專利名稱：用于預(yù)防和治療病毒誘發(fā)腫瘤的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療病毒誘發(fā)的腫瘤的預(yù)防劑和治療劑，特別是涉及到來源于曲霉屬的發(fā)酵提取物組合物，這些組合物可用作預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤如乳頭狀瘤病毒誘發(fā)的腫瘤的表面用藥物。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)腫瘤的病毒非常多。確實(shí)，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)六十八種以上都能單獨(dú)誘發(fā)腫瘤形成的人類乳頭狀瘤病毒。其中一些與良性腫瘤，比如尋常疣有關(guān)，而其它的則與感染哺乳動(dòng)物的口腔以及生殖器粘膜發(fā)育不良和癌的病源物密切相關(guān)。另外一些能誘發(fā)腫瘤的病毒包括各種RNA病毒和皰疹病毒。
近來，還發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)功能低下如獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)的個(gè)體易受人類乳頭狀瘤病毒感染從而引起全身生長腫瘤，給患者造成精神和身體上的巨大痛苦。
治療病毒誘發(fā)的腫瘤常用的方法包括以下任何一種方法(1)外科手術(shù)(激光或手術(shù))；(2)利用有機(jī)酸如冰醋酸和/或水楊酸將腫瘤“燒”掉；(3)將一種由基瘤制成的抗腫瘤疫苗小范圍地注射到腫瘤中；(4)應(yīng)用藥物治療[例如鬼臼樹脂；干擾素和5-氟-2，4-(1H，3H)-嘧啶-酮；2-4-雙氧-5-氟嘧啶。也即是氟尿嘧啶或5-FU]來除去腫瘤。
然而目前一般使用的對(duì)去除病毒誘發(fā)的腫瘤有效的治療方法仍存在以下一種或多種缺陷(1)它們會(huì)損傷健康未感染組織；(2)會(huì)造成疤痕和外貌損傷；(3)可引起用此治療的哺乳動(dòng)物不適；和(4)它們并不能損傷在周圍組織殘留的潛在病毒的DNA。而且，采用這些治療方法，患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的全身副作用，腫瘤去除不完全和腫瘤的經(jīng)常性復(fù)發(fā)。
人們也已知使用光療法可去除喉部乳頭狀腫瘤。這種光療法在抑制約50％的腫瘤生長的同時(shí)，也會(huì)造成至少六周的全身的皮膚光敏感性和其它微小的反應(yīng)。而且，盡管這種技術(shù)取得了明顯成功，而潛伏病毒的DNA仍然是殘留在周圍組織。
美國紙件專利No.5,073,630公開了一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫刺激特性的聚合鎂酐和蛋白磷酰亞油酸銨。這種抗病毒劑是由一種曲霉屬選擇系的無細(xì)胞濾過物制備成的。但是那種化合物不溶于水且分子量大(316,000道爾頓)。而且，該化合物的重新獲得仍有困難。
由此可見仍需要能預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的組合物，該組合物不會(huì)損傷健康的未感染的組織，不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的全身副作用，也不會(huì)給用此治療的哺乳動(dòng)物造成疤痕或外貌損傷和/或不適，且可損傷在周圍組織中殘留的潛伏病毒的DNA，這樣可減少腫瘤的去除不完全和經(jīng)常性復(fù)發(fā)。進(jìn)一步來說，還需要制備這種預(yù)防和治療的組合物的方法以及用這種組合物預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的使用方法。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)主要目的就是提供用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的組合物，該組合物既不會(huì)損傷健康的未受感染的組織，也不會(huì)對(duì)用此治療的哺乳動(dòng)物造成嚴(yán)重的全身副作用、疤痕、外貌損傷或不適，而且還能損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，從而減少了腫瘤的去除不完全和腫瘤經(jīng)常性復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是提供用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)腫瘤的組合物的簡便、易行的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)主要目的是提供預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的方法，這些方法既不會(huì)損傷健康的未感染的組織，也不會(huì)對(duì)用該方法治療的哺乳動(dòng)物造成嚴(yán)重的全身副作用，疤痕，外貌損傷或者不適，而且還能損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，這樣就減少了腫瘤的去除不完全和經(jīng)常性復(fù)發(fā)。
根據(jù)本發(fā)明所述，本文公開了用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)腫瘤的組合物。這些組合物既不會(huì)損傷健康的未受感染的組織，也不會(huì)對(duì)用該組合物治療的哺乳動(dòng)物引起嚴(yán)重的系統(tǒng)副作用、疤痕形成、外貌損傷或不適。而且，這些組合物會(huì)損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，從而減少了腫瘤的去除不完全和經(jīng)常性復(fù)發(fā)。
這些預(yù)防和治療的組合物優(yōu)選表面使用。
本發(fā)明的預(yù)防和治療組合物優(yōu)選發(fā)酵提取物/和或其衍生物。這些發(fā)酵提取物的更好優(yōu)選是一種曲霉屬發(fā)酵提取物。優(yōu)選的曲霉屬發(fā)酵提取物是一種黑曲霉屬發(fā)酵提取物。特別優(yōu)選黑曲霉1.2 AN29和黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物。
本發(fā)明的組合物另外還優(yōu)選含有藥劑上可接受的載體的發(fā)酵提取物和/或其衍生物。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物包括濃縮的發(fā)酵提取物。如需要的話，這些提取物可進(jìn)行凍干處理。
這些發(fā)酵提取物特別優(yōu)選無細(xì)胞的全部粗提物。而且，這些無細(xì)胞的全部粗提物通過分子量截止為10000的膜超濾，這樣得到保留物為10000分子量的滲透物。
如需要，本發(fā)明的組合物可以是酶組合物，這些組合物可以是本發(fā)明所公開的發(fā)酵提取物的衍生物，和/或來源于這些發(fā)酵提取物。
本發(fā)明的一個(gè)特別之處在于，本發(fā)明所述的曲霉屬發(fā)酵提取物(和/或其衍生物)是用來制備預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒所誘發(fā)的腫瘤的組合物。更優(yōu)選地，曲霉屬發(fā)酵提取物(和/或其衍生物)是用來制備哺乳動(dòng)物所需的表面使用的預(yù)防和治療組合物。
另外根據(jù)本發(fā)明所描述的，本文公開了制備本發(fā)明預(yù)防和治療組合物的方法。這些方法包括在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)曲霉屬菌種。這種培養(yǎng)基優(yōu)選固體表面培養(yǎng)基。這些方法還包括用水從培養(yǎng)基中提取細(xì)胞外的化合物，這樣便得到液體的發(fā)酵提取物。這些方法還包括過濾所得到的液體發(fā)酵提取物，以去除其中的細(xì)胞生物質(zhì)和孢子，這樣得到一種液體發(fā)酵提取物。最后，若需要，所公開的方法包括冷凍所得的液體發(fā)酵提取物直至使用為止。優(yōu)選在約4℃時(shí)進(jìn)行這種冷凍。
另一個(gè)特別優(yōu)選之外是，發(fā)酵提取物可通過冷凍干燥而濃縮。經(jīng)這種冷凍干燥而得的凍干粉末(發(fā)酵提取物的)可在室溫下用干燥劑儲(chǔ)存直至使用。
一個(gè)特別優(yōu)選之處是，在保留物冷凍之前發(fā)酵提取物可通過分子量截止為10000的截?cái)嗄みM(jìn)一步超濾。這種分子量為10000的超濾保留物的干燥固體含量為7.6％(w/v)。如需要，可再將保留物經(jīng)脫水而濃縮。
較為優(yōu)選地，本發(fā)明所公開的方法是用來制備表面使用的預(yù)防和治療組合物。
根據(jù)本發(fā)明所述進(jìn)一步可知，本文公開了預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的方法。這些方法的使用既不會(huì)損傷健康的未受感染的組織，也不會(huì)對(duì)用此方法治療的哺乳動(dòng)物造成嚴(yán)重的全身副作用、疤痕、外貌損傷或不適。而且，這些方法的使用會(huì)損傷在周圍組織殘留的潛伏病毒的DNA，這樣便減少了腫瘤的去除不完全和經(jīng)常性復(fù)發(fā)。這些方法包括制備含藥劑上可接受的載體的發(fā)酵提取物和/或其衍生物，以便得到預(yù)防和/或治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的組合物。這些方法還包括對(duì)需要的哺乳動(dòng)物給予治療有效量的組合物。在預(yù)防時(shí)，可將這些藥物用在需要這種預(yù)防方法的哺乳動(dòng)物的體表，或者，在治療時(shí)，將這些藥物直接用在需要治療的哺乳動(dòng)物的病毒誘發(fā)的腫瘤部位。這些使用方法優(yōu)選表面用藥。
較為優(yōu)選地，制備本發(fā)明的預(yù)防和治療組合物包括制備一種發(fā)酵提取物，尤其是曲霉屬的發(fā)酵提取物。更為優(yōu)選地，此方法包括提供一種黑曲霉的發(fā)酵提取物。最好的優(yōu)選是，這種方法包括制備黑曲霉1.2 AN29或1.2 AN39的發(fā)酵提取物。
若需要，本方法還包括制備發(fā)酵提取物的衍生物。
如需要，本方法還包括通過分子量截止為10000的膜對(duì)無細(xì)胞全黑曲霉發(fā)酵提取物進(jìn)行超濾和回收分子量為10000的超濾殘留物。如進(jìn)一步需要，此方法還可包括蒸發(fā)濃縮殘留物。
如果需要，本方法還可包括冰凍干燥發(fā)酵提取物，這樣提取物被濃縮而得到粉末，可將凍干粉末在室溫下使用干燥劑儲(chǔ)存。
本發(fā)明的一個(gè)特別之處在于，所公開的是用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中EB病毒誘發(fā)的腫瘤的表面用防治組合物和其使用方法。
本發(fā)明的另一個(gè)特別之處是，文本公開了用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中棉尾兔乳頭狀瘤病毒誘發(fā)的腫瘤的表面用防治組合物和其使用方法。
本發(fā)明還有一個(gè)特別之處是，本發(fā)明所公開的是用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中乳頭狀瘤病毒誘發(fā)的腫瘤的表面用防治組合物及其使用方法。
一旦看了下面附有實(shí)施例的發(fā)明時(shí)，本發(fā)明這些和另外的目的和優(yōu)點(diǎn)就顯而易見了。
優(yōu)選的具體說明本發(fā)明包含用于防治哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的表面用防治組合物。這些組合物是從發(fā)酵提取物和/或其衍生物中制成的。然后可將這些發(fā)酵提取物和其衍生物與藥劑上可接受的載體相混合從而制成本發(fā)明的治療組合物。
“發(fā)酵提取物”一詞是指提取物的環(huán)境，特別是發(fā)酵環(huán)境，這種環(huán)境是已用一種適當(dāng)微生物的培養(yǎng)物進(jìn)行了接種，并且其中的微生物已經(jīng)培養(yǎng)(成熟的)。
當(dāng)“衍生物”和“來源于”用于指發(fā)酵提取物時(shí)，意思是指從發(fā)酵提取物中得到的(衍生或分離的)組合物或組分，如特殊的酶或酶的組合。順便說明一下，有一種衍生物是經(jīng)濃縮或過濾的發(fā)酵提取物?！把苌铩焙汀霸从凇蓖瑯涌捎糜谥概c那些發(fā)酵提取物的組合物或組分是等同的，且已證明它們具有與發(fā)酵提取物相同的預(yù)防和治療作用組合物和混合物。順便說明一下，這一定義包括從發(fā)酵提取物中分離出的(如果需要，經(jīng)純化的)發(fā)酵提取物組分本身(如其活性劑)。再順便說明一下，這種定義還包括模擬活性劑構(gòu)建成(如，合成)的組合物或混合物，具有本發(fā)明的發(fā)酵提取物的預(yù)防和治療作用。
更為特別的，本文所公開的發(fā)酵提取物及其衍生物是用一種適當(dāng)微生物的培養(yǎng)物接種的表面發(fā)酵的水提物(或這種水提物的衍生物)。
發(fā)酵提取物優(yōu)選曲霉屬發(fā)酵提取物，更好的優(yōu)選是黑曲霉發(fā)酵提取物。最佳的優(yōu)選是黑曲霉1.2 AN29發(fā)酵提取物和黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物。
特別優(yōu)選的是，發(fā)酵提取物為分子量10000的超濾殘留物[干燥固體含量為7.6％(w/v)]。殘留物可經(jīng)蒸發(fā)而濃縮。
特別是已發(fā)現(xiàn)接種有黑曲霉培養(yǎng)基的表面發(fā)酵的水提物對(duì)于預(yù)防和消除哺乳動(dòng)物疣起作用。
藥劑上可接受的載體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何載體。這種載體優(yōu)選親水物質(zhì)，以便能協(xié)助防治組合物穿入皮膚。這些載體包括以下，但并不局限于此，如水性薄荷醇溶液，水，丙二醇，羊毛脂，丁醇，無水醇，異丙醇，二甲基亞砜，乳酸乙醚和其混合物。這種載體的另一個(gè)例子是眾所周知的“VEHICLEN”，此組合物包括乙醇、異丙醇、純凈水、LAURETH-4(一種表面活性劑)和丙二醇。
用于制備本發(fā)明的防治組合物的發(fā)酵提取物(和/或其衍生物)和藥劑上可接受的載體的準(zhǔn)確用量優(yōu)選濃度約為1％(w/v)至15％(w/v)的凍干發(fā)酵提取物(或其衍生物)。特別優(yōu)選濃度約為8％的凍干發(fā)酵提取物。
預(yù)防和治療的組合物可根據(jù)需要制備來用于被預(yù)防的哺乳動(dòng)物的部位的表面，或需要治療的哺乳動(dòng)物所患的腫瘤比如疣的部位的表面。這些成分包括液體組合物，如油膏、搽劑和酊劑的組合物。由于乳膏、肥皂和凝膠能使防治組合物與皮膚和/或腫瘤有充足的時(shí)間保持接觸，所以可作為特別優(yōu)選。
雖然還不是非常明確，但一般認(rèn)為本發(fā)明組合物的作用方式實(shí)際上并不一定是直接抗病毒或抗腫瘤。相反，可以認(rèn)為本發(fā)明所公開的組合物的作用方式可能是刺激全身免疫系統(tǒng)的結(jié)果。細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答可能對(duì)AN-1抗原很重要，這種抗原能誘發(fā)影響腫瘤生長的非特異性免疫應(yīng)答。在這方面上，我們認(rèn)為本發(fā)明的組合物可能是一種免疫增強(qiáng)劑。事實(shí)上，前面的研究已表明細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答很可能對(duì)乳頭狀瘤病毒誘發(fā)的良性腫瘤和前期癌的消退起作用。
我們還認(rèn)為發(fā)酵提取物的活性成分的分子量約在1000道爾頓至10000道爾頓至之間。而且發(fā)現(xiàn)發(fā)酵提取物的活性成分的分子量更特別接受10000道爾頓。
本發(fā)明的防治組合物對(duì)于預(yù)防和治療病毒誘發(fā)的腫瘤例如那些由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)、馬乳頭狀瘤病毒(EPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)引起的腫瘤是有效的。
制備本發(fā)明的防治組合物首先是制備適合的生長培養(yǎng)基。優(yōu)選固體表面培養(yǎng)基。根據(jù)其中培養(yǎng)的微生物的不同，所使用的培養(yǎng)基也不同，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說完全能夠確定。如果所培養(yǎng)的是一種曲霉屬，則優(yōu)選的培養(yǎng)基包括7.9％(w/w)SOLKA FLOC BNB 100(James River Corp.，U.S.A.)；7.9％(w/w)燕麥外殼；7.9％(w/w)花生粉；15.8％(w/w)甜菜漿；0.39％(w/w)KH2P04；13ppm ZnSO4和60％(w/w)水。
然后將培養(yǎng)基滅菌、冷卻并在其上接種需要培養(yǎng)的特定的曲霉屬種孢子。接種和混合后，將培養(yǎng)基移至深約0.75英寸的多孔金屬盤中。然后將這些金屬盤放在30℃-32℃的高濕度的環(huán)境中孵育約72小時(shí)，這期間曲霉屬菌種得到了培養(yǎng)。再在水(水提物中)攪拌幾小時(shí)后回收(提取)到內(nèi)含物，這樣便得到液體的發(fā)酵提取物。然后再將液體發(fā)酵提取物過濾(通過末端濾器)以去除提取物中的細(xì)胞生物質(zhì)、孢子和其它不溶物。
如果需要，液體的濾過提取物便可照此使用，或者將其進(jìn)一步處理，如進(jìn)行濃縮，以便制備其適合的衍生物。
這種進(jìn)一步處理的例子包括通過分子量截止為10000的膜的發(fā)酵提取物的超濾過程，以便獲得10000MW-UF的殘留物。這種殘留物可含有7.6％(w/w)的干燥固體組合物。再處理的另一例子是通過蒸發(fā)而濃縮(如，2.5倍)。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)不論是無細(xì)胞的發(fā)酵粗提物還是分子量為10000(或任意大小)的殘留物均可通過蒸發(fā)而被濃縮。
如果不需立即使用，這種液體濾過提取物(和/或其衍生物)最好在4℃冷凍，直至使用。
若需長期儲(chǔ)存，可將這種液體濾過提取物(或其衍生物)進(jìn)行真空濃縮，然后澄清濾液，將濾液(或其衍生物)冰凍干燥。由此得到的凍干粉末可在室溫用干燥劑儲(chǔ)存直至使用。
所得到的發(fā)酵提取物(或其衍生物)的凍干粉末極易溶于水。當(dāng)需要用時(shí)，可將凍干粉末重新溶解在液體比如水中，和/或藥劑上可接受的載體中。
本發(fā)明的預(yù)防和治療組合可用于防治哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤。這些方法包括給需要治療的哺乳動(dòng)物使用治療有效量的防治組合物，該組合物在藥劑上可接受的載體中含有曲霉屬發(fā)酵提取物(或其衍生物)。
“治療有效量”一詞意思是指對(duì)于防止或減緩新的或現(xiàn)存病毒誘發(fā)可疑的腫瘤生長的預(yù)防或治療的有效劑量。
防治組合物的準(zhǔn)確用量是指薄薄地覆蓋在所需的哺乳動(dòng)物(患病)的皮膚表面(如病毒誘發(fā)的腫瘤所在部位)的本發(fā)明表面用的防治組合物的必需用量。
防治組合物可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任何適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥。這些方式包括皮下或靜脈內(nèi)注射。給藥優(yōu)選表面給藥，例如，根據(jù)需要，輔以眼用滴管、多孔涂藥器(如紗布，藥簽或布，卷頂涂藥器)、刷子或任意其它的適當(dāng)用具，將藥涂在皮膚或腫瘤(或其所需的患處)的表面。
如果需要，可在感染之前用防治組合物來防治初期感染。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)感染后不久使用防治組合物，或用于現(xiàn)有的腫瘤時(shí)，防治組合物具有顯著抑制腫瘤的能力。還觀察到只要腫瘤存在，每天至少要用這種組合物一至兩次。但是，使用的具體次數(shù)可根據(jù)需要增多和/或減少，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員來說是完全能確定的。應(yīng)該注意防止皮膚對(duì)這些組合物反應(yīng)的發(fā)展，但不管怎樣，我們發(fā)現(xiàn)任何這種反應(yīng)最終均會(huì)消失，而對(duì)所試驗(yàn)的物種沒有任何損害。
因此為了描述本發(fā)明的防治組合物和其制備方法以及它們的使用方法，現(xiàn)在給出下面的實(shí)施例，這些實(shí)施例僅僅是舉例說明，而不是也不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物的制備首先，制備適合的生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由7.9％(w/w)SOLKAFLOC BNB 100(James River Corp.，U.S.A.)；7.9％(w/w)燕麥殼；7.9％(w/w)花生粉；15.8％(w/w)甜菜漿；0.39％(w/w)KH2PO4；13ppm ZnSO4；和60％(w/w)水組成。
然后將培養(yǎng)基滅菌、冷卻并接種黑曲霉1.2 AN39孢子，該孢子按照布達(dá)佩斯條約1992年7月30日以登記號(hào)21126保藏在農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)1815 N.University St.，Peoria，Illinois(U.S.A.)。
經(jīng)接種和混合后，將培養(yǎng)基移至深約0.75英寸的多孔金屬盤中。然后將這些盤放在30℃至32℃的高濕度(水分足)的環(huán)境中孵育約72小時(shí)，以制備所需的黑曲霉1.2 AN39培養(yǎng)物。再在水(水提物)中攪拌數(shù)小時(shí)收獲到培養(yǎng)物，隨后過濾(通過末端濾器)以去除細(xì)胞生物質(zhì)、孢子和其它不溶物。
再將濾液真空濃縮，接著澄清濾液。所得的組合物為黑曲霉1.2AN39發(fā)酵提取物，稱之為“AN-1”。
然后將一部分液體濾過提取物冰凍干燥制成AN-1發(fā)酵提取物粉末。這種發(fā)酵提取物的凍干粉末可在室溫下使用干燥劑儲(chǔ)存直至使用。
實(shí)施例2黑曲霉1.2 AN29發(fā)酵提取物的制備黑曲霉1.2 AN29發(fā)酵提取物按實(shí)施例1所述黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物的相同制備方法制備，不同之處是用黑曲霉1.2 AN29孢子接種冷卻了的滅菌培養(yǎng)基，這種黑曲霉1.2 AN29孢子按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1993年9月7日以登記號(hào)21139保藏在農(nóng)業(yè)研究所培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)1815 N.University St.，Peoria，Illinois(U.S.A.)。把這種組合物稱之為“AN-2”。
然后將一部分液體濾過提取物冰凍干燥制成AN-1發(fā)酵提取物粉末。再將這種發(fā)酵提取物的凍干粉末在室溫下用干燥劑儲(chǔ)存直至使用。
實(shí)施例3黑曲霉發(fā)酵提取物的體外治療指數(shù)評(píng)價(jià)本發(fā)明酶組合物的體外抗EB病毒(EBV)和皰疹型病毒的功效是為了證實(shí)本發(fā)明的治療組合物在體內(nèi)的潛在作用。
抗病毒劑的藥效的評(píng)斷標(biāo)準(zhǔn)是通過比較細(xì)胞毒性的半數(shù)有效量與抗病毒的半數(shù)有效量的比率。這種比率就是“體外治療指數(shù)”或“選擇性指數(shù)”。對(duì)于危急病癥，抗病毒劑的選擇指數(shù)必須大于100才表明如(1)中所述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)病毒抑制的有效作用。
本文所述的評(píng)估是通過Raji細(xì)胞與通常稱為P3HR-1的EBV病毒細(xì)胞系的雙重感染來進(jìn)行的。P3HR-1是一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室EBV菌株。雙重感染后，便可測定培養(yǎng)物中的早期抗原。1.人類包皮成纖維細(xì)胞的制備在包皮環(huán)切術(shù)后盡可能獲得新生兒的包皮，并在補(bǔ)加有(每mlDMEM)50μg萬古霉素、3μg二性霉素B、100單位青霉素和25μg慶大霉素的Dulbecco基本必需培養(yǎng)基(DMEM)(GIBCO BRL，LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，Maryland U.S.A.)中于37℃放置4小時(shí)。
然后取出培養(yǎng)基，將包皮切成小碎片，用Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)(GIBCO BRL)重復(fù)沖洗，這樣可去掉鈣和鎂，洗到不再看見紅細(xì)胞為止。
接著用0.25％(w/v)胰蛋白酶對(duì)組織進(jìn)行胰蛋白酶作用，在CO2孵育器中持續(xù)攪拌15分鐘。在這15分鐘的后期，組織被沉在瓶底。再將含細(xì)胞的上清液經(jīng)無菌干酪布注入含DMEM和10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，USA)的第二個(gè)瓶中。每次過濾細(xì)胞后，用含少量DMEM的血清沖洗干酪布。再將新鮮的胰蛋白酶加入上述的包皮碎片中，重復(fù)上述過程直到?jīng)]有細(xì)胞為止。
整個(gè)受胰蛋白酶作用的過程中，第二個(gè)瓶(含培養(yǎng)基和受胰蛋白酶作用的細(xì)胞)是放在冰中的。
然后將第二瓶中的含細(xì)胞的培養(yǎng)基以大約1000RPM(約100g)于4℃離心10分鐘(所需要的最小離心力是使細(xì)胞形成小球而不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷)。去掉上清液，并將細(xì)胞再懸浮于約50ml的含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中。
之后細(xì)胞置于適當(dāng)數(shù)量的25cm2的組織培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞保留在50μg/ml DMEM萬古霉素和3μg/ml DMEM二性霉素B中于37℃下約72小時(shí)，直至細(xì)胞傳代融合。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行如上所述的傳代培養(yǎng)，但使用大瓶和新鮮培養(yǎng)基。這一過程還需重復(fù)兩次直至得到四個(gè)傳代。2.EBV的篩選試驗(yàn)A.病毒根據(jù)(12)所述過程，所使用的傳染性EBV原型是來源于P3HR-1細(xì)胞系(按登記號(hào)VR 603從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland(U.S.A.)得到的)的上清液的病毒。這種細(xì)胞系產(chǎn)生非轉(zhuǎn)化病毒，該病毒在初期感染或B細(xì)胞雙重感染后可導(dǎo)致早期抗原(EA)的形成。B.細(xì)胞系Raji(按照登記號(hào)CCL86從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland(U.S.A.)得到的)是含有60EBV基因組/細(xì)胞的伯基特淋巴瘤細(xì)胞系，曾用作篩選對(duì)EBV早期抗原(EA)表達(dá)的抗病毒活性的原始細(xì)胞。
所有的病毒細(xì)胞系(P3HR-1和Raji病毒細(xì)胞系)均保留在RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO BRL)中，培養(yǎng)基中補(bǔ)加有10％(v/v)胎牛血清、2.05mN/ml L-谷氨酰胺培養(yǎng)基和25μg/ml慶大霉素培養(yǎng)基。每周兩次用新鮮培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基體積的一半，并將細(xì)胞濃度調(diào)至(12)所述的3×105/ml。然后將細(xì)胞在37℃下含5％(v/v)CO2的濕潤(90％)環(huán)境中保留至使用。3.用單克隆抗體的免疫熒光試驗(yàn)如(12)所述用EBV的P3HR-1菌株感染Raji細(xì)胞。于37℃被動(dòng)吸收45分鐘后加入上述實(shí)施例1中所得的組合物，并用不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)物。之后將培養(yǎng)物放在RPMI-1640培養(yǎng)基(上述的)于37℃孵育兩天，以產(chǎn)生病毒基因表達(dá)。48小時(shí)的孵育完成后，按(12)所述用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算每個(gè)標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)，然后將其點(diǎn)在有弓形體病的玻片(BellcoGlass Co.，U.S.A.)孔中并風(fēng)干。
然后按(12)所述將針對(duì)擴(kuò)散的早期抗原EA(D)(DuPont，U.S.A.)產(chǎn)生的單克隆抗體(由Dr.Gary Pearson，GeorgetownUniversity，U.S.A.無償提供)加入玻片孔中的Raji細(xì)胞中。再加入熒光素共軛山羊抗鼠IgG抗體(Fisher Scientific，U.S.A.)，按(12)所述的步驟，用熒光顯微鏡肉眼計(jì)算玻片孔中熒光陽性細(xì)胞的數(shù)目。然后計(jì)算并比較含EA(D)的培養(yǎng)物中細(xì)胞的總數(shù)，如(12)所述，EBV的早期抗原表達(dá)在不顯示熒光的Raji細(xì)胞中被抑制了。
4.體外細(xì)胞毒性AN-1的體外細(xì)胞毒性在上述得到的人類包皮成纖維細(xì)胞中測定，隨后把在(13)所述的條件和技術(shù)做如下改變實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，將低傳代人類包皮成纖維細(xì)胞固定在有96孔、濃度為每孔2.5×104細(xì)胞的組織培養(yǎng)皿(8×12平底孔)(Becton Dickinson Labware，U.S.A.)中。細(xì)胞置于含10％(v/v)胎牛血清(Hyclone，U.S.A.)的0.1ml DMEM中。然后將細(xì)胞放在CO2孵育器中于37℃孵育24小時(shí)。再吸出培養(yǎng)基并將100μl含2％(v/v)胎牛血清的DMEM加入除第一排的八個(gè)孔之外的其它孔中。將上述實(shí)施例1所得到的凍干發(fā)酵提取物(AN-1)溶解在含2％(v/v)胎牛血清的DMEM中直至濃度為100μg/ml。再將125微升AN-1分別加入第一排的每個(gè)孔中，并用Cetus液體處理器(Perkin-Elmer Corp.，U.S.A.)將全部現(xiàn)存的孔移去25μl，用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM按1∶5連續(xù)稀釋AN-1，使孔中的AN-1濃度范圍為100μg/ml到0.03μg/ml，再將培養(yǎng)皿放在CO2孵育器中于37℃孵育7天。然后吸去含AN-1溶液的無細(xì)胞培養(yǎng)基，并在每孔中加入Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水中的0.01％(v/v)的中性紅200μl。將此置于CO2孵育器中于37℃孵育1小時(shí)。去掉染料，用Nunc平皿清洗器(Nunc，Inc.，U.S.A.)沖洗細(xì)胞。撤去Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，每孔中加入50％(v/v)EtOH/1％(v/v)冰醋酸(水中)200μl。通過在軌道混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)15分鐘使內(nèi)含物混合。然后，用平皿讀數(shù)器(Beckman Instruments Inc.，U.S.A.)于550nm讀出每孔的光密度。
對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中經(jīng)用100μg/ml AN-1處理的人類包皮成纖維細(xì)胞(通常為靜止細(xì)胞)的視覺檢驗(yàn)顯示沒有毒性。
AN-1的細(xì)胞毒性也已在人類包皮成纖維細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(迅速生長的人類包皮成纖維細(xì)胞)中測定。迅速生長的人類包皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)已經(jīng)完成。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，將人類包皮成纖維細(xì)胞(上述所得的)以每孔含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中含有2.5×104個(gè)細(xì)胞的濃度種在有6個(gè)孔的組織培養(yǎng)皿中(有2×3平底孔)(Becton Dickinson Labware，U.S.A.)。在實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，按1∶5的增量在含10％(v/v)胎牛血清的DMEM中連續(xù)稀釋，使每個(gè)孔中AN-1的濃度范圍在100μg/ml-0.03μg/ml。然后從細(xì)胞中吸去培養(yǎng)基，并在每個(gè)孔中加入2ml AN-1濃縮物。隨后將細(xì)胞置CO2孵育器中于37℃孵育72小時(shí)。去除溶液中含AN-1的無細(xì)胞培養(yǎng)基并用不含鈣和鎂的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水沖洗細(xì)胞(單層細(xì)胞)。再經(jīng)抽吸去除Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水。在每個(gè)孔中加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶并孵育直至細(xì)胞開始從平皿孔的底部分離。用力來回吸取細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物以使細(xì)胞懸液分散，將0.2ml混合物加入9.8ml稀釋了的ISOTON III(Coulter Electronics Inc.，U.S.A.)中，用Coulter計(jì)數(shù)器(Coulter Electronics Inc.，U.S.A.)計(jì)算細(xì)胞數(shù)。對(duì)每個(gè)樣本的三個(gè)復(fù)制孔計(jì)數(shù)三次。
用這種比較嚴(yán)格的毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AN-1在100μg/ml時(shí)沒有毒性。AN-1在100μg/ml(IC50大于100μg)時(shí)對(duì)未轉(zhuǎn)染(無EBV)的Raji伯基特淋巴瘤細(xì)胞系也沒有毒。如(12)中85頁所述該方法是用于AN-1對(duì)未轉(zhuǎn)染(無EBV)Raji伯基特淋巴瘤細(xì)胞的毒性測定的。5.結(jié)果這些篩選結(jié)果如下所述，其中EC50(50％有效濃度)是抑制50％病毒的細(xì)胞病原性所需的濃度；IC50(50％抑制濃度)是抑制50％細(xì)胞增殖所需的濃度；和S.I.代表“選擇指數(shù)”。SI＝IC50/EC50。(1)。
當(dāng)檢測AN-1對(duì)Raji細(xì)胞(～60EBV Copies/細(xì)胞)中EB病毒(EBV)的早期抗原(EA)表達(dá)的抗病毒活性時(shí)，所得的選擇指數(shù)(SI)大于137(IC50＞100μg/ml÷EC500.73μg/ml)，如下EBV(RAJI細(xì)胞)免疫熒光法-微克(MCG)/mlEC50＝0.73；IC50＞100；SI＞137由于RAJI細(xì)胞中AN-1的選擇指數(shù)大于100(＞137)，表明在哺乳動(dòng)物試驗(yàn)中對(duì)病毒的抑制有效。
無環(huán)鳥苷(對(duì)多種皰疹病毒具有抑制活性的一種抗病毒標(biāo)準(zhǔn)物)的EC50為4.9μg(ACV EC504.9)。因而，AN-1的粗樣本的藥效超過無環(huán)鳥苷的6.71倍?？梢灶A(yù)測出，經(jīng)純化后，AN-1組合物的特殊活性還會(huì)增加。
抗病毒劑AN-1的粗制品在體外100μg/ml時(shí)，對(duì)I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、人類巨細(xì)胞病毒或水痘帶狀皰疹病毒均無抑制作用。
實(shí)施例4黑曲霉發(fā)酵提取物用作表面治療劑使用NIH(國家健康研究所)的棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)的兔模型體系能在兔中找到與疾病相關(guān)的人類乳頭狀瘤病毒的體內(nèi)研究的最佳動(dòng)物模型體系。這種體系以前是用來檢驗(yàn)測定病毒劑的。
CRPV是中西部棉尾兔天然特有的，它能誘發(fā)皮膚乳頭狀瘤，其中約25％進(jìn)一步形成侵害性癌。將CRPV注射在家兔的皮膚上會(huì)不斷地形成疣。因此，CRPV兔模型體系可用于檢驗(yàn)不同的抗病毒劑的阻止或減緩疣生長的功效。
在NIH的CRPV一兔模型體系中進(jìn)行上述實(shí)施例1中所得到的無細(xì)胞凍干發(fā)酵粗提物(AN-1)的治療作用的對(duì)比試驗(yàn)。該試驗(yàn)的第一步是比較動(dòng)物腫瘤的存在和大小，這些試驗(yàn)動(dòng)物或者a)僅接受50％(v/v)甘油的局部治療(第1組)；或b)接受含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油的治療(第2組)；或c)開始九周根本不進(jìn)行治療，感染了CRPV后再用含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油治療。這樣，將第2組(預(yù)防作用)和第3組(治療作用)與第1組和對(duì)照組進(jìn)行比較，可以研究本發(fā)明的組合物的預(yù)防和治療作用。方法和技術(shù)1.病毒的制備從野兔的腫瘤中分離出CRPV并用(2)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行制備，得到不含細(xì)胞殘?jiān)?0％(w/v)棉尾兔疣的勻漿。經(jīng)不斷稀釋滴定病毒，并在家養(yǎng)雄性荷蘭兔身上劃痕，如(3)中所述，這樣約3-4周后形成疣。然后用等密度CsCl密度梯度將一部分該病毒純化，如(4)中所述產(chǎn)生純化病毒顆粒。
之后將切除的腫瘤放在液氮中冷凍，用研缽和研棒將其研碎，如(4)所述便制成10％(w/v)的懸浮液。按(2)所述再將病毒的上清液用于43g/100ml、32g/100ml和27g/100ml的速度分級(jí)梯度，并在18℃以70,000g(在SW27轉(zhuǎn)子中)離心2小時(shí)，這些在(2)中進(jìn)行了描述。收集病毒帶，透析48小時(shí)，稀釋并用CsCl使密度達(dá)到1.34g/ml，這些也在(2)中進(jìn)行了描述。再將病毒綁在SW50.1轉(zhuǎn)子中以100,000g于18℃下離心40小時(shí)，收集并透析，這些在(2)中作了進(jìn)一步描述。2.實(shí)驗(yàn)記錄按(2)所述用純化的CRPV病毒顆粒(上述所得的)對(duì)兩只兔(C1和C2)進(jìn)行免疫接種。
使三組中的每七只兔均感染上上述所得到的CRPV。用50μl現(xiàn)有病毒的1∶4稀釋液(約32ID50單位)感染每只兔背部的八個(gè)部位(左邊四處和右邊四處)。如(3)所述，用劃痕法進(jìn)行這種感染。
一周后，開始表面治療。用100μl的50％(v/v)甘油去離子水每天兩次給第1組(對(duì)照組)的樣本進(jìn)行治療。用100μl含8％(w/v)AN-1的50％(v/v)甘油去離子水每天兩次給第2組的樣本進(jìn)行治療。第3組的樣本用100μl與治療第2組樣本相同的組合物每天治療兩次，但這種治療是在感染后的第九周初才開始的，此時(shí)大多數(shù)的感染灶都已長出了腫瘤。每組的治療均持續(xù)兩月。
通過用特殊方法接觸感染的腫瘤部位并用一種“橡皮淀帚”使這種接觸保持約5秒從而使治療引進(jìn).這樣來實(shí)現(xiàn)這些治療方法。3.細(xì)胞的DNA的分離從第2部分三個(gè)小組的各個(gè)樣本中取出腫瘤、切碎并用蛋白酶處理(消化)，這些在(5)中進(jìn)行了描述。然后在冷卻的消化物中加入氯化鉀和乙醇，以分別沉淀其中的蛋白絡(luò)合物和所有細(xì)胞的核酸，這些也在(5)中進(jìn)行了描述。用十二烷基硫酸鈉-蛋白酶消化，苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀后，再用核糖核酸酶A處理去除RNA。4.放射性標(biāo)記的CRPV DNA的制備從上述第3部分的分離的DNA中得到CRPV DNA，并根據(jù)(2)所述將其分子克隆到pBR322(Clontech Laboratories，U.S.A.)中。如(2)所述，在適用瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫適當(dāng)?shù)腄NA帶后，用EcoRI處理，從質(zhì)粒載體中去除克隆化的CRPV DNA。根據(jù)(6)所述再經(jīng)切口平移用32p-dCTP對(duì)CRPV DNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。通常獲得約3×108cpm/μg的比活。5.DNA分析如(5)所述在嚴(yán)格條件下進(jìn)行DNA濾膜雜交。根據(jù)(5)所述從上述第三部分中由蛋白酶和洗滌劑、酚和氯仿分離的DNA中提取細(xì)胞的DNA，隨后用基因擴(kuò)增(TM)(Perkin-Elmer，U.S.A.)和來源于CRPV E6開放讀框的寡聚體引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行分析。引物所用的序列為5′-GAACTGCCTGCCACGCTCGC-3′序列標(biāo)識(shí)號(hào)15′-CGCCTGGCCCTAGGTCAAC-3′.序列標(biāo)識(shí)號(hào)2循環(huán)35次后，雜交到放射性標(biāo)記CRPV DNA探針上之后，擴(kuò)增0.5μg細(xì)胞DNA可能會(huì)在初始樣本中測得少于1fg的CRPV DNA。見(3)。6.血清試驗(yàn)從第二部分中的每個(gè)樣本中抽取外周血用于CRPV毒性蛋白的體液抗體中酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試驗(yàn)。根據(jù)(7)中所述，將上述本實(shí)施例第1部分的純化病毒顆粒與弗氏完全和不完全佐劑結(jié)合以產(chǎn)生抗-CRPV血清。如(7)所述在標(biāo)準(zhǔn)的酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)中使用10ng純化的毒粒蛋白，發(fā)現(xiàn)這些血清具有7.7×104-4.7×105的效價(jià)。這些血清在酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)中是作為陽性對(duì)照[如(7)所述]以檢測試驗(yàn)動(dòng)物中的體液CRPV抗體。用1mg凍干粉末(上述實(shí)施例1所得)作為抗原測定血清對(duì)黑曲霉發(fā)酵提取物(AN-1)的反應(yīng)性。在兩組試驗(yàn)中，對(duì)來源于感染前的和研究結(jié)束時(shí)的兔子的血清進(jìn)行了分析。效價(jià)至少增加4倍的對(duì)比結(jié)果表明有顯著性意義。7.統(tǒng)計(jì)分析采用(8)所述的卡方試驗(yàn)法檢驗(yàn)有疣或無疣的單個(gè)樣本組與對(duì)照組對(duì)比的顯著性。用(9)、(10)和(11)中所述的FisherExact Test評(píng)定血清抗體效應(yīng)的差異性。用(9)-(11)所述的方法使用Fisher Exact Test計(jì)算“P值”。這兒所使用的，P值是指概率指數(shù)。我們認(rèn)為等于或小于0.05的概率指數(shù)(P)具有顯著性意義，表明這種結(jié)果隨機(jī)出現(xiàn)的機(jī)會(huì)少于5％。8.結(jié)果A.臨床觀察后面討論的臨床觀察的結(jié)果總結(jié)如下表1所示表1表面使用黑曲霉發(fā)酵提取物對(duì)CRPV所引起的疣的生長和去除作用的臨床觀察感染部位重量/腫瘤數(shù)

開始治療后八周，在第1組(未使用任何組合物)的動(dòng)物中96％的腫瘤感染部位和沒有接受任何治療的第3組中動(dòng)物的94％的中觀察到了腫瘤。相比之下，在第2組動(dòng)物中僅有80％觀察到了腫瘤。第2組是用組合物進(jìn)行預(yù)防處理的組，且是直至此時(shí)使用任何組合物的唯一的樣本。因而，可以發(fā)現(xiàn)，在CRPV感染的一周內(nèi)開始延長表面用藥一段時(shí)間，八周后與對(duì)照組相比腫瘤數(shù)減少了17％。又過了九周后(沒有繼續(xù)治療)，與對(duì)照組相比發(fā)現(xiàn)樣本的腫瘤數(shù)減少了43％。
腫瘤的17％和43％減少證實(shí)了本發(fā)明的組合物的預(yù)防作用。
對(duì)于第3組的樣本(用組合物進(jìn)行治療的組)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)有現(xiàn)存腫瘤(CRPV感染后九周出現(xiàn))的樣本表面反復(fù)使用AN-1時(shí)，大約八周后，這些樣本比對(duì)照組樣本減少了24％的腫瘤(第3組樣本腫瘤感染部位的百分比為57％，P＞0.05)。這24％的腫瘤減少證實(shí)了本發(fā)明的組合物的治療功效。
總之，該試驗(yàn)證實(shí)了本發(fā)明的組合物對(duì)防治病毒誘發(fā)腫瘤的預(yù)防和治療作用。
1)皮膚反應(yīng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用AN-1幾周后每組有幾個(gè)樣本出現(xiàn)“皮炎”(紅的、凹凸不平的表面)，這種皮炎開始僅在用藥的附近出現(xiàn)。然而，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，我們發(fā)現(xiàn)皮炎會(huì)有更大范圍地?cái)U(kuò)展。
所觀察到的皮炎使人想起退行性疣患者身上所見的皮膚發(fā)紅和瘙癢。
由于樣本以前或持續(xù)暴露于黑曲霉抗原，人們懷疑樣本可能曾經(jīng)有過遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。如所觀察到的這種遲發(fā)型超敏反應(yīng)是一種細(xì)胞免疫應(yīng)答。動(dòng)物的尸體剖檢發(fā)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)器官?zèng)]有不適的副作用。在一些用AN-1治療的動(dòng)物的腫瘤部位，表皮被中等量淋巴細(xì)胞和小量巨噬及漿細(xì)胞浸潤。在與超敏反應(yīng)有關(guān)的無乳頭狀瘤病毒感染的小結(jié)處可見到同樣的浸潤。
2)疣的消退感染后112天，各組均出現(xiàn)一些腫瘤消退。此時(shí)，第1組感染部位腫瘤的百分比為75％。所以，有25％腫瘤消退。由于用發(fā)酵提取物進(jìn)行治療，第3組的樣本的腫瘤中另外有24％疣消退。但是，第3組中一些已消退的腫瘤是用AN-1治療前消退的腫瘤，這取決于中間腫瘤大小的測量。B.血清的觀察用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)檢測各樣本的試驗(yàn)前血清和試驗(yàn)后血清對(duì)CRPV和AN-1抗原的反應(yīng)性的血清試驗(yàn)如表2所示。C1和C2分別代表對(duì)照樣本#1和對(duì)照樣本#2，它們是作為此酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)的對(duì)照
表2用CRPV和AN-1抗原的酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)的結(jié)果每只動(dòng)物血清的效價(jià)

將血清按1∶10稀釋，然后再稀釋兩倍。將陽性對(duì)照的血清按1∶10稀釋后再稀釋六倍。效價(jià)為稀釋度的倒數(shù)。當(dāng)490毫微米時(shí)的吸收率為0.1或更大時(shí)是最后稀釋的終點(diǎn)。四倍或更多的增加可認(rèn)為有顯著性意義。對(duì)照組包括用上述(3)中的純化CRPV病毒顆粒免疫接種過的樣本。
上述表2的結(jié)果表明，第3組有5只動(dòng)物對(duì)CRPV抗原產(chǎn)生顯著的血清學(xué)陽性反應(yīng)(后/前之比等于或大于4)，相反第1組僅有1只樣本有此反應(yīng)。按照Fisher Exact Test，第1組樣本(未使用任何本發(fā)明的組合物)與第3組樣本(使用本發(fā)明的組合物治療)對(duì)CRPV抗原的反應(yīng)的差異具有顯著性意義(P＝0.05)。
還觀察到第3組有4只樣本對(duì)AN-1抗原有血清學(xué)陽性反應(yīng)，相比第1組只有1只樣本有此反應(yīng)。雖然這似乎進(jìn)一步表明本發(fā)明組合物的功效，但從統(tǒng)計(jì)學(xué)來說，這一比例表明第1組和對(duì)照組動(dòng)物的反應(yīng)沒有顯著性差異。
盡管發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)的抗原反應(yīng)與所觀察到的腫瘤生長或不生長沒有關(guān)聯(lián)，但通常在第2和3組中對(duì)一種抗原的反應(yīng)的增加與對(duì)其它抗原的反應(yīng)的增加是相等的。對(duì)疣消退的血清學(xué)反應(yīng)的作用還不清楚。這些結(jié)果表明，全身的超敏反應(yīng)，如通過皮膚反應(yīng)所觀察到的，可作為AN-1促進(jìn)乳頭狀瘤消退的途徑。C.分子檢測本試驗(yàn)中，如(3)所述的PCR-雜交分析是在三組樣本的腫瘤陰性部位進(jìn)行的，目的是檢測在每個(gè)CRPV誘發(fā)的腫瘤中CRPV的實(shí)際存在。研究表明第1組有23％(3/13)之多的試驗(yàn)部位有CRPV DNA，相比，第2組僅有6.5％(2/31)的試驗(yàn)部位，第3組有9.5％(2/21)的試驗(yàn)部位(見表3)。與此相比，在作為陽性對(duì)照的腫瘤樣本中有76％發(fā)現(xiàn)CRPV DNA。
表3PCR DNA分析的結(jié)果<

1如(3)所述，取出感染部位以得到總DNA，用PCR擴(kuò)增證明CRPVDNA的存在并用Southern Blot Analysis進(jìn)行分析。對(duì)三個(gè)研究組的第一組所有腫瘤陰性部位進(jìn)行檢驗(yàn)。僅對(duì)每組腫瘤陽性部位的代表性抽樣進(jìn)行了檢驗(yàn)。2CRPV DNA陽性數(shù)與檢測數(shù)之比(％)。這是本表中原始材料的總結(jié)。3原始材料如下兔子數(shù)CRPV DNA陽性的感染部位兔模型體系中的這些結(jié)果似乎表明在人類以及其它哺乳動(dòng)物中達(dá)到預(yù)防和治療的目的時(shí)本發(fā)明組合物的功效。
實(shí)施例5黑曲霉發(fā)酵提取物用作表面治療劑對(duì)鼻部長有疣型腫瘤的兩匹馬均進(jìn)行兩周治療。用棉紗布將上述實(shí)施例1所得到的液體濾過發(fā)酵提取組合物(冰凍干燥前)涂在每只馬鼻子一側(cè)疣的表面上。作為對(duì)照，用棉紗布將滅菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)涂在每只馬鼻子另一側(cè)疣的表面上。1.實(shí)驗(yàn)記錄治療是這樣進(jìn)行的，將30ml溶液(PBS對(duì)照組合物)置于數(shù)層紗布上，再輕敷在疣上直至吸收。每次治療期間重復(fù)兩次，以使患處吸收。治療在第0、1、2、3、7和14天進(jìn)行。觀測在第0、1、2、3、7、14、21和30天進(jìn)行。2.結(jié)果大約治療開始后第7天，用組合物進(jìn)行治療的一側(cè)鼻中的疣外觀上開始改變(變得較白，而另外的為粉紅色外觀)。
到第21天，發(fā)現(xiàn)敷有PBS的一側(cè)疣變得更大，似乎數(shù)量增多了。這些疣為粉紅色且生存能力很強(qiáng)。用組合物治療的一側(cè)的疣依然存在，但它們的大小和數(shù)量沒有增長。另外，它們外表為白色且很硬。
到第30天，與第20天對(duì)比沒有什么改變。3.結(jié)論本發(fā)明的組合物對(duì)疣具有治療作用。用PBS處理的疣變得更大且擴(kuò)散了，表明在這兩種處理的初始時(shí)疣仍未成熟。因此，第30天時(shí)用PBS處理和用組合物治療的疣在外觀上的差異是有顯著性意義的。
實(shí)施例6黑曲霉發(fā)酵提取物用作表面治療劑用于體內(nèi)研究人類乳頭狀瘤病毒相關(guān)疾病的另一個(gè)極好的動(dòng)物模型體系是重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)小鼠。
重度聯(lián)合免疫缺損小鼠是從別的動(dòng)物中移植細(xì)胞的嵌合動(dòng)物。這類重度聯(lián)合免疫缺損小鼠幾乎很少有移植物抗宿主疾病。由于移植重度聯(lián)合免疫缺損小鼠的引進(jìn)細(xì)胞支持感染，所以重度聯(lián)合免疫缺損小鼠是檢驗(yàn)治療和預(yù)防組合物的一種有吸引力的模型。參考Milman，G.，and D′Souza，P.，ASM News(1990)Vol.56，No.12 at 639-642，可以得到重度聯(lián)合免疫缺損小鼠的全部說明，其內(nèi)容也包括在本文中。
此模型包括用棉尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)對(duì)已移植到重度聯(lián)合免疫缺損小鼠的背部的新西蘭白(NZW)兔耳的皮膚進(jìn)行感染。然后判斷潛在的抗乳頭狀瘤病毒治療對(duì)抑制疣生長的能力。由于重度聯(lián)合免疫缺損小鼠在免疫學(xué)上為T和B細(xì)胞功能缺損，所以這種模型用來檢驗(yàn)本發(fā)明的防治組合物(黑曲霉發(fā)酵提取物AN-1)的功效時(shí)不考慮任何這些免疫因素的介入。
上述實(shí)施例1所得的關(guān)于凍干無細(xì)胞發(fā)酵粗提物(AN-1)的治療作用的對(duì)照試驗(yàn)是按以下所述進(jìn)行的
材料和方法CRPV原料病毒原料是通過研磨棉尾兔疣得到10％(v/v)的組織勻漿，再將其離心以去除細(xì)胞殘?jiān)瞥?。上清液貯存于-70℃直至使用。
新西蘭白兔皮膚的移植和感染將新西蘭白兔耳皮膚移植到麻醉的小鼠的背部兩側(cè)并進(jìn)行數(shù)周的治療。然后用27G的針(100×)劃痕并在擦傷的組織處放5μl的未稀釋的CRPV培養(yǎng)物，這樣使兩側(cè)腹的組織受感染。
混合物的制備所有的混合物均在水乳膏中制備，得到最終濃度達(dá)8％(w/v)并加有10％(v/v)二甲基亞砜(DMSO)的凍干提取物。將400mg混合物加入4.1g乳膏中并攪拌15分鐘。為了幫助溶解將混合物置于56℃水浴1小時(shí)。最后，加入0.5ml DNSO并再攪拌該混合物。在治療之間將混合物在4℃下儲(chǔ)存。
損傷的治療感染(PI)后3天開始在CRPV感染的移植物的左右兩側(cè)每天兩次進(jìn)行表面治療，持續(xù)到感染(PI)后第6周。每個(gè)治療組有5只小鼠，每組感染移植物為10只。
功效的判斷用下述的損傷記分法從第2周至第8周每周判斷治療功效分?jǐn)?shù) 臨床表現(xiàn)0無明顯的感染1感染部位的皮膚增厚2小而分散的乳頭狀瘤3大而分散的乳頭狀瘤4半融合的乳頭狀瘤5融合的乳頭狀瘤6稠密的角蛋白角質(zhì)為了數(shù)據(jù)的分析，將治療組移植物的損傷分?jǐn)?shù)加在一起進(jìn)行平均。確定曲線以下的面積(AUC)，對(duì)于未進(jìn)行治療的對(duì)照組動(dòng)物則計(jì)算每次處理的曲線以下面積的減少百分比。
結(jié)果結(jié)果總結(jié)于下面表4中
表4

在這一模型中，一般認(rèn)為曲線以下面積減少大于未治療動(dòng)物的20％則有顯著性差異，可能表明有效的治療作用。使用無細(xì)胞的黑曲霉粗提物(AN-1)曲線以下面積的減少為21.1％。因此，可以看到當(dāng)在這種模型中實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用AN-1發(fā)酵提取物能使疣的生長明顯減少。
在沒有脫離本發(fā)明的基本構(gòu)思的情況下可進(jìn)行許多改進(jìn)。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都清楚除了在本文中特別加以描述的以外，在所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明是能夠?qū)嵤┑?。參考文獻(xiàn)(1)Takeshima，H.，Antiviral Agents.In The Search forBioactive Compounds from Microorganisms，Omura，S.，ed.，Springer-Verlag，N.Y.，N.Y.(1992)at page 50.(2)Watts，S.，et al.，(1983)Virology 125 at 127-138.(3)Ostrow，R.，et al.，(1992)Antiviral Res.17 at 99-113.(4)Ostrow，R.，et al.，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79 at1634-1638.(5)Manias，D.，et al.，(1989)Cancer Res.49 at 2514-2519.(6)Ostrow，R.，et al.，(1981)Virology，108 at 21-27.(7)Poindexter，N.，and Schlieverr，P.，(1985)J.of Infect.Dis.151 at 65-72.(8)Dowdy，S.，and Wearden，S.，Chi-Square Distributions InStatistics for Research，J.Wiley &amp; Sons，Inc.，N.Y.，N.Y.(1983)at 97-124.(9)Latscha，R.，(1955)Biometrika 40 at 74-86.(10)Finney，D.J.，(1948)Biometrika 35 at 145-156.(11)Fisher，R.A.，Statistical Methods for Research Workers，14thed.，Hafner，N.Y.，N.Y.(1973).(12)Lidin，B.，et al.，(1992)Antiviral Res.17 at 79-89.(13)Korba，B.E.and J.L.Gerin(1992)Antiviral Res.19，55-70.
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)腫瘤的防治組合物，它由藥劑上可接受的載體和曲霉屬發(fā)酵提取物或其衍生物組成。
2.權(quán)利要求1所述的防治組合物，其中曲霉屬發(fā)酵提取物為黑曲霉發(fā)酵提取物。
3.權(quán)利要求2所述的防治組合物，其中黑曲霉發(fā)酵提取物為黑曲霉1.2 AN29發(fā)酵提取物。
4.權(quán)利要求2所述的防治組合物，其中黑曲霉發(fā)酵提取物為黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物。
5.曲霉屬發(fā)酵提取物用于制造預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤的防治組合物。
6.權(quán)利要求5所述的用途，其中曲霉屬發(fā)酵提取物用于制造預(yù)防和治療的表面用的組合物。
7.一種用于制備預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)腫瘤的防治組合物的方法，該方法包括的步驟有在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)曲霉屬菌種，用水從培養(yǎng)基中提取細(xì)胞外的混合物，以便得到液體發(fā)酵提取物，過濾所得的液體發(fā)酵提取物，以去除其中的細(xì)胞生物質(zhì)和孢子，由此便制成防治組合物。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中培養(yǎng)的步驟包括在適當(dāng)?shù)墓腆w表面培養(yǎng)基上培養(yǎng)曲霉屬菌種。
9.權(quán)利要求7所述的方法，還包括冷凍液體發(fā)酵提取物直至其使用的步驟。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中培養(yǎng)曲霉屬菌種的步驟包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)黑曲霉。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中黑曲霉為黑曲霉1.2 AN29。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中黑曲霉為黑曲霉1.2 AN39。
13.預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)腫瘤的方法包括給需要治療的哺乳動(dòng)物使用治療有效量的防治組合物，該組合物包括曲霉屬發(fā)酵提取物或其衍生物和藥劑上可接受的載體。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中治療有效量是在所需哺乳動(dòng)物的體表，比如病毒誘發(fā)的腫瘤部位上表面用藥。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中曲霉屬發(fā)酵提取物為黑曲霉發(fā)酵提取物。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中黑曲霉發(fā)酵提取物為黑曲霉1.2 AN29發(fā)酵提取物。
17.權(quán)利要求13所述的方法，其中黑曲霉發(fā)酵提取物為黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物。
18.權(quán)利要求13所述的方法，其中病毒誘發(fā)的腫瘤為乳頭狀瘤病毒誘發(fā)的腫瘤。
19.一種黑曲霉1.2 AN29發(fā)酵提取物及其衍生物。
20.一種黑曲霉1.2 AN39發(fā)酵提取物及其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療病毒誘發(fā)腫瘤的防治劑，特別是來源于曲霉屬發(fā)酵提取物的組合物，及其應(yīng)用、直接使用或制備成一種藥劑來防治哺乳動(dòng)物中病毒誘發(fā)的腫瘤。這些腫瘤包括乳頭狀瘤病毒誘發(fā)的腫瘤。該組合物是表面給藥的。
文檔編號(hào)C12R1/685GK1134671SQ94194047
公開日1996年10月30日 申請(qǐng)日期1994年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月27日
發(fā)明者E·W·博耶, R·L·查爾斯 申請(qǐng)人:索爾維酶有限公司