消化以置換質粒pT2的相應區(qū)(圖11)。<2>抑制失敏的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的選擇將大腸埃希桿菌用如上所述得到的質粒轉化，并培養(yǎng)被轉化株回收質粒以選擇一種被Eco RI剪切的。至于被選擇的DNA，用雙脫氧法確定通過前述PCR方法擴增的區(qū)的堿基序列以證實目的堿基置換已被引入。這種質粒被稱為pT2R438C。通過將該質粒引入前述大腸埃希桿菌F15得到的菌株(AJ12874)已以FERM P-13753保藏在工業(yè)科學和技術院全國生物科學和人類技術研究所(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本；郵編305)，入藏日為1993年7月15日，于1994年7月11日從初始保藏處轉移至基于布達佩斯條約的國際保藏中心并以保藏號FERM BP-4733被保藏。
pT2R438C的堿基序列是SEQ ID NO1中的第1541位和第1550位核苷酸分別被從C置換為T的序列。<3>天冬氨酸對突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的抑制作用的失敏的證實研究了前述含有pT2R438C的大腸埃希桿菌AJ12874產生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶對天冬氨酸的敏感性。順便提一句，如上所述，由于大腸埃希桿菌F15是缺乏磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的，因而AJ12874產生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶來源于質粒。
按照公知的方法(Yoshinaga，T.，Izui，K.and Katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))研究對天冬氨酸的敏感性。即，作為在公知可在活性測定系統(tǒng)中影響活性的乙酰輔酶A以1mM或2mM濃度存在下酶活性的測定結果，測定的對天冬氨酸的敏感性顯示于圖12 。
顯然在天冬氨酸為高濃度時，野生型酶基本失去其活性，而本發(fā)明的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶繼續(xù)維持其活性。<4>制備突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(II)為將質粒pT2中攜帶的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因中620位賴氨酸的密碼子用絲氨酸的密碼子替代，應用PCR(多聚酶鏈反應)方法的重疊延伸法(Ho，S.N.，Hunt，H.D.，Horton，R.M.，Pullen，J.K.and Pease，L.R.，Gene，77，51-59(1989))被采用。具體步驟按照<1>中所述方法。攜帶由目標置換(aimed replacement)構建的突變型基因的質粒被稱為pT2K620S。進一步，得到的突變型酶被稱為K620S突變型酶。<5>關于突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶天冬氨酸的抑制失敏的證實關于由通過將質粒pT2K620S引入前述大腸埃希桿菌F15得到的轉化子生產的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，對天冬氨酸的敏感性得到研究。順便說明，如上所述，由于大腸埃希桿菌F15缺乏磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，任何由轉化子產生的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶均來源于該質粒。
按照公知的方法(Yoshinaga，T.，Izui，K.and Katsuki，H.，J.Biochem.，68，747-750(1970))研究對天冬氨酸的敏感性。即作為在公知在活性測定系統(tǒng)中能影響活性的乙酰輔酶A以1mM或2mM濃度存在下該酶活性的測定結果，對天冬氨酸的敏感性如圖13所示被測定。
顯然當天冬氨酸以高濃度存在時野生型酶基本喪失其活性，而本發(fā)明的該型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶繼續(xù)維持其活性。
在圖13中，還描繪出一種第650位賴氨酸被絲氨酸置換的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(K650A突變型酶)，和一種第491位賴氨酸被絲氨酸置換的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(K491突變型酶)對天冬氨酸的敏感性。對于這些酶，天冬氨酸抑制不失敏。
工業(yè)應用性本發(fā)明的DNA序列編碼該突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，并且，含有該DNA序列的微生物產生前述這種酶。
本發(fā)明的這種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性基本不受天冬氨酸的抑制，因此它可被用于發(fā)酵生產受天冬氨酸及類似物質生物合成調節(jié)的氨基酸。
序列表(1)一般信息(i)申請人Ajinomoto Co.Inc.(ii)發(fā)明名稱突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其基因和氨基酸的方法(iii)序列數(shù)12(iv)通訊地址(A)地址(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(F)郵編(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日
(viii)代理人/事務所信息(A)名稱(B)登記號(C)參考/摘要號(ix)電信信息(A)電話(B)電傳(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度5186(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學環(huán)形的(ii)分子類型其它..基因組的DNA和載體DNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物大腸埃希桿菌(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置237..2888(xi)序列描述SEQ ID NO1
TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA60ATGACGTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA120CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA180ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT236ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 284Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly1 5 10 15AAA GTG CTG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT 332Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu20 25 30GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC 380Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly35 40 45AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG 428Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser50 55 60AAC GAC GAG CTG CTG CCC GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC 476Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn65 70 75 80CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA 524Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu85 90 95GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 572Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys100 105 110AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG 620Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser115 120 125CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT 668Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg130 135 140CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG 716Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln145 150 155 160CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT 764Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg165 170 175CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT 812Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg180 185 190
AAG CTG CGT CCA AGC CCG GTA GAT GAA GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA 860Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val195 200 205GTG GAA AAC AGC CTG TGG CAA GGC GTA CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG 908Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu210 215 220AAC GAA CAA CTG GAA GAG AAC CTC GGC TAC AAA CTG CCC GTC GAA TTT 956Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe225 230 235 240GTT CCG GTC CGT TTT ACT TCG TGG ATG GGC GGC GAC CGC GAC GGC AAC 1004Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn245 250 255CCG AAC GTC ACT GCC GAT ATC ACC CGC CAC GTC CTG CTA CTC AGC CGC 1052Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg260 265 270TGG AAA GCC ACC GAT TTG TTC CTG AAA GAT ATT CAG GTG CTG GTT TCT 1100Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser275 280 285GAA CTG TCG ATG GTT GAA GCG ACC CCT GAA CTG CTG GCG CTG GTT GGC 1148Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly290 295 300GAA GAA GGT GCC GCA GAA CCG TAT CGC TAT CTG ATG AAA AAC CTG CGT 1196Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg305 310 315 320TCT CGC CTG ATG GCG ACA CAG GCA TGG CTG GAA GCG CGC CTG AAA GGC 1244Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly325 330 335GAA GAA CTG CCA AAA CCA GAA GGC CTG CTG ACA CAA AAC GAA GAA CTG 1292Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu340 345 350TGG GAA CCG CTC TAC GCT TGC TAC CAG TCA CTT CAG GCG TGT GGC ATG 1340Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met355 360 365GGT ATT ATC GCC AAC GGC GAT CTG CTC GAC ACC CTG CGC CGC GTG AAA 1388Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys370 375 380TGT TTC GGC GTA CCG CTG GTC CGT ATT GAT ATC CGT CAG GAG AGC ACG 1436Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr385 390 395 400CGT CAT ACC GAA GCG CTG GGC GAG CTG ACC CGC TACCTC GGT ATC GGC 1484Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly405 410 415
GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC 1532Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg420 425 430GAA CTG AAC TCC AAA CGT CCG CTT CTG CCG CGC AAC TGG CAA CCA AGC 1580Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser435 440 445GCC GAA ACG CGC GAA GTG CTC GAT ACC TGC CAG GTG ATT GCC GAA GCA 1628Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala450 455 460CCG CAA GGC TCC ATT GCC GCC TAC GTG ATC TCG ATG GCG AAA ACG CCG 1676Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro465 470 475 480TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG 1724Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly485 490 495TTT GCG ATG CCG GTT GCT CCG CTG TTT GAA ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1772Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn500 505 510AAC GCC AAC GAT GTC ATG ACC CAG CTG CTC AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1820Asn Ala ASn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg515 520 525GGC CTG ATT CAG GGC AAA CAG ATG GTG ATG ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1868Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser530 535 540GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT CAG GCA 1916Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala545 550 555 560CAG GAT GCA TTA ATC AAA ACC TGC GAA AAA GCG GGT ATT GAG CTG ACG 1964Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr565 570 575TTG TTC CAC GGT CGC GGC GGT TCC ATT GGT CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2012Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala580 585 590CAT GCG GCG CTG CTG TCA CAA CCG CCA GGA AGC CTG AAA GGC GGC CTG 2060His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu595 600 605CGC GTA ACC GAA CAG GGC GAG ATG ATC CGC TTT AAA TAT GGT CTG CCA 2108Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro610 615 620GAA ATC ACC GTC AGC AGC CTG TCG CTT TAT ACC GGG GCG ATT CTG GAA 2156Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu625 630 635 640GCC AAC CTG CTG CCA CCG CCG GAG CCG AAA GAG AGC TGG CGT CGC ATT 2204Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile645 650 655
ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC GTA 2252Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val660 665 670CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG CCG GAA 2300Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu675 680 685CAA GAA CTG GGC AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC 2348Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg690 695 700CCA ACC GGC GGC GTC GAG TCA CTA CGC GCC ATT CCG TGG ATC TTC GCC 2396Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala705 710 715 720TGG ACG CAA AAC CGT CTG ATG CTC CCC GCC TGG CTG GGT GCA GGT ACG 2444Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr725 730 735GCG CTG CAA AAA GTG GTC GAA GAC GGC AAA CAG AGC GAG CTG GAG GCT 2492Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala740 745 750ATG TGC CGC GAT TGG CCA TTC TTC TCG ACG CGT CTC GGC ATG CTG GAG 2540Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu755 760 765ATG GTC TTC GCC AAA GCA GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA 2588Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr ASp Gln770 775 780CGC CTG GTA GAC AAA GCA CTG TGG CCG TTA GGT AAA GAG TTA CGC AAC 2636Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn785 790 795 800CTG CAA GAA GAA GAC ATC AAA GTG GTG CTG GCG ATT GCC AAC GAT TCC 2684Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala ASn Asp Ser805 810 815CAT CTG ATG GCC GAT CTG CCG TGG ATT GCA GAG TCT ATT CAG CTA CGG 2732His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg820 825 830AAT ATT TAC ACC GAC CCG CTG AAC GTA TTG CAG GCC GAG TTG CTG CAC 2780Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His835 840 845CGC TCC CGC CAG GCA GAA AAA GAA GGC CAG GAA CCG GAT CCT CGC GTC 2828Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val850 855 860GAA CAA GCG TTA ATG GTC ACT ATT GCC GGG ATT GCG GCA GGT ATG CGT 2876Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg865 870 875 880AAT ACC GGC TAATCTTTCCT CTTCTGCAAA CCCTCGTGCT TTTGCGCGAG 2925Asn Thr Gly
GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACACC CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT 2985TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT CCTTAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT 3045ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA 3105TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3165GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3225ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 3285CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 3345CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3405TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3465CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3525ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 3585CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 3645GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 3705ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACTCTAGCTT CTGTAGCAAT 3765GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 3825ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 3885GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 3945TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 4005TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4065GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4125TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4185TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4245TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC 4305AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4365CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 4425CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4485TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4545GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 4605CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 4665GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 4725GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 4785TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 4845CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC 4905GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG 4965CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT 5025ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG 5085CATTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CTCCAATTCT TGGAGTGGTG AATCCGTTAG 5145CGAGGTGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA GGTGGCCCGG G5186(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度883個氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓撲學線形的(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly1 5 10 15Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu20 25 30Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly35 40 45Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser50 55 60Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn65 70 75 80Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu85 90 95Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys100 105 110Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser115 120 125Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg130 135 140Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln145 150 155 160Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg165 170 175Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg180 185 190Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val195 200 205Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu210 215 220Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe225 230 235 240Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn245 250 255Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg260 265 270Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser275 280 285
Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly290 295 300Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg305 310 315 320Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly325 330 335Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu340 345 350Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met355 360 365Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys370 375 380Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr385 390 395 400Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly405 410 415Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg420 425 430Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser435 440 445Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala450 455 460Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro465 470 475 480Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly485 490 495Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn500 505 510Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg515 520 525Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser530 535 540Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala545 550 555 560Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr565 570 575Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala580 585 590His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu595 600 605Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro610 615 620Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu625 630 635 640
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile645 650 655Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val660 665 670Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu675 680 685Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg690 695 700Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala705 710 715 720Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr725 730 735Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala740 745 750Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu755 760 765Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gln770 775 780Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn785 790 795 800Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser805 810 815His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg820 825 830Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His835 840 845Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val850 855 860Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg865 870 875 880Asn Thr Gly(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型其它..合成的DNA
(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO3TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型其它..合成的DNA(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO4ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度1643(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型基因組的DNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物谷氨酰棒桿菌(C)株ATCC13869
(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat肽(B)位置217..1482(xi)序列描述SEQ ID NO5TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234Met Ala Leu Val Val Gln1 5AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu75 80 85TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val90 95 100CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro105 110 115GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala120 125 130GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn155 160 165GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala170 175 180GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225 230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300 305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg410 415 420AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度421個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線形的(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度1643
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型基因組的DNA(iii)假設無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物谷氨酸棒桿菌(C)株ATCC13869(ix)特征(A)名稱/關鍵詞mat肽(B)位置964..1482(xi)序列描述SEQ ID NO7TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600AAGATCTGCA TTGTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu1 5 10 15GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val35 40 45CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe50 55 60ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys65 70 75CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val80 85 90 95GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val100 105 110ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu115 120 125TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp130 135 140GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly145 150 155GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg160 165 170 172AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG1550GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT1610TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線形的(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO8
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu35 40 45Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr50 55 60Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu65 70 75 80Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly85 90 95Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr100 105 110Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu115 120 125Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp130 135 140Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度16(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型其它..合成的DNA(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO9AAAAACCTGC GTTCTC16(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征
(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型其它..合成的DNA(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO10TGACTTAAG GTTTACAGGCC 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型其它..合成的DNA(iii)假設無(xi)序列描述SEQ ID NO11ACTGAATTCC AAATGTCCGC 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度16(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線形的(ii)分子類型其它..合成的DNA
(iii)假設無(xi)序列描述SEQ IDNO12AAGTGCAGG CCGTTT 1權利要求
1.一種來源于屬于埃希桿菌屬的微生物的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑制失敏的突變。
2.按照權利要求1的突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，在被允許存在于一種屬于埃希桿菌屬的微生物的情況下，它給予該細胞對于具有下述特性的一種化合物的抗性對于產野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的屬于埃希桿菌屬的微生物表現(xiàn)生長抑制作用。所述生長抑制作用在L-谷氨酸或L-天冬氨酸存在下恢復；并且抑制野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
3.按照權利要求2的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述化合物從3-溴丙酮酸天冬氨酸-β-肼和DL-蘇-β-羥天冬氨酸中選擇。
4.按照權利要求1的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變?yōu)榘磸脑摿姿嵯┐急狒然傅腘-末端計算用賴氨酸取代第625位谷氨酸的突變。
5.按照權利要求1的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變?yōu)榘磸脑摿姿嵯┐急狒然傅腘-末端計算第222位精氨酸被組氨酸取代并且第223位谷氨酸被賴氨酸取代的突變。
6.按照權利要求1的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變?yōu)榘磸脑摿姿嵯┐急狒然傅腘-末端計算相應地第228位絲氨酸被苯丙氨酸取代，289位谷氨酸被賴氨酸取代551位蛋氨酸被異亮氨酸取代并且804位谷氨酸被賴氨酸取代的突變。
7.按照權利要求1的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變?yōu)榘磸脑摿姿嵯┐急狒然傅腘-末端計算第867位丙氨酸被蘇氨酸取代的突變。
8.按照權利要求1的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變?yōu)榘磸脑摿姿嵯┐急狒然傅腘-末端計算第438位精氨酸被半胱氨酸取代的突變。
9.按照權利要求1的一種突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述突變?yōu)榘磸脑摿姿嵯┐急狒然傅腘-末端計算第620位賴氨酸被絲氨酸取代的突變。
10.一個DNA片段，它編碼按照權利要求1至9的任意一個突變型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
11.一種微生物，它屬于埃希桿菌屬或棒狀桿菌，通過將按照權利要求10的DNA片段整合到染色體DNA上而被轉化。
12.一種重組DNA，它通過將按照權利要求10的DNA片段與能在屬于埃希桿菌屬或棒狀桿菌的細菌細胞內自主復制的載體DNA連接而形成。
13.一種微生物，它屬于埃希桿菌屬或棒狀桿菌，被按照權利要求12的重組DNA轉化。
14.一種生產氨基酸的方法，包含在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)按照權利要求11或13的微生物；和從培養(yǎng)基中分離從包含L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸的組中選擇的一種氨基酸。
全文摘要
一種磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因，它具有突變例如用賴氨酸置換從磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的N-末端第625位的谷氨酸的突變，用半胱氨酸置換從N-末端第438位精氨酸的突變和其它類似者，將該基因引入大腸埃希桿菌或棒狀桿菌，以便產生基本不被天冬氨酸抑制的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，從而有效地生產氨基酸。
文檔編號C12P13/14GK1133615SQ9419390
公開日1996年10月16日 申請日期1994年8月17日 優(yōu)先權日1993年8月24日
發(fā)明者杉本雅一, 鈴木智子, 松井裕, 泉井桂 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (1),