專利名稱：血小板生成素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及影響造血細(xì)胞、特別是血小板遠(yuǎn)祖細(xì)胞存活、增殖、分化或成熟的蛋白質(zhì)的分離、提純和重組體或化學(xué)合成。本發(fā)明具體涉及編碼能結(jié)合并激活細(xì)胞因子受體超家族成員mpl的蛋白質(zhì)配體的核酸的克隆和表達(dá)。本發(fā)明還涉及應(yīng)用這些蛋白質(zhì)單獨(dú)或結(jié)合其他細(xì)胞因子以治療包括血小板減少在內(nèi)的免疫性或造血性疾病。本發(fā)明背景I.造血系統(tǒng)造血系統(tǒng)產(chǎn)生所有哺乳動(dòng)物生存必需的高度特化的成熟血細(xì)胞。這些成熟細(xì)胞包括專門(mén)輸送氧氣和二氧化碳的紅細(xì)胞；擔(dān)負(fù)細(xì)胞介導(dǎo)和抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的T和B淋巴細(xì)胞；專門(mén)生成血塊的血小板；以及作為清除細(xì)胞或輔佐細(xì)胞以抵御感染的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。粒細(xì)胞進(jìn)一步分為具有獨(dú)立功能的特化細(xì)胞類型中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和肥大細(xì)胞。值得注意的是，所有這些特化的成熟血細(xì)胞來(lái)自一種最初見(jiàn)于骨髓中的、稱作多能(或全能)干細(xì)胞的單一共同的原始細(xì)胞類型(Dexter等，Ann.Rve.Cell Biol.，3423-441〔1987〕)。
在哺乳動(dòng)物的生命全過(guò)程中，必須持續(xù)、大量地產(chǎn)生高度特化的成熟血細(xì)胞。絕大部分特化的血細(xì)胞只能維持幾小時(shí)至幾周的功能活性(Cronkite等，Blood，Cells，2263-284〔1976〕)。因此，為了維持哺乳動(dòng)物正常的穩(wěn)態(tài)血細(xì)胞需求，需要不斷更新成熟血細(xì)胞、原始干細(xì)胞本身，以及在原始細(xì)胞和成熟細(xì)胞之間的任何中間遠(yuǎn)祖細(xì)胞系或譜系定向的遠(yuǎn)祖細(xì)胞系。
造血系統(tǒng)的核心是多能干細(xì)胞。這些細(xì)胞相對(duì)量少，通過(guò)增殖進(jìn)行自身更新產(chǎn)生子代干細(xì)胞，或經(jīng)一系列分化步驟轉(zhuǎn)化為增多且成熟的譜系限定的遠(yuǎn)祖細(xì)胞，最終形成高度特化的成熟血細(xì)胞。
例如，來(lái)自干細(xì)胞的稱作CFC-Mix的某些多能遠(yuǎn)祖細(xì)胞經(jīng)增殖(自身更新)和發(fā)育而產(chǎn)生包含全部不同骨髓細(xì)胞的集落紅細(xì)胞、中性細(xì)胞、巨核細(xì)胞(血小板的前身)、巨噬細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和乳大細(xì)胞。其它淋巴譜系的遠(yuǎn)祖細(xì)胞增殖和發(fā)育成為T(mén)細(xì)胞和B細(xì)胞。
此外，在CFC-Mix遠(yuǎn)祖細(xì)胞和骨髓細(xì)胞之間，存在另一組定向于子代的中間遠(yuǎn)祖細(xì)胞。這些譜系限定的遠(yuǎn)祖細(xì)胞按其產(chǎn)生的子代表分類。因此，已知骨髓細(xì)胞最接近的前身為產(chǎn)生紅細(xì)胞的紅細(xì)胞集落形成單位(CFU-E)、產(chǎn)生中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞(GM-CFC)、產(chǎn)生巨核細(xì)胞的巨核細(xì)胞集落形成細(xì)胞(Meg-CFC)、產(chǎn)生嗜酸性細(xì)胞的嗜酸性細(xì)胞集落形成細(xì)胞(Eos-CFC)以及產(chǎn)生肥大細(xì)胞的嗜堿性細(xì)胞集落形成細(xì)胞(Bas-CFC)。其它介于多能干細(xì)胞和成熟血細(xì)胞之間的中間前身細(xì)胞也已知(見(jiàn)下述)或會(huì)被發(fā)現(xiàn)具有各種程度的譜系限定和自身更新能力。
因?yàn)閬G失了多能性并且獲得了譜系限定和成熟性，所以，正常造血細(xì)胞系統(tǒng)中的主細(xì)胞似乎降低自身更新的能力。因此，在造血細(xì)胞譜的一端，是具有自身更新和分化成所有各種譜系特化的定向遠(yuǎn)祖細(xì)胞能力的多能干細(xì)胞。這種能力是骨髓移植治療的基礎(chǔ)，在該治療中原始干細(xì)胞重新注入整個(gè)造血細(xì)胞系統(tǒng)中。在造血細(xì)胞譜的另一端，是高度譜系限定的遠(yuǎn)祖細(xì)胞及其子代，它們失去了自身更新的能力，但獲得了成熟的功能活性。
由各種造血生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子精細(xì)地控制著干細(xì)胞和譜系限定遠(yuǎn)祖細(xì)胞的增殖和發(fā)育。這些生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的作用是復(fù)雜的，尚未完全被了解。一些生長(zhǎng)因子，例如白細(xì)胞介素-3(IL-3)能刺激多能干細(xì)胞和一些譜系定向的遠(yuǎn)祖細(xì)胞，包括如巨核細(xì)胞。其它因子，如粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)起初被認(rèn)為其作用限于GM-CFC′s，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)，GM-CSF還影響特別是巨核細(xì)胞的增殖和發(fā)育。因此，發(fā)現(xiàn)IL-3和GM-CSF更有重疊的生物活性，盡管它們具有不同的潛能。最近，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素11(IL-11)單獨(dú)地對(duì)巨核細(xì)胞集落形成均無(wú)明顯影響，而與IL-3協(xié)同作用時(shí)則刺激巨核細(xì)胞的成熟(Yonemura等，Exp.Hematol.，201011-1016〔1992〕)。
因此，造血生長(zhǎng)因子可影響-個(gè)或多個(gè)譜系的生長(zhǎng)和分化，在影響單個(gè)遠(yuǎn)祖細(xì)胞系方面可與其它生長(zhǎng)因子重疊，或可與其它生長(zhǎng)因子協(xié)同作用。
而且，在從全能干細(xì)胞通過(guò)各種定向的譜系限定遠(yuǎn)祖細(xì)胞到成熟血細(xì)胞的細(xì)胞發(fā)育不同階段，造血生長(zhǎng)因子能夠顯示出它們的效應(yīng)。例如，紅細(xì)胞生成素(epo)似乎僅僅促進(jìn)成熟紅細(xì)胞的遠(yuǎn)祖細(xì)胞的增殖。IL-3似乎較早地發(fā)揮影響原始于細(xì)胞和中間譜系限定遠(yuǎn)祖細(xì)胞的效應(yīng)。其它生長(zhǎng)因子如干細(xì)胞因子(SCF)可影響甚至更原始的細(xì)胞發(fā)育。
綜上所述可理解，影響任何血細(xì)胞或其前身的存活、增殖、分化或成熟的新的造血生長(zhǎng)因子將是有用的，特別有肋于由疾病或放療或化療引起的削弱的造血系統(tǒng)的重建。II.巨核細(xì)胞生成——血小板產(chǎn)生巨核細(xì)胞生成和血小板產(chǎn)生的調(diào)節(jié)參見(jiàn)綜述Mazur，Exp.Hematol.，15248〔1987〕Hoffman，Blood，741196-1212〔1989〕。簡(jiǎn)而言之，骨髓多能干細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞和髓細(xì)胞系。據(jù)信，在干細(xì)胞和巨核細(xì)胞之間有定向巨核細(xì)胞遠(yuǎn)祖細(xì)胞這一級(jí)。至少鑒定出三類巨核細(xì)胞遠(yuǎn)祖細(xì)胞，即爆發(fā)集落形成單位巨核細(xì)胞(BFU-MK)、集落形成單位巨核細(xì)胞(CFU-MK)和低密度巨核細(xì)胞遠(yuǎn)祖細(xì)胞(LD-CFU-MK)。巨核細(xì)胞成熟本身是發(fā)育的延續(xù)，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)分成若干階段。巨核細(xì)胞(MK或meg)家族最早的可識(shí)別成員為成巨核細(xì)胞。這些細(xì)胞開(kāi)始時(shí)直徑為20-30μm，有嗜堿性細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)略微不規(guī)則的核，該核具有疏松的、略呈網(wǎng)狀的染色質(zhì)和幾個(gè)核仁。此后，成巨核細(xì)胞可含有多至32個(gè)核多倍體，但細(xì)胞質(zhì)仍維持稀疏和不成熟。在成熟過(guò)程中，核變得更呈小葉狀且固縮，細(xì)胞質(zhì)的量增加，變得更嗜酸性且呈顆粒狀。這一家族的大多數(shù)成熟細(xì)胞的邊緣可有釋放血小板的外觀。通常，10％以下的巨核細(xì)胞處于胚胎細(xì)胞階段，50％以上為成熟細(xì)胞。通常用于巨核細(xì)胞系列的權(quán)威形態(tài)學(xué)分類是最早期形態(tài)的成巨核細(xì)胞；中間形態(tài)的前巨核細(xì)胞或嗜堿性巨核細(xì)胞；后期形態(tài)的成熟(嗜酸性、顆粒狀或產(chǎn)生血小板的)巨核細(xì)胞。成熟巨核細(xì)胞將細(xì)胞質(zhì)纖絲延伸進(jìn)血竇腔，在血竇腔中它們碎裂成單個(gè)血小板(Williams等，Hematlolgy，1972)。
據(jù)信巨核細(xì)胞生成涉及一些調(diào)節(jié)因子(Williams等，Br.J.Haematol.，52173〔1982〕和Willams等，J.Cell Physiol.，110101〔1982〕)。巨核細(xì)胞生成的早期階段假定呈有絲分裂，涉及來(lái)自CFU-MK的細(xì)胞增殖和細(xì)胞集落的起始形成，但不受血小板數(shù)量的影響(Burstein等，J.Cell Physiol.，109333〔1981〕和Kimura等，Exp.Hematol.，131048〔1985〕)。成熟的后期階段呈非有絲分裂，涉及核的多倍體化和細(xì)胞質(zhì)成熟，可能通過(guò)外周血小板數(shù)目以反饋機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)(Odell等，Blood，48765〔1976〕和Ebbe等，Blood，32787〔1968〕)。
對(duì)獨(dú)特的、特異性的巨核細(xì)胞集落刺激因子(MF-CSF)的存在頗有爭(zhēng)議(Mazur，Exp.Hematol.，15340&350〔1987〕)。但是，多數(shù)作者相信，作為血小板產(chǎn)生這一對(duì)生存極其重要的過(guò)程絕對(duì)地受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。存在巨核細(xì)胞/血小板特異性細(xì)胞因子這一假說(shuō)為30多年的研究提供了基礎(chǔ)，但至今尚無(wú)象單一的MK-CSF(TPO)這樣的細(xì)胞因子被提純、測(cè)序和分析鑒定。
雖然據(jù)報(bào)道，MK-CSF′s被從實(shí)驗(yàn)性產(chǎn)生的血小板減少(Hill等，Exp.Hematol.，14752〔1986〕)和人胚腎條件培養(yǎng)基〔CM〕(McDonald等，J.Lab.Clin.Med.，8559〔1975)以及從可塑性貧血和特發(fā)性血小板減少性紫癜尿提取物(Kawakita等，Blood，6556〔1983〕和血漿(Hoffman等，J.Clin.invest.，751174〔1985〕)中部分地提純，但在大多數(shù)病例中，它們的生理功能尚未明了。
商陸促分裂原激活的脾細(xì)胞條件培養(yǎng)基(PWM-SpCM)和鼠骨髓單核細(xì)胞細(xì)胞系WEHI-3(WEHI-3CM)被用作巨核細(xì)胞促進(jìn)劑。PWM-SpCM含有多種促進(jìn)CFU-MK生長(zhǎng)的因子(Met-calf等，Pro.Natl.Acad.Sci.，USA，721744&1748〔1975〕；Quesenberry等，Blood，652141985；和lscove，N.N.，inHematopoietic Cell Differentiation，ICN-UCLA Symposia onMolecular and Cellular Biology，Vol.10，Golde等編輯〔NewYork，Academy Press〕pp 37-52〔1978〕)，其中一個(gè)是白細(xì)胞介素-3(IL-3)，這是一種多譜系細(xì)胞集落刺激因子(multi-CSF〔Burstein，Blood Cells，11469〔1986〕〕)。這種培養(yǎng)基中的其它因子尚未被鑒定和分離出來(lái)。WEHI-3鼠骨髓單核細(xì)胞系分泌相對(duì)地大量的IL-3和較少量的GM-CSF。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，IL-3促進(jìn)大范圍的造血細(xì)胞生長(zhǎng)(lhle等，J.lmmunol.，13282〔1983〕)。還發(fā)現(xiàn)，在非常早期的多能前體誘導(dǎo)中以及在非常大量的混合造血細(xì)胞集落的形成中，IL-3和很多已知的造血激素或生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，(Bartelmez等，J.Cell Physiol.，122382&369〔1985〕和Warren等，Cell，46667&674〔1988〕)，包括紅細(xì)胞生成素(EPO)和白細(xì)胞介素-1(IL-1)。
巨核細(xì)胞促進(jìn)劑的其它來(lái)源還見(jiàn)于鼠肺、骨、巨噬細(xì)胞系、腹膜滲出物細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中。盡管有某些相抵觸的數(shù)據(jù)(Mazur，Exp.Hematol.，15340&350〔1987〕)，但有一些證據(jù)(Geissler等，Br.J.Haematol.，60233-238〔1985〕)表明，激活的T淋巴細(xì)胞而非單核細(xì)胞在巨核細(xì)胞生成中起促進(jìn)作用。這些發(fā)現(xiàn)提示，激活的T淋巴細(xì)胞分泌物如白細(xì)胞介素可以是MK發(fā)育中的調(diào)節(jié)因子(Geissler等，Exp.Hematol.，15845-853〔1987〕)。用純化的紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)巨核細(xì)胞生成進(jìn)行的一些研究(Vainchenker等，Blood，54940〔1979〕；McLeod等，Nature，261492-4〔1976〕和Williams等，Exp.Hematol.，12734〔1984〕)表明，該激素對(duì)MK集落形成具有促進(jìn)作用。這在不含血清培養(yǎng)物和含血清培養(yǎng)物中，以及缺乏輔佐細(xì)胞的情況下均得到了證明(Williams等，Exp.Hematol.，12734〔1984〕。與PWM-SpCM的效應(yīng)相反，EPO被假設(shè)為更多地涉及巨核細(xì)胞生成的單細(xì)胞和雙細(xì)胞階段，而PWM-SpCM涉及巨核細(xì)胞發(fā)育的四細(xì)胞階段。所有這些因子對(duì)巨核細(xì)胞的早期和晚期的相互作用有待闡明。
從一些實(shí)驗(yàn)室得到的資料提示，僅各自具有MK-集落刺激活性的多譜系因子是GM-CSF和IL-3，而在較低程度上，是B細(xì)胞刺激因子IL-6(Ikebuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，849035〔1987〕。最近，一些作者報(bào)道了IL-11和白血病抑制因子(LIF)與IL-3起協(xié)同作用，增加巨核細(xì)胞體積和倍性(Yonemura等，British Journal of Hematology，8416-23〔1993〕；Burstein等，J.Cell.Physiol.，153305-312〔1991〕；Bruno等，Blood，7650-56〔1990〕；Metcalf等，Blood，772150-2153〔1991〕；Bruno等，Exp.Hematol.，19378-381〔1991〕；和Yonemura等，Exp.Hematol.，201011-1016〔1992〕。
其它令人感興趣的文獻(xiàn)包括Eppstein等，美國(guó)專利No.4,962,091；Chong，美國(guó)專利NNo.4,879,111；Fernandes等，美國(guó)專利No.4,604,377；Wissler等，美國(guó)專利No.4,512,971；Got-tlieb，美國(guó)專利No.4,468,379；Bennett等，美國(guó)專利No.5,215,895；Kogan等，美國(guó)專利No.5,250,732；Kimura等，Eur.J.lm-munol.，20(9)1927-1931〔1990〕；Secor等，J.of lmmunol.，144(4)1484-1489〔1990〕；Warren等，J.of lmmunol.，140(1)94-99〔1988〕；Warren等，Exp.Hematol.，17(11)1095-1099〔1989〕；Bruno等，Exp.Hematol.，17(10)1038-1043〔1989〕；Tamikawa等，Exp.Hematol.，17(8)883-888〔1989〕；Koike等，Blood，75(12)2286-2291〔1990〕；Lotem，Blood，75(5)1545-1551〔1989〕；Rennick等，Blood，73(7)1828-1835〔1989〕；和Clutterbuck等，Blood，73(6)1504-1512〔1989〕。III.血小板減少血小板是血凝機(jī)制中的關(guān)鍵要素。稱作小血板減少的血小板循環(huán)水平的耗竭存在于各種臨床狀況和疾病中。血小板減少通常定義為血小板計(jì)數(shù)低于150×109/升。根據(jù)血小板壽命，可將血小板減少的主要原因粗略地分為三類，即(1)骨髓引起的血小板產(chǎn)生受損，(2)脾血小板匯集(脾大)或(3)外周循環(huán)中血小板破壞增加(例如自身免疫性血小板減少或化療和放療)。此外，接受大劑量的快速施用破壞血小板的血制品的患者，可因稀釋而發(fā)生血小板減少。
血小板減少的臨床出血癥狀依賴于血小板減少的嚴(yán)重性、病因和可能伴有的凝血缺陷。通常，血小板計(jì)數(shù)在20－100×109/升的患者有外傷后過(guò)多出血的危險(xiǎn)，而血小板計(jì)數(shù)低于20×109/升的患者可自發(fā)性出血。后一種患者是血小板輸液的候選者，伴隨有免疫性和病毒性危險(xiǎn)。當(dāng)病因是血小板產(chǎn)生減少而不是破壞增加時(shí)，任何一種程度的血小板減少其出血傾向更為嚴(yán)重。在后一種情況，加速的血小板轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致更新、更多的止血更有效的血小板循環(huán)。血小板減少可來(lái)自各種疾病，簡(jiǎn)述如下。更詳細(xì)的描述可參見(jiàn)Schafner，A.L.，″Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function，″InternalMedicine，第三版，John J.Hutton等，編輯，Litte Brown和Co.，Boston/Toronto/London〔1990〕。
(a)由血小板產(chǎn)生受損造成的血小板減少先天性血小板減少的病因包括體質(zhì)性再生障礙性貧血(Fanconi綜合癥)和先天性無(wú)巨核細(xì)胞性血小板缺乏，這些可能與骨骼畸形相關(guān)。獲得性血小板產(chǎn)生疾病是由巨核細(xì)胞發(fā)育不全或低效血小板生成造成的。有多種情況會(huì)導(dǎo)致巨核細(xì)胞發(fā)育不全，其中包括骨髓發(fā)育不全(包括特發(fā)性形式或由化療劑或放療造成的骨髓抑制)、骨髓纖維變性、白血病和轉(zhuǎn)移腫瘤或肉芽腫對(duì)骨髓的侵襲。在有些情況中，毒素、感染原或藥物會(huì)相對(duì)選擇性地干擾血小板生成；其實(shí)例包括由酒精或某些病毒感染造成的暫發(fā)性血小板減少和與服用噻嗪類利尿劑有關(guān)的輕度血小板減少。最后，巨成紅細(xì)胞形成過(guò)程(葉酸或B12缺乏)中繼發(fā)的低效血小板生成也會(huì)導(dǎo)致血小板減少，通常伴隨以貧血和白細(xì)胞減少。
當(dāng)前對(duì)由血小板產(chǎn)生減弱造成的血小板減少的治療依賴于對(duì)存在的骨髓障礙病因的鑒定和逆轉(zhuǎn)。通常只對(duì)有嚴(yán)重出血并發(fā)癥的病人或?yàn)榱耸中g(shù)過(guò)程中的保護(hù)而進(jìn)行血小板輸液，因?yàn)橥N免疫可能導(dǎo)致對(duì)繼續(xù)輸入血小板產(chǎn)生不應(yīng)性。由嚴(yán)重血小板減少導(dǎo)致的粘膜出血可通過(guò)口服或靜脈注射以抗溶纖維蛋白劑來(lái)得到緩解。但是，如果對(duì)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)病人使用抗溶纖維蛋白劑可能使血栓形成并發(fā)癥進(jìn)一步發(fā)展。
(b)由脾(血小板)匯集造成的血小板減少由任何原因造成的脾大都可能與輕度至中度的血小板減少相關(guān)。與下文將要論述的在免疫介導(dǎo)的血小板減少中脾對(duì)血小板的積極性破壞相比，這是一個(gè)很消極的脾血小板匯集過(guò)程(脾功能亢進(jìn))。雖然脾功能亢進(jìn)的最常見(jiàn)病因是酒精性肝硬變?cè)斐傻拈T(mén)靜脈高血壓引起的充血性脾大，但其它形式的充血性、浸潤(rùn)性或淋巴組織增生性脾大也與血小板減少相關(guān)。單由脾功能亢進(jìn)引起的血小板減少通常計(jì)數(shù)不低于50×109/升。
(c)由非免疫介導(dǎo)的血小板破壞造成的血小板減少各種非免疫過(guò)程對(duì)血小板的加速破壞會(huì)導(dǎo)致血小板減少。這種類型的疾病包括彌漫性血管內(nèi)凝血，血管內(nèi)假體裝置、體外血循環(huán)和如血栓形成性血小板性紫癜等血栓形成性微血管病。在所有這些情況中，暴露于假體表面或異常血管內(nèi)膜的循環(huán)中的血小板會(huì)在這些位置被消耗或被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)破壞，然后在未成熟前將其清除。Braunwald等編輯的Harrison’s Principles of Internal Medicine第11版，P1478，McGraw Hill(1987)中較為詳細(xì)地?cái)⑹隽丝赡軐?dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的疾病狀況。血管內(nèi)假體裝置包括心瓣膜和主動(dòng)脈內(nèi)球囊能導(dǎo)致輕度至中度的破壞性血小板減少，而接受心肺分流術(shù)或血液透析的病人中的暫發(fā)性血小板減少可能是由體外回路中血小板的消耗或破壞造成的。
(d)藥物誘導(dǎo)的免疫性血小板減少有100多種藥物與免疫介導(dǎo)的血小板減少有關(guān)。但是，只對(duì)奎尼丁、奎寧、金、磺胺類藥、頭孢噻吩和肝素進(jìn)行了詳細(xì)的定性。藥物誘導(dǎo)的血小板減少通常十分嚴(yán)重而且一般在病人服用了致敏藥物后的幾天內(nèi)立即發(fā)生。
(e)免疫性(自身免疫性)血小板減少性紫癜(ITP)
成人中的ITP是一種慢性病，其特征在于自身免疫性血小板破壞。這種自身抗體通常是IgG，但對(duì)其它免疫球蛋白也有報(bào)道。雖然ITP自身抗體已被發(fā)現(xiàn)與血小板膜GPIIbIIIa相關(guān)，但大多數(shù)病例中的血小板抗原特異性仍未鑒定出來(lái)。致敏血小板的血管外破壞發(fā)生在脾和肝的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中。雖然半數(shù)以上的ITP病例是特發(fā)性的，但大多數(shù)病人患有風(fēng)濕性或自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)或淋巴組織增生性疾病(如慢性淋巴細(xì)胞性白血病)。
(f)HIV誘導(dǎo)的ITPITP是越來(lái)越常見(jiàn)的一種HIV感染并發(fā)癥(Morris等，Ann.Intern.Med.，96714-717〔1982〕)，而且能出現(xiàn)在疾病發(fā)展的任何階段，在已被確診的獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)病人、AIDS相關(guān)復(fù)合癥的病人和被HIV感染但無(wú)AIDS癥狀的病人中都有發(fā)生。HIV感染是一種傳染性疾病，最終表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能的深度缺陷和發(fā)生機(jī)會(huì)性感染及病情惡化。由HIV感染引起的最初免疫異常是表達(dá)CD4細(xì)胞表面糖蛋白的T淋巴細(xì)胞的發(fā)展性減少和功能性損壞(Lane等，Ann.Rev.Immunol.3477〔1985〕)。可能是CD4輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞功能的喪失造成了導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染和AIDS病情惡化特征的細(xì)胞免疫和體液免疫的深度缺陷。(H.Lane同上)。
雖然還不知到HIV相關(guān)的ITP機(jī)制，但據(jù)信不同于與HIV感染不相關(guān)的ITP機(jī)制(walsh等，N.Eng.J.Med.311635-639〔1984〕；和Ratner，Am.J.Med.，86194-198〔1989〕)。IV.當(dāng)前對(duì)血小板減少的治療方法對(duì)血小板減少病人的治療方法取決于臨床癥狀的嚴(yán)重性和緊迫性。對(duì)HIV相關(guān)性和HIV不相關(guān)性血小板減少的治療方法相似，而且，雖然已經(jīng)使用了多種不同的治療方法，但這樣的治療仍有爭(zhēng)議。
糖皮質(zhì)素(如強(qiáng)的松龍)療法成功地提高了確診患血小板減少癥病人的血小板數(shù)，但在大多數(shù)病人中，這種反應(yīng)不完全，或者會(huì)在減少糖皮質(zhì)素的劑量或中斷服用時(shí)出現(xiàn)復(fù)發(fā)?；谝訦IV相關(guān)的ITP患者進(jìn)行的研究，有些研究者提出糖皮質(zhì)素療法可能導(dǎo)致易感染AIDS。通常在血小板低于20×109/升以下或在出現(xiàn)自發(fā)性出血時(shí)服用糖皮質(zhì)素。
至于對(duì)糖皮質(zhì)素不應(yīng)的病人，化合物4-(2-氯苯基)-9-甲基-2-〔3-(4-嗎啉基)-3-丙酮-1-基〕6H-噻吩并〔3，2，f〕〔1，2，4〕三唑〔4，3，a〕〔1，4〕二氮雜草(WEB2086)已被成功地用于治療HIV不相關(guān)的ITP重病例。用WEB2086治療一血小板數(shù)為37,000-58,000/微升的病人，1-2周的治療后，血小板數(shù)升至140,000-190,000/微升。(EP361,077和Lohman等，Lancet，1147(1988))。
雖然獲得性無(wú)巨核細(xì)胞性血小板減少性紫癜(AATP)的最佳治療方法還不確定，但抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)(一種針對(duì)人胸腺組織的馬抗血清)已被顯示可產(chǎn)生長(zhǎng)期的、完全的緩解。(Trimble等，Am.J.Hematol.，37126-127〔1991〕)。但最近的一則報(bào)道指出，ATG的造血作用緣于硫柳汞，而蛋白質(zhì)被假設(shè)起著汞載體的作用。(Panella等，Cancer Research，504429-4435〔1990〕)。
已有報(bào)道稱脾摘除具有良好效果。脾摘除在許多病人中消除了大多數(shù)血小板破壞位置和大多數(shù)自身抗體產(chǎn)生源。該方法可在大量的病人中產(chǎn)生長(zhǎng)期的、無(wú)需治療的緩解。但是，缺乏免疫力的病人通常應(yīng)避免外科手術(shù)，所以脾摘除只適用于重癥血小板減少病例(如重癥HIV相關(guān)性ITP)及對(duì)2至3周的糖皮質(zhì)素治療無(wú)反應(yīng)或中斷糖皮質(zhì)素服用后無(wú)法獲得持續(xù)性反應(yīng)的病人?；诂F(xiàn)有的科學(xué)知識(shí)，還不清除脾摘除是否會(huì)使病人傾向于患AIDS。
除了強(qiáng)的松龍療法和脾摘除外，某些細(xì)胞毒劑，如長(zhǎng)春新堿和疊氮胸苷(AZT，zidovudine)也顯示出用于治療HIV誘導(dǎo)的ITP的可能性，但結(jié)果都是初試性的。
由此可知，治療血小板減少的一種方法應(yīng)是獲取一種能加速巨核細(xì)胞或其前體分化和成熟成為血小板產(chǎn)生形式的藥劑。在鑒定這樣一種通常稱為“血小板生成素”(TPO)的藥劑方面已經(jīng)花費(fèi)了大量努力。文獻(xiàn)中常見(jiàn)的TPO的其它名稱還有血小板產(chǎn)生刺激因子(TSF)、巨核細(xì)胞集落刺激因子(MK-CSF)，巨核細(xì)胞刺激因子和巨核細(xì)胞促進(jìn)劑。早在1959年，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TPO活性(Rak等，Med.Exp.，1125)，對(duì)它進(jìn)行定性和純化的努力一直持續(xù)至今。雖然有TPO-活性多肽的部分純化的報(bào)道(例如參見(jiàn)Tayrien等，J.Biol.Chem.，2623262〔1987〕和Hoffman等，J.Clin.Invest.751174〔1985〕)，但其它報(bào)道則推測(cè)TPO本身并不是一種獨(dú)立體，而只是某種已知激素的多功能表現(xiàn)形式(IL-3，Sparrow等，Prog.Clin.Biol.Res.，215123〔1986〕)。不管何種形式和來(lái)源，具有血小板生成活性的分子都應(yīng)具有重要的治療價(jià)值。雖然尚無(wú)蛋白質(zhì)被確切鑒定為T(mén)PO，但相當(dāng)大的興趣則圍繞著最近的一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)即mpl，一種假定的細(xì)胞因子受體，可能轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)血小板生成信號(hào)。V.Mpl是一種巨核細(xì)胞生成性細(xì)胞因子受體據(jù)信，造血細(xì)胞的增殖和成熟受某些因子緊密地調(diào)節(jié)，這些因子正向或負(fù)向調(diào)節(jié)多能干細(xì)胞的增殖和多譜系分化。這些作用是通過(guò)細(xì)胞外蛋白因子與特異性細(xì)胞表面受體的高親合性結(jié)合介導(dǎo)的。這些細(xì)胞表面受體具有高度的同源性，而且通常被歸類為細(xì)胞因子受體超家族的成員。該超家族的成員包括以下物質(zhì)的受體IL-2(β和γ鏈)(Hatakeyama等，Science，244551-556〔1989)；Takeshita等，Science，257379-382〔1991〕)、IL-3(itoh等，Science，247324-328〔1990)；Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，875459-5463〔1990)；Kitamura等，Cell，661165-1174〔1991a)；Kitamura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，885082-5086〔1991b〕)、IL-4(Mosley等，Cell，59335-348〔1989〕)、IL-5(Takaki等，EMBO J.，94367-4374〔1990)；Tavernier等，Cell，661175-1184〔1991〕)、IL-6(Yamasaki等，Science，241825-828〔1988〕；Hibi等，Cell，63149-1157〔1990I〕、IL-7(Goodwin等，Cell，60941-951〔1990〕)、IL-9(Renault等，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA，895690-5694〔1992〕)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(Gearing等，EMBO J.83667-3676〔1991〕)；Hayashida等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2449655-9659〔1990〕)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(Fukunaga等，Cell，61341-350〔1990a〕；Fukunaga等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，878702-8706〔1990b〕；Larsen等，J.Exp.Med.，1721559-1570〔1990〕)，EPO(D’Andrea等，Cell，57277-285〔1989〕；Jones等，Blood，7631-35〔1990〕)、白血病抑制因子(LIF)(Gearing等，EMBO J.，102839-2848〔1991〕)、制癌蛋白M(OSM)(Rose等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888641-8645〔1991〕)和促乳素(Boutin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，887744-7748〔1988〕；Edery等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86211 2-2116〔1989〕)，生長(zhǎng)激素(Leung等，Nature，330536-543〔1987〕和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)(GH)(Davis等，Science，25359-63〔1991〕)的受體。
細(xì)胞因子受體超家族中的成員可分為三種功能類別(有關(guān)綜述可參見(jiàn)Nicola等，Cell，671-4〔1991〕)。第一類由單鏈?zhǔn)荏w組成，如紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)或粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSF-R)，它們通過(guò)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與配體高親合性結(jié)合并產(chǎn)生一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。第二類受體又稱α-亞基，包括白細(xì)胞介素-6受體(IL6-R)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體(GM-CSF-R)、白細(xì)胞介素-3受體(IL3-Rα)和其它細(xì)胞因子受體超家族的成員。這些α-亞基與配體低親合性結(jié)合但不能轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。一種能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的高親合性受體是由α-亞基和稱為β-亞基的第三類細(xì)胞因子成員(如βc、IL3-Rα和GM-CSF-R等三種α-亞基的共同β-亞基)之間形成的一種異源二聚體而產(chǎn)生的。
mpl是細(xì)胞因子超家族中一員的證據(jù)來(lái)自于序列同源性(Gear-ing，EMBO J.83667-3676〔1988〕；Bazan，Proc.Natl.Sci.USA，876834-6938〔1990〕；Davis等，Science，25359-63〔1991〕和Vigon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644〔1992〕)和其轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)的能力。
由鼠c-mpl的分子克隆推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列揭示這種蛋白與其它細(xì)胞因子受體具有同源性。其胞外結(jié)構(gòu)域含465個(gè)氨基酸殘基，該結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每個(gè)亞結(jié)構(gòu)域有4個(gè)高度保守的半胱氨酸和N端亞結(jié)構(gòu)域和C端亞結(jié)構(gòu)域的一段特殊基序。預(yù)計(jì)結(jié)合配體的胞外結(jié)構(gòu)域具有相似的雙重β-折疊桶幾何結(jié)構(gòu)。這種重復(fù)的胞外結(jié)構(gòu)域與IL-3、IL-5和GM-CSF受體共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈和LIF的低親合性結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Vigon等，Oncogene，82607-2615〔1993〕)具有高度的同源性。所以mpl可能屬于細(xì)胞因子受體超家族的低親合性配體結(jié)合類。
鼠mpl與人成熟mplp比較顯示，兩種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出81％的序列一致性。尤其是，N端和C端胞外亞結(jié)構(gòu)域分別具有75％和80％的序列一致性。最保守的mpl區(qū)是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，顯示出91％的氨基酸一致性，在跨膜結(jié)構(gòu)域附近有一段在兩物種中完全一致的37個(gè)殘基序列。所以，mpl被報(bào)道為細(xì)胞因子受體超家族中最保守的成員之一(Vigon，同上)。
mpl是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)的功能性受體的證據(jù)來(lái)源于嵌合受體的構(gòu)建，嵌合受體含有與某已知細(xì)胞因子高親合性的細(xì)胞因子受體的胞外結(jié)構(gòu)域和mpl的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。由于還沒(méi)有報(bào)道過(guò)已知的mpl的配體，所以必須由第一類細(xì)胞因子受體如IL-4R或G-CSFR構(gòu)建嵌合型高親合性配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域。Vigon等(同上)將G-CS-FR的胞外結(jié)構(gòu)域與c-mpl的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域融合。用這種G-CSFR/c-mpl嵌合體和作為對(duì)照的全長(zhǎng)G-CSFR轉(zhuǎn)染IL-3依賴的細(xì)胞系BAF/B03(Ba/F3)。用嵌合體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-3或G-CSF存在時(shí)生長(zhǎng)良好。同樣，用G-CSFR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在IL-3或G-CSF中也生長(zhǎng)良好。沒(méi)有生長(zhǎng)因子時(shí)，所有細(xì)胞均死亡。Skoda等(EMBO J.12(7)2645-2653〔1993〕)也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中將人IL-4受體(hIL-4-R)的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域與鼠mpl的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合，并以此轉(zhuǎn)染鼠的IL-3依賴性Ba/F3細(xì)胞系。用野生型hIL-4-R轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在種特異性IL-4或IL-3存在時(shí)均能正常增殖。用hIL-4R/mpl轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞在hIL-4存在時(shí)(有或無(wú)IL-3時(shí))增殖正常，由此表明在Ba/F3細(xì)胞中，mpl的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含了轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)所必需的全部要素。
這些嵌合實(shí)驗(yàn)證明了mpl胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)的能力，但沒(méi)有提及mpl的胞外結(jié)構(gòu)域是否能結(jié)合配體。這些結(jié)果與至少兩種可能性相一致，即mpl象EPO-R或G-CSFR一樣，是一種單鏈?zhǔn)荏w(第一類)或著是需要一個(gè)IL-3樣α-亞基的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)β-亞基(第三類)(Skoda等，同上)。VI.Mpl配體是一種血小板生成素(TPO)如上所述，有人提出血清中含有一種有時(shí)被稱為血小板生成素(TPO)的獨(dú)特因子，它協(xié)助各種其它細(xì)胞因子促進(jìn)巨核細(xì)胞的生長(zhǎng)與成熟。還未曾從血清或其它來(lái)源中分離出這種天然因子，雖然許多研究組織為此進(jìn)行了大量的努力。即使不知道m(xù)pl是否能直接結(jié)合某種巨核細(xì)胞刺激因子，最近的實(shí)驗(yàn)仍證明了mpl與來(lái)自再生障礙性骨髓患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種或多種因子的增殖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)(Methia等，Blood，82(5)1395-1401〔1993〕)。
有一種獨(dú)特的不同于IL-1α、IL-3、IL-4、IL-6、IL-11、SCF、EPO、G-CSF和GM-CSF的血清集落形成因子通過(guò)mpl來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)的證據(jù)來(lái)自于對(duì)原始和定向造血細(xì)胞系中c-mpl表達(dá)分布的檢測(cè)和在一種這些細(xì)胞系中進(jìn)行的mpl反義研究。
在免疫純化的人造血細(xì)胞中使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR(Methia等，同上)表明只在CD34+純化的細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)mpl mRNA信息。由骨髓(BM)純化而得的CD34+細(xì)胞約占全部BM細(xì)胞的1％，并且富集于所有譜系的原始和定向遠(yuǎn)祖細(xì)胞中(如紅細(xì)胞、粒巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞)。
有報(bào)道顯示Mpl反義寡脫氧核苷酸抑制來(lái)自多能CD34+細(xì)胞的巨核細(xì)胞集落形成，這些多能CD34+細(xì)胞培養(yǎng)于取自再生障礙性骨髓(一種巨核細(xì)胞集落刺激活性〔MK-CSA〕的豐富來(lái)源)患者的血清中。這些相同的反義寡脫氧核苷酸對(duì)紅細(xì)胞或粒巨噬細(xì)胞集落形成都沒(méi)有作用。
mpl是否直接結(jié)合配體和是否血清因子顯示能通過(guò)mpl作用導(dǎo)致巨核細(xì)胞生成仍不清楚。但是曾有人提出，如果mpl確實(shí)直接結(jié)合配體，其氨基酸序列可能是高度保守的，并由于人和鼠mpl胞外結(jié)構(gòu)域之間的高度序列一致性而具有種間交叉反應(yīng)性(Vigon等，同上〔1993〕)。VII.目的綜上所述，可以理解，在本領(lǐng)域中存在著一種現(xiàn)時(shí)且將持續(xù)的要求，即分離和鑒定能促進(jìn)造血細(xì)胞、尤其是用于治療血小板減少的巨核細(xì)胞或其前體增殖、分化和成熟的分子。據(jù)信，這類分子是一種mpl配體，所以還進(jìn)一步需要分離出這種配體以評(píng)價(jià)它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)和分化中的作用。
所以，本發(fā)明目的之一是獲取一種藥學(xué)純的能刺激巨核細(xì)胞增殖、分化和/或成熟為成熟的血小板生成形式的分子。
本發(fā)明目的之二是提供用于治療造血性疾病，尤其是血小板減少的治療形式的分子。
本發(fā)明目的之三是分離，純化，尤其是鑒定能在體內(nèi)結(jié)合被稱為mpl的某細(xì)胞因子超家族受體的蛋白質(zhì)配體并轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)。
本發(fā)明目的之四是提供編碼這類蛋白質(zhì)配體的核酸分子和用這些核酸分子在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生用于診斷和治療的mpl結(jié)合配體。
本發(fā)明目的之五是提供蛋白質(zhì)配體的衍生物和修飾形式，包括它們的氨基酸序列變異體、變異糖蛋白形式和它們的共價(jià)衍生物。
本發(fā)明目的之六是提供mpl配體與某異源蛋白組合而成的融合多肽和它們的共價(jià)衍生物。
本發(fā)明目的之七是提供mpl配體與氨基酸添加和取代后的EPO序列組合而成的變異多肽，從而生成一種能調(diào)節(jié)血小板和紅細(xì)胞遠(yuǎn)祖細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明另一目的是制備用于提高針對(duì)mpl配體或其融合形式的抗體的免疫原，以及獲取能結(jié)合這類配體的抗體。
參照以下說(shuō)明，本發(fā)明的這些及其它目的對(duì)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明概述本發(fā)明目的是通過(guò)提供一種分離的哺乳動(dòng)物巨核細(xì)胞生成性增殖和成熟促進(jìn)蛋白而達(dá)到，該蛋白被命名為“mpl配體”(ML)或“血小板生成素”(TPO)，它能刺激巨核細(xì)胞增殖、成熟和/或分化成成熟的血小板生成形式。
可以用以下方法從某天然來(lái)源純化這種基本均一的蛋白質(zhì)(1)在可使待純化mpl配體分子選擇性吸附于固定化受體多肽上的條件下，將含有待純化mpl配體分子的某源血漿與某固定化受體多肽，尤其是固定在某載體上的mpl或mpl融合多肽接觸，(2)洗滌固定化受體多肽及其載體以去除未吸附物質(zhì)，(3)用洗脫緩沖液從吸附有mpl配體分子的固定化受體多肽上洗脫mpl配體分子。天然來(lái)源最好是含有mpl配體的哺乳動(dòng)物血漿或尿液。該哺乳動(dòng)物可患有再生障礙性貧血，而固定化受體是mpl-lgG融合體。
可選的是，優(yōu)選的巨核細(xì)胞生成性增殖和成熟促進(jìn)蛋白是分離的和基本均一的利用合成或重組方法制得的mpl配體多肽。
本發(fā)明的“mpl配體”多肽或“TPO”最好與高度純化的基本均一的豬mpl配體多肽氨基酸序列至少具有70％的全序列一致性，而與豬mpl體基多肽“EPO結(jié)構(gòu)域”至少具有80％的序列一致性?？蛇x的是，本發(fā)明的mpl配體是具有

圖1所示成熟氨基酸序列(SEQ IDNO1)的成熟人mpl配體(hML)，或其變異體或其轉(zhuǎn)錄后修飾形式或具有與成熟人mpl配體約80％序列一致性的蛋白質(zhì)。mpl配體變異體可以是片段，尤其是成熟的人mpl配體(hML)的氨基端或“EPO結(jié)構(gòu)域”片段。最好，氨基端片段保留有第一至第四半胱氨酸殘基之間幾乎全部人ML序列，但可以含有該區(qū)域外的一般性添加、缺失或取代。根據(jù)這種實(shí)施方式，片段多肽可由以下結(jié)構(gòu)式表示X-hML(7-151)-Y其中hML(7-151)表示Cys7至Cys151之間的人TPO(hML)氨基酸序列(包括Cys7和Cys151)；X表示Cys7的氨基或一個(gè)或多個(gè)成熟hMl的氨基端氨基酸殘基或其氨基酸殘基延伸至如Met、Tyr或至含有如蛋白酶解位置的引導(dǎo)序列(如Xa因子或凝血酶)；Y表示Cys151的羧基或一個(gè)或多個(gè)成熟hMl的羧基端氨基酸殘基或其延伸氨基酸殘基。
可選的是，mpl配體多肽或其片段可以與某異源多肽融合(嵌合體)。優(yōu)選的異源多肽是某種細(xì)胞因子、集落刺激因子或白細(xì)胞介素或其片段，尤其是成套配體(kit-ligand，KL)、IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、EPO、GM-CSF或LIF。一種優(yōu)選的異源多肽是免疫球蛋白鏈，尤其是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgD、IgM或其片段，尤其是含有IgG重鏈恒定區(qū)。
另一方面，本發(fā)明提供了一種含有分離的mpl激動(dòng)劑的組合物，具有生物活性并最好能刺激標(biāo)記的核苷酸(如3H-胸苷)摻入用人mpl轉(zhuǎn)染的IL-3依賴的、Ba/F3細(xì)胞DNA中。可選的是，該mpl激動(dòng)劑是有生物活性的mpl配體，并最好能在鼠血小板回跳測(cè)定中刺激35S摻入循環(huán)的血小板中。合適的mpl激動(dòng)劑包括hML153、hML(R153A、R154A)、hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2或它們的片段。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種分離的能結(jié)合mpl配體的抗體。這種分離的能結(jié)合mpl配體的抗體可選地與另一種多肽融合，而這種抗體或其融合體可用于從前述來(lái)源中分離和純化用于固定mpl的mpl配體。在該實(shí)施例的另一方面內(nèi)容中，本發(fā)明提供了一種用于體內(nèi)或在體外檢測(cè)mpl配體的方法，包括使抗體與被疑含有配體的某種樣品(尤其是血清樣品)接觸以及檢測(cè)是否發(fā)生結(jié)合。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種分離的編碼mpl配體或其片段的核酸分子，該核酸分子可選地用某種可檢測(cè)成份進(jìn)行標(biāo)記；并且提供了一種具有與某mpl配體編碼序列的核酸分子互補(bǔ)或在中度至高度嚴(yán)緊條件下能與之雜交的核酸分子。優(yōu)選的核酸分子是那些人、豬和鼠mpl配體的編碼核酸，包括RNA和DNA、為基因組和cDNA。在該實(shí)施例的另一方面中，核酸分子是編碼mpl配體的DNA并且還含有一可復(fù)制載體，其中DNA與可被用該載體轉(zhuǎn)化的宿主識(shí)別的調(diào)控序列可操作地連接?？蛇x的是，DNA是具有圖1中5′-3′(SEQ ID NO2)或3′-5′序列的cDNA或其片段。這一方面內(nèi)容還包括用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(最好是CHO細(xì)胞)和一種使用DNA來(lái)產(chǎn)生mpl配體的方法，最好包括在轉(zhuǎn)化后宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)編碼mpl配體的cDNA和從宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收mpl配體。以此方式制備的mpl配體最好是人mpl配體。
本發(fā)明還包括一種用于治療患有某種造血性疾病，尤其是血小板減少的哺乳動(dòng)物的方法，它包括給哺乳動(dòng)物服用有效治療量的某種mpl配體?？蛇x的是，可將這種mpl配體與某種細(xì)胞因子，尤其是某種集落刺激因子或白細(xì)胞介素聯(lián)合服用。優(yōu)選的集落刺激因子或白細(xì)胞介素包括成套配體(KL)、ILF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、IL-1、IL-3、IL-6和IL-11。
本發(fā)明還包括從產(chǎn)生TPO的微生物中分離和純化TPO(ML)的方法(1)裂解或溶解含TPO的細(xì)胞，(2)可選地將可溶性物質(zhì)與含TPO的不溶性物質(zhì)分離，(3)用溶解緩沖液溶解不溶性物質(zhì)中的TPO，(4)將溶解的TPO與其它可溶性和不溶性物質(zhì)分離，(5)在氧還緩沖液中重折疊TPO，(6)將正確折疊的TPO與錯(cuò)誤折疊的TPO分離。
該方法用離液劑溶解含TPO的不溶性物質(zhì)，該離液劑選自胍鹽、硫氰酸鈉或脲。該方法還提出，溶解的TPO是通過(guò)離心、凝膠過(guò)濾和反相色譜中的一步或多步與其它可溶性和不溶性物質(zhì)分離。該方法的重折疊步驟提供了一種既含氧化劑又含還原劑的氧化還原緩沖液。通常，氧化劑是氧氣或含有至少一個(gè)二硫鍵的化合物，而還原劑是含有至少一個(gè)游離巰基的化合物。最好，氧化劑選自已氧化的谷胱甘肽(GSSG)和半胱氨酸，而還原劑選自已還原的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸。最優(yōu)選的氧化劑是已氧化的谷胱甘肽(GSSG)，而最優(yōu)選的還原劑是已還原的谷胱甘肽(GSH)。而且，氧化劑的摩爾比最好等于或大于還原劑。另外氧化還原緩沖液還含有去垢劑，最好選自CHAPS和CHAPSO，含量至少為1％。氧化還原緩沖液還含有濃度以約0.1-0.5M為佳的NaCl和濃度以大于15％為佳的甘油。氧化還原緩沖液的pH以pH7.5-pH9.0為佳，重折疊步驟在4℃進(jìn)行12-48小時(shí)。重折疊步驟產(chǎn)生具有生物活性的TPO，其中在最靠近EPO結(jié)構(gòu)域氨基端的Cys和最靠近其羧基端的Cys之間形成一個(gè)二硫鍵。
本發(fā)明還包括一種從微生物中純化具有生物活性TPO的方法，它包括(1)至少溶解微生物的胞外膜，(2)用離液劑處理含TPO的裂解物，(3)重折疊TPO，(4)從正確折疊的TPO中分離去雜質(zhì)和錯(cuò)誤折疊的TPO。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示推斷的人mpl配體(hML)cDNA的氨基酸序列(SEQID NO1)和編碼的核苷酸序列(SEQ ID NO2)。在每一行的開(kāi)頭對(duì)核苷酸進(jìn)行編號(hào)。5’和3’非翻譯區(qū)用小寫(xiě)字母表示。從成熟mpl配體(ML)蛋白序列的Ser1開(kāi)始，在序列上方對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。假定的外顯子3的邊界用箭頭標(biāo)出，并加框標(biāo)出潛在的N-糖基化位點(diǎn)。以序列上方的黑點(diǎn)標(biāo)出半胱氨酸殘基。劃線序列對(duì)應(yīng)于由純化自豬血漿的mpl配體測(cè)得的N端序列。
圖2顯示用3H-胸苷摻入的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。為了測(cè)定各種來(lái)源中mpl的存在，mpl P Ba/F3細(xì)胞在缺乏IL-3的條件下，在濕度培養(yǎng)箱中37℃、5％CO2和空氣下培養(yǎng)24小時(shí)。在IL-3饑餓培養(yǎng)后，將細(xì)胞鋪平在含有或不含有稀釋樣品的96孔培養(yǎng)板上，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。將20μl含1μCi3H-胸苷的無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基加入每一孔中進(jìn)行最后6-8小時(shí)的培養(yǎng)。然后在96孔濾板上收獲細(xì)胞并用水洗滌。然后對(duì)濾板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
圖3顯示了鏈霉蛋白酶、DTT和高溫對(duì)APP刺激Ba/F3-mpl細(xì)胞增殖的效應(yīng)作用。為了用鏈霉蛋白酶消化APP，將鏈霉蛋白酶(Boehringer Mannheim公司)或牛血清白蛋白與Affi-gel10(Bio-rad公司)偶聯(lián)后，與APP分別在37℃孵育18小時(shí)。接著，離心去除樹(shù)脂而對(duì)上清液進(jìn)行分析。APP還被加熱至80℃4分鐘或制成100μM的DTT后透析PBS。
圖4顯示從Phenyl-Toyopearl，Blue-Sepharose和Ultra-lind-mpl柱上的mpl配體活性物洗脫。mpl親和柱上的洗脫組分4-8是峰值活性部分。
圖5顯示Ultralink-mpl洗脫組分的SDS-PAGE。200μl每一洗脫組分2-8中分別加入1ml-20℃、含1mM HCl的丙酮。3小時(shí)后，樣品在-20℃進(jìn)行離心，然后對(duì)所得的沉淀在-20℃用丙酮洗滌兩次。接著將丙酮洗滌后的沉淀溶于30μl SDS-溶解緩沖液中，制成100μM DTT并在90℃加熱5分鐘。然后將樣品在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，通過(guò)銀染色可目測(cè)到蛋白質(zhì)。
圖6顯示SDS-PAGE上的mpl配體活性物。在非還原條件下，mpl-親和柱的洗脫組分6在4-20％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離。電泳后將凝膠切割成12個(gè)等分區(qū)，然后如實(shí)施例所述進(jìn)行電洗脫。將電洗脫后的樣品透析入PBS，以1/20的稀釋液進(jìn)行分析。用于校準(zhǔn)凝膠的分子量(Mr)標(biāo)準(zhǔn)是Novex Mark12標(biāo)準(zhǔn)物。
圖7顯示已耗盡APP的mpl配體對(duì)人巨核細(xì)胞生成的影響。將1ml通過(guò)1ml mpl-親和柱(700μg mpl-IgG/ml NHS-superose，Pharmacia公司)來(lái)制備已耗盡APP的mpl配體。人外周干細(xì)胞被制成10％APP或10％已耗盡APP的mpl的配體并培養(yǎng)12天。如實(shí)施例所述定量分析巨核細(xì)胞生成。
圖8顯示通過(guò)APP mpl-IgG對(duì)人巨核細(xì)胞生成刺激作用的影響。人外周干細(xì)胞被制成10％APP并培養(yǎng)12天。在第0，2，4天加入mpl-IgG(0.5μg)或ANP-R-IgG(0.5μg)。12天后，如實(shí)施例所述定量分析巨核細(xì)胞生成。括號(hào)中給出實(shí)際重復(fù)數(shù)據(jù)表示重復(fù)樣品的平均值。
圖9顯示了編碼mpl配體的人基因組DNA的390bp片段雙鏈。還顯示了“外顯子3”的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO3)，編碼序列(SEQ IS NO4)和它的互補(bǔ)序列(SEQ ID NO5)。
圖10顯示了成熟的人mpl配體(hML)(SEQ ID NO6)和成熟的人紅細(xì)胞生成素(hEPO)(SEQ ID NO7)的推導(dǎo)氨基酸序列。將人mpl配體的假定氨基酸序列與人紅細(xì)胞生成素的序列排齊。加框標(biāo)出相同的氨基酸，為對(duì)齊而引入的空檔用虛線表示。用下劃線標(biāo)出潛在的N-糖基化位置，對(duì)hML用實(shí)線，對(duì)hEPO用虛線。對(duì)紅細(xì)胞生成素活性來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵性的兩個(gè)半胱氨酸用大黑點(diǎn)標(biāo)出。
圖11顯示成熟的人mpl配體同種型的推導(dǎo)氨基酸序列hML(SEQ ID NO6)、hML2(SEQ ID NO8)、hML3(SEQ ID NO9)和hML4(SEQ ID NO10)。加框標(biāo)出相同的氨基酸，為對(duì)齊而引入的空檔用虛線表示。
圖12A，12B和12C顯示了人mpl配體對(duì)Ba/F3-mpl細(xì)胞增殖作用的影響(A)，用放射性標(biāo)記的特異性針對(duì)巨核細(xì)胞糖蛋白GPIIbIIIa的鼠IgG單克隆抗體定量分析體外人巨核細(xì)胞生成(B)和在血小板回跳測(cè)定中檢測(cè)鼠血小板生成(C)。
293細(xì)胞利用CaPO4法(Gorman，Cin DNA CloningA NewApproach 2143-190〔1985〕)單獨(dú)以pRK5載體、以pRK5-hML或以pRK5-ML153(pRK5-ML153是利用PCR在hML的殘基153后引入一個(gè)終止密碼子而產(chǎn)生)轉(zhuǎn)染過(guò)夜。然后如實(shí)施例1中所述在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時(shí)，分析Ba/F3-mpl細(xì)胞增殖(A)或體外人巨核細(xì)胞生成(B)的刺激作用。利用125I放射性標(biāo)記的針對(duì)巨核細(xì)胞特異糖蛋白GPIIbIIIa的鼠IgG單克隆抗體定量分析巨核細(xì)胞生成(如Grant等，Blood 691334-1339〔1987〕所述)。利用McDon-ald，T.P.在Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1441006-10012(1973)中所述的回跳血小板生成測(cè)定分析部分純化的重組ML(rML)對(duì)體內(nèi)血小板生成的作用(C)。部分純化的rML是從200ml含重組ML的條件培養(yǎng)基制得。將培養(yǎng)基通過(guò)在PBS中平衡的2mlBlue-Separose柱，用PBS洗柱，用含2M脲和2M NaCl的PBS洗脫。將活性洗脫組分透析入PBS，用無(wú)內(nèi)毒素的BSA制成1mg/ml濃度。每ml樣品含少于1單位的內(nèi)毒素。給小鼠注射64,000、32,000或16,000單位的rML或單獨(dú)的賦形劑。每組6個(gè)小鼠。給出每一組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。利用比較中值的2具尾T-測(cè)驗(yàn)測(cè)定p值。
圖13比較了人mpl配體同種型和變異體在Ba/F3-mpl細(xì)胞增殖測(cè)定中的作用。如實(shí)施例1所述在各種稀釋比時(shí)對(duì)hML，模擬試驗(yàn)、hML2、hML3、hML(R153A、R154A)、和hML153進(jìn)行了測(cè)定。
圖14A，14B和14C顯示了人mpl配體(hML)或人TPO(hT-PO)的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO1)和人基因組DNA編碼序列(SEQ ID NO11)。在每行的開(kāi)頭為核苷酸和氨基酸編號(hào)。
圖15顯示了純化的293-rhML332和純化的293-rhML153的SDS-PAGE。
圖16顯示了核苷酸序列cDNA編碼(SEQ ID NO12)和某種鼠ML同種型的開(kāi)放讀框的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO13)。該成熟鼠mpl配體同種型含331個(gè)氨基酸殘基，比假定的全長(zhǎng)mML少4個(gè)，因此表示為mML2。核苷酸編號(hào)在每行的開(kāi)頭。從Ser1開(kāi)始在序列上方為氨基酸殘基編號(hào)。下劃線標(biāo)出潛在的N-糖基化位點(diǎn)。用序列上方的黑點(diǎn)標(biāo)出半胱氨酸殘基。
圖17顯示該鼠ML同種型(mML)的cDNA序列(SEQ IDNO14)和假定的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO15)。核苷酸編號(hào)在每行開(kāi)頭。氨基酸編號(hào)在序列上方，從Ser1開(kāi)始。該成熟鼠mpl配體同種型含335個(gè)氨基酸殘基，并據(jù)信是全長(zhǎng)mpl配體，標(biāo)為mML。用虛線標(biāo)出信號(hào)肽序列，用箭頭標(biāo)出可能的切割位點(diǎn)。5′和3′的非翻譯區(qū)用小寫(xiě)字母表示?？勺兤唇赢a(chǎn)生的兩處缺失(mML2和mML3)用下劃線標(biāo)出。用一黑點(diǎn)標(biāo)出4個(gè)半胱氨酸殘基。7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)加框標(biāo)出。
圖18比較了人ML同種型hML3(SEQ ID NO9)和鼠ML同種型mML3(SEQ ID NO16)推導(dǎo)的氨基酸序列。將人mpl配體的假定氨基酸序列與鼠mpl配體序列排齊。相同的氨基酸被加框，為對(duì)齊引入的空檔用虛線標(biāo)出。在每行開(kāi)頭對(duì)氨基酸編號(hào)。
圖19比較了鼠ML(SEQ ID NO17)，豬ML(SEQ ID NO18)和人ML(SEQ ID NO6)的成熟ML同種型的假定氨基酸序列。將氨基酸序列排齊，其中有用虛線標(biāo)出為對(duì)齊而引入的空檔。在每行開(kāi)頭給氨基酸編號(hào)，加框標(biāo)出相同的殘基。用加陰影的方框標(biāo)出潛在的N-糖基化位置，用點(diǎn)標(biāo)出半光氨酸殘基。表示潛在的蛋白酶切割位點(diǎn)的保守性雙堿性氨基酸基序被加以下劃線。在三種類中都出現(xiàn)的4個(gè)氨基酸缺失(ML2)用粗體方框標(biāo)出。
圖20顯示了某種豬ML同種型(pML)的cDNA序列(SEQ IDNO19)和假定成熟蛋白序列(SEQ ID NO18)。該豬mpl配體同種型含332個(gè)氨基酸殘基，并據(jù)信是全長(zhǎng)的豬mpl配體，命名為pML。在每行開(kāi)頭為核苷酸編號(hào)。在序列上方給氨基酸殘基編號(hào)，從Ser1開(kāi)始。
圖21顯示了某種豬ML同種型(pML2)的cDNA序列(SEQID NO20)和假定的成熟蛋白序列(SEQ ID NO21)。該豬mpl配體同種型含328個(gè)氨基酸殘基，比全長(zhǎng)豬mpl配體少4個(gè)，命名為pML2。在每行開(kāi)頭給核苷酸編號(hào)。在序列上方給氨基酸殘基編號(hào)，從Ser1開(kāi)始。
圖22比較了全長(zhǎng)豬ML同種型pML的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQID NO18)和命名為pML2的豬ML同種型的推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO21)。將pML的假定氨基酸序列與pML2的序列排齊。給相同的氨基酸殘基加框，虛線表示為對(duì)齊而引入的空檔。在每行開(kāi)頭給氨基酸編號(hào)。
圖23顯示了用于轉(zhuǎn)染宿主CHO-DP12細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生CHO-rhTPO332的質(zhì)粒pSV15.ID.LL.MLORF(“全長(zhǎng)”或TPO332)的有關(guān)特性。
圖24顯示了用于轉(zhuǎn)染宿主CHO-DP12細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生CHO-rhTPO153的質(zhì)粒pSV15.ID.LL.MLEPO-D(“截短的”或TPO153)的有關(guān)特性。
圖25A、25B和25C顯示了E.coli-rhTPO(Met-1，153)在正常小鼠體內(nèi)對(duì)血小板(A)、紅細(xì)胞(B)和白細(xì)胞(C)的作用。給兩組6個(gè)一組的雌性C57 B6小鼠每天注射PBS緩沖液或0.3μg E.coli-rhTPO(Met-1，153)(100μl sc.)。在第0天和第3-7天，由眶竇抽取40μl血。該血樣被立即稀釋在10ml商購(gòu)稀釋劑中并在SerronoBaker Hematology Analyzer 9018上獲取全血計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖26A，26B和26C顯示了E.coli-rhTPO(Met-1，153)在亞致死照射過(guò)的小鼠體內(nèi)對(duì)血小板(A)、紅細(xì)胞(B)和白細(xì)胞(C)的作用。用來(lái)自137Cs的750cGyγ射線亞致死照射兩組10個(gè)雌性C57 B6小鼠，并每天注射PBS緩沖液或0.3μg E.coli-rhTPO(Met-1，153)(100μl sc.)。在第0天和以后的間隔時(shí)間點(diǎn)，由眶竇抽取40μl血。該血樣被立即稀釋在10ml商購(gòu)稀釋劑中并在Serrono BakerHematology Analyzer 9018上獲取全血計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖27A、27B和27C顯示了CHO-rhTPO332在正常小鼠體內(nèi)對(duì)(A)血小板、(B)紅細(xì)胞和(C)白細(xì)胞的作用。給兩組6個(gè)一組的雌性C57 B6小鼠每天注射PBS緩沖液或0.3μg CHO-rhTPO332(100μl sc.)。在第0天和第3-7天，由眶竇抽取40μl血。該血樣被立即稀釋在10ml商購(gòu)稀釋劑中并在Serrono Baker HematologyAnalyzer 9018上獲取全血計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖28顯示了從各種細(xì)胞系獲得的各種形式的rhTPO劑量反應(yīng)曲線。對(duì)取自以下細(xì)胞系的rhTPO繪制劑量反應(yīng)曲線來(lái)自CHO(來(lái)自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的全長(zhǎng)形式)的hTPO332；hTPOMet-1153(E-coli衍生的截短形式，有一個(gè)N-端甲硫氨酸)；hTPO332(來(lái)自人293細(xì)胞的全長(zhǎng)TPO)；Met-less 155 E.coli(來(lái)自E.coli的截短形式〔rhTPO155〕，無(wú)末端甲硫氨酸)。用各種rhTPO分別給各組6個(gè)一組的C57B6小鼠注射7天。每天從眶竇抽取40μl血進(jìn)行全血計(jì)數(shù)。圖上表示的數(shù)據(jù)是所見(jiàn)出現(xiàn)在第7天的最強(qiáng)作用，只有一個(gè)例外(Met153 E-coli)。而在前述的“Met 153 E-coli”組中，最強(qiáng)作用出現(xiàn)在第5天。數(shù)據(jù)表示為平均值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖29顯示了比較在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的全長(zhǎng)和“截短”形式的rhTPO與來(lái)自E.coli截短形式的活性的劑量反應(yīng)曲線。給6個(gè)一組的C57B6雌性小鼠每天注射0.3μg的各種類型rhTPO。在第2-7天，由眶竇抽取40μl血進(jìn)行全血計(jì)數(shù)。處理組是來(lái)自E.coli的截短形式TPO rhTPO153；全長(zhǎng)TPO rhTPO332(混合組份)含約80-90％全長(zhǎng)和10-20％截短形式；TPO332(30K組份)＝從原混合制劑純化的截短組份；TPO332(70K組份)＝從原混合制劑純化的全長(zhǎng)TPO組份。數(shù)據(jù)表示為平均值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖30是表示測(cè)定TPO的KIRA ELISA實(shí)驗(yàn)的示意圖。該圖顯示了MPL/Rse.gD嵌合體和親代受體的相關(guān)部分以及最終結(jié)構(gòu)(圖的右側(cè))和表示測(cè)定的有關(guān)步驟流程圖(圖的左側(cè))。
圖31是表示程序中每一步的KIRA ELISA測(cè)定流程圖。
圖32A-32L提供了在實(shí)施例17中用于表達(dá)Res.gD的pSVI17.ID.LL表達(dá)載體的核苷酸序列(SEQ ID NO22)。
圖33是制備質(zhì)粒pMP1的圖示。
圖34是制備質(zhì)粒pMP21的圖示。
圖35是制備質(zhì)粒pMP151的圖示。
圖36是制備質(zhì)粒pMP202的圖示。
圖37是制備質(zhì)粒pMP172的圖示。
圖38是制備質(zhì)粒pMP21O的圖示。
圖39是來(lái)自pMP21O質(zhì)粒文庫(kù)中5個(gè)最佳TPO表達(dá)克隆(SEQ ID NO23、24、25、26、27和28)的列表。
圖40是制備質(zhì)粒pMP41的圖示。
圖41是制備質(zhì)粒pMP57的圖示。
圖42是制備質(zhì)粒pMP251的圖示。
本發(fā)明的詳細(xì)描述1.定義一般情況下，下列詞語(yǔ)用于說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和權(quán)利要求書(shū)時(shí)，具有以下所述定義。
“離液劑”指一種處于水溶液中并達(dá)到適合濃度時(shí)，能引起蛋白質(zhì)空間構(gòu)型和構(gòu)象變化的化合物，這種變化是通過(guò)至少部分地破壞維系蛋白質(zhì)正常二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的力來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些化合物包括尿素，鹽酸胍和硫氰酸鈉等。通常要求這些化合物達(dá)到4-9M的高濃度時(shí)才能對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生作用。
“細(xì)胞因子”表示由一個(gè)細(xì)胞群分泌的蛋白質(zhì)的一般性術(shù)語(yǔ)，該類蛋白質(zhì)作為胞間介體作用于其他細(xì)胞。例如淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素等。其中包括生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、甲狀旁腺素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松馳素、松弛素原、糖蛋白激素(如促卵泡素[FSH]、促甲狀腺素[TSH]、促黃體素[LH])、造血生長(zhǎng)因子、肝生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促乳素、胎盤(pán)促乳素、α腫瘤壞死因子(TNF-α和TNF-β)、穆勒氏抑制物、鼠促性腺素關(guān)聯(lián)肽、抑制素、活化素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、整聯(lián)蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(如NGF-β)、血小板生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFs(如TGF-α和TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、骨誘導(dǎo)因子、干擾素(如α、β、γ干擾素)、集落刺激因子(CSFs)(如巨噬細(xì)胞集落刺激因子[M-CSF]、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子[GM-CSF]、粒細(xì)胞集落刺激因子[G-CSF])、白細(xì)胞介素(IL′s)(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12)和其他多肽因子(如白細(xì)胞抑制因子[LIF]、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子[SCF]和成套配體)。本文中的“細(xì)胞因子”術(shù)語(yǔ)表示各種從自然來(lái)源或重組細(xì)胞培養(yǎng)物中得到的蛋白質(zhì)。類似地，這一術(shù)語(yǔ)也包括具有生物活性的等價(jià)物，例如其氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸不同或糖基化類型及程度不同。
“mpl配體”、“mpl配體多肽”、“ML”、“血小板生成素”或“TPO”在本文中互換使用，并包括任何具有可與mpl結(jié)合的特性的多肽。mpl是細(xì)胞因子受體超家族中的一員，并具備如下所述的ML的生物學(xué)特性。其中一種典型的生物學(xué)特性是能促進(jìn)標(biāo)記的核苷酸(如3H-胸苷)摻入用人mpl P轉(zhuǎn)染的、依賴IL-3的Ba/F3細(xì)胞DNA中。另一種典型的生物學(xué)特性是在鼠血小板回跳分析實(shí)驗(yàn)中，能促進(jìn)35S摻入循環(huán)的血小板。這個(gè)定義主要指某種多肽，這種多肽從mpl配體來(lái)源(如發(fā)育不全的豬血漿)或其他來(lái)源(如包括人在內(nèi)的其他動(dòng)物種類)中分離到，或者通過(guò)重組或合成方法制備，同時(shí)該定義也包含了包括功能性衍生物、片段、等位基因、同種型及其類似物在內(nèi)的多種形式。
“mpl配體片段”或“TPO片段”指除去了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或糖單元的、自然產(chǎn)生成熟全長(zhǎng)mpl配體或TPO序列中的一段。其中，氨基酸殘基的去除可以發(fā)生在肽鏈上的任何位置，包括N末端、C末端或肽內(nèi)部。該片段至少具備一種與mpl配體相同的生物學(xué)特性。這種mpl配體片段一般有一個(gè)至少10、15、20、25、30或40個(gè)氨基酸殘基的連續(xù)序列，與從哺乳動(dòng)物中分離的mpl配體，包括從發(fā)育不全的豬血漿中分離的配體或者人或鼠的mpl配體，尤其是其促紅細(xì)胞生成素(EPO)結(jié)構(gòu)域，序列完全相同。N末端片段的代表性例子有hML153或TPO(Met-11-153)。
“mpl配體變異體”或“mpl配體序列變異體”在本文中表示下述具有生物活性的mpl配體，它與具有如圖1(SEQ ID NO1)所示推斷序列的、從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或發(fā)育不全的豬血漿中分離到的mpl配體或人配體并不100％地有相同的序列。通常，一個(gè)具有生物活性的mpl配體變異體應(yīng)至少有70％的氨基酸序列與從發(fā)育不全的豬血漿中分離到的mpl配體或成熟的鼠或人配體及其片段相同(見(jiàn)圖1[SEQ ID NO1])，達(dá)到至少約75％則較好，至少約80％則更好，至少約85％還要好，至少約90％甚至還要好，最好至少約95％相同。
“嵌合mpl配體”表示由全長(zhǎng)mpl配體或其一個(gè)或多個(gè)片段融合或結(jié)合于一條次要的異源多肽或其一個(gè)或多個(gè)片段中而組成的一種多肽。這種嵌合體至少有一種生物學(xué)特性與mpl配體相同。那條次要的多肽一般為細(xì)胞因子、免疫球蛋白或其片段。
“分離的mpl配體”、“高純度mpl配體”和“基本均一的mpl配體”可互換使用，表示從某個(gè)mpl配體源純化或由重組或合成方法得到的mpl配體，其中基本上不含其他肽或蛋白質(zhì)。(1)用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀或非常商業(yè)化的市售氨基酸測(cè)序儀或根據(jù)本申請(qǐng)歸檔后公布的改進(jìn)方法從N末端或某段內(nèi)部氨基酸序列中獲取至少為15、較好為20個(gè)的氨基酸殘基，或者(2)用考馬斯亮藍(lán)或較佳地用銀染法，在非還原或還原條件下，以SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)達(dá)到均一性。在這里，均一性表示雜蛋白的污染低于5％。
“生物學(xué)特性”一詞在與“mpl配體”或“分離的mpl配體”連同使用時(shí)，表示具有由mpl配體(無(wú)論是自然的還是變性后的構(gòu)象)或其片段直接或間接地引起或行使的血小板生成素活性或體內(nèi)效應(yīng)子功能或抗原性功能或活性。效應(yīng)子功能包括mpl結(jié)合活性和任何載體結(jié)合活性、mpl的興奮作用和拮抗作用尤其是增殖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括復(fù)制、DNA調(diào)節(jié)功能、其他細(xì)胞因子生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)，受體(尤其是細(xì)胞因子)激活、正向或負(fù)向調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)或分化等?？乖怨δ鼙硎緭碛幸粋€(gè)能與由天然mpl配體得到的抗體起交叉反應(yīng)的表位或抗原位點(diǎn)。mpl配體多肽的主要抗原性功能是它與由分離自發(fā)育不全的豬血漿mpl配體得到的抗體結(jié)合，其親和性至少有106l/mole。通常，該親和性至少為107l/mole。最佳情況下，具有抗原活性的mpl配體多肽是一種與由具備上述某個(gè)效應(yīng)子功能的mpl配體得到的抗體相結(jié)合的多肽。用于確定“生物活性”的抗體是通過(guò)以下方法得到的兔多克隆抗體首先在Freund′s完全佐劑中，制備從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或發(fā)育不全的豬血漿中分離的mpl配體，然后皮下注射制備物，再向腹膜內(nèi)注射制備物以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，直至mpl配體抗體的效價(jià)達(dá)到平臺(tái)區(qū)。
“生物活性”一詞在與“mpl配體”或“分離的mpl配體”連同使用時(shí)，表示本文中所描述的一種mpl配體或多肽，其顯示血小板生成素活性或者具備從發(fā)育不完全的豬血漿分離的或由重組細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的mpl配體的某個(gè)效應(yīng)子功能。本文中所知的mpl配體或多肽的一個(gè)基本功能是與mpl結(jié)合并能促進(jìn)標(biāo)記的核苷酸(3H-胸苷)摻入用人mpl P轉(zhuǎn)染的、依賴IL-3的Ba/F3細(xì)胞DNA中。本文中所知的mpl配體或多肽的另一個(gè)效應(yīng)子功能是在鼠血小板回跳測(cè)定中能促進(jìn)35S摻入循環(huán)的血小板。還有一個(gè)已知的mpl配體的效應(yīng)子功能是能促進(jìn)體外人巨核細(xì)胞生成，可用放射性標(biāo)記的針對(duì)巨核細(xì)胞糖蛋白GPIIbIIIa的單克隆抗體進(jìn)行定量。
關(guān)于mpl配體序列的“氨基酸序列同一性百分率”，在本文中表示候選序列中的氨基酸殘基與具備如圖1(SEQ ID NO1)所示氨基酸推斷序列的、從發(fā)育不全的豬血漿中分離的或者鼠或人配體的mpl配體序列中的殘基完全相同的百分比。為了達(dá)到序列同一性的最大百分比，必要時(shí)，可在比較前使序列線性化并引入裂口。比較時(shí)，任何保守性置換都不作為序列同一性的一部分來(lái)分析。mpl配體序列的N末端、C末端或內(nèi)部的延伸、缺失或插入被認(rèn)為不影響序列同一性或同源性。因此，一些典型的具有生物活性的mpl配體多肽被認(rèn)為具有完全相同的序列，包括前mpl配體原、mpl配體原和成熟的mpl配體。
“mpl配體的微量測(cè)序”可由任一足夠靈敏的合適的標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)完成。在一個(gè)這樣的方法中，由SDS凝膠或者最后的高效液相色譜(HPLC)步驟獲得的高純度多肽用配備了一臺(tái)120A乙內(nèi)酰苯硫脲(PTH)氨基酸分析儀的470A型號(hào)Applied Biosystems氣相測(cè)序儀通過(guò)自動(dòng)Edman(異硫氰酸苯酯)降解直接測(cè)序。另外，由化學(xué)制劑(如溴化氰、羥胺、2-硝基-5-硫氰酸苯酯)或酶(如胰蛋白酶、膠原蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶)消化及純化(如HPLC)后所得到的mpl配體片段也可進(jìn)行類似的測(cè)序。PTH氨基酸的分析使用ChromPerfect數(shù)據(jù)系統(tǒng)(Justice Innovations，Palo Alto，CA)。序列解譯由Henzel等人在J.Chromatography，40441-52中提及的VAX 11/785 Digital Equipment Co.的計(jì)算機(jī)來(lái)完成?；蛘?，可將一份HPLC組分在5-20％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(ProBlott，AIB，F(xiàn)oster City，CA)，再用考馬斯亮藍(lán)染色(Mat-surdiara，J.Biol.Chem.，26210035-10038)。通過(guò)染色鑒別的特異性蛋白從染色斑中切出，并用如上所述的氣相測(cè)序儀進(jìn)行N末端測(cè)序。對(duì)于內(nèi)部的蛋白質(zhì)序列，先將HPLC組分在真空(SpeedVac)中干燥，然后在合適的緩沖液中重懸，再用溴化氰、賴氨酸特異的酶Lys-C(Wako Chemicals，Richmond，VA)或天冬氨酸特異的酶Asp-N(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)進(jìn)行消化。消化后，對(duì)得到的肽鏈以混合物形式測(cè)序或在氣相測(cè)序以前，在一個(gè)0.1％TFA(三氟醋酸)丙醇梯度的C4柱中進(jìn)行HPLC分離。
“血小板減少”指血液中的血小板數(shù)少于150×109/每升。
“血小板生成活性”是指一種能加速巨核細(xì)胞或巨核細(xì)胞前體增殖、分化和/或成熟成為血小板生成形式的生物活性。這種生物活性可用多種方法測(cè)定，如體內(nèi)鼠血小板回跳合成測(cè)定，用針對(duì)人白血病成巨核細(xì)胞系[CMK]的抗血小板免疫測(cè)定[抗GPIIbIIIa]來(lái)進(jìn)行血小板細(xì)胞表面抗原誘導(dǎo)分析，以及一個(gè)成巨核細(xì)胞系(DAMI)的多倍性化誘導(dǎo)。
“血小板生成素”(TPO)是一種具有血小板生成活性或能夠增加哺乳動(dòng)物血清中血小板數(shù)的化合物。TPO在較佳情況下能夠增加至少10％的內(nèi)源血小板數(shù)，50％則更佳，而在最佳情況下，可使人血液中的血小板數(shù)提高到150×109/每升以上。
“分離的mpl配體核酸”是一段RNA或DNA，其中含有不少于16個(gè)、較佳地20個(gè)或更多序貫的核苷酸堿基，該序列具備如下特點(diǎn)能編碼具有生物活性的mpl配體及其片斷，與RNA或DNA互補(bǔ)，或與RNA或DNA雜交并且在溫和和嚴(yán)緊條件下都能保持穩(wěn)定結(jié)合。這種RNA或DNA應(yīng)該至少不被一個(gè)在自然源中通常與其結(jié)合的污染源核酸所污染，并且較佳地基本上不含其他哺乳動(dòng)物RNA或DNA。在這里，“至少不被一個(gè)通常與其結(jié)合的污染源核酸所污染”包含如下情況核酸存在于源中或自然細(xì)胞中但所處染色體位置不同，或者是位于側(cè)翼的、一般地在源細(xì)胞中找不到的核酸序列。分離的mpl配體核酸的一個(gè)例子是一段RNA或DNA，編碼具有生物活性的mpl配體，與人、鼠或豬的mpl配體至少有75％的序列相同，較佳地至少80％，更佳地至少85％，還要佳地為90％，最佳地為95％。
“控制序列”用于涉及表達(dá)時(shí)，表示在一個(gè)特定的宿主有機(jī)體中，是一段可操作地連于編碼序列且對(duì)該編碼序列表達(dá)所必需的DNA序列。適合于原核細(xì)胞的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的某個(gè)操縱子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、可能還有一些至今未知的序列。真核細(xì)胞已知的控制序列有啟動(dòng)子、聚腺苷酸信號(hào)和增強(qiáng)子。
“可操作地連接”涉及核酸時(shí)，意味著該核酸與另一個(gè)核酸序列處于功能上相關(guān)的位置。例如，如果某種DNA表達(dá)的前體蛋白參與了多肽的分泌，那么這個(gè)表達(dá)前序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的DNA就與表達(dá)該多肽的DNA可操作地連接；如果一個(gè)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子對(duì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄有影響，那它與該編碼序列是可操作地連接；或者如果一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于一個(gè)編碼序列上以促進(jìn)翻譯，那么它們之間也是可操作地連接。通常，“可操作地連接”要求被連接的DNA序列之間相鄰近。對(duì)于分泌前導(dǎo)區(qū)，要求相鄰近并處于可讀狀態(tài)。但是，增強(qiáng)子并不一定要求鄰近。連接是通過(guò)合適的限制性位點(diǎn)相聯(lián)而完成。如果這樣的位點(diǎn)并不存在，則根據(jù)常規(guī)技術(shù)使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭來(lái)完成。
“外源的”指某個(gè)元件時(shí)，表示來(lái)自于細(xì)胞外的核苷酸序列，或者與細(xì)胞同源，但是在宿主細(xì)胞核苷酸的某一位置中，通常不能發(fā)現(xiàn)該元件。
“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”在本文中可互換使用，該定義包含了一個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞系的所有子代。因此，類似于“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”的術(shù)語(yǔ)包括了原代母細(xì)胞及其衍生培養(yǎng)物，而不考慮傳代的次數(shù)。應(yīng)該理解，由于誘導(dǎo)或自發(fā)突變，并非所有的子代都有完全相同的DNA序列。那些具有與篩選出的原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同功能和生物活性的突變后代同樣也包括在內(nèi)。當(dāng)試圖指某種特殊表示時(shí)，該詞可根據(jù)上下文內(nèi)容來(lái)理解。
“質(zhì)粒”是一種能自我復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，它具有獨(dú)立的復(fù)制起始點(diǎn)。本文中，用“p”后跟大寫(xiě)字母和/或數(shù)字來(lái)表示。本文中的最初質(zhì)粒來(lái)源是商購(gòu)獲得、在沒(méi)有限制的情況下從公共途徑獲得或根據(jù)已公開(kāi)的程序以上述二種質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建。另外，其他相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒是本領(lǐng)域中已知的，并且對(duì)一般的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
“限制酶消化”對(duì)DNA而言，表示在一種酶的催化作用下，DNA內(nèi)部的磷酸二酯鍵斷裂，而酶的作用只限于DNA序列上的特定位點(diǎn)。這種酶稱為“限制性內(nèi)切核酸酶”。每個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別一段特異的DNA序列，即雙重對(duì)稱的“限制酶切位點(diǎn)”。本文中使用的各種限制酶都可以商購(gòu)，而且可根據(jù)供應(yīng)商提供的反應(yīng)條件、輔助因子和其他條件來(lái)使用。通常，限制酶用下述的縮寫(xiě)形式來(lái)表示第一個(gè)大寫(xiě)字母后跟其他字母表示微生物，從中獲得限制酶，然后是一個(gè)數(shù)字表示特定的酶。限制酶消化的條件通常為，在約20微升緩沖溶液中，1微克質(zhì)?；駾NA片段加入約1-2單位酶。特定的限制酶作用的合適緩沖液和底物的量由制造商指定。常規(guī)的步驟是37℃溫育約1小時(shí)，但應(yīng)根據(jù)供應(yīng)商的建議加以改動(dòng)。溫育后，蛋白質(zhì)和多肽用酚和氯仿抽提來(lái)除去，被消化的核酸則用乙醇沉淀的方法從緩沖液中回收。限制酶消化后，可以用細(xì)菌堿性磷酸酶對(duì)5′末端磷酸進(jìn)行水解作用，以防止一個(gè)DNA片段的兩個(gè)限制酶切末端“環(huán)化”或形成一個(gè)閉合環(huán)而阻止其他DNA片段在限制酶切位點(diǎn)的插入。除非有另外的要求，否則質(zhì)粒消化后不需要進(jìn)行5′末端的去磷酸化。去磷酸化的常規(guī)步驟和試劑可參見(jiàn)Sambrook等人所著《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中1.56-1.61部分[New YorkCold Spring Har-bor Laboratory Press，1989]。
限制酶消化后，DNA片段的“回收”或“分離”是指通過(guò)聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳使消化產(chǎn)物分離，根據(jù)與已知分子量的標(biāo)記DNA片段比較電泳遷移率來(lái)鑒別目的片段，切出含有目的片段的凝膠塊，并將該凝膠塊中的DNA分離出來(lái)。這個(gè)程序已經(jīng)被廣泛地掌握。例如，可參見(jiàn)Lawn等人，Nucleic Acids Res.，96103-6114以及Goeddel等人，Nucleic Acids Res.，84057。
“Southern分析”或“Southern印跡法”是這樣一種方法DNA或含DNA的組合物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)與已知標(biāo)記的寡核苷酸或DNA片段雜交證實(shí)DNA序列的存在。Southern分析的步驟通常依次為瓊脂糖凝膠電泳分離DNA消化產(chǎn)物，電泳分離后使DNA變性，并將得到的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其他合適的膜上，分析與射性標(biāo)記、生物素標(biāo)記或酶標(biāo)記探針的雜交情況。參見(jiàn)Sambrook等人著作(同上)中9.37-9.52部分。
“Northern分析”或“Northern印跡法”則是一種通過(guò)與一個(gè)已知探針如寡核苷酸、DNA片段、cDNA及其片段或RNA片段雜交鑒定RNA序列的方法。探針的標(biāo)記可用放射性同位素(如32P)、生物素或酶。通常，經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，待分析的RNA被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其他合適的膜上與探針雜交。使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域中廣為知道的。參見(jiàn)Sambrook等人著作(同上)中的7.39-7.52部分。
“連接”是二個(gè)核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。二個(gè)片段的連接要求彼此的末端相互匹配。在某些情況下，末端間的匹配可通過(guò)內(nèi)切酶的消化直接實(shí)現(xiàn)。但是，在內(nèi)切酶消化以后，必需將通常產(chǎn)生的交錯(cuò)末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠秸┒耸怪m合于連接。為產(chǎn)生平整末端，須將DNA在15℃于合適緩沖液中，用10單位DNA聚合酶I Klenow片段或T4 DNA聚合酶并在4種脫氧核糖核苷三磷酸存在下至少作用15分鐘。然后，用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀來(lái)純化DNA。將用于連接的DNA片段等摩爾數(shù)地置于溶液中。溶液中還應(yīng)含有三磷酸腺苷(ATP)、連接酶緩沖液和一種連接酶如T4 DNA連接酶，其含量約每0.5微克DNA加入約10單位。當(dāng)DNA與某個(gè)載體連接時(shí)，先要通過(guò)合適限制性內(nèi)切酶的消化使載體線性化。然后，用細(xì)菌磷酸酶或小牛小腸磷酸酶處理線性化片段，以防止在連接過(guò)程中發(fā)生自身連接。
從細(xì)胞中“制備”DNA表示從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。大規(guī)模和小規(guī)模的質(zhì)粒制備是常用的DNA制備方法，參見(jiàn)Sambrook等人著作(同上)中的1.25-1.33部分。制備后的DNA可用本領(lǐng)域中廣為知道的方法來(lái)純化，參見(jiàn)Sambrook等人著作(同上)中的1.40部分。
“寡核苷酸”是用已知化學(xué)方法合成的單鏈或雙鏈多聚脫氧核糖核苷酸短鏈。已知的化學(xué)合成方法有使用固相技術(shù)(參見(jiàn)1988年5月4日發(fā)表的EP266,032)或通過(guò)脫氧核糖核苷H-膦酸酯中間物(參見(jiàn)Froehler等人，Nucl.Acids Res.，145399-5407)的磷酸三酯、亞磷酸鹽或亞磷酰胺化學(xué)方法。其它方法有如下所述的聚合酶鏈反應(yīng)和其他自動(dòng)引物法以及固相支持物上的寡核苷酸合成。所有這些方法的敘述見(jiàn)于Engel等人，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28716-734(1989)。如果已知基因的整個(gè)核酸序列或者得到了編碼鏈的互補(bǔ)核酸序列，就可以使用上述方法。另一種選擇是，如果已知靶氨基酸序列，則可根據(jù)每個(gè)氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的最佳密碼子來(lái)推斷潛在的核酸序列。合成后的寡核苷酸通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行純化。
“聚合酶鏈反應(yīng)”或簡(jiǎn)稱“PCR”是一種將微量特定的核酸(RNA和/或DNA)擴(kuò)增的過(guò)程或技術(shù)。參見(jiàn)1987年7月28日公布的美國(guó)專利號(hào)4,683,195。通常，需要從感興趣區(qū)段的末端或末端外側(cè)獲得序列情況，以設(shè)計(jì)出寡核苷酸引物。引物與待擴(kuò)增的模板的互補(bǔ)鏈序列完全相同或相似，使得兩個(gè)引物的5′末端核苷酸能夠與擴(kuò)增物質(zhì)末端相結(jié)合。PCR能夠用來(lái)擴(kuò)增特定RNA序列、整個(gè)基因組DNA中特定的DNA序列、從總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄得到的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等。參見(jiàn)Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51263(1987)；Erlich等人編輯，PCR Technology，(Stock-ton Press，NY，1989)。在本文中，PCR被認(rèn)為是一種(但不是唯一的一種)擴(kuò)增核酸測(cè)試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)方法，包括使用已知的核酸作為引物和用一種核酸聚合酶來(lái)擴(kuò)增或產(chǎn)生特定的核酸片段。
“嚴(yán)緊條件”指(1)在低離子強(qiáng)度和高溫下進(jìn)行洗滌，如50℃時(shí)0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)，或者(2)在雜交過(guò)程中使用甲酰胺等變性劑，如42℃下50％(v/v)的甲酰胺中含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液及750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉；又如42℃下50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt＇s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50微克/毫升)、0.1％SD和10％硫酸葡聚糖，并在42℃下使用0.2×SSC和0.1％SDS洗滌。
“中等嚴(yán)緊條件”指使用的洗滌溶液和雜交條件比上述嚴(yán)緊條件低，(如溫度、離子強(qiáng)度和SDS百分比濃度)，參見(jiàn)Sambrook等人著作(同上)。中等嚴(yán)緊條件的一個(gè)例子是在含有以下成份的溶液中37℃溫育過(guò)夜，20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升變性的剪切鮭精DNA，隨后用1×SSC在37-50℃下洗滌濾膜。熟練的技術(shù)人員懂得如何根據(jù)探針長(zhǎng)度等類似因素調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等條件。
“抗體”(Abs)和“免疫球蛋白(Igs)”是有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w對(duì)特定的抗原有特異性結(jié)合作用，而免疫球蛋白包括抗體和其他與抗體類似但沒(méi)有抗原特異性的分子。例如，后者的多肽鏈由淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生而由骨髓瘤以增強(qiáng)水平產(chǎn)生。
“天然抗體和免疫球蛋白”通常是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白。它由兩條完全相同的輕鏈(L)和兩條完全相同的重鏈(H)構(gòu)成。每條L鏈都與一條H鏈通過(guò)共價(jià)二硫鍵結(jié)合，而不同免疫球蛋白同種型的兩條重鏈之間的二硫鍵數(shù)目不同。每條輕鏈和重鏈各自都有規(guī)則隔開(kāi)的鏈內(nèi)二硫鍵橋。每條重鏈的一端有一個(gè)可變區(qū)(VH)，后跟若干恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有一個(gè)可變區(qū)(VL)，另一端有一個(gè)恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)并排，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)并排。相信在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間有一個(gè)由特定氨基酸殘基形成的界面。(參見(jiàn)Clothia等人，J.Mol.Bi-ol.，186651-663；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824592-4596)。
術(shù)語(yǔ)“可變的”指各種抗體可變區(qū)的特定部分序列普遍相異，從而被用作使每種特定抗體和它的特定抗原間產(chǎn)生特異性結(jié)合。然而，在抗體的可變區(qū)中，序列的可變性并不是平均分布的?？勺冃约性诿織l輕鏈和重鏈可變區(qū)的三個(gè)稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)或超變區(qū)的區(qū)段?？勺儏^(qū)較高保守性部分則稱作構(gòu)架(FR)。每條天然輕鏈和重鏈有四個(gè)主要為β-折疊構(gòu)型的FR區(qū)，由三個(gè)成環(huán)狀的或在某些情況下形成部分β-折疊結(jié)構(gòu)的CDRs區(qū)連接。每條鏈的CDRs區(qū)通過(guò)FR區(qū)緊密地聚集在一起，并和其他鏈的CDRs構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)Kabat等人所著的Sequneces of Proteins of Immuno-logical Interest，National Institute of Health，Bethesda，MD)。恒定區(qū)并不直接參與抗原和抗體的結(jié)合，但能表現(xiàn)多種效應(yīng)子功能，如在抗體依賴的細(xì)胞毒中抗體的參與。
經(jīng)木瓜蛋白酶消化抗體后，產(chǎn)生兩個(gè)完全相同的抗原結(jié)合片段“Fab”和一個(gè)殘余“Fc”片段。每個(gè)Fab片段帶有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而Fc片段易于結(jié)晶。胃蛋白酶處理抗體則得到一個(gè)“F(ab′)2”片段，帶有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并仍然能交聯(lián)抗原。
“Fv”是帶有完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這是一種由一條輕鏈的可變區(qū)和一條重鏈的可變區(qū)通過(guò)緊密的非共價(jià)結(jié)合而形成的二聚體。它的構(gòu)型中，在VH-VL二聚體的表面，每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)CDRs相互作用形成一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這六個(gè)CDRs共同決定了抗體的抗原結(jié)合特異性。但是，甚至單個(gè)可變區(qū)(或由三個(gè)特異于某抗原的CDRs組成的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然其親和性低于整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還包含了輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab′片段與Fab片段的不同在于，前者在重鏈CH1區(qū)的羧基末端多了幾個(gè)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab′-SH在本文中表示Fab′恒定區(qū)的半胱氨酸上攜帶一個(gè)游離的巰基。F(ab′)2抗體片段最初以一對(duì)中間有半胱氨酸鉸鏈的Fab′形式產(chǎn)生。另外，抗體片段間還有一些化學(xué)偶聯(lián)。
根據(jù)恒定區(qū)的氨基酸序列，可將來(lái)自脊椎動(dòng)物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”明確地分為兩類κ型和λ型。
根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同的類型。主要有五種免疫球蛋白類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有的還可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同類型免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)則分別對(duì)應(yīng)地稱為α、δ、ε、γ和μ。不同免疫球蛋白類型的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型已經(jīng)知道得相當(dāng)清楚。
術(shù)語(yǔ)“抗體”從最廣義上使用時(shí)，其中專門(mén)包括專一的單克隆抗體(包括興奮劑和拮抗劑抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物以及抗體片段(如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它們具備所要求的生物活性。
術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”在本文中指從一個(gè)基本同源的抗體群中得到的某種抗體。即除了極少量的自發(fā)突變外，構(gòu)成群體的每個(gè)抗體都完全相同。單克隆抗體高度特異地直接對(duì)應(yīng)于專一的抗原位點(diǎn)。而且，不同于常規(guī)的(多克隆)抗體制備物，這些制備物一般包括直接針對(duì)多個(gè)抗原決定簇(表位)的多個(gè)抗體，每種單克隆抗體直接針對(duì)抗原上的專一決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)越性還體現(xiàn)在能夠用雜交瘤培養(yǎng)來(lái)合成，而不會(huì)被其他免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆的”說(shuō)明了該抗體的特性是來(lái)自于基本均一的抗體群，而不表示抗體的獲得需要任何特殊的方法。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可運(yùn)用雜交瘤技術(shù)(首先由Kohler&Milstein在Nature，256495中描述)或重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,816,567[Cabilly等人])。
本文中的單克隆抗體還特別地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)。嵌合抗體重鏈或/和輕鏈上的一部分與來(lái)自某一特定物種的或者屬于某一特定抗體類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列完全相同或者同源；而余下的另一部分與來(lái)自另一特定物種或者屬于另一特定抗體類或亞類的抗體的對(duì)應(yīng)序列完全相同或者同源。嵌合抗體的片段也具有這種情況，只要它們能表現(xiàn)出所需的生物活性。(參見(jiàn)Cabilly等人的美國(guó)專利號(hào)4,816,567和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。
非人類(如鼠)抗體的“人源化”形式是一種嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)，其中帶有極少的非人類免疫球蛋白序列。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被其他物種的CDR的殘基(供體抗體)所代替，如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基，它們具有所需的特異性、親和性和容量。有時(shí)，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基也被相應(yīng)的非人類殘基代替。甚至，人源化抗體也會(huì)含有既非來(lái)自受體抗體也非來(lái)自供體CDR或構(gòu)架序列的殘基。這類修飾可以進(jìn)一步完善和優(yōu)化抗體的功能。通常，人源化抗體包括了所有的可變區(qū)(至少一個(gè)，一般兩個(gè))，其中全部的或幾乎全部的CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)，而全部的或幾乎全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化免疫球蛋白最好還帶有至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定區(qū)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)Jones等人，Nature，321522-525；Reichman等人，Nature，332323-329和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。
“人體中的非免疫原性”指將存在于藥學(xué)上可接受的載體中的多肽或?qū)⒃摱嚯囊杂兄委熜?yīng)的劑量與合適的人體組織接觸，經(jīng)過(guò)一段適當(dāng)?shù)臐摲?如8至14天)后，再次施用該多肽，沒(méi)有出現(xiàn)針對(duì)該多肽的過(guò)敏性和抗性狀態(tài)。II.本發(fā)明的優(yōu)選例子本發(fā)明優(yōu)先選用一些被稱為mpl配體或血小板生成素(TPO)的基本同源的多肽。這些多肽與受體細(xì)胞因子超家族的一員，mpl，有結(jié)合特性，并具有促進(jìn)標(biāo)記的核苷酸(3H-胸苷)摻入用人mpl P轉(zhuǎn)染的、IL-3依賴的Ba/F3細(xì)胞DNA中的生物特性。更優(yōu)先選用的mpl配體是被分離的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，其具有造血，尤其是巨核細(xì)胞生成或血小板生成活性；也就是說(shuō)，能夠促進(jìn)未成熟的巨核細(xì)胞或巨核細(xì)胞前體增殖、成熟和/或分化為成熟的血小板生成形式。本發(fā)明最優(yōu)先選用的多肽是有造血、巨核細(xì)胞生成或血小板生成活性的人mpl配體及其片段?？蛇x擇地使這些人mpl配體非糖基化。其他可優(yōu)先選用的人mpl配體有被稱為hML153或hTPO153的hML“EPO”結(jié)構(gòu)域；被稱為hML245或hTPO245的hML截短形式；具有如圖1(SEQ ID NO1)所示氨基酸序列、被稱為hML、hML332或hTPO332的成熟全長(zhǎng)多肽；以及具有生物活性的置換性變異體hML(R153A、R154A)。
本發(fā)明可優(yōu)先選擇的多肽還有具有生物或免疫活性的mpl配體變異體，它們選自hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2。
本發(fā)明可優(yōu)先選擇的多肽還有具有生物活性的mpl配體變異體，其與以下的mpl配體比較，至少有70％的氨基酸序列完全相同人mpl配體(見(jiàn)圖1[SEQ ID NO1])、鼠mpl配體(見(jiàn)圖16[SEQID NOS12和13])、重組豬mpl配體(見(jiàn)圖19[SEQ ID NO18])或從發(fā)育不全的豬血漿分離的mpl配體。同源性達(dá)到至少75％則更好，達(dá)到至少80％還要好，達(dá)到至少85％又更好，達(dá)到至少90％甚至還要好，達(dá)到至少95％則最佳。
從發(fā)育不全的豬血漿分離的mpl配體有以下特點(diǎn)(1)部分純化的該配體用磷酸鹽緩沖液(PBS)從凝膠濾柱中洗脫，其分子量為60,000-70,000，PBS或含0.1％SDS，或含4MMgCl2；(2)該配體的活性可被鏈霉蛋白酶破壞；(3)該配體在低pH值(2.5)、0.1％SDS和2M尿素時(shí)保持穩(wěn)定；(4)基于能與多種凝集素柱結(jié)合，該配體是一種糖蛋白；(5)分子量25,000-35,000的高純度該配體可從非還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠中洗脫。較少量活性物時(shí)，洗脫的分子量約18,000-22,000和60,000；(6)分子量28,000-31,000的高純度配體在還原性SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以雙聯(lián)體形式分離；(7)18,000-22,000、28,000和31,000條帶的氨基末端序列是一樣的SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR(SEQ ID NO29)；(8)下列親和柱可供配體結(jié)合和洗脫
Blue-Sepharose，CM Blue-Sepharose，MONO-Q，MONO-S，小扁豆凝集素-Sepharose，麥胚凝集素(WGA)-Sepharose，伴刀豆球蛋白-Sepharose，乙醚650m Toyopearl，丁基650m Toyopearl，苯基650m Toyopearl，和苯基-Sepharose。
更可優(yōu)先選用的mpl配體多肽由人基因組或具有圖1(SEQ IDNO1)所示氨基酸序列的cDNA編碼。
本發(fā)明優(yōu)先選用的其他具有天然生物活性的mpl配體多肽包括前mpl配體原、mpl配體原，成熟的mpl配體，mpl配體片段及其糖基化變異體。
還有一些本發(fā)明優(yōu)選的多肽，包括mpl配體序列變異體和嵌合體。通常，二者都是具有生物活性的mpl配體變異體，其氨基酸序列至少有70％與人mpl配體或從發(fā)育不全的豬血漿分離的mpl配體相同。同源序列分別達(dá)到至少75％、80％、85％、90％、95％，則優(yōu)選的級(jí)別依次提高。優(yōu)選mpl配體變異體的一個(gè)例子是hML N末端結(jié)構(gòu)域變異體(因其序列與紅細(xì)胞生成素同源而稱為“EPO結(jié)構(gòu)域”)。優(yōu)選的hML EPO結(jié)構(gòu)域包括成熟hML的前153個(gè)氨基酸殘基，也被稱作hML153。一種可供選擇的優(yōu)選hML序列變異體在C末端結(jié)構(gòu)域有一個(gè)或多個(gè)堿性或雙堿性氨基酸殘基被非堿性氨基酸殘基(如疏水的、中性的、酸性的、芳香族的、甘氨酸、脯氨酸等)替代。在一種優(yōu)選的hML C末端結(jié)構(gòu)域序列變異體中，153和154位置的精氨酸被丙氨酸所替代，這種變異體稱作hML332(R153A、R154A)。另一個(gè)優(yōu)選的hML變異體hML332或hML153，其111-114位的殘基(QLPP或LPPQ)缺失或被其他四聯(lián)肽(如AGAG或類似序列)所替代。上述的缺失突變被稱作Δ4hML332或Δ4hML153。
優(yōu)先選用的嵌合體是mpl配體及其片段(定義如下)與異源多肽及其片段融合。例如，hML153可以與IgG片段融合以提高血清半衰期，也可以與IL-3、G-CSF或EPO融合得到一個(gè)增強(qiáng)的血小板生成活性或嵌合造血活性分子。
另一個(gè)可供選擇的優(yōu)選人mpl配體嵌合體是“ML-EPO結(jié)構(gòu)域嵌合體”，它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是，一個(gè)或多個(gè)(但不是全部)N末端153-157位的hML殘基被人EPO殘基(可能的排列如圖10所示[SEQ ID NO7])替代。在本例的約153-166個(gè)殘基長(zhǎng)度的hML嵌合體中，人EPO序列中單個(gè)或組合殘基被加入或者替換hML序列，替換的位置對(duì)應(yīng)于圖10[SEQ ID NO7]所示的排列。典型的插入hML N端部分的組合序列包括在EPO的24-27、38-40和83-85位置上有一個(gè)或多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)；也包括四個(gè)位于EPO的9-22、59-76、90-107和132-152位置的預(yù)測(cè)的雙親媒性α螺旋管中的一個(gè)或多個(gè)；以及其他包括高度保守的區(qū)域，如N末端區(qū)、C末端區(qū)和44-52殘基位置(EPO)(參考見(jiàn)Wen等人，Blood，821507-1516和Boissel等人，J.Biol.Chem.，268(21)15983-15993)。預(yù)期這種“ML-EPO結(jié)構(gòu)域嵌合體”聯(lián)合有血小板生成一紅細(xì)胞生成(TEPO)的生物活性。
其他本發(fā)明的優(yōu)選多肽包括mpl配體片段，含有一個(gè)至少10、15、20、25、30或40個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的連續(xù)序列，該序列與在本文中所描述的分離自發(fā)育不全的豬血漿mpl配體或人mpl配體的序列完全相同(見(jiàn)表14，實(shí)施例24)。一種優(yōu)選的mpl配體片段是人ML[1-X]，其中X代表153、164、205、207、217、229或245(見(jiàn)圖1[SEQ ID NO1]中1-X殘基序列部分)。其他優(yōu)選的mpl配體片段包括那些純化的mpl配體的化學(xué)或酶解或者消化后的產(chǎn)物。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選方面是純化mpl配體分子的方法。該方法的原理為根據(jù)待純化的mpl配體分子能夠選擇性地吸咐于固定化的受體多肽，使含mpl配體分子的mpl配體源接觸mpl或mpl融合多肽等固定化的受體多肽；洗滌固定化支持物以除去非吸咐物質(zhì)；然后用洗脫緩中液將固定化的受體多肽上的分子洗脫下來(lái)達(dá)到純化。mpl配體源也許是血漿，而優(yōu)選的固定化受體為mpl-IgG融合體。
重組細(xì)胞培養(yǎng)物作為mpl配體源，其培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物中的mpl配體含量通常要高于血漿或其他天然來(lái)源。在這種情況下，使用上述的mpl-IgG免疫親和方法依然可行，但并非必須，可用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法。簡(jiǎn)而言之，產(chǎn)生基本同源mpl配體的優(yōu)選純化方法包括用離心或超濾方法除去宿主細(xì)胞或裂解片段等微小碎片；可選擇地使用商購(gòu)的蛋白質(zhì)濃縮濾膜來(lái)濃縮蛋白質(zhì)；然后，通過(guò)下列一個(gè)或多個(gè)步驟將mpl配體從其他雜質(zhì)中分離出來(lái)免疫親和、離子交換(如DEAE或含羧甲基或磺酸正丙基基團(tuán)的基質(zhì))、Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-Sepharose，麥胚凝集素-Sepharose、伴刀豆球蛋白-Sepharose、乙醚Toypearl、丁基Toypearl、苯基Toypearl、蛋白A-Sepharose，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、反相HPLC(如帶脂肪族基團(tuán)的硅膠)或葡聚糖凝膠分子篩大小排阻色譜，以及乙醇或硫酸氨沉淀。上述步驟的任意一個(gè)中都可加入氟化甲磺酸等蛋白酶抑制劑，以抑制蛋白水解作用。
在另一個(gè)優(yōu)選例子中，提供了一種能與mpl配體結(jié)合的分離抗體。優(yōu)先選用的mpl配體分離抗體是單克隆的(Kohler和Milstein，Nature，256495-497；Campbell，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology，Burdon等人編輯，13卷，Elisevier Science Publisrers，Amsterdam；和Huse等人，Science，2461275-1281)。優(yōu)選的mpl配體分離抗體與mpl配體的親和性至少應(yīng)為106升/摩爾?？贵w結(jié)合的親和性達(dá)到107升/摩爾時(shí)，更應(yīng)優(yōu)先選用。最為優(yōu)先的情況是，抗體針對(duì)具上述效應(yīng)子功能的mpl配體而產(chǎn)生。能與mpl配體結(jié)合的分離抗體可有選擇地與另一條多肽融合，該抗體或其融合體可用作固定化的mpl多肽，將mpl配體從上述的來(lái)源中分離純化到。在本例進(jìn)一步的優(yōu)先考慮中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)體外或體內(nèi)mpl配體的方法用可疑含配體的樣品如血清樣品接觸抗體，檢測(cè)是否發(fā)生結(jié)合。
在進(jìn)一步的優(yōu)選例子中，本發(fā)明提供了一種編碼mpl配體及其片段的分離的核酸分子，該核酸分子可用一個(gè)可檢測(cè)成分作標(biāo)記或去標(biāo)記。本發(fā)明還提供了一種核酸分子，其序列與含編碼mpl配體的核酸分子序列互補(bǔ)或在嚴(yán)緊或中度嚴(yán)緊條件下能與之雜交。優(yōu)選的mpl配體核酸是編碼具有生物活性的mpl配體的RNA或DNA，其編碼產(chǎn)物與人mpl配體至少有75％的序列完全相同，相同序列分別達(dá)到至少80％、85％、90％、95％，則選用的優(yōu)先程度依次提高。更優(yōu)選的分離核酸分子是編碼具有生物活性的mpl配體的DNA序列，其來(lái)源有(a)哺乳動(dòng)物mpl配體基因的編碼區(qū)DNA(如含有圖1[SEQ ID NO2]所示核苷酸序列的DNA分子及其片段)；(b)至少能在中度嚴(yán)緊條件下與(a)所述DNA雜交的DNA；以及(c)因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所得到的(a)或(b)所述DNA的簡(jiǎn)并DNA。我們期望本文中所述新的mpl配體是配體家族或細(xì)胞因子家族的一員，具有適當(dāng)?shù)男蛄幸恢滦?，以至在低于中度?yán)緊條件下，它們的DNA(或其互補(bǔ)鏈或片段)能與圖1(SEQ ID NO2)所示的DNA雜交。因此，本發(fā)明更進(jìn)一步的方面包括了在低于中度嚴(yán)緊條件下，與編碼mpl配體多肽的DNA雜交的DNA。
在本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選例子中，核酸分子是編碼mpl配體的cDNA，包含在一個(gè)可復(fù)制的載體上，其中cDNA可操作地結(jié)合于用該載體轉(zhuǎn)化的宿主能識(shí)別的控制序列。這方面又進(jìn)一步包括了用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和用cDNA產(chǎn)生有效應(yīng)的mpl配體的一種方法，該方法包括編碼mpl配體的cDNA在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)及從中回收。用該方法獲得的mpl配體為優(yōu)選地基本同源的人mpl配體。產(chǎn)生mpl配體的優(yōu)選宿主細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
本發(fā)明還進(jìn)一步包括了一個(gè)治療免疫性疾病或造血性疾病尤其是血小板生成減少的哺乳動(dòng)物的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施以有效治療量的mpl配體。可選擇地，mpl配體可以以與細(xì)胞因子、尤其是集落刺激因子或白細(xì)胞介素結(jié)合的形式給藥。優(yōu)選的集落刺激因子或白細(xì)胞介素包括成套配體、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、IL-1、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9或IL-11。III.制備方法一些作者長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為血小板的產(chǎn)生是由多譜系的特定體液因子控制。假設(shè)認(rèn)為，兩種被稱為巨核細(xì)胞集落刺激因子(meg-CSF)和血小板生成素的不同的活性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)了巨核細(xì)胞生成和血小板生成作用(參見(jiàn)Williams等人，J.Cell Physiol.，110101-104；Williams等人，Blood Cell，15123-133；和Gor-den等人，Blood，80302-307)。根據(jù)這個(gè)假設(shè)，meg-CSF促進(jìn)前體巨核細(xì)胞的增殖，而血小板生成素主要影響更多分化細(xì)胞的成熟和最終的血小板釋放。自60年代以來(lái)，大量文獻(xiàn)記載了出現(xiàn)血小板減少現(xiàn)象后，動(dòng)物和人類的血漿、血清和尿中會(huì)誘發(fā)并形成meg-CSF和血小板生成素活性物(如Odell等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，108428-431；Nakeff等人，Acta Haematol.，54340-344；Specter，Proc.Soc.Exp.Biol.，108146-149；Schreiner等人，J.Clin.Invest.，491709-1713；Ebbe，Blood 44605-608；Hoffman等人，N.En-gl.J.Med.，305533；Straneva等人，Exp.Hematol.，171122-1127；Mazur等人，Exp.Hematol.，131164；Mazur等人，J.Clin.Invest.，68733-741；Sheiner等人，Blood 56183-188；Hill等人，Exp.Hema-tol.，20354-360；以及Hegyi等人，Int.J.Cell Cloning，8236-244)。根據(jù)報(bào)道，這兩種活性因子所屬的譜系不同于已知的細(xì)胞因子(參見(jiàn)Hil R.J等人，Blood 80346；Er-ickson-Miller C.L.等人，Brit.J.Haematol.，84197-203；Straneva J.E.等人，Exp.Hematol.，204750；以及Tsukada J.等人，Blood 81866-867)。迄今，從血小板減少的血漿或尿中提純meg-CSF和血小板生成素的工作還未獲成功。
與上述從血小板減少血漿中觀察到的現(xiàn)象一致，我們發(fā)現(xiàn)，從照射處理過(guò)的豬得到的發(fā)育不全豬血漿(APP)能夠在體外刺激人巨核細(xì)胞生成。我們發(fā)現(xiàn)，這一刺激活性可被c-mpl的可溶性胞外區(qū)所終止，從而證實(shí)APP是一般所認(rèn)為的mpl配體(ML)的一個(gè)潛在來(lái)源。我們已經(jīng)成功地從APP中純化出了mpl配體，并且氨基酸序列信息已經(jīng)被用于分離鼠，豬和人MLcDNA。這些ML有同源于紅細(xì)胞生成素的序列，并同時(shí)具有meg-CSF和血小板生成素樣活性。
1.從血漿中鑒定和純化mpl配體如上述，有報(bào)道顯示來(lái)自不同物種的發(fā)育不全血漿有促進(jìn)體外血細(xì)胞生成的活性；但是，以前的報(bào)道中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)從血漿中分離造血刺激因子的例子。發(fā)育不全血漿的一個(gè)來(lái)源是經(jīng)照射性處理的豬。這種發(fā)育不全的豬血漿(APP)可以體外刺激人血細(xì)胞生成。判斷APP中是否含有mpl配體，可通過(guò)測(cè)定3H-胸苷摻入用人mpl P轉(zhuǎn)染(步驟見(jiàn)圖2)的Ba/F3細(xì)胞來(lái)分析其效應(yīng)。APP可促進(jìn)3H-胸苷摻入Ba/F3-mpl細(xì)胞，而不是Ba/F3對(duì)照細(xì)胞(即未用人mpl P轉(zhuǎn)染)。另外，在正常的豬血漿中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的活性。上述結(jié)果說(shuō)明，APP含有一個(gè)或多個(gè)因子，能通過(guò)mpl受體轉(zhuǎn)導(dǎo)一個(gè)增殖信號(hào)，也許就是該受體的天然配體。用可溶性mpl-IgG處理可阻斷APP對(duì)Ba/F3-mpl細(xì)胞促進(jìn)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步地支持了該觀點(diǎn)。
APP中活性物是一種蛋白質(zhì)，因?yàn)殒溍沟鞍酌?、DTT或加熱都可以破壞APP活性(圖3)。這種活性物也是不能透析的。但是，這種活性物在低pH值(pH2.5，2小時(shí))時(shí)保持穩(wěn)定，并在一些凝集素親和柱上吸附和洗脫，顯示出是一種糖蛋白。為進(jìn)一步明確這種活性物結(jié)構(gòu)及其特性，可以利用mpl-IgG嵌合體從APP中進(jìn)行親和純化。
APP的處理方法可依據(jù)實(shí)施例1和實(shí)施例2中的方案。簡(jiǎn)而言之，mpl配體可使用疏水作用性色譜(HIC)、固定化染料色譜和mpl-親和色譜來(lái)純化。回收該活性物的每一個(gè)步驟見(jiàn)圖4，各步的純化倍數(shù)見(jiàn)表1。通過(guò)mpl-親和柱，該活性物總的回收率約10％。mpl-親和柱洗脫的活性物峰值組分(F6)有約9.8×106單位/毫克的活性。5升APP純化約4×106(從0.8單位/毫克到3.3×106單位/毫克)，蛋白質(zhì)含量則稀釋了83×106倍(從250克到3微克)。估計(jì)從mpl-親和柱上洗脫的配體特異性活性約為3×106單位/毫克。
表1mpl配體的純化
通過(guò)Bradford測(cè)定確定蛋白質(zhì)。mpl洗脫物組分5-7的蛋白質(zhì)濃度的估計(jì)是根據(jù)銀染SDS凝膠中染色的強(qiáng)度。一個(gè)單位定義為引起B(yǎng)a/F3-mpl細(xì)胞增殖的最大促進(jìn)的50％。
在還原條件下通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(4-20％，Novex凝膠)分析mpl-親和柱中洗脫的組分，可發(fā)現(xiàn)存在幾種蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖5)。用高強(qiáng)度銀染顯示的蛋白質(zhì)分子量約66,000、55,000、30,000、28,000和18,000-22,000。為證明哪些蛋白質(zhì)促進(jìn)了Ba/F3-mpl細(xì)胞培養(yǎng)物的增殖，可如實(shí)施例2所述將它們從凝膠中洗脫。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，絕大多數(shù)從含蛋白質(zhì)的凝膠薄片中洗脫下來(lái)的活性物分子量為28,000-32,000，而分子量18,000-22,000(圖6)的活性物較少。這些區(qū)域中只可見(jiàn)的蛋白質(zhì)分子量為30,000、28,000和18,000-22,000。為了鑒定和得到這一凝膠區(qū)域中分離的蛋白質(zhì)(即30、28和18-22千道爾頓的條帶)的序列，這些蛋白質(zhì)被電印跡于PVDF上，并以如實(shí)施例3所述方法測(cè)序。獲得的氨基末端序列如表2所示。
表2mpl配體氨基末端序列
計(jì)算機(jī)輔助分析顯示，這些氨基酸序列是新發(fā)現(xiàn)的。由于所有這三種序列都是相同的，可認(rèn)為這30千道爾頓，28千道爾頓和18千道爾頓的蛋白質(zhì)是相關(guān)的，也許就是同一種新蛋白質(zhì)的不同形式。而且，這種蛋白質(zhì)可能就是一種自然存在的mpl配體。因?yàn)?，該活性物可以?-20％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的同一個(gè)區(qū)域內(nèi)(28,000-32,000)分離。另外，當(dāng)用Superose 12(Pharmacia公司)柱作凝膠過(guò)濾色譜時(shí)，部分純化的配體與17,000-30,000分子量的物質(zhì)一起遷移。相信，配體的不同分子量形式只是蛋白水解化或糖基化差異的結(jié)果，或者是其他翻譯前后的修飾所造成的結(jié)果。
如前所述，反義人mplRNA能阻止富集CD34+母細(xì)胞的人骨髓培養(yǎng)物中的巨核細(xì)胞生成，但不影響其他造血細(xì)胞譜系的分化(Methia等人(同上))。這一結(jié)果表示，mpl受體也許在巨核細(xì)胞的體外增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步闡明mpl配體在巨核細(xì)胞生成中的作用，可以比較APP和除去mpl配體的APP在體外人巨核細(xì)胞生成過(guò)程中的效應(yīng)。APP對(duì)于人巨核細(xì)胞生成的效應(yīng)通過(guò)液體懸浮巨核細(xì)胞生成分析的一個(gè)改進(jìn)方法來(lái)測(cè)定，方法的描述見(jiàn)實(shí)施例4。該分析中，在mpl-IgG親和色譜的前后用APP處理人外周干細(xì)胞(PSC)。GPIIbIIIa對(duì)巨核細(xì)胞生成的促進(jìn)作用由抗體125I-anti-IIbIIIa來(lái)定量(見(jiàn)圖7)。如圖7所示，10％的APP能引起約3倍的促進(jìn)作用，但除去mpl配體的APP沒(méi)有效應(yīng)。顯然，除去mpl配體的APP不能誘導(dǎo)Ba/F3-mpl細(xì)胞的增殖。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分別在第0，2，4天將可溶性人mpl-IgG加入含10％APP的培養(yǎng)物中，可以中和APP對(duì)人巨核細(xì)胞生成的促進(jìn)作用(見(jiàn)圖8)。這些結(jié)果顯示，mpl配體在人巨核細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，因此也可能對(duì)血小板減少癥的治療有用。
2.mpl配體的分子克隆根據(jù)從30千道爾頓，28千道爾頓和18-22千道爾頓蛋白質(zhì)得到的氨基末端氨基酸序列(見(jiàn)上述表2)，已經(jīng)設(shè)計(jì)并使用了兩個(gè)簡(jiǎn)并寡核苷酸引物集合體用于通過(guò)PCR擴(kuò)增豬基因組DNA?？梢院芎侠淼卣J(rèn)為，如果氨基末端氨基酸序列由單一外顯子編碼，那么正確的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度應(yīng)該為69bp。發(fā)現(xiàn)了一個(gè)該長(zhǎng)度的DNA片段并亞克隆到pGEMT。PCR寡核苷酸引物以及得到的三個(gè)克隆序列見(jiàn)于實(shí)施例5。由PCR引物之間部分編碼的肽的氨基酸序列(PRLLNKLLR[SEQ ID NO33])完全等同于對(duì)豬配體氨基末端蛋白質(zhì)測(cè)序后得到的序列(見(jiàn)上文所示28和30千道爾頓豬蛋白質(zhì)序列的9-17殘基)。
一種根據(jù)PCR片段序列合成的寡核苷酸被用于篩選人基因組DNA文庫(kù)。一個(gè)稱為pR45的45聚體的寡核苷酸已經(jīng)根據(jù)PCR片段的序列設(shè)計(jì)并合成出來(lái)。該寡核苷酸有以下序列5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3′(SEQ ID NO34)
參照實(shí)施例6，該脫氧寡核苷酸在低嚴(yán)緊雜交和洗滌條件下被用于篩選構(gòu)建于λgeml2噬菌體中的人基因組DNA文庫(kù)。挑出陽(yáng)性克隆，純化噬菌斑，用限制性圖譜和southern印跡法來(lái)分析。一個(gè)與45聚體雜交的390bp EcoRl-XBal片段被亞克隆于pBluescriptSK-。這一克隆的DNA測(cè)序表明，編碼豬mpl配體的人同系物的DNA已經(jīng)被分離出來(lái)。人DNA序列和依此推斷的氨基酸序列如圖9(SEQ ID NO3和4)?；蚪M序列中內(nèi)含子的預(yù)測(cè)位置由箭頭表示，并標(biāo)出一個(gè)推斷的外顯子(“外顯子3”)。
根據(jù)人“外顯子3”序列合成了對(duì)應(yīng)于外顯子3′端和5′端序列的寡核苷酸。從不同人組織中制備模板DNA，用這兩個(gè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。所期望的正確PCR產(chǎn)物的大小為140bp。在12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳中分析PCR產(chǎn)物后，可以在用成人腎、293胎兒腎細(xì)胞構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中和人胎兒肝制備的cDNA中檢測(cè)到期望大小的DNA片段。
接著，用同樣的45聚體寡核苷酸篩選構(gòu)建于λDR2噬菌體中的胎兒肝cDNA文庫(kù)(7×106個(gè)克隆)，該45聚體寡核苷酸用于在低嚴(yán)緊雜并條件下篩選人基因組文庫(kù)和胎兒肝cDNA文庫(kù)。挑選陽(yáng)性克隆，純化噬菌斑，并用PCR測(cè)定插入片段的大小。選擇含1.8kb插入片段的克隆以供進(jìn)一步分析。運(yùn)用實(shí)施例7所述程序，得到人mpl配體(hML)的核苷酸序列及依此推斷的氨基酸序列。這些序列見(jiàn)于圖1(SEQ ID NOS1和2)。
3.人mpl配體(hML)的結(jié)構(gòu)人mpl配體(hML)cDNA序列(圖1[SEQ ID NO2])由1774個(gè)核苷酸構(gòu)成，并有一個(gè)聚腺苷酸尾。它包括215個(gè)核苷酸的5′端非翻譯序列和498個(gè)核苷酸的3′端非翻譯區(qū)。在核苷酸位置216-218處的假定起始密碼子位于真核翻譯起始要求的共有序列內(nèi)。開(kāi)放讀框起始于核苷酸位置220，共有1059個(gè)核苷酸，并編碼長(zhǎng)度為353個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。該預(yù)測(cè)氨基酸序列的氨基末端高度疏水，可能對(duì)應(yīng)于某種信號(hào)肽。對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析(vonHeijne等人，Eur.J.Biochem，.13317-21)顯示在殘基21和22之間，有一個(gè)信號(hào)肽酶的潛在切割位點(diǎn)。在這個(gè)位置上的切割會(huì)產(chǎn)生一個(gè)332個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度的成熟多肽，其起點(diǎn)是純化自豬血漿的mpl配體的氨基末端序列。預(yù)測(cè)該332個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度配體的未經(jīng)糖基化分子量約38千道爾頓。共有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)和4個(gè)半胱氨酸殘基。
將mpl配體序列和Genbank序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較發(fā)現(xiàn)成熟的人mpl配體和人紅細(xì)胞生成素(hEPO)氨基末端的153個(gè)殘基之間有23％完全相同(圖10[SEQ ID NOS6和7])。如果考慮保守性置換，hML和hEPO在這一區(qū)域相似性達(dá)到50％。hML和hEPO都有4個(gè)半胱氨酸。其中，包括第一個(gè)和最后一個(gè)在內(nèi)的4個(gè)半胱氨酸中的3個(gè)在hML中是保守的。定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅細(xì)胞生成素的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸根據(jù)其功能的需要形成一個(gè)二硫鍵(Wang，F(xiàn).F.等人，Endocrinology 1162286-2292)。類似地，hML的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸可能也形成了一個(gè)重要的二硫鍵。在hML中沒(méi)有保守的糖基化位點(diǎn)。hML多肽所有潛在的N-糖基化位點(diǎn)都位于近羧基末端的一半處。
與hEPO類似，hML mRNA既沒(méi)有共有聚腺苷酸序列AAUAAA，也沒(méi)有調(diào)節(jié)元件AUUUA，AUUUA出現(xiàn)在許多細(xì)胞因子的3′端非翻譯區(qū)，并被認(rèn)為影響mRNA的穩(wěn)定性(Shawet等人，Cell，46659-667)。Northern印跡法分析顯示了在胎兒和成人肝中，單一的1.8kb hML RNA轉(zhuǎn)錄物水平低。在較長(zhǎng)時(shí)間曝光之后，可以在成人的腎中檢測(cè)到相同大小的較弱條帶。經(jīng)比較，人的紅細(xì)胞生成素在胎兒肝中表達(dá)，并且當(dāng)?shù)脱醭霈F(xiàn)時(shí)，在成人的腎和肝中表達(dá)(Jacobs等人，Nature，313804-809和Bondurant等人，Molec.Cell.Biol.，62731-2733)。
hML羧基末端區(qū)的重要性還有待進(jìn)一步闡述。根據(jù)6個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)的存在和該配體能與凝集素親和柱結(jié)合的特點(diǎn)，hML的該區(qū)域可能被糖基化。在一些凝膠洗脫實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到活性物分辨的分子量約60,000，也許代表了全長(zhǎng)的糖基化分子。因此，羧基末端區(qū)也許起了穩(wěn)定和提高循環(huán)的hML半衰期的作用。就紅細(xì)胞生成素而言，其未經(jīng)糖基化的形式在體外具有完整的生物活性，但與糖基化紅細(xì)胞生成素相比，血漿的半衰期明顯縮短(Takeuchi等人，J.Biol.Chem.，26512127-12130；Narhi等人，J.Biol.Chem.，26623022-23026和Spivack等人，Blood，790-99)。hML的羧基末端結(jié)構(gòu)域有兩個(gè)雙堿性的氨基酸序列[在153-154和245-246位置的Arg-Arg基序]，可作為潛在的加工位點(diǎn)。在這些位點(diǎn)的切割可能就是分離自APP的ML的30、28、18-22千道爾頓形式的來(lái)源。很重要地，Arg153-Arg154序列的出現(xiàn)是緊接著ML的紅細(xì)胞生成素樣結(jié)構(gòu)域。這些現(xiàn)象說(shuō)明，也許全長(zhǎng)的ML是一種前體蛋白，經(jīng)過(guò)有限蛋白酶解產(chǎn)生成熟的配體。
4.人mpl配體的同種型和變異體人mpl配體的同種型或剪接形式可通過(guò)成人肝的PCR檢測(cè)到。簡(jiǎn)而言之，合成對(duì)應(yīng)于hML編碼序列的兩端及選擇的內(nèi)部區(qū)域的引物。如實(shí)施例10所述，這些引物被用于通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增成人肝RNA。除了稱為hML的全長(zhǎng)形式外，還觀察到或推斷出其他三種形式，稱為hML2、hML3和hML4。推斷出的所有這四種同種型的成熟氨基酸序列如圖11(SEQ ID NOS6、8、9和10)所示。hML3在位置700處有116個(gè)核苷酸缺失，導(dǎo)致了氨基酸的缺失和移碼。cDNA編碼一條265個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的成熟多肽，從hML序列的第139個(gè)氨基酸殘基起趨異。最后，hML4既有在位點(diǎn)618后12個(gè)核苷酸缺失(也在鼠和豬序列中發(fā)現(xiàn)[見(jiàn)下文])，也有見(jiàn)于hML3的116bp的缺失。雖然在人中還沒(méi)有分離到只有12bp(緊接核苷酸位點(diǎn)619)缺失的克隆，但這種被稱為hML2同種型可能存在，因?yàn)樵谑蠛拓i中都鑒定出了這樣的的同種型(見(jiàn)下文)，也因?yàn)橐呀?jīng)發(fā)現(xiàn)其與缺失116個(gè)核苷酸的hML4相連同。
雙堿性的Argl53-Arg154被兩個(gè)丙氨酸殘基替代的hML置換變異體和hML的一個(gè)“EPO結(jié)構(gòu)域”截短形式被構(gòu)建以判斷全長(zhǎng)的ML是否為具有生物活性所必須。稱作hML(R153A、R154A)的Arg153-Arg154雙堿性序列置換變異體用實(shí)施例10所述的PCR方法來(lái)構(gòu)建?！癊PO結(jié)構(gòu)域”截短形式hML153，通過(guò)在Arg153后引入一個(gè)終止密碼子，也是用PCR來(lái)構(gòu)建。
5.在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人胚胎腎(293)細(xì)胞中重組人mpl配體(rhML)的表達(dá)為了證實(shí)克隆的人cDNA編碼mpl配體，在巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子的控制下，使用表達(dá)載體pRK5-hML或pRK5-hML153，在哺乳動(dòng)物293細(xì)胞中表達(dá)配體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人胚胎腎293細(xì)胞得到的上清液能促進(jìn)3H-胸苷摻入Ba/F3-mpl細(xì)胞，但不是親代Ba/F3細(xì)胞(圖12A)。只用pRK載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的培養(yǎng)基則沒(méi)有這種活性。在培養(yǎng)基中加入mpl-IgG能夠消除這種促進(jìn)作用(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。這些結(jié)果顯示，克隆的cDNA編碼一種功能性的人ML(hML)。
將hML的截短形式hML153在293細(xì)胞中表達(dá)，可以判斷單獨(dú)“EPO結(jié)構(gòu)域”是否可以結(jié)合并激活mpl。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液與表達(dá)全長(zhǎng)hML(圖12A)的細(xì)胞的上清液有相似的活性，表示ML的羧基末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赾-mpl的結(jié)合和激活并不是必須的。
6.mpl配體促進(jìn)巨核細(xì)胞生成和血小板生成重組hML的兩種形式，全長(zhǎng)的rhML和截短的rhML153都能在體外促進(jìn)人巨核細(xì)胞生成(圖12B)。在不加入其他外源造血生長(zhǎng)因子時(shí)，可以觀察到這種效應(yīng)。除了IL-3以外，ML是唯一在檢測(cè)中顯示這種活性的造血生長(zhǎng)因子。在我們的分析中，IL-11、IL-6、IL-1、紅細(xì)胞生成素、G-CSF、IL-9、LIF、成套配體(KL)、M-CSF、OSM和GM-CSF在單獨(dú)檢測(cè)時(shí)對(duì)巨核細(xì)胞生成都沒(méi)有效應(yīng)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。這個(gè)結(jié)果顯示了ML具有巨核細(xì)胞促進(jìn)活性，也指出了ML在巨核細(xì)胞生成調(diào)節(jié)中的作用。
在鼠血小板增多回跳分析中，患血小板減少癥動(dòng)物的血漿中的血小板生成活性物顯示出促進(jìn)血小板生成(McDonald，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，141006-1001和Mcdonald等人，Scand.J.Haematol.，16326-334)。在這個(gè)模型中，使用特異的抗血小板血清引發(fā)鼠急性血小板缺少，來(lái)導(dǎo)致預(yù)測(cè)中的血小板增多回跳。這種免疫血小板增多型鼠對(duì)于外源的血小板生成素樣活性物比普通的鼠更為敏感(McDonald，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，141006-1001)，就如同去除低氧的鼠對(duì)紅細(xì)胞生成素的敏感性比普通的鼠強(qiáng)(McDonald等人，J.Lab.Clin.Med.，77134-143)。為了判斷rML是否在體內(nèi)刺激血小板生成，將部分純化的rhML注射入血小板增多回跳的鼠中。然后，計(jì)量血小板數(shù)以及摻入到血小板中的35S。將64,000或32,000單位的rML注射到鼠體內(nèi)可顯著增加血小板生成，與只注射入賦行劑的對(duì)照鼠相比，血小板數(shù)增加約20％(對(duì)應(yīng)的p＝O.0005和0.0001)，摻入血小板的35S增加約40％(p＝0.003)(圖12C)。這個(gè)刺激水平與我們?cè)诖四Ｐ椭惺褂肐L-6觀察到的情況相匹比(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。只以16,000單位的rML進(jìn)行處理不能顯著地刺激血小板的生成。這些結(jié)果表明，ML以劑量依賴的方式刺激血小板的生成，因此具備了血小板生成素樣活性。
用上述hML同種型構(gòu)建物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并用Ba/F3-mpl增殖來(lái)測(cè)定分析上清液(見(jiàn)圖13)。在分析中，hML2，hML3沒(méi)有顯示可測(cè)定的活性，但hML(R153A，R154A)的活性類似于hML和hMLl53，這一結(jié)果表明，在Arg153-Arg154雙堿性位點(diǎn)的加工對(duì)于其活性既不是必須的，也不是不利的。
7.巨核細(xì)胞生成和mpl配體已經(jīng)有假說(shuō)認(rèn)為，巨核細(xì)胞生成受多重細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)(Williams等人，J.Cell Physiol.，110101-104和William等人，Blood Cell，15123-133)。這一假說(shuō)的主要依據(jù)是，某些造血生長(zhǎng)因子刺激巨核細(xì)胞前體的增殖，而另一些主要影響其成熟。本文中的結(jié)果提示ML同時(shí)以增殖和成熟因子發(fā)揮作用。有一系列證據(jù)支持ML對(duì)巨核細(xì)胞前體增殖的刺激作用。首先，APP能在體外刺激人巨核細(xì)胞前體的增殖和成熟，而其刺激作用可以被mpl-IgG完全抑制(圖7和圖8)。此外，c-mpl反義寡核苷酸對(duì)巨核細(xì)胞集落形成的抑制(Methia等人，Blood，821395-1401)以及c-mpl可將細(xì)胞內(nèi)的增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入其被轉(zhuǎn)染對(duì)象中的發(fā)現(xiàn)(Skoda等人，EMBO，122645-2653和Vigon等人，Oncogene，82607-2615)也都表明了ML刺激增殖。在巨核細(xì)胞分化的所有時(shí)期中，c-mpl顯著的表達(dá)(Methia等人，Blood，821395-1401)以及重組ML在體內(nèi)迅速刺激血小板生成的能力都表明了ML也影響成熟。由于可獲得重組ML，就可以對(duì)其在巨核細(xì)胞生成和血小板生成調(diào)節(jié)中的作用進(jìn)行仔細(xì)的評(píng)估，以及它對(duì)其他造血細(xì)胞譜系的潛在影響。
8.人mpl配體(TPO)基因的分離在低嚴(yán)緊或高嚴(yán)緊條件下，使用一個(gè)與編碼mpl配體的人cD-NA 3′端一半序列對(duì)應(yīng)的片段，篩選含有pR45的構(gòu)建于λ-Gem12噬菌體中的人基因組文庫(kù)，分離到含TPO基因的人基因組DNA克隆。兩個(gè)跨越35kb的重疊λ克隆被分離出來(lái)。對(duì)含有完整TPO基因的兩個(gè)重疊片段(BamH1和EcoRI)進(jìn)行亞克隆和測(cè)序。
人基因的結(jié)構(gòu)為7kb基因組DNA中含有6個(gè)外顯子。所有外顯子和內(nèi)含子連接邊界都與哺乳動(dòng)物基因的共有基序一致(Shapiro，M.B.等人，Nucl.Acids Res.157155)。外顯子1和外顯子2含有5′端非翻譯序列和信號(hào)肽的4個(gè)起始氨基酸。分泌信號(hào)的殘基和成熟蛋白質(zhì)的前26個(gè)氨基酸由外顯子3編碼。整個(gè)羧基結(jié)構(gòu)域和3′非翻譯區(qū)以及紅細(xì)胞生成素樣結(jié)構(gòu)域的約50個(gè)氨基酸由外顯子6編碼。涉及在hML-2(hTPO-2)中觀察到的缺失的4個(gè)氨基酸由外顯子6的5′末端編碼。
Southern印跡法分析人基因組DNA顯示，TPO基因以單拷貝形式存在。該基因在染色體上的位置由熒光原位雜交(FISH)定位于染色體3q27-28。
9. 293細(xì)胞TPO的表達(dá)與純化實(shí)施例19中詳細(xì)敘述了如何從293細(xì)胞制備和純化ML或TPO。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是用pRK5-hmpl I通過(guò)PCR來(lái)獲得對(duì)應(yīng)于TPO整個(gè)開(kāi)放讀框的cDNA。PCR產(chǎn)物純化后克隆入質(zhì)粒pRK5tkneo(一種衍生自pRK5的載體，經(jīng)過(guò)改造以在胸苷激酶啟動(dòng)子控制下表達(dá)新霉素抗性基因)的限制性位點(diǎn)Clal和Xbal之間，以得到載體pRK5tkneo.ORF(一種編碼整個(gè)開(kāi)放讀框的載體)。
第二種編碼EPO同源結(jié)構(gòu)域的載體可用相同的方法制成，但使用不同的PCR引物，最后得到的構(gòu)建物為pRK5-tkneoEPO-D。
這兩種構(gòu)建物通過(guò)CaPO4法轉(zhuǎn)染入人胚胎腎細(xì)胞，挑選出新霉素抗性的克隆并使之生長(zhǎng)到匯合。在條件培養(yǎng)基中通過(guò)Ba/F3-mpl增殖分析來(lái)評(píng)估這些克隆中ML153或ML332的表達(dá)。
rhML332的純化如實(shí)施例19所述。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將293-rhML332的條件培養(yǎng)基上樣于Blue-Sepharose(Pharmacia公司)柱，接著用含2M尿素的緩沖液洗滌。柱的洗脫用含2M尿素和1MNaCl的緩沖液。Blue-Sepharose柱洗脫后的集合體再直接上樣于WGA-Sepharose柱，用含2M尿素和1MNaCl的10倍柱體積緩沖液洗滌，洗脫用同樣的緩沖液，但含0.5M的N-乙酰-D-葡糖胺。WGA-Sepharose的洗脫物再上樣于C4-HPLC柱(Synchrom，Inc.)，并以不連續(xù)的丙醇梯度來(lái)洗脫。通過(guò)SDS-PAGE，純化的293-rhML332在凝膠的68-80千道爾頓區(qū)以一個(gè)寬帶遷移。
rhML153的純化亦如實(shí)施例19所述。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，rhML153的條件培養(yǎng)基如rhML332一樣地在Blue-Sepharose柱上分離。Blue-Sepharose柱的洗脫物直接上樣于如前文所述的mpl親和柱。從mpl親和柱得到的rhML153洗脫物，在與rhML332相同的條件下，用C4-HPLC柱純化達(dá)到均一性。通過(guò)SDS-PAGE，純化的rhML153分離為2個(gè)主帶和2個(gè)次帶，分子量約18,000-22,000(見(jiàn)圖15)。
10.鼠mpl配體一個(gè)對(duì)應(yīng)于人mpl配體編碼區(qū)的DNA片段通過(guò)PCR而獲得、凝膠純化后用32P-dATP和32P-dCTP標(biāo)記。這一探針被用來(lái)篩選構(gòu)建于λGT10噬菌體中的鼠肝cDNA文庫(kù)的106個(gè)克隆。一個(gè)含有1443個(gè)堿基對(duì)插入片段的鼠克隆(圖16[SEQ ID NOS12和13])被分離并測(cè)序。在核苷酸位置138-141處的假定起始密碼子位于真核翻譯起始要求的共有序列內(nèi)(Kozak，M.J.Cell Biol.，108229-241)。這一序列表明了一個(gè)1056個(gè)核苷酸的開(kāi)放讀框，預(yù)示其能產(chǎn)生主要的長(zhǎng)度為352個(gè)氨基酸翻譯產(chǎn)物。在這個(gè)開(kāi)放讀框的兩端，有5′端的137個(gè)核苷酸和3′端的247個(gè)核苷酸的非翻譯區(qū)。在3′端非翻譯區(qū)后沒(méi)有聚腺苷酸尾，表示該克隆可能不完整。預(yù)測(cè)的氨基酸序列N末端高度疏水可能代表了一個(gè)信號(hào)肽。計(jì)算機(jī)分析(von Heijne，G.Eur.J.Biochem.13317-21)顯示，在殘基21-22之間有一個(gè)信號(hào)肽酶的潛在切割斷裂位點(diǎn)。在這個(gè)位置發(fā)生的切割產(chǎn)生一個(gè)成熟的331個(gè)氨基酸(35千道爾頓)的多肽，稱為mML331(由于以下原因也稱為mML2)。這一序列有4個(gè)半胱氨酸和7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，前者在人的序列中都是保守的，后者中有5個(gè)在人的序列中保守。而且，與hML一樣，所有7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)都位于蛋白質(zhì)C末端的一半處。
當(dāng)與人ML相比較時(shí)，可以觀察到在這些ML的“EPO結(jié)構(gòu)域”中，核苷酸及其推斷的氨基酸序列都有很大的相同性。然而，如果將人和鼠ML推斷的氨基酸序列排列作比較，可以在鼠序列的111-114殘基間發(fā)現(xiàn)一個(gè)四肽的缺失，對(duì)應(yīng)于在人(見(jiàn)上文)和豬(見(jiàn)下文)cDNA中的核苷酸位置618后的12個(gè)核苷酸缺失。相應(yīng)地，檢查其他克隆以檢測(cè)可能的鼠ML同種型。有一個(gè)克隆編碼335個(gè)氨基酸的推斷的多肽，其中含有缺失的四肽LPLQ。這種形式被確信為全長(zhǎng)的鼠ML，稱為mML或mML335。mML的核苷酸序列及其推斷的氨基酸序列見(jiàn)圖17(SEQ ID NOS14和15)。這個(gè)cDNA克隆由1443個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，后接一個(gè)聚腺苷酸尾。它擁有一個(gè)1068bp的開(kāi)放讀框，其兩側(cè)在5′端和3′端各有134個(gè)堿基和241個(gè)堿基的非翻譯區(qū)序列。假定的起始密碼子位于核苷酸位置138-140處。開(kāi)放讀框編碼356個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中開(kāi)始的21個(gè)高度疏水并有類似分泌信號(hào)的功能。
最后，又分離、測(cè)序到了第三種克隆，含有對(duì)應(yīng)于bML3的116個(gè)核苷酸缺失。這種鼠同種型被定名為mML3。這兩種同種型推斷的氨基酸序列比較見(jiàn)圖18(SEQ ID NOS9和16)。
人和鼠ML的整個(gè)氨基酸序列的相同性為72％(圖19[SEQID NOS6和17])，但這種同源性并不是均勻地分布的。稱為“EPO結(jié)構(gòu)域”(人氨基酸序列1-153，鼠氨基酸序列1-149)區(qū)域的保守性(同源性86％)要強(qiáng)于蛋白質(zhì)的羧基末端區(qū)域(同源性62％)。這也許進(jìn)一步表明，只有“EPO結(jié)構(gòu)域”對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性是重要的。有趣地，在hML中找到的兩個(gè)雙堿性氨基酸基序中，只有緊接“EPO結(jié)構(gòu)域”的一個(gè)雙堿性基序(殘基位置153-154)在鼠序列中發(fā)現(xiàn)。這一現(xiàn)象支持了這樣一種可能性全長(zhǎng)的ML也許代表了一個(gè)前體蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)有限蛋白酶解產(chǎn)生成熟的配體。也有可能，在Arg153-Arg154之間的蛋白酶解有助于分解hML。
如實(shí)施例1所述，一個(gè)含有mML完整編碼序列的表達(dá)載體被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能刺激3H-胸苷摻入表達(dá)鼠或人mpl的Ba/F3細(xì)胞。但對(duì)親代(少mpl)細(xì)胞系沒(méi)有效應(yīng)。這表明，克隆的鼠ML cDNA編碼一個(gè)能激活鼠和人ML受體的功能性配體(mpl)。
11.豬mpl配體如實(shí)施例13所述，豬ML(pML)cDNA通過(guò)RACE PCR分離。已經(jīng)在腎中發(fā)現(xiàn)并亞克隆了一個(gè)1342bp的PCR cDNA產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)克隆能編碼一個(gè)332個(gè)氨基酸殘基的豬mpl配體，稱為pML或pML332。這些克隆的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列如圖20(SEQ ID NOS18和19)所示。
另外，已經(jīng)鑒定了第二種形式(見(jiàn)圖21[SEQ ID NO21])，稱為pML2，它編碼的蛋白質(zhì)有4個(gè)氨基酸殘基缺失(228個(gè)氨基酸殘基)。比較pML和pML2可知，除了對(duì)應(yīng)于殘基111-114的四肽QLPP缺失外，兩種形式完全一樣(見(jiàn)圖22[SEQ ID NOS18和21])。在鼠和豬ML cDNA中觀察到的4個(gè)氨基酸缺失都是精確地發(fā)生在假定蛋白質(zhì)的同一位置。
比較人、鼠和豬的成熟ML假定的氨基酸序列(圖19[SEQ IDNOS6、17和18])，結(jié)果顯示，在整個(gè)序列相同性上，鼠和人之間為72％，鼠和豬之間為68％，而豬和人之間為73％。在ML氨基端的一半處(EPO同源結(jié)構(gòu)域)，同源性明顯地增大。在以上物種的任何兩種之間，這一區(qū)域的同源性為80％至84％，而在羧基端的一半處(糖類結(jié)構(gòu)域)，相同性僅有57％至67％。在紅細(xì)胞生成素同源結(jié)構(gòu)域的羧基末端，有一個(gè)代表蛋白酶切割位置的雙堿性氨基酸基序。這一位置上的該基序在三個(gè)物種之間是保守的(圖19[SEQ ID NOS6、17和18])。在人的序列位置245-246處出現(xiàn)的第二個(gè)雙堿性位點(diǎn)在豬或鼠的序列中沒(méi)有出現(xiàn)。鼠和豬ML序列有4個(gè)半胱氨酸，都保留于人的序列中。在鼠配體和豬ML中，潛在的N-糖基化位點(diǎn)分別有7個(gè)和6個(gè)，其中5個(gè)保留于人的序列中。另外，所有潛在的N-糖基化位點(diǎn)都位于蛋白質(zhì)羧基端的一半處。
12.中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞TPO的表達(dá)和純化用于轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的表達(dá)載體稱為pSV15.ID.LL.MLORF(全長(zhǎng)或TP0332)和pSV15.ID.LL.MLORF-D(截短的或TP0153)。這些質(zhì)粒的相關(guān)特性見(jiàn)圖23和圖24。
轉(zhuǎn)染的過(guò)程如實(shí)施例20所述。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，通過(guò)PCR得到對(duì)應(yīng)于TPO整個(gè)開(kāi)放讀框的cDNA。PCR產(chǎn)物純化后克隆入pSV15.ID.LL質(zhì)粒的兩個(gè)限制位點(diǎn)(Clal和Sall)之間，從而獲得載體pSV15.ID.LL.MLORF。對(duì)應(yīng)于EPO同源結(jié)構(gòu)域的第二種構(gòu)建物以同樣方式產(chǎn)生，但使用不同的反義引物(EPOD.Sal)。編碼TPO的EPO同源結(jié)構(gòu)域的載體的最終構(gòu)建物稱為pSV15.ID.LL.MLEPO-D。
這兩種構(gòu)建物以Notl消化使之線性化，并通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO-DP12細(xì)胞，EP 307,247 1989年3月15日發(fā)表)。107個(gè)細(xì)胞在存在有10、25或50mg DNA時(shí)，用BRL電穿孔儀(350伏，330毫法，低電容)作電穿孔，(Andreason，G.L.J.Tissue Cult.Meth.15，56)。轉(zhuǎn)染后第二天，將細(xì)胞在DHFR選擇培養(yǎng)基(不含甘氨酸的高濃度葡萄糖DMEM-F125050、2mM谷氨酰胺、2-5％透析的小牛胚胎血清)中打勻。10至15天后，將單個(gè)集落轉(zhuǎn)移到96平板，使之生長(zhǎng)至匯合。用Ba/F3-mpl增殖測(cè)定來(lái)評(píng)估來(lái)自這些克隆的ML153或ML332在條件培養(yǎng)基中的表達(dá)(如實(shí)施例1所述)。
從收獲的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液中分離和純化TPO的步驟見(jiàn)實(shí)施例20。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將收獲的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCF)上樣于Blue-Sepharose柱(Pharmcia公司)，上樣的比例為每升樹(shù)脂約100升HCCF。接著，先用3至5倍柱體積的緩沖液洗滌柱，續(xù)之以3至5倍柱體積含2.0M尿素的緩沖液洗滌柱。然后，再用3至5倍柱體積含2.0M尿素和1.0MNaCl的緩沖液來(lái)洗脫TPO。
將含TPO的Blue-Sepharose洗脫集合物上樣于Wheat Germ(麥胚)凝集素-Sepharose柱(Pharmacia公司)，按每毫升樹(shù)脂8至16毫升Blue-Sepharose洗脫液的比例用Blue-Sepharose洗脫緩沖液來(lái)平衡柱。柱的洗滌用2至3倍柱體積的平衡緩沖液。TPO的洗脫采用2至5倍柱體積含2.0M尿素和0.5M N-乙酰-D-葡糖胺的緩沖液。
隨后，將含TPO的麥胚凝集素洗脫物酸化，并加入C12E8使終濃度為0.04％。再將得到的溶液上樣于C4反相柱，用0.1％TFA、0.04％C12E8平衡，裝載量為每毫升樹(shù)脂約0.2至0.5mg蛋白質(zhì)。
在含0.1％TFA和0.04％C12E8的乙腈雙相線性梯度中洗脫蛋白質(zhì)，并經(jīng)SDS-PAGE后獲得一種集合物。
然后，將C4中的集合物稀釋，并在能使之截?cái)酁?0,000至30,000道爾頓分子量的Amicon YM之類的超濾膜上用6倍體積的緩沖液透濾。得到的透濾液可直接用于以后的操作或經(jīng)超濾進(jìn)一步地濃縮。通常，透濾/濃縮液用終濃度為0.01％吐溫-80來(lái)調(diào)節(jié)。
接著，將相當(dāng)于柱體積2％至5％的全部或部分透濾/濃縮液上樣于Sephacryl S-300HR柱(Pharmacia公司)，平衡用含0.01％吐溫-80的緩沖液，然后進(jìn)行色譜。不含聚合物和蛋白酶解的降解產(chǎn)物的TPO組分隨后經(jīng)SDS-PAGE后獲得集合物。得到的集合物經(jīng)過(guò)濾后保存于2-8℃。
13.在微生物中轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)TPO合成的方法以及從中分離、純化和重折疊合成的TPO大腸桿菌TPO表達(dá)載體的構(gòu)建在實(shí)施例21中有詳細(xì)的描述。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，設(shè)計(jì)質(zhì)粒pMP21、pMP151、pMP41、pMP57和pMP202來(lái)表達(dá)一個(gè)短引導(dǎo)序列下游的TPO前155個(gè)氨基酸，該引導(dǎo)序列因不同的構(gòu)建物而有差異。這個(gè)引導(dǎo)序列主要提供高水平的翻譯起始和快速純化。又設(shè)計(jì)了質(zhì)粒pMP210-1、-T8、-21、-22、-24、-25來(lái)表達(dá)TPO起始甲硫氨酸下游的前153個(gè)氨基酸，這些質(zhì)粒的不同僅僅在于針對(duì)TPO前6個(gè)氨基酸的密碼子的使用。pMP210-1中TPO的羧基末端延伸兩個(gè)氨基酸后，得到pMP251。在色氨酸啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下，上述的所有質(zhì)粒將在大腸桿菌中產(chǎn)生高水平的細(xì)胞內(nèi)TPO表達(dá)(Yansura，D.G.等，Methods in Enzymology[Goedded，D.V.，編輯]18554-60，Academic Press，SanDiego)。質(zhì)粒pMP1和pMP172是上述TPO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中的過(guò)渡物。
通過(guò)CaCl2熱休克法，將上述TPO表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Mandel，M.等，J.Mol.Biol.，53159-162，)，其他轉(zhuǎn)化過(guò)程的描述見(jiàn)實(shí)施例21。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，首先將轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37℃中培養(yǎng)直至培養(yǎng)物光密度達(dá)到約2-3。稀釋培養(yǎng)物，并在通氣條件下生長(zhǎng)后，加入酸。然后，讓培養(yǎng)物繼續(xù)在通氣條件下生長(zhǎng)15小時(shí)后，離心法收集細(xì)胞。
實(shí)施例22和實(shí)施例23描述了產(chǎn)生生物活性的、重折疊的人TPO及其片段的分離、純化和重折疊步驟；這些方法可應(yīng)用于包括N末端和C末端延伸形式在內(nèi)的任何TPO變異體的回收。其他適合于重折疊重組體或合成的TPO的步驟可參見(jiàn)下列專利Builder等，U.S.專利號(hào)4,511,502；Jones等，U.S.專利號(hào)4,512,922；Olson，U.S.專利號(hào)4,518,526和Builder等，U.S.專利號(hào)4,620,948；其中大致敘述了以不溶性形式表達(dá)于大腸桿菌中的大量重組蛋白的回收和重折疊方法。
A.不溶性TPO的回收將能表達(dá)由任何合適質(zhì)粒編碼的TPO的微生物如大腸桿菌，在一定條件下發(fā)酵，要求TPO能夠以不溶性的“折射體”沉泥。可選擇地首先用細(xì)胞裂解緩沖液洗滌細(xì)胞。通常，用Polytron勻漿器將約100克的細(xì)胞重懸于10倍體積的細(xì)胞裂解緩沖液中(如10mMTris、5mM EDTA，pH8)，并以5000×g、30分鐘的條件離心細(xì)胞。然后，使用諸如張力休克、超聲處理、壓力循環(huán)、化學(xué)或酶法等常規(guī)技術(shù)裂解細(xì)胞。例如，上述經(jīng)洗滌的細(xì)胞沉淀物可通過(guò)勻漿器重懸于10倍體積的另一種細(xì)胞裂解緩沖液中，并根據(jù)制造商的說(shuō)明將細(xì)胞懸浮液流經(jīng)LH Cell Disrupter(LH Inceltech公司)或Microflu-idizer(Microfluidics International公司)。含TPO的顆粒物從液相中被分離出來(lái)，并可選擇地以任何合適的液體洗滌。例如，一種細(xì)胞解裂物的懸浮液可以5,000g離心30分鐘，重懸后可選擇地進(jìn)行第二次離心，最后得到經(jīng)洗滌的折射體沉淀。這些經(jīng)過(guò)洗滌的沉淀可立即使用或冰凍保存(如-70℃)。
B.單體TPO的增溶和純化折射體沉淀中不溶性TPO用增溶緩沖液來(lái)增溶。增溶緩沖液含有離液劑，通常在堿性pH下起緩沖作用，并含有能提高單體TPO產(chǎn)量的還原劑。代表性的離液劑有尿素、鹽酸胍和硫氰酸鈉。而優(yōu)選的離液劑為鹽酸胍。離劑的濃度通常為4-9M，優(yōu)選地為6-8M。增溶緩沖液的pH值由合適的緩沖液維持在7.5-9.5范圍內(nèi)，優(yōu)選地為8.0-9.0，最為優(yōu)選地為8.0。優(yōu)選的增溶緩沖液中還含有還原劑以幫助形成TPO的單體形式。合適的還原劑包括游離的巰基(RSH)等有機(jī)化合物。代表性的還原劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、巰基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、半胱胺和半胱氨酸。優(yōu)選的還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)?？蛇x擇地，增溶緩沖液可包含一種溫和的氧化劑(如氧分子)和一種亞硫酸鹽以通過(guò)亞硫酸化形成單體TPO。在這個(gè)例子中，得到的TPO-S-磺酸鹽以后又在氧化還原緩沖液(如GSH/GSSG)中重折疊以形成合適的折疊TPO。
TPO蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化，通常的方法如離心、凝膠過(guò)濾色譜和反相柱色譜。
以舉例的方法，通過(guò)下列步驟能得到合適產(chǎn)量的單體TPO。將折射體沉淀重懸于約5倍體積的增溶緩沖液(20mM Tris，pH8，6-8M胍和25mM DTT)中，攪拌1-3小時(shí)或4℃過(guò)夜，使TPO蛋白質(zhì)增溶。也可以用高濃度的尿素(6-8M)，但與胍相比，產(chǎn)量要低一些。增溶后，溶液在30,000×g離心30分鐘，得到含變性單體TPO的透明上清液。然后，將上清液在Superdex 200凝膠柱(Phar-macia公司，2.6×60cm)上進(jìn)行色譜，設(shè)定流速為2毫升/分鐘。蛋白質(zhì)的洗脫條件為，20mM磷酸鈉pH6.0、10mMDTT。合并收集含變性單體TPO蛋白質(zhì)洗脫液160至200毫升之間的組分。TPO蛋白質(zhì)在半制備的反相柱(2×20cm VYDAC)上進(jìn)一步純化。樣品以5毫升/分鐘上樣，柱的平衡用含30％乙腈的0.1％TFA(三氟乙酸)。蛋白質(zhì)的洗脫采用乙腈的線性梯度(在60分鐘內(nèi)，從30％到60％)。純化的還原性蛋白質(zhì)在濃度約為50％乙腈時(shí)被洗脫下來(lái)。洗脫物用于重折疊以得到具有生物活性的TPO變異體。
C.重折疊TPO以產(chǎn)生生物活性形式TPO增溶和進(jìn)一步純化之后，就要通過(guò)變性單體TPO在氧化還原緩沖液中的重折疊來(lái)得到生物活性形式。由于TPO的高效價(jià)(約3pg/ml時(shí)，能在Ba/F3測(cè)定中達(dá)到最大刺激作用的一半)，通過(guò)多種不同的緩沖液、去垢劑和氧化還原條件得到生物活性物質(zhì)是可能的。但是，在大多數(shù)情況下，只能得到少量合適的折疊物質(zhì)(＜10％)。用制造商推薦的程序，希望得到的重折疊產(chǎn)物至少為10％，達(dá)到30％-50％更好，達(dá)到50％以上則最佳。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的至少能產(chǎn)生一定量合適折疊產(chǎn)物的去垢劑有很多Triton X-100、十二烷基-β-麥芽糖、CHAPS、CHAPSO、SDS、sarkosyl、吐溫20、吐溫80、Zwittergent及其他。但其中最為優(yōu)選的去垢劑都屬于CHAPS家族(CHAPS和CHAPSO)，CHAOS家族去垢劑在重折疊反應(yīng)中的效果最佳并能限制蛋白質(zhì)聚集和不適當(dāng)?shù)亩蜴I形成。CHAPS最為優(yōu)選的濃度是大于1％。為得到最高產(chǎn)量，需要最適濃度0.1至0.5M的氯化鈉。為了限制在一些制備物中發(fā)現(xiàn)的由金屬催化的氧化作用(和聚集作用)，可在氧化還原緩沖液中加入EDTA(1-5mM)。最適的重折疊條件需要濃度大于15％的甘油。為了得到最高產(chǎn)量，還必須在氧化還原緩沖液中含有一個(gè)由氧化和還原有機(jī)巰基(RSH)構(gòu)成的氧化還原對(duì)。合適的氧化還原對(duì)有巰基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、半胱胺、半胱氨酸以及它們相應(yīng)的氧化形式。優(yōu)選的氧化還原對(duì)是谷胱甘肽(GSH)氧化谷胱甘肽(GSSH)或半胱胺半胱氨酸。而最為優(yōu)選的氧化還原對(duì)為谷胱甘肽(GSH)氧化谷胱甘肽(GSSH)。通常，當(dāng)氧化還原對(duì)中氧化物的摩爾比等于或大于還原物時(shí)，可以得到更高的產(chǎn)量。這些TPO變異體重折疊的最適pH值在7.5和約9之間。有機(jī)溶劑(如乙醇、乙腈，甲醇)的耐受濃度為10-15％或更低。更高濃度的有機(jī)溶劑增加了不合適折疊形式的量。Tris和巰酸鹽緩沖液通常能起作用。4℃溫育也能增加TPO合適折疊的量。
經(jīng)過(guò)第一個(gè)C4步驟純化后，TPO的重折疊產(chǎn)量通常為40-60％(根據(jù)用于重折疊反應(yīng)的還原和變性TPO的量)。雖然因?yàn)榇罅砍恋砗驮赥PO重折疊過(guò)程中非TPO蛋白質(zhì)的干擾產(chǎn)量會(huì)減少，但當(dāng)制備物純化度較低(例如直接在Superdex 200柱或最初的折射體抽提之后)時(shí)，能夠得到活性物質(zhì)。
因?yàn)門(mén)PO含有4個(gè)半胱氨酸殘基，這種個(gè)蛋白質(zhì)可能形成3種不同的二硫鍵形式形式1二硫鍵位于半胱氨酸殘基1-4和2-3之間形式2二硫鍵位于半胱氨酸殘基1-2和3-4之間形式3二硫鍵位于半胱氨酸殘基1-3和2-4之間。
在確定重折疊條件的最初實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)C4反相柱色譜得到了幾個(gè)不同的含TPO蛋白質(zhì)的峰。在這些峰中，只有一個(gè)在Ba/F3測(cè)定中表現(xiàn)出明顯的生物活性。隨后，優(yōu)化重折疊條件以優(yōu)先產(chǎn)生這一形式。在這些條件下，從增溶步驟得到的所有單體TPO的錯(cuò)折疊形式低于10-20％。
使用質(zhì)譜法和蛋白質(zhì)測(cè)序(從氨基末端起，依此給半胱氨酸編號(hào))，確定了具有生物活性TPO的二硫鍵形式為1-4和2-3。這種半胱氨酸的交聯(lián)形式同已知的相關(guān)紅細(xì)胞生成素分子的二硫鍵形式一致。
D.重組體、重折疊TPO的生物活性在體和離體測(cè)定中，重折疊并純化的TPO都有活性。例如在Ba/F3測(cè)定中，3.3pg/ml(0.3pm)的TPO(Met-11-153)對(duì)胸苷摻入Ba/F3細(xì)胞的刺激作用達(dá)到最大值的一半。在基于mpl受體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中，濃度為1.9ng/ml(120pM)時(shí)，活性達(dá)到最大值的一半。在正常動(dòng)物和經(jīng)過(guò)近致死X射線處理的骨髓抑制動(dòng)物中，重折疊TPO(Met-11-153)高效地刺激新血小板生成(在劑量低達(dá)30ng/鼠時(shí)，可觀察到活性)。經(jīng)上述步驟重折疊后的TPO的其他形式中，也可以觀察到類似的生物活性。
14.測(cè)量血小板生成素活性的方法血小板活性的測(cè)量可通過(guò)多種方法，例如實(shí)施例1所述的Ba/F3mpl配體測(cè)定、體內(nèi)血小板回跳合成測(cè)定、以針對(duì)人白血病成巨核細(xì)胞系(CMK)的抗血小板免疫(抗GPIIbIIIa)測(cè)定的血小板細(xì)胞表面抗原的誘導(dǎo)測(cè)定(參見(jiàn)Sato等，Brit.J.Heamatol.，72184-190)(亦參見(jiàn)實(shí)施例4所述液體懸浮液巨噬細(xì)胞生成測(cè)定)以及成巨核細(xì)胞系(DAMI)中的多倍體化的誘導(dǎo)(參見(jiàn)Ogura等，Blood(1)，7249-60)。從未成熟的、大多沒(méi)有DNA合成的巨噬細(xì)胞成熟為形態(tài)可鑒別的巨噬細(xì)胞的過(guò)程包括胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞器，獲取膜抗原(GPIIbIIIa)及如發(fā)明背景中所述的核內(nèi)復(fù)制及釋放血小板。需要一個(gè)譜系特異的成熟巨核細(xì)胞的啟動(dòng)子(如mpl配體)來(lái)誘導(dǎo)未成熟巨噬細(xì)胞在成熟過(guò)程中的至少一部分這樣的變化，從而導(dǎo)致釋放血小板及緩和血小板減少。因此，已經(jīng)設(shè)計(jì)了一些實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)未成熟的巨噬細(xì)胞系即CMK和DAMI細(xì)胞中這些參數(shù)的出現(xiàn)。CMK測(cè)定(實(shí)施例4)檢測(cè)特異血小板標(biāo)記GPIIbIIIa以及血小板釋放的出現(xiàn)。DAMI測(cè)定(實(shí)施例15)則檢測(cè)核內(nèi)復(fù)制，因?yàn)楸缎缘脑黾邮蔷奘杉?xì)胞成熟的標(biāo)志?？勺R(shí)別的巨噬細(xì)胞有2N、4N、8N、16N、32N等倍數(shù)值。最后，體內(nèi)鼠血小板回跳測(cè)定(實(shí)施例16)可用來(lái)證明，施用測(cè)試化合物(此處是mpl配體)將導(dǎo)致血小板數(shù)的增加。
另外又發(fā)展了兩種離體測(cè)定法來(lái)檢測(cè)TPO活性。第一種是激酶受體激活(KIRA)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，其中用mpl-Rse嵌合體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并在將嵌合體的mpl部分暴露于mpl配體以后，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)Rse的酪氨酸磷酸化(參見(jiàn)實(shí)施例17)。第二種是基于受體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，其中用包被兔抗人IgG的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定板來(lái)捕獲與待測(cè)mpl配體結(jié)合的人嵌合受體mpl-IgG。mpl配體的一個(gè)生物素標(biāo)記的免多克隆抗體被用來(lái)檢測(cè)結(jié)合的mpl配體，并以實(shí)施例18所述鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶來(lái)測(cè)定。
15.用TPO處理的正常鼠和經(jīng)亞致死輻射的鼠的體內(nèi)生物反應(yīng)正常鼠和經(jīng)亞致死輻射的鼠都用截短的和全長(zhǎng)的TPO來(lái)處理，其中TPO從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、大腸桿菌和人胚腎細(xì)胞(293)中分離。從這三種宿主中得到的TPO兩種形式都能刺激鼠的血小板生成，但是，分離自CHO的全長(zhǎng)TPO表現(xiàn)出了最強(qiáng)的體內(nèi)反應(yīng)。這些結(jié)果表明，最適的體內(nèi)活性可能需要在羧基末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行合適的糖基化。
(a)大腸桿菌-rhTPO(Met-1，153)每天，將大腸桿菌(參見(jiàn)實(shí)施例23)產(chǎn)生的EPO結(jié)構(gòu)域的“Met”形式(-1位置的甲硫氨酸加上人TPO的前153個(gè)殘基)注射入正常的雌性C57 B6鼠，方法如圖25A、25B和25C的說(shuō)明。這些圖顯示，由大腸桿菌產(chǎn)生并以上述方法重折疊的TPO未糖基化截短形式能夠刺激正常鼠中血小板數(shù)量增加2倍，而不影響紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量。
如圖26A、26B和26C的說(shuō)明，每天將同樣的分子注射入亞致死輻射(137Cs)的雌性C57 B6鼠，可刺激血小板的回復(fù)以及提高水平，但對(duì)紅細(xì)胞或白細(xì)胞沒(méi)有效應(yīng)。
(b)CHO-rhTPO332如27A、27B和27C的說(shuō)明，每天將由CHO產(chǎn)生的TPO全長(zhǎng)形式注射入雌性C57 B6鼠，能夠使正常鼠的血小板數(shù)量增加5倍，但對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞球的數(shù)量沒(méi)有效應(yīng)。
(c)CHO-rhTPO332；大腸桿菌-rhTPO(Met-1，153)；293-rhTPO332和大腸桿菌-rhTPO155如圖28的說(shuō)明，用rhTPO處理正常鼠構(gòu)建劑量反應(yīng)曲線，其中rhTPO來(lái)自不同細(xì)胞系(CHO-rhTPO332；大腸桿菌-rhTPO(Met-1，153)；293-rhTPO332；和大腸桿菌-rhTPO155)。這個(gè)圖顯示，這種分子的所有受測(cè)形式都能刺激血小板的生成，但CHO產(chǎn)生的全長(zhǎng)形式具有最強(qiáng)的體內(nèi)活性。
(d)CHO-rhTPO153；CHO-rhTPO“截短的”和CHO-rhT-PO332同樣，如圖29的說(shuō)明，用CHO(CHO-rhTPO153；CHO-rhT-PO“截短的”和CHO-rhTPO332)產(chǎn)生的多種形式的rhTPO處理正常鼠構(gòu)建劑量反應(yīng)曲線。這個(gè)圖顯示，該分子的所有受測(cè)CHO形式都刺激血小板的生成，但全長(zhǎng)的70千道爾頓形式有最強(qiáng)的體內(nèi)活性。
16.mpl配體及變異體的一般重組制備優(yōu)先采用標(biāo)準(zhǔn)重組程序制備mpl配體培養(yǎng)用表達(dá)mpl配體的核酸轉(zhuǎn)染(一般用一種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞)的細(xì)胞，產(chǎn)生mpl配體多肽，從細(xì)胞中回收多肽。但是，也可認(rèn)為，mpl配體的產(chǎn)生是通過(guò)同源重組或者重組產(chǎn)生方法，其中后者是將控制元件引入已經(jīng)含編碼mpl配體的DNA的細(xì)胞。例如，可將一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件、抑制基因、或外源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入到指定宿主細(xì)胞的基因組，插入位置的鄰近和方向足以影響編碼所需mpl配體多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄?？刂圃痪幋ampl配體，而該DNA是宿主細(xì)胞原有的。接著，可以根據(jù)需要進(jìn)行篩選以得到產(chǎn)生本發(fā)明的受體多肽的細(xì)胞，或者得到表達(dá)水平增強(qiáng)或減低的細(xì)胞。
因此，本發(fā)明期待一種產(chǎn)生mpl配體的方法，要求該方法能將一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入含mpl配體核酸分子的細(xì)胞基因組，插入位置的足夠鄰近和方向?qū)υ摵怂岱肿拥霓D(zhuǎn)錄有影響?；蛘吒M(jìn)一步的步驟還應(yīng)該包括培養(yǎng)含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和核酸分子的細(xì)胞。本發(fā)明還期待一種宿主細(xì)胞，其中含有的內(nèi)源mpl配體核酸分子可操作地與被宿主細(xì)胞識(shí)別的外源控制序列結(jié)合。
A.編碼mpl配體多肽的DNA的分離編碼mpl配體多肽的DNA可以從任何cDNA文庫(kù)中得到，該cDNA文庫(kù)的制備是來(lái)自確信含有mpl配體mRNA并能以可檢測(cè)水平表達(dá)的組織。mpl配體基因也可以從某個(gè)基因組DNA文庫(kù)或者通過(guò)完整核苷酸或氨基酸序列的體外寡核苷酸合成而獲得。
用設(shè)計(jì)好的探針篩選文庫(kù)，以獲得目標(biāo)基因及其編碼的蛋白質(zhì)。對(duì)于cDNA表達(dá)文庫(kù)，合適的探針包括能識(shí)別和特異性結(jié)合mpl配體的單克隆或多克隆抗體。對(duì)于cDNA文庫(kù)，合適的探針包括長(zhǎng)度約20-80個(gè)堿基的寡核苷酸，能編碼來(lái)自相同或不同物種的mpl配體cDNA的已知或未知部分；也包括編碼相同或相似基因的互補(bǔ)或同源cDNA或其片段。篩選基因組DNA文庫(kù)的合適探針包括(但不限于)編碼相同或相似基因的寡核苷酸、cDNA或它們的片段和/或同源基因組DNA或其片段。Sambrook等(同上)的10-12章中所述的標(biāo)準(zhǔn)程序可作為用選定的探針篩選cDNA或基因組文庫(kù)的指導(dǎo)。
分離編碼mpl配體基因的另一個(gè)方法是PCR，如Sambrook等(同上)第14部分所述。這個(gè)方法需要使用能夠與編碼mpl配體的DNA雜交的寡核苷酸探針。選擇寡核苷酸的策略如下所述。
實(shí)踐本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法是，用精心選擇的寡核苷酸序列篩選來(lái)自多種組織的cDNA文庫(kù)，較佳地那些組織是人或豬腎(成體或胚胎)或者肝細(xì)胞系。例如，人胚肝細(xì)胞系cDNA文庫(kù)用寡核苷酸探針篩選?；蛘撸嘶蚪M文庫(kù)用寡核苷酸探針篩選。
被選作探針的寡核苷酸序列應(yīng)有足夠的長(zhǎng)度，并且要有足夠的精確性使假陽(yáng)性達(dá)到最小。通常，實(shí)際使用的核苷酸序列是根據(jù)mpl配體密碼子豐余性最小的區(qū)域設(shè)計(jì)。該寡核苷酸可能在一個(gè)或幾個(gè)位置呈簡(jiǎn)并性。對(duì)于從一個(gè)優(yōu)選的密碼子使用是未知的物種中篩選文庫(kù)來(lái)說(shuō)，簡(jiǎn)并性寡核苷酸的使用是極其重要的。
該寡核苷酸必須被標(biāo)記，從而使它能夠在與被篩選文庫(kù)的DNA雜交時(shí)被檢測(cè)出來(lái)。標(biāo)記的優(yōu)選方法是用ATP(如γ32P)和多聚核苷酸激酶放射性標(biāo)記寡核苷酸的5′末端。但是，其他方法也可用于標(biāo)記寡核苷酸，包括(但不限于)生物素或酶標(biāo)記。
最令人感興趣的是能編碼全長(zhǎng)mpl配體多肽的mpl配體核酸。在一些優(yōu)選例子中，其核酸序列包括了天然mpl配體信號(hào)序列。使用推導(dǎo)的氨基酸序列篩選選擇的cDNA或基因組文庫(kù)，可以得到具有所有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸。
B.天然mpl配體的氨基酸序列變異體mpl配體的氨基酸序列變異體的制備方法為將適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓雖pl配體DNA中或通過(guò)所需mpl配體多肽的體外合成。例如這類變異體包括豬mpl配體氨基酸序列中殘基的缺失、插入或置換。例如可通過(guò)在體或離體的蛋白酶解切割作用或者通過(guò)克隆并表達(dá)一個(gè)片段或編碼全長(zhǎng)mpl配體的DNA來(lái)去除成熟全長(zhǎng)mpl配體的羧基末端部分，從而得到一個(gè)具有生物活性的變異體。只要最終的構(gòu)建物有所需的生物活性，因此可將缺失、插入和置換任意組合來(lái)形成最終的構(gòu)建物。氨基酸的變化也許還能改變mpl配體的轉(zhuǎn)譯后加工過(guò)程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和位置。對(duì)于mpl配體氨基酸序列變異體的設(shè)計(jì)，突變位點(diǎn)和突變性質(zhì)由將要被改變的mpl配體特性決定。突變位點(diǎn)的改變可每次一個(gè)或每次一系列，例如(1)根據(jù)需要達(dá)到的效果，首先保守地、然后更激進(jìn)地作出選擇來(lái)置換；(2)去除靶殘基；(3)在指定的位點(diǎn)附近插入同類或不同類的殘基，或者將選擇1-3的組合。
如Cunningham和Wells，Science，在2441081-1085中所述，“丙氨酸掃描誘變”是確定mpl配體多肽的某些殘基或區(qū)域?yàn)檎T變的優(yōu)選位置的一個(gè)有用方法。在這里，可以確定一個(gè)殘基或一組靶殘基(如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸等帶電殘基)并可被任何氨基酸替換(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)，但如以中性或帶負(fù)電荷的氨基酸替換也較好。替換的結(jié)果影響了氨基酸與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的周圍水溶液環(huán)境的相互作用。對(duì)置換產(chǎn)生功能性敏感這些結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)在置換位點(diǎn)引入進(jìn)一步的其他變異來(lái)將其精制。因此，當(dāng)預(yù)先決定引入一個(gè)氨基酸序列變異的位點(diǎn)時(shí)，則突變本身的性質(zhì)不需要被預(yù)定。例如，為了在某個(gè)指定位點(diǎn)優(yōu)化突變行為，在靶密碼子或靶區(qū)域處實(shí)施丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變并篩選出表達(dá)的mpl配體變異體以獲得所需活性的最佳組合。
在構(gòu)建氨基酸序列變異體中，有兩個(gè)主要的變項(xiàng)突變位點(diǎn)的定位以及突變的性質(zhì)。例如，mpl配體多肽的變異體包括mpl配體序列的變異體，并可能代表了自然形成的等位基因(不需要mpl配體DNA的操作)或預(yù)定的突變體形式(將DNA突變成自然界中未發(fā)現(xiàn)的等位基因或變異體)。通常，突變的位置和性質(zhì)根據(jù)待修飾的mpl配體特性來(lái)選擇。
氨基酸序列缺失通常有約1-30個(gè)殘基，約1-10個(gè)殘基更好，而且殘基的缺失一般是連續(xù)的?；蛘?，mpl配體的氨基酸序列缺失可能包括羧基末端糖基化結(jié)構(gòu)域的一部分或全部。氨基酸序列的缺失也可能包括成熟蛋白質(zhì)的最初6個(gè)氨基末端殘基中的一個(gè)或幾個(gè)?？蛇x擇的氨基酸缺失包含存在于“螺旋束”之間的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)殘基。連續(xù)的缺失通常為偶數(shù)殘基，但單個(gè)或奇數(shù)殘基的缺失也屬于這一范疇。在具有絕大部分序列一致性的mpl配體之間的低同源區(qū)可引入缺失以修飾mpl配體的活性?；蛘撸谌薽pl配體和具有與人mpl配體絕大部分序列一致性的其他哺乳動(dòng)物mpl配體多肽之間的低同源區(qū)，也可引入缺失。在與另一哺乳動(dòng)物mpl配體基本同源的某個(gè)哺乳動(dòng)物mpl配體多肽區(qū)域引入缺失，更可能使該mpl配體的生物活性發(fā)生更顯著的變化。要選擇好連續(xù)缺失的殘基數(shù)目，以維持mpl配體效應(yīng)結(jié)構(gòu)域中的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如β折疊或α螺旋。
氨基酸序列的插入包括氨基和/或羧基末端的融合，其長(zhǎng)度可以從一個(gè)殘基到一百個(gè)甚至更多殘基的多肽；同時(shí)也包括了單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。序列內(nèi)插入(即成熟mpl配體序列內(nèi)的插入)一般有約1至10個(gè)殘基，1至5個(gè)殘基更好，最好有1至3個(gè)殘基。一個(gè)典型的融合發(fā)生在mpl配體或其片段與另一個(gè)細(xì)胞因子或其片段之間。末端插入的例子包括具有一個(gè)N-末端甲硫氨酰的成熟mpl配體、在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中成熟mpl配體直接表達(dá)的人工構(gòu)建物以及一個(gè)異源N-末端信號(hào)序列與成熟mpl配體分子N-末端的融合，后者可促進(jìn)重組宿主分泌成熟的mpl配體。這種信號(hào)序列通常來(lái)自指定的宿主細(xì)胞種類，并與之同源。合適的序列包括大腸桿菌的STII或Ipp、酵母的α因子和病毒信號(hào)如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的皰疹gD。
其他mpl配體分子的插入變異體包括mpl配體N-末端或C-末端與具有免疫原性的多肽的融合體(即施用的融合體對(duì)宿主而言是外源的)，免疫原性多肽有細(xì)菌多肽如β乳糖酶或大腸桿菌trp基因座編碼的酶或酵母蛋白；還包括半衰期長(zhǎng)的蛋白質(zhì)與C末端的融合體，前者如免疫球蛋白恒定區(qū)(或其他免疫球蛋白區(qū))、白蛋白或鐵蛋白，參見(jiàn)1989年4月6日發(fā)表的WO89/02922。
第三類變異體是氨基酸置換變異體。這些變異體中，至少有一個(gè)mpl配體分子的氨基酸殘基被去除并在原處插入一個(gè)不同的殘基。置換誘變最感興趣的位點(diǎn)包括確認(rèn)是mpl配體活性位點(diǎn)的部位和下述部位。在這樣的部位中，由于側(cè)鏈的體積、帶電或疏水性，與其他類似物中的氨基酸基本不同；但對(duì)于選定的位點(diǎn)而言，多種mpl配體種類和/或某個(gè)mpl配體成員在多種動(dòng)物的類似物之間，也存在高度的序列同一性。
在其他感興趣的位點(diǎn)中，來(lái)自多種家族成員或動(dòng)物種類的mpl配體的特定殘基完全相同。這些位點(diǎn)以相對(duì)保守的方式進(jìn)行置換，尤其是那些處于至少含有3個(gè)其他完全相同的保守位點(diǎn)的序列部位。這樣的保守置換參見(jiàn)表3中標(biāo)題為優(yōu)選置換的部分。如果這樣的置換導(dǎo)致生物活性的變化，那么將引入更多實(shí)質(zhì)性的變化并篩選出產(chǎn)物，這些實(shí)質(zhì)性變化參見(jiàn)表3中典型置換部分或參考以下對(duì)氨基酸類型的進(jìn)一步描述。
表3原來(lái)的殘基典型的置換 優(yōu)選的置換Ala(A)Val；Leu；Ile ValArg(R)Lys；Gln；Asn LysAsn(N)Gln；His；Lys；Arg GlnAsp(D)Glu GluCys(C)Ser SerGln(Q)Asn AsnGlu(E)Asp AspGly(G)Pro ProHis(H)Asn；Gln；Lys；Arg ArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸LeuLeu(L)亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe IleLys(K)Arg；Gln；Asn ArgMet(M)Leu；Phe；Ile LeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala LeuPro(P)Gly GlySer(S)Thr ThrThr(T)Ser SerTrp(W)Tyr TyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser PheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala正亮氨酸 Leumpl配體功能或免疫一致性的基本修飾作用通過(guò)選擇置換來(lái)完成，這些置換根據(jù)其維持下列情況的效應(yīng)而有顯著的差異(a)置換區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如一個(gè)折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的帶電性或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)一般的側(cè)鏈特性，天然形成的殘基被分成以下類型(1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸(2)中性親水性半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸(3)酸性天門(mén)冬氨酸、谷氨酸(4)堿性天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸、精氨酸(5)影響鏈方向的殘基甘氨酸、脯氨酸(6)芳香族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸非保守的置換必須是由上述類型中的一個(gè)殘基替換另一個(gè)類型中的殘基。這樣的置換殘基也可被引入保守性置換位點(diǎn)或較佳地引入保留的(非保守性)位點(diǎn)。
在本發(fā)明的一個(gè)例子中，希望能使分子中存在的一個(gè)或多個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)失活。這些位點(diǎn)通過(guò)檢查編碼的氨基酸序列來(lái)確定，例如對(duì)于胰蛋白酶，就要尋找賴氨酸或精氨酸殘基。在確定了蛋白酶切割位點(diǎn)以后，就通過(guò)以下方法使它們對(duì)蛋白酶切割沒(méi)有作用靶殘基的置換，用于置換的殘基最好是堿性殘基如谷氨酰胺或疏水性殘基如絲氨酸；去除該殘基；或者緊接該殘基后插入一個(gè)脯氨酸。
在另一例了中，除了信號(hào)序列的起始甲硫氨酸殘基以外的任何甲硫氨酸殘基以及位于每一該甲硫氨酸殘基N-末端或C-末端約3個(gè)殘基以內(nèi)的任何殘基都被另一個(gè)殘基置換(最好依照表3)或被去除?；蛘?，在該位點(diǎn)附近插入約1至3個(gè)殘基。
任何涉及維持mpl配體適當(dāng)構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可以被置換，以提高分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常的交聯(lián)，用于置換的殘基通常為絲氨酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從氨基末端起的epo結(jié)構(gòu)域中第一個(gè)和第四個(gè)半胱氨酸對(duì)于維持適當(dāng)?shù)臉?gòu)象是必需的，但第二個(gè)和第三個(gè)非必需。相應(yīng)地，epo結(jié)構(gòu)域中第二個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸可以被置換。
編碼mpl配體變異體的核酸分子可以用本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括(但不限于)從自然來(lái)源分離(對(duì)于自然形成的氨基酸序列變異體)或以寡核苷酸介導(dǎo)的(或定位)誘變來(lái)制備、PCR誘變、以及對(duì)mpl配體多肽的一個(gè)已制備的變異體或非變異體形式進(jìn)行盒式誘變。
寡核苷酸介導(dǎo)的誘變是制備mpl配體DNA的置換、缺失和插入變異體的一個(gè)優(yōu)選方法。參見(jiàn)Adelman等，DNA，2183，這一技術(shù)已經(jīng)廣為人知。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，通過(guò)將編碼所需突變的寡核苷酸與一個(gè)DNA模板雜交使mpl配體DNA發(fā)生變化，模板是含有mpl配體的未變或天然DNA序列的質(zhì)?；蚴删w的單鏈形式。雜交之后，使用DNA聚合酶合成完整的互補(bǔ)于模板的第二條鏈，由此，該鏈可以摻入寡核苷酸引物，并為mpl配體DNA中選定的變化而進(jìn)行編碼。
通常，要使用長(zhǎng)度至少有25個(gè)核苷酸的寡核苷酸。最適的寡核苷酸有12至15個(gè)核苷酸，并且在編碼突變的核苷酸兩邊，都與模板完全互補(bǔ)。這就確保了該寡核苷酸能與單鏈DNA模板分子正確地雜交。該寡核苷酸可以使用本領(lǐng)域上已知的技術(shù)容易地合成，參見(jiàn)Crea等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755765。
DNA模板由載體產(chǎn)生，這些載體可以是噬菌體M13載體的衍生物(商購(gòu)的M13mp18和M13mp19是合適的載體)，也可以是經(jīng)過(guò)復(fù)制得到的單鏈?zhǔn)删w，參見(jiàn)Viera等，Meth.Enzymol.，1533。因此，可將需要突變的DNA插入上述一種載體中，從而產(chǎn)生單鏈模板。單鏈模板的產(chǎn)生參見(jiàn)Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY 1989)中4.21-4.41部分。
或者，單鏈DNA模板可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)變性雙鏈質(zhì)?；蚱渌鸇NA而得到。
在合適的雜交條件下，將寡核苷酸雜交于單鏈模板可使天然的DNA序列發(fā)生變化(如產(chǎn)生氨基酸序列變異體)。然后，加入某種DNA聚合酶，通常是DNA聚合酶I的Klenow片段，合成模板的互補(bǔ)鏈，而該寡核苷酸則作為合成的引物。于是，就形成了一個(gè)異源雙鏈分子，其中一條DNA鏈編碼mpl配體的突變形式，另一條鏈(原始模板)則編碼mpl配體的天然的、未變序列。再將該異源雙鏈分子轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞，通常是原核細(xì)胞如大腸桿菌JM101。細(xì)胞經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)以后，將其涂布于瓊脂糖平板，并用32P放射性標(biāo)記的寡核苷酸引物進(jìn)行篩選，以鑒定含有突變DNA的菌落。將突變區(qū)去除并置入合適的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的載體，通常這類表達(dá)載體用作轉(zhuǎn)化合適的宿主。
可將上述方法加以修飾，以產(chǎn)生同源雙鏈分子即質(zhì)粒的兩條鏈都含有突變。修飾的方式如下所述。將單鏈寡核苷酸與上述的單鏈模板一起退火。將脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(dGTP)這三種脫氧核苷酸的混合物與被稱為dCTP-(aS)的硫代脫氧胞苷三磷酸(可從Amersham公司獲得)相結(jié)合。將混合物加入模板-寡核苷酸復(fù)合物。在得到的混合物中加入DNA聚合酶以后，就得到了與模板相同的一條DNA鏈，其中突變堿基除外。另外，在新合成的DNA鏈中，dCTP-(aS)代替了dCTP，保護(hù)其不受限制性內(nèi)切酶的消化。
使用合適的限制酶在該異源雙鏈的模板鏈上產(chǎn)生一個(gè)缺口，然后，用ExoIII核酸酶或其他不作用于突變位點(diǎn)區(qū)域的合適的核酸酶將模板鏈消化。反應(yīng)終止后，得到一個(gè)部分單鏈的分子。在加入所有4種脫氧核苷三磷酸、ATP和DNA連接酶以后，使用DNA聚合酶以合成完整的DNA同源雙鏈分子。如上所述，該同源雙鏈分子可被轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞如大腸桿菌JM101。
編碼一個(gè)以上氨基酸置換的mpl配體突變體的DNA可由幾種方法中的某一個(gè)來(lái)產(chǎn)生。如果置換的氨基酸在多肽鏈上的位置彼此較近，可以用一個(gè)寡核苷酸將它們同時(shí)突變，只要該寡核苷酸能編碼所有預(yù)想被置換的氨基酸。但是，如果這些氨基酸的位置彼此有一定距離(被多于10個(gè)氨基酸分開(kāi))，產(chǎn)生單個(gè)能編碼所有預(yù)想變化的寡核苷酸就更困難?？墒褂孟率鰞蓚€(gè)變通方法中的一個(gè)來(lái)解決。
第一個(gè)方法，產(chǎn)生一個(gè)分離的寡核苷酸來(lái)對(duì)應(yīng)每一個(gè)被置換的氨基酸。將該寡核苷酸與單鏈模板DNA一起退火，從模板合成的第二條DNA可編碼所有預(yù)想的氨基酸置換。
第二種方法需要兩次或更多的誘變循環(huán)以得到預(yù)想的突變體。第一次循環(huán)過(guò)程與上述單突變型相同野生型DNA作為模板，編碼第一個(gè)預(yù)想氨基酸置換的寡核苷酸與模板一起退火，然后產(chǎn)生異源雙鏈DNA分子。誘變的第二次循環(huán)將第一次誘變循環(huán)產(chǎn)生的突變DNA作為模板。所以，該模板已經(jīng)含有一個(gè)或多個(gè)突變。然后，將編碼其他預(yù)想氨基酸置換的寡核苷酸與該模板一起退火，于是就得到了一條DNA鏈能夠編碼第一次和第二次誘變循環(huán)中的突變。這樣得到的DNA就可以在第三次循環(huán)中作為模板，如此等等。
PCR誘變也適用于產(chǎn)生mpl配體多肽的氨基酸變異體。雖然以下討論僅指DNA，但應(yīng)理解該技術(shù)同樣適用于RNA。PCR技術(shù)通常包括以下程序(參見(jiàn)Erlich，同上R.Higuchi所著章節(jié)的61至70頁(yè))PCR中以少量模板DNA作為起始物質(zhì)，使用與模板DNA相應(yīng)區(qū)域的序列有輕微差異的引物，能夠產(chǎn)生相對(duì)大量的特異DNA片段，其序列僅在引物與模板不同的位置與模板有差異。為了將突變引入一個(gè)質(zhì)粒DNA，需要設(shè)計(jì)一個(gè)引物與突變位置重疊并含有該突變；另一個(gè)引物的序列必須與質(zhì)?；パa(bǔ)鏈的一部分序列完全相同，但該序列可以定位于質(zhì)粒DNA上的任何位置。但是，第二個(gè)引物的序列最好定位于距離第一個(gè)引物序列200個(gè)核苷酸以內(nèi)，這樣可使最后得到的與引物連接的整個(gè)DNA擴(kuò)增區(qū)域能夠容易地被測(cè)序。正如上文所述，PCR擴(kuò)增使用一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量的某個(gè)DNA片段，該DNA片段的差異可能在引物中特異的突變位置，也有可能在其他位置，因?yàn)槟０宓膹?fù)制有時(shí)產(chǎn)生易錯(cuò)。
如果模板與產(chǎn)物比率非常低，則絕大部分產(chǎn)生的DNA片段摻入了預(yù)想的突變。使用標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)，可將該產(chǎn)物替代作為PCR模板的質(zhì)粒上的相應(yīng)區(qū)域。在分開(kāi)位置上的突變可同時(shí)引入，引入方法可以是使用一個(gè)突變型的第二種引物，也可以是用不同的突變型引物作第二次PCR并通過(guò)三步(或更多)連接反應(yīng)將得到的兩個(gè)PCR片段同時(shí)連接于載體片段。
在PCR誘變的一個(gè)特殊例子中，模板質(zhì)粒DNA(1微克)經(jīng)限制性內(nèi)切酶的消化作用而線性化，該限制性內(nèi)切酶在質(zhì)粒DNA被擴(kuò)增區(qū)域以外的部分只有單一的識(shí)別位點(diǎn)。將100納克該產(chǎn)物加入含PCR緩沖液的PCR混合物中，在終體積為50微升的PCR混合物中，有GeneAmp配套試劑中(來(lái)自Perkin-Elmer Cetus公司，Norwalk，CT和Emeryville，CA)的四種脫氧核苷三磷酸和兩種寡核苷酸引物各25皮摩爾。用35微升礦物油覆蓋反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物在100℃變性5分鐘后，放置冰上并在礦物油層下加入1微升棲熱水生菌(Taq)DNA聚合酶(每微升5單位，購(gòu)自Perkin-Elmer Cetus公司)。然后，將反應(yīng)混合物置于DNA Thermal Cycler儀(購(gòu)自Perkin-Elmer Cetus公司)中，如下設(shè)置程序2分鐘，55℃30秒，72℃，然后是以下步驟的19個(gè)循環(huán)30秒，94℃30秒，55℃和30秒，72℃。
在以上程序結(jié)束以后，反應(yīng)小瓶取出thermal cycler儀，將水相轉(zhuǎn)移到新的小瓶中，酚/氯仿抽提(體積50∶50)，乙醇沉淀，并按標(biāo)準(zhǔn)程序回收DNA。接著，對(duì)該產(chǎn)物作適當(dāng)?shù)奶幚硎怪迦胼d體。
盒式誘變是另一種制備變異體的方法，其技術(shù)依據(jù)參見(jiàn)Wells等，Gene，34315。起始物質(zhì)為含有將要被突變的mpl配體DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。在mpl配體DNA中，將要被突變的密碼子是確定的。在確定的突變位點(diǎn)的每一側(cè)都必須有單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果這樣的限制性位點(diǎn)不存在，可使用上述寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法將其引入到mpl配體DNA的合適位置。將限制性位點(diǎn)引入到質(zhì)粒以后，在這些位點(diǎn)切割質(zhì)粒使之線性化。用標(biāo)準(zhǔn)程序合成能編碼限制性位點(diǎn)之間DNA序列但含有預(yù)定突變的雙鏈寡核苷酸。兩條鏈分別合成，并以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使之雜交。該雙鏈寡核苷酸被稱為盒。這個(gè)盒被設(shè)計(jì)成含有與線性化質(zhì)粒末端相容的3′端和5′端，使之能直接與質(zhì)粒連接。此時(shí)，該質(zhì)粒已經(jīng)含有mpl配體DNA序列。
C.可復(fù)制載體中核酸的插入將編碼天然或變異mpl配體多肽的核酸(如cDNA或基因組DNA)插入可復(fù)制的載體用于進(jìn)一步的克隆(DNA的擴(kuò)增)或表達(dá)。有許多可用載體，而合適載體的選擇是根據(jù)(1)是否該載體將用于DNA擴(kuò)增或表達(dá)，(2)被插入載體的核酸大小和(3)將被該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。每一種載體根據(jù)它的功能(DNA的擴(kuò)增或表達(dá))和與它相適應(yīng)的宿主細(xì)胞可含有多種成份。載體的成份通常包括(但不局限于)下述的一種或幾種一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因、一個(gè)增強(qiáng)子元件、一個(gè)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(i)信號(hào)序列成份本發(fā)明的mpl配體不僅能直接表達(dá)，而且能以與異源多肽的融合形式表達(dá)，該異源多肽最好是一個(gè)在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端有一個(gè)特異性切割位點(diǎn)的信號(hào)序列或其他多肽。通常，該信號(hào)序列可以是載體的一個(gè)成份，或者是插入載體的mpl配體DNA的一部分。被選擇的異源信號(hào)序列必須能被宿主細(xì)胞識(shí)別或?qū)儆谒拗骷?xì)胞(即能被一個(gè)信號(hào)肽酶斷裂)。對(duì)于不能識(shí)別或不具有天然mpl配體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，該信號(hào)序列被選定的原核信號(hào)序列替代，例如從一組堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)區(qū)中選定信號(hào)序列。對(duì)于酵母的分泌，可以替代天然信號(hào)序列的例子有酵母轉(zhuǎn)化酶、α因子、酸性磷酸酶前導(dǎo)區(qū)、白色念珠菌葡糖淀粉酶(1990年4月4日出版的EP362,179)或1990年11月15日出版的WO90/13646中所述的信號(hào)。對(duì)于哺乳動(dòng)物的表達(dá)，天然的信號(hào)序列(即指導(dǎo)體內(nèi)天然哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌mpl配體作的mpl配體前導(dǎo)序列)是令人滿意的，雖然其他哺乳動(dòng)物的信號(hào)序列也可能是合適的，例如來(lái)自其他mpl配體多肽或來(lái)自一個(gè)不同動(dòng)物種類的相同mpl配體的信號(hào)序列、來(lái)自一個(gè)mpl配體的信號(hào)序列、來(lái)自相同或相關(guān)物種的分泌多肽的信號(hào)序列、以及病毒分泌前導(dǎo)區(qū)如皰疹單顯性組合gD信號(hào)。
(ii)復(fù)制起始點(diǎn)成份表達(dá)和克隆載體都含有一個(gè)核酸序列，該序列使載體能在一個(gè)或幾個(gè)選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制。通常，在克隆載體中，該序列使載體獨(dú)立于宿主染色體細(xì)胞DNA而復(fù)制，并含有復(fù)制起點(diǎn)或自主性復(fù)制序列。這個(gè)序列廣泛分布于細(xì)菌、酵母和病毒之中。來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌；2μ質(zhì)粒起始點(diǎn)適合于酵母菌；而多種病毒起始點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)則對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體有用。通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起始點(diǎn)成份(通常要使用SV40起始點(diǎn)，只是因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。
大多數(shù)表達(dá)載體是“穿梭”載體，即它們能在至少一類生物體中復(fù)制但能被轉(zhuǎn)染到另一種生物體中進(jìn)行表達(dá)。例如，將一個(gè)載體在大腸桿菌中克隆，然后將同一個(gè)載體轉(zhuǎn)染到酵母菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，即使它不能獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體而復(fù)制。
同樣可通過(guò)插入宿主基因組擴(kuò)增DNA。這一過(guò)程可通過(guò)以桿菌作為宿主容易地完成，例如在載體中加入一個(gè)互補(bǔ)于桿菌基因組DNA上某個(gè)序列的DNA序列。用該載體轉(zhuǎn)染桿菌，產(chǎn)生桿菌基因組與插入的mpl配體DNA之間同源重組。然而，編碼mpl配體的基因組DNA的回收比外源復(fù)制載體的回收更復(fù)雜，因?yàn)樾枰拗泼傅南饔脕?lái)切割mpl配體DNA。
(iii)選擇基因成份表達(dá)和克隆載體應(yīng)該含有一個(gè)選擇基因，亦稱選擇標(biāo)記。該基因編碼轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上存活和生長(zhǎng)所必須的一個(gè)蛋白質(zhì)。未經(jīng)含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不能在培養(yǎng)基上存活。典型的選擇基因編碼的蛋白質(zhì)有(a)提供對(duì)抗生素或其他毒素抗性，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素，(b)互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基中沒(méi)有的重要營(yíng)養(yǎng)物，如編碼桿菌D丙氨酸消旋酶的基因。
選擇計(jì)劃的一個(gè)例子是使用藥物以阻止宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些用異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)一個(gè)藥物抗性的蛋白質(zhì)并能在選擇條件下存活。這種優(yōu)勢(shì)選擇的幾個(gè)例子使用的藥物為新霉素(South-ern等，J.Molec.Appl.Genet.1327)、霉酚酸(Mullgan等，Science，2091422)或潮霉素(Sugden等，Mol.Biol.，5410-413)。上述三個(gè)例子在真核控制下，使用細(xì)菌基因來(lái)表達(dá)對(duì)適當(dāng)藥物的抗性，相應(yīng)的藥物為G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)、潮霉素。
其他適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記的例子是那些能鑒別細(xì)胞成份含有mpl配體核酸的標(biāo)記，如二氫葉酸(DHFR)或胸苷激酶。哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體處于選擇性壓力下，只有轉(zhuǎn)化體由于含有標(biāo)記而適應(yīng)并存活。在培養(yǎng)基中連續(xù)地改變選擇試劑的濃度的條件下，對(duì)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體施以選擇壓力，其結(jié)果是導(dǎo)致選擇基因和編碼mpl配體多肽的DNA都被擴(kuò)增。在這樣的擴(kuò)增過(guò)程中，連續(xù)傳代的重組細(xì)胞染色體中，因生長(zhǎng)所必須的一種蛋白質(zhì)需求量增加的基因以串聯(lián)形式重復(fù)。擴(kuò)增的DNA使mpl配體合成的量增加。
例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的鑒定首先通過(guò)在含有一種DHFR競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑氨甲蝶呤(Mtx)的培養(yǎng)物中，培養(yǎng)所有的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)運(yùn)用野生型DHFR時(shí)，缺乏DHFR活性的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系是一種合適的宿主細(xì)胞，關(guān)于其制備與增殖，參見(jiàn)Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216。接著，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞暴露于濃度增高的Mtx。這導(dǎo)致了多拷貝DHFR基因合成以及隨之而來(lái)的其他構(gòu)成表達(dá)載體的DNA如編碼mpl配體的DNA的拷貝數(shù)增加。如果使用了對(duì)Mtx有高度抗性的突變型DHFR基因(EP117,060)，有內(nèi)源的DHFR，這一擴(kuò)增技術(shù)也可適用于任何其他合適的宿主，如ATCC No.CCL61 CHO-K1?；蛘?，用編碼mpl配體、野生型DHFR蛋白質(zhì)和另一種選擇性標(biāo)記。如氨基糖苷類3′轉(zhuǎn)磷酸酶的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞[尤其是含有內(nèi)源DHFR的野生型宿主]，可在含選擇劑的培養(yǎng)物中通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)所選擇，其中，用于選擇性標(biāo)記的選擇劑為氨基糖苷類抗生素等，如卡那霉素、新霉素或G418。參見(jiàn)U.S.專利號(hào)4,965,199。
適合于酵母中使用的一個(gè)選擇基因是出現(xiàn)于酵母質(zhì)粒YRp7的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239；Kingsman等，Gene，7141或Tschemper等，Gene，10157)。trp1基因?qū)⒁粋€(gè)選擇標(biāo)記提供給在色氨酸中生長(zhǎng)能力缺失的酵母菌突變型株，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512)。于是，酵母菌宿主細(xì)胞基因組中的trp1缺失提供了一種效應(yīng)環(huán)境，用于通過(guò)在無(wú)色氨酸情況下的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化。類似地，Leu2缺陷的酵母菌株(ATCC No.20,622或38,626)與已知的攜帶Leu2基因的質(zhì)?；パa(bǔ)。
(iv)啟動(dòng)子成份表達(dá)和克隆載體通常含有一個(gè)啟動(dòng)子，可被宿主生物體識(shí)別并可操作地連接mpl配體核酸。啟動(dòng)子是非翻譯序列，可操作地與一個(gè)結(jié)構(gòu)基因(通常在約100至1,000bp之間)連接，并位于控制特定核酸序列如mpl配體核酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因起始密碼子的上游(5′)。這種啟動(dòng)子通常分為誘導(dǎo)型和組成型兩類。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠控制DNA轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始增加，這種作用是隨培養(yǎng)條件中的某些變化如一種營(yíng)養(yǎng)物的存在與否或者溫度的變化而出現(xiàn)?，F(xiàn)在，已經(jīng)知道了能被許多潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別的大量啟動(dòng)子。經(jīng)限制性酶的消化作用將啟動(dòng)子從源DNA上切除下來(lái)，將分離的啟動(dòng)子序列插入載體，從而使這些啟動(dòng)子可操作地連接編碼mpl配體的DNA。天然的mpl配體啟動(dòng)子和許多異源啟動(dòng)子都能用來(lái)指導(dǎo)mpl配體DNA的擴(kuò)增和/或表達(dá)。但是，異源的啟動(dòng)子更好一些，因?yàn)榕c天然的mpl配體啟動(dòng)子相比較，它們通常能容許更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄和更高的mpl配體表達(dá)產(chǎn)量。
適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括β內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，Nature，275615)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，Nucleic Acid Res.，84057和EP36,776)和tac啟動(dòng)子等雜交啟動(dòng)子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25)。然而，其他已知的細(xì)菌啟動(dòng)子是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，因此，使用接頭或銜接子提供所需的限制性位點(diǎn)，一個(gè)熟練的工作人員可操作地將它們連接編碼mpl配體的DNA(siebenlist等，Cell，20269)。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子也含有一個(gè)Shine-Dalgarno(S.D.)序列，可操作地連接編碼mpl配體多肽的DNA。
真核細(xì)胞也有啟動(dòng)子序列。實(shí)際上，所有真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基處，都有一個(gè)AT富集區(qū)。在許多基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處，還發(fā)現(xiàn)了另一段序列稱為CXCAAT區(qū)，其中X可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′末端有AATAAA的序列，也許是在編碼序列3′末端加入多聚A尾的信號(hào)。所有這些序列可以合適地插入真核表達(dá)載體。
酵母菌宿主使用的合適啟動(dòng)序列的例子有3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073)或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7149和Holland，Biochemistry，174900)的啟動(dòng)子，如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其他酵母菌啟動(dòng)子即由生長(zhǎng)條件控制并有額外轉(zhuǎn)錄優(yōu)勢(shì)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下列物質(zhì)的啟動(dòng)子區(qū)域乙醇脫氫酶2、異構(gòu)細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及與麥芽糖和半乳糖使用有關(guān)的酶。關(guān)于酵母菌表達(dá)中使用的合適載體和啟動(dòng)子的進(jìn)一步描述參見(jiàn)Hitzeman等，EP73,657A。酵母菌增強(qiáng)子與酵母菌啟動(dòng)子一起使用也是有利的。
舉例來(lái)說(shuō)，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中載體的mpl配體轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子控制，這里的啟動(dòng)子來(lái)自病毒基因組，如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日出版，UK2,211,504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、一種逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、最好是猿猴病毒40(V40)；來(lái)自異源的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和免疫球蛋白啟動(dòng)子；來(lái)自熱休克啟動(dòng)子；也可來(lái)自通常與mpl配體相關(guān)的mpl配體序列，只要這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以作為一個(gè)SV40限制性片段而方便地得到，其中還含有SV40病毒的復(fù)制起始(Fiers等，Na-ture，273113；Mulligan和Berg，Science，2091422-1427；Pavlakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787398-7402)。巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子可以作為HindIIIE限制性片段方便地得到(Greenway等，Gene，18355-360)。以牛乳頭瘤病毒為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的一個(gè)系統(tǒng)的描述參見(jiàn)U.S.專利號(hào)4,419,446。U.S.專利號(hào)4,601,978則是該系統(tǒng)的一個(gè)改進(jìn)。其他還可參考Gray等，Nature，295503-508中關(guān)于在猿猴細(xì)胞中編碼免疫干擾素cDNA的表達(dá)；Reyes等，Na-ture，297598-601中關(guān)于在皰疹單顯性組合病毒胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下，人β-干擾素cDNA在鼠細(xì)胞中的表達(dá)；Canaani和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，795166-5170中關(guān)于人β1干擾素基因在培養(yǎng)的鼠和兔細(xì)胞中的表達(dá)；以及Gorman等，Proc.Natl.Sci.USA，796777-6781中關(guān)于以Rous肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列為啟動(dòng)子，細(xì)菌CAT序列在CV-1猿猴腎細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和鼠NIH-3T3細(xì)胞中的表達(dá)。
(v)增強(qiáng)子成份在本發(fā)明中，經(jīng)常通過(guò)在載體中插入一個(gè)增強(qiáng)子序列來(lái)增加較高等真核細(xì)胞中編碼mpl配體的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約100至300bp，作用于一個(gè)增加其轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。增強(qiáng)子的位置和方向相對(duì)獨(dú)立，在轉(zhuǎn)錄單位的5′端(Laimis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78993)和3′端(Lusky等，Mol.Cell Bio.，31108)都有發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)內(nèi)含子(Banerji等，Cell，33729)和它本身的編碼序列(Osborne等人，Mol.Cell Bio.，41293)之中也有發(fā)現(xiàn)。已知許多哺乳動(dòng)物基因的增強(qiáng)子序列(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒球蛋白和胰島素)。但是，通常使用的增強(qiáng)子來(lái)自真核細(xì)胞病毒。例如，在復(fù)制起點(diǎn)晚期基因一側(cè)的SV40增強(qiáng)子(100-270bp)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制起點(diǎn)晚期基因一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。參見(jiàn)Yaniv，Nature，29717-18中關(guān)于真核啟動(dòng)子活化的增強(qiáng)元件。增強(qiáng)子可以被拼接到位于mpl配體編碼序列5′端或3′端的載體中，但優(yōu)選的位點(diǎn)在啟動(dòng)子的5′端。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止成份真核宿主細(xì)胞(酵母菌、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或其他多細(xì)胞生物的含核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體也含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的序列。通常，這一序列來(lái)自5′端，偶爾來(lái)自真核細(xì)胞或病毒DNA或cDNA的3′端非翻譯區(qū)。這些區(qū)域含有在編碼mpl配體mRNA的非翻譯部分轉(zhuǎn)錄成多聚腺苷酸的核苷酸片段。
(vii)載體的構(gòu)建和分析通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)，構(gòu)建含有以上所列成份中一個(gè)或多個(gè)的適用載體。對(duì)分離的質(zhì)?；駾NA片段進(jìn)行切割、改編和再連接，以預(yù)想的形式生成所需的質(zhì)粒。
為分析確定構(gòu)建質(zhì)粒的正確序列，使用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株294(ATCC No.31,446)，根據(jù)情況以氨芐青霉素或四環(huán)素抗性來(lái)選擇成功的轉(zhuǎn)化體。用限制性內(nèi)切酶消化制備、分析轉(zhuǎn)化體中的質(zhì)粒和/或用Messing等，Nucleic Acids Res.，9309或Maxam等，Methods in Enzymology，65499中的方法測(cè)序。
(viii)瞬時(shí)表達(dá)載體在本發(fā)明的實(shí)施中特別有用的表達(dá)載體能提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編碼mpl配體多肽的DNA的瞬時(shí)表達(dá)。通常，瞬時(shí)表達(dá)要求使用一個(gè)能在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制的表達(dá)載體，其有效的復(fù)制使宿主細(xì)胞中積累表達(dá)載體的許多拷貝，由此高水平地合成由表達(dá)載體編碼的所需多肽。參見(jiàn)Sambrook等，同上，pp.16.17-16.22。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)由合適的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞組成，能方便地鑒定克隆DNA編碼的多肽并迅速地篩選該多肽以得到所需的生物和生理特性。因此，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在本發(fā)明中對(duì)于鑒定具有mpl配體多肽生物活性的mpl配體多肽的類似物和變異體特別有用。
(ix)合適的脊椎動(dòng)物細(xì)胞載體的例子在重組脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中，合成mpl配體的其他合適的方法、載體和宿主細(xì)胞參見(jiàn)Gething等，Nature，293620-625；Mantei等，Nature，28140-46；Levinson等，EP117,060和EP117,058。pRK5(EP307,247 U.S.專利號(hào)5,258,287)或pSVl6B(PCT出版號(hào)WO91/08291)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)mpl配體的特別有用的質(zhì)粒。D.宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化上文所述的原核細(xì)胞、酵母菌或高等真核細(xì)胞都是克隆或表達(dá)本文中載體的合適宿主細(xì)胞。合適的原核細(xì)胞包括真細(xì)菌如革蘭氏陽(yáng)性或陰性菌，例如大腸桿菌、枯草桿菌等桿菌、綠膿桿菌等假單胞菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌或粘質(zhì)沙雷氏桿菌。雖然其他的菌株如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC No.31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC No.27,325)也是合適的，但大腸桿菌294(ATCC No.31,446)是優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主。這些例子僅是用于說(shuō)明，并非表示合適的宿主細(xì)胞只限于這些。較好地，宿主細(xì)胞分泌蛋白水解酶的量最少。另外，體外克隆方法如PCR或其他核酸聚合酶反應(yīng)也是適用的。
除了原核細(xì)胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母菌，是mpl配體編碼載體合適的宿主。釀酒酵母或普通的面包酵母在低等真核宿主微生物中是最常用的。但是，通?？傻玫降囊幌盗衅渌鼘?、種和菌株可用于本文中，如非洲粟酒裂殖酵母菌(Beach和Nurse，Na-ture，290140)；1985年5月2日發(fā)表的EP139,383)、克魯維酵母菌屬宿主(U.S.專利號(hào)4,943,529)如K.lactis(Louven-court等，J.Bacteriol.，737)、K.fragilis、K.bulgaricus、K.耐熱菌和K.marxianus、yarrowia(EP402,226)、Pichia pastoris(EP183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278)、白色絲酵母、Trichoderma reesia(木霉菌屬)(EP244,234)、鏈孢霉crassa(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263)和絲狀真菌如鏈孢酶屬、青霉屬、Tolypocladi-um(1991年1月10日出版的WO91/00357)和曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284-289；tilburn等，Gene，26205-221；Yelton等，Proc.Sci.USA，811470-1474)和黑曲霉(Kelly和Hynes，EMBO J.，4475-479)。表達(dá)糖基化mpl配體的適合宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。這類宿主細(xì)胞能完成復(fù)雜的加工并具糖基化活性。原則上，無(wú)論是來(lái)自脊椎動(dòng)物還是無(wú)脊椎動(dòng)物培養(yǎng)物，任何高等真核細(xì)胞培養(yǎng)物是可用的。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子有植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已經(jīng)鑒定到了大量的桿狀病毒株和變異體及相應(yīng)的昆蟲(chóng)允許宿主細(xì)胞，如草地夜蛾(毛蟲(chóng))、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黃果蠅(果蠅)和家蠶。參見(jiàn)Luckow等，Bio/Technology，647-55；Miller等，Genetic Engineering，Setlow等編輯，Vol.8(Plenum出版，1986)，pp277-279和Maeda等，Na-ture，315592-594。可以從公共途徑獲得許多用于轉(zhuǎn)染的病毒株，如苜蓿銀紋夜蛾NPV的L-1變異體和家蠶NPV的Bm-5株系，這些病毒可以被本發(fā)明所使用，尤其是對(duì)于草地夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
棉花、玉米、土豆、大豆、牽?；?、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物能被用作宿主。通常，植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染通過(guò)與根瘤土壤桿菌一起溫育，其中，后者已經(jīng)過(guò)操作而含有mpl配體DNA。通過(guò)植物細(xì)胞與根瘤土壤桿菌一起的溫育，編碼mpl配體的DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞宿主中使之受轉(zhuǎn)染，并在合適的條件下表達(dá)mpl配體DNA。另外，可得到與植物細(xì)胞相容的調(diào)節(jié)和信號(hào)序列，如胭脂堿合成酶啟動(dòng)子和多聚腺苷酸信號(hào)序列。參見(jiàn)Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.，1561。另外，從T-DNA780基因上游區(qū)域分離的DNA片段能激活或增加含重組DNA的植物組織中植物可表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄水平。參見(jiàn)1989年6月21日出版的EP321,196。
但是，最令人感興趣的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。近年來(lái)，脊椎動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)基(組織培養(yǎng)物)中的增殖已經(jīng)成為一種常規(guī)操作(TissueCulture，Academic Press，Kruse和Patterson，editors)。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系有SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(生長(zhǎng)于懸浮培養(yǎng)物的293或293亞克隆細(xì)胞，參見(jiàn)Graham等，J.Gen virol.，3659)；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774261)；鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251)；猴腎細(xì)胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人喉癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細(xì)胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W1 38，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；鼠乳汁腫瘤(MMT 060562，ATCCCCL51)；TRI細(xì)胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)。
用上述本發(fā)明的表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染、最好是轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并配合誘導(dǎo)性啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。無(wú)論實(shí)際上是否有編碼序列表達(dá)，轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞取得一個(gè)表達(dá)載體。對(duì)于熟練的技術(shù)員來(lái)說(shuō)，有大量轉(zhuǎn)染的方法是已知的，如磷酸鈣和電穿孔法。通常，在宿主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該載體作用的任何跡象時(shí)，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。
轉(zhuǎn)化表示將DNA引入一種生物，使該DNA能夠以染色體外成份或染色體整合形式進(jìn)行復(fù)制。根據(jù)被使用的宿主細(xì)胞，運(yùn)用適合該細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)完成轉(zhuǎn)化。如Sambrook等，同上1.82部分所述，通常以氯化鈣對(duì)原核細(xì)胞和其他有細(xì)胞壁的細(xì)胞進(jìn)行鈣處理。某些植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通過(guò)根瘤土壤桿菌進(jìn)行傳染，參見(jiàn)shaw等，Gene，23315和1989年6月29日出版的WO89/05859。另外，也可用超聲處理轉(zhuǎn)染植物。參見(jiàn)1991年1月10日出版的WO91/00358。對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使用Graham和van derEb在Virology，52456-457中的磷酸鈣沉淀方法較好。Axel在1983年8月16日頒布的U.S.專利號(hào)4,399,216中敘述了哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般情況。進(jìn)行酵母菌轉(zhuǎn)化的通常方法參見(jiàn)Van Solingen等，J.Bact.，130946和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829。但是，也可用其他方法將DNA引入細(xì)胞，如核酸注射、電穿孔法或原生質(zhì)融合。E.宿主細(xì)胞的培養(yǎng)如Sambrook等，(同上)的概述，本發(fā)明中用來(lái)產(chǎn)生mpl配體多肽的原核細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
本發(fā)明中用來(lái)產(chǎn)生mpl配體多肽的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商購(gòu)的培養(yǎng)基如Ham′s F10(sigma公司)、基本必需培養(yǎng)基([MEM]sigma公司)、RPMI-1640(sigma公司)和Dul-beccos改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)基([MEM]sigma公司)都適合宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。另外，下列文獻(xiàn)中所述的任何培養(yǎng)基可被用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Ham和Wallace，Meth.Enz.，5844，Barnes和Sato.Anal.Biochem.，102255，美國(guó)專利號(hào)4,767,704；4,657,866；4,927,762或4,560,655；WO90/03430；WO87/00195；美國(guó)專利Re.30,985或1990年10月3日同時(shí)歸檔的copending U.S.S.N.07/592,107或07/592,141，所有的文件在此一并作為參考。根據(jù)需要可以在這些培養(yǎng)基的任何一個(gè)中補(bǔ)充激素和/或其他生長(zhǎng)因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如藥物慶大霉素)、微量元素(通常終濃度在微摩爾水平的無(wú)機(jī)物)和葡萄糖或相當(dāng)?shù)哪茉?。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，還可加入適當(dāng)濃度的其他任何必需補(bǔ)充物。溫度、pH值之類的培養(yǎng)條件與先前用于選擇表達(dá)宿主細(xì)胞的那些條件相同，這對(duì)一般的熟練技術(shù)人員也是很明顯的。
宿主細(xì)胞包括體外培養(yǎng)的細(xì)胞和宿主動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞F.檢測(cè)基因擴(kuò)增/表達(dá)在一個(gè)樣品中，基因擴(kuò)增和/或表達(dá)的測(cè)量可直接通過(guò)下列方法定量mRNA轉(zhuǎn)錄的常規(guī)Southern印跡和Northern印跡法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205)，斑點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交，并根據(jù)提供的序列使用合適的標(biāo)記探針。有許多標(biāo)記可以被使用，大多數(shù)是放射性同位素，尤其是32P。但是，也可運(yùn)用其他技術(shù)，如將生物素修飾的核苷酸引入多聚核苷酸。然后，將生物素作為結(jié)合抗生物素蛋白或抗體的位點(diǎn)，后者可被許多種標(biāo)記所標(biāo)記，如放射性核素、熒光劑、酶或其他類似物?；蛘撸墒褂媚茏R(shí)別特定雙鏈體的抗體，包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。反過(guò)來(lái)，可對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，并在雙鏈體與表面結(jié)合處進(jìn)行分析，當(dāng)在表面上形成雙鏈體時(shí)，可以檢測(cè)到與雙鏈體結(jié)合的抗體。
基因的表達(dá)也可用免疫方法測(cè)量，如用組織切片的免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的分析來(lái)直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)。在免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，一般以脫水和固定方法制備細(xì)胞樣品，接著與特異于偶聯(lián)基因產(chǎn)物的標(biāo)記抗體在通常能檢測(cè)到標(biāo)記的位置發(fā)生反應(yīng)，使用的標(biāo)記如酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記和類似物。適用于本發(fā)明的一個(gè)特別敏感的染色技術(shù)見(jiàn)于Hsu等，Am.J.Clin.Path.，75734-738。
可用于免疫組織化學(xué)染色和/或樣品液體分析的抗體可以是單克隆或多克隆，可以在任何哺乳動(dòng)物中制備。通常，抗體的制備通過(guò)針對(duì)天然mpl配體多肽或合成肽，其中，后者根據(jù)本文中提供的DNA序列而合成，進(jìn)一步的敘述見(jiàn)下文。G.mpl配體多肽的純化雖然在沒(méi)有分泌信號(hào)而直接表達(dá)時(shí)，也能從宿主細(xì)胞裂解物中回收mpl配體，但最好還是以分泌多肽的形式從培養(yǎng)基中回收。
當(dāng)mpl配體在非人源的重組細(xì)胞中被表達(dá)時(shí)，該mpl配體中完全不含人源蛋白質(zhì)或多肽。但是，仍然有必要從其他重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中純化mpl配體，以得到與mpl配體本身基本同源的制備物。第一步，離心培養(yǎng)物或裂解物以除去微小的細(xì)胞碎片。然后，分離膜和可溶蛋白質(zhì)部分。或者，可使用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾膜(如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)。于是，根據(jù)mpl配體是否與膜結(jié)合，可以從培養(yǎng)裂解物的可溶蛋白質(zhì)部分和膜部分中提純到mpl配體。隨后，通過(guò)鹽析和使用多種凝膠基質(zhì)的交換或色譜法程序，把mpl配體從雜質(zhì)可溶蛋白質(zhì)和多肽中提純出來(lái)。這些基質(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和其他在蛋白質(zhì)純化中常用的物質(zhì)。適用于蛋白質(zhì)純化的典型色譜法程序包括免疫親和(如抗hmpl配體Mab)、受體親和(如mpl-IgG或蛋白A Sepharose)、疏水性相互作用色譜(HIC)(如乙醚、丁基或苯基Toyopearl)、植物凝集素色譜法(如伴刀豆球蛋白A Sepharose和小扁豆植物凝集素Sepharose)、大小排阻(如Sephadex G-75)、陽(yáng)離子和陰離子交換柱(如DEAE或羧甲基和磺丙基纖維素)以及反相高效液相色譜(RP-HPLC)(如參見(jiàn)Urdal等，J.Chromatog.，296171中所述，用兩個(gè)連續(xù)的RP-HPLC步驟純化重組的人IL-2)。其他可選用的純化步驟包括乙醇沉淀、硫酸銨沉淀、色譜聚焦法、制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和其他類似方法。
考慮到發(fā)生的任何性質(zhì)上的基本變化，有殘基缺失、插入和置換的mpl配體變異體可用與天然mpl配體同樣的方法回收。例如，一個(gè)mpl配體與另一個(gè)蛋白質(zhì)或多肽如細(xì)菌或病毒抗原的融合體制備能促進(jìn)純化；可用一個(gè)免疫親和柱吸附融合多肽，柱中含有對(duì)應(yīng)該抗原的抗體。通過(guò)至少在一個(gè)剩余的免疫表位的結(jié)合，兔多克隆抗mpl配體柱等免疫親和柱可用以吸附mpl配體變異體?；蛘?，可用親和色譜純化mpl配體，其中使用與固定化(優(yōu)選)的Affi-Gel 10(Bio-Rad，Richmond，CA)或類似樹(shù)脂偶聯(lián)的純化的mpl-IgG，該方法已經(jīng)被廣為使用。苯甲基硫酸氟(PMSF)等蛋白酶抑制劑可在純化過(guò)程中用于抑制蛋白酶解的降解作用，并且可加入抗生素來(lái)防止意外污染物的生長(zhǎng)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，適合天然mpl配體的純化方法也許需要修改以適應(yīng)重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)的，mpl配體及其變異體性質(zhì)的變化。H.mpl配體多肽的共價(jià)修飾本發(fā)明范疇中包括了mpl配體多肽的共價(jià)修飾。天然的mpl配體和mpl配體的氨基酸序列變異體都能被共價(jià)修飾。mpl配體片段是本發(fā)明范疇中共價(jià)修飾的一種類型。氨基酸殘基多達(dá)約40個(gè)的變異mpl配體多肽片段能夠方便地制備，其方法有化學(xué)合成或者酶法或化學(xué)切割全長(zhǎng)或變異mpl配體多肽。通過(guò)mpl配體及其片段的靶氨基酸殘基與一種有機(jī)衍生劑的反應(yīng)，將其他類型的mpl配體及其片段的共價(jià)修飾引入分子，該試劑能與選擇的側(cè)鏈或N-或C-末端的殘基反應(yīng)。
半胱氨酰殘基通常與α鹵代乙酸(和相應(yīng)的胺)如氯代乙酸或氯代乙酰胺反應(yīng)，以獲得羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰殘基的衍生來(lái)自與下列物質(zhì)的反應(yīng)，溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-imidozoyl-)丙酸、磷酸氯乙酰、N-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對(duì)-氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯-2-oxa-1，3-二唑。
組氨酰殘基的衍生通過(guò)在pH5.5-7.0時(shí)與焦磷酸二乙酯的反應(yīng)，因?yàn)樵撛噭?duì)組氨酰側(cè)鏈有相對(duì)的特異性。也可用對(duì)溴苯酰甲基溴化物；優(yōu)選的反應(yīng)條件為pH6.0時(shí)0.1M的卡夫基酸鈉。
賴胺酰和氨基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸的酸酐反應(yīng)。使用這些試劑進(jìn)行的衍生作用可起反轉(zhuǎn)賴胺酰殘基電荷的效應(yīng)。其他適用于含氨基殘基的衍生試劑有亞氨酸酯如亞基picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮和含乙醛酸鹽的轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)。
精胺酰殘基的修飾通過(guò)與一個(gè)或幾個(gè)常規(guī)試劑的反應(yīng)，如苯基乙醛酰、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。由于胍功能基團(tuán)的高pKa值，精氨酸殘基的衍生需要在反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行。另外，這些試劑還可以與賴氨酸的基團(tuán)和精氨酸的ε氨基反應(yīng)。
酪氨酰殘基的特異性修飾通過(guò)與芳香族的重氮化合物或四硝基甲烷的反應(yīng)，其主要的目的在于將特殊的標(biāo)記引入到絡(luò)氨酰殘基。在大多數(shù)情況下，使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷相應(yīng)地得到O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。用125I或131I碘化酪氨酰殘基以制備用于放射免疫測(cè)定的標(biāo)記蛋白質(zhì)，如上所述的氯胺T方法適用于該操作。
天冬氨酰和谷氨酰的羧基側(cè)基通過(guò)與碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R′)的反應(yīng)有選擇地修飾，其中，R和R′是不同的烷基，如1-環(huán)乙基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽(yáng)離子-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺。另外，通過(guò)與銨離子的反應(yīng)，天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。
用雙功能試劑進(jìn)行的衍生可用于將mpl配體交聯(lián)到抗mpl配體抗體純化方法中使用的水不溶性支持介質(zhì)或表面上。反過(guò)來(lái)也是這樣。常用的交聯(lián)劑包括1，1-二(重氮乙基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯如4-疊氮水楊酸酯、同源雙功能亞胺酯包括雙琥珀酰亞胺酯如3，3′-二硫代bis(琥珀酰亞胺丙酸)、以及雙功能的馬來(lái)酰亞胺如二-N-馬來(lái)酰亞胺基-1，8-辛烷。衍生試劑如甲基-3-[(p-疊氮苯基)二硫代]propioimidate產(chǎn)生能在光照下形成交聯(lián)的光敏中間物。或者，反應(yīng)的不溶于水的介質(zhì)如溴化氰激活的碳水化合物和反應(yīng)的底物如美國(guó)專利號(hào)3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中所述，可用于蛋白質(zhì)的固定。
天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基經(jīng)常脫氨而成為相應(yīng)的天冬氨酰和谷氨酰殘基。這些殘基的脫氨是在中性或堿性條件下進(jìn)行。這些殘基的脫氨形式在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。
其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨酰或蘇氨酰殘基羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86)，N-末端氨基的乙?；腿魏蜟-末端羧基的酰胺化。
改變多肽的天然糖基化形式是本發(fā)明范疇中另一個(gè)類型的mpl配體多肽共價(jià)修飾。這里的變化指除去一個(gè)或多個(gè)天然mpl配體的糖類部分和/或加入一個(gè)或多個(gè)天然mpl配體中沒(méi)有的糖基化位點(diǎn)。
多肽的糖基化通常是N-結(jié)合或O-結(jié)合。N-結(jié)合指糖類部分與一個(gè)天冬酰胺殘基側(cè)鏈的連接。糖類部分與天冬酰胺側(cè)鏈的酶催化的結(jié)合識(shí)別序列為三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X表示除脯氨酸以外的任何氨基酸。因此，當(dāng)多肽中出現(xiàn)這些三肽序列中的一個(gè)時(shí)，同時(shí)也就形成了一個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。O結(jié)合的糖基化指糖與羥氨基酸的結(jié)合，其中，前者如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖，后者一般為絲氨酸或蘇氨酸，5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可用。
在mpl配體多肽中加入糖基化位點(diǎn)一般是通過(guò)改變氨基酸序列，使之含有一個(gè)或多個(gè)上述的的三肽序列(對(duì)于N-結(jié)合的糖基化位點(diǎn))。這種改變也可以通過(guò)在天然mpl配體序列中加入或置換入一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基(對(duì)于O-結(jié)合的糖基化位點(diǎn))。為了方便一些，最好通過(guò)DNA水平的變化來(lái)改變mpl配體氨基酸序列，尤其是通過(guò)使編碼mpl配體多肽的DNA在預(yù)選的堿基發(fā)生突變而得到能翻譯出所需氨基酸的密碼子。DNA突變的方法可以根據(jù)上述標(biāo)題為“mpl配體的氨基酸序列變異體”的內(nèi)容進(jìn)行。
在mpl配體中增加糖類部分?jǐn)?shù)量的另一個(gè)方法是通過(guò)化學(xué)或酶法使糖基與多肽偶聯(lián)。這些程序的優(yōu)點(diǎn)在于它們不要求在一個(gè)對(duì)N-或O-結(jié)合糖基化有能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽。根據(jù)偶聯(lián)的形式，糖類可以被連接于(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離的羧基，(c)游離的巰基如半胱氨酸的巰基，(d)游離的羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基，(e)芳香族殘基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族殘基，或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法可參見(jiàn)1987年9月11日出版的WO87/05330和in Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306。
可以用化學(xué)或酶法除去mpl配體多肽中的糖類部分?；瘜W(xué)的去糖基化需要將多肽置于三氟甲烷磺酸或類似的化合物。這種處理將導(dǎo)致除結(jié)合糖類(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多數(shù)或全部糖類斷裂，但對(duì)多肽鏈沒(méi)有影響。化學(xué)去糖基化的方法可參見(jiàn)Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophy.，25952和Edge等，Anal.Biochem.，118131。多肽中糖類部分的酶法斷裂可使用多種內(nèi)源或外源糖苷酶，參見(jiàn)Thotakura等，Meth.enzy-mol.，138350。
可以用化合物衣霉素來(lái)防止?jié)撛谔腔稽c(diǎn)的糖基化，參見(jiàn)Buskin等，J.Biol.Chem.，2573105。衣霉素能阻止蛋白質(zhì)-N-糖苷鍵的形成。
mpl配體共價(jià)修飾的另一種類型是通過(guò)將mpl配體多肽與多種非蛋白質(zhì)多聚體中的一個(gè)相連，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧烷，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337。與上述多聚體共價(jià)連接的mpl配體多肽被稱作聚合化的mpl配體多肽。
在優(yōu)選情況下，需要對(duì)回收的mpl配體進(jìn)行一些篩選來(lái)選擇出最佳的變異體，用以與mpl結(jié)合并具有上述的免疫和/或生物活性?？梢詫?duì)下列特性進(jìn)行篩選在重組細(xì)胞培養(yǎng)物或血漿中的穩(wěn)定性(如對(duì)抗蛋白酶解的斷裂作用)、對(duì)于一個(gè)mpl成員的高親和性，氧化穩(wěn)定性，以提高的產(chǎn)量被分泌的能力和其他類似的特性。例如，mpl配體多肽中免疫性質(zhì)的某個(gè)變化，如對(duì)指定抗體的親和性，由競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析來(lái)測(cè)量。蛋白質(zhì)或多肽性質(zhì)的其他潛在變化如氧化還原或熱穩(wěn)定性、疏水性或?qū)Φ鞍酌附饨到庾饔玫拿舾行?，都可以用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)分析。17.制備mpl配體的抗體的一般方法抗體制備(i)多克隆抗體mpl配體多肽或片段的多克隆抗體的制備通常是將mpl配體和一個(gè)佐劑多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射到某個(gè)動(dòng)物體內(nèi)。很有用地是將含有靶氨基酸序列的mpl配體或一個(gè)片段共軛于在被免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)，如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。連接需使用一種雙功能或衍生試劑，如順丁烯二酰亞胺苯甲酰磺基琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基共軛結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、glytaralde-hyde、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
由mpl配體多肽或片段、具有免疫原性的共軛物或衍生物來(lái)免疫動(dòng)物，是通過(guò)將1毫克或1微克的肽或共軛物(對(duì)應(yīng)于兔或鼠)與3倍體積的Freund′s完全佐劑混合并將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位。一個(gè)月以后，將原來(lái)量的1/5到1/10肽或共軛物與Freund′s完全佐劑混合在多個(gè)部位皮下注射以加強(qiáng)免疫。7至14天后，將動(dòng)物放血并分析血清中mpl配體抗體的效價(jià)。繼續(xù)加強(qiáng)免疫直至效價(jià)曲線到達(dá)平臺(tái)區(qū)。優(yōu)選地，使用相同mpl配體的共軛物加強(qiáng)免疫，但可共軛于一種不同的蛋白質(zhì)并/或通過(guò)一個(gè)種同的交聯(lián)試劑。共軛物也可以作為蛋白質(zhì)融合體在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制成。另外，明礬等聚集劑可用以提高免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體單克隆可以來(lái)自一個(gè)基本同源抗體的群落，即除了可能存在的出現(xiàn)概率極小的自發(fā)突變體外，構(gòu)成群落的每個(gè)抗體都是相同的。因此，修飾詞“單克隆”是指抗體的特性，并非指獨(dú)立抗體的混合物。
例如，本發(fā)明中mpl配體單克隆抗體的制備可用雜交瘤方法或重組DNA方法，前者由Kohler和Milstein，Nature，256495首先描述，后者參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,816,567(Cabilly等)。
在雜交瘤方法中，用上述方法免疫一個(gè)鼠或其他合適的宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠，以引出淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生的抗體可以與用作免疫的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合?；蛘撸稍隗w外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用一種合適的融合劑如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞融合到骨髓瘤細(xì)胞中形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinci-ples and Practice，pp.59-103[Academic Press，1986])。
將這樣制備好的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種并生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中最好含有能抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的一種或幾種物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺少次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，通常就可以使雜交瘤培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT培養(yǎng)基)，從而基本抑制了HGPRT缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是能有效地融合、支持選出的抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平表達(dá)抗體和對(duì)HAT等培養(yǎng)基敏感。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如來(lái)自Salk Institute Cell Distri-bution Center，San Diego，California USA的MOPC-21和MPC-11鼠腫瘤細(xì)胞和來(lái)自American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA的SP-2細(xì)胞。也有記載將人骨髓瘤和鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J.Im-munol.，1333001；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Application，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，New York，1987)。
對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行分析，以確定直接對(duì)應(yīng)mpl配體的單克隆抗體的產(chǎn)量。在優(yōu)選情況下，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性由免疫沉淀法或離體結(jié)合分析如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，來(lái)決定。
單克隆抗體的結(jié)合親和性可用例如Scatchard analysis ofMunson&Pollard，Anal.biochem.，107220中所述的方法來(lái)決定。
在確定了雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生具有所需的特異性、親和性和/或活性的抗體后，可通過(guò)極限稀釋程序?qū)⒖寺喛寺』⒁詷?biāo)準(zhǔn)方法使之生長(zhǎng)(Goding，同上)。能達(dá)到這個(gè)目的合適的培養(yǎng)基包括Dulbec-co′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物體內(nèi)以腹水腫瘤的形式生長(zhǎng)。
將亞克隆分泌的單克隆抗體適當(dāng)?shù)嘏c培養(yǎng)基、腹水或血清分離，分離采用常規(guī)的免疫球蛋白純化程序如蛋白A Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
使用常規(guī)程序可以方便地分離并測(cè)序本發(fā)明的編碼單克隆抗體的DNA(如通過(guò)使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞是作為這種DNA的一個(gè)優(yōu)選來(lái)源。一旦被分離，DNA可被置入到表達(dá)載體中，然后隨載體一起轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞如猴腎COS細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不再產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以獲得重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成。還可對(duì)DNA進(jìn)行修飾，如以鼠的同源序列置換編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列(Cabilly等，同上；Morrison等Proc.Nat.Acad.Sci.，816851)或?qū)⑺谢虿糠址敲庖咔虻鞍锥嚯逆湹木幋a序列共價(jià)結(jié)合于免疫球蛋白的編碼序列。
通常，這樣的非免疫球蛋白多肽鏈被用來(lái)置換本發(fā)明的一種抗體的恒定區(qū)，或者，被用來(lái)置換本發(fā)明的一種抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以形成一個(gè)嵌合雙價(jià)抗體，其中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于mpl配體，另一個(gè)則特異于不同的抗原。
嵌合或雜交抗體也可在體外制備，使用已知的蛋白質(zhì)合成化學(xué)方法，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可使用二硫鍵交換反應(yīng)或通過(guò)形成一個(gè)硫酯鍵來(lái)構(gòu)建一個(gè)免疫毒素。為達(dá)到這個(gè)目的所需的合適的試劑包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-mercaptobutyrimidate。
由于診斷的需要，本發(fā)明的抗體通常用一個(gè)可測(cè)部分作標(biāo)記。對(duì)該可測(cè)部分的唯一要求是能夠直接或間接生成一個(gè)可測(cè)信號(hào)。例如，該可測(cè)部分可以是一個(gè)放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I，一個(gè)熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，如熒光素異硫氰酸鹽、若丹明或蟲(chóng)熒光素，放射性同位素標(biāo)記，如125I、32P、14C或3H，或者某種酶，如堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或辣根過(guò)氧化物酶。
本領(lǐng)域任何已知的可將抗體單個(gè)地共軛于可測(cè)部分的方法都可使用，包括下列文獻(xiàn)中所述的方法Hunter等，Nature，144945；David等，Biochemistry，131014；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219和Nygren，J.Hisrochem.andCytochem.，30407。
本發(fā)明的抗體可用于任何已知的分析方法，如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析、直接或間接夾層分析和免疫沉淀分析。參見(jiàn)Zola，Monoclonal Anti-bodiesA Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987)。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析是依據(jù)一個(gè)被標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物(可以是mpl配體或其免疫反應(yīng)部分)與實(shí)驗(yàn)樣品被分析物(mpl配體)競(jìng)爭(zhēng)與有限數(shù)量的抗體結(jié)合的能力。實(shí)驗(yàn)樣品中mpl配體的量與結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了更快決定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，通常要在競(jìng)爭(zhēng)之前或之后固化抗體，從而能夠方便地將結(jié)合抗體的標(biāo)準(zhǔn)物和被分析物從游離的標(biāo)準(zhǔn)物和被分析物中分離出來(lái)。
夾層分析涉及兩個(gè)抗體的使用，每個(gè)抗體都能結(jié)合至待測(cè)蛋白質(zhì)(mpl配體)的不同致免疫部位，即抗原決定部位。在夾層分析中，實(shí)驗(yàn)樣品被分析物結(jié)合到固定于一個(gè)固體支持物的第一個(gè)抗體，隨后，第二個(gè)抗體結(jié)合于被分析物，于是就形成了一個(gè)不溶性三元復(fù)合物。參見(jiàn)David和Greene，美國(guó)專利號(hào)4,376,110。第二個(gè)抗體可以本身可測(cè)部分標(biāo)記(直接夾層分析)或以被可測(cè)部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體來(lái)測(cè)定(間接夾層分析)。例如，ELISA分析是夾層分析的一種類型，其中的可測(cè)部分是一種酶(如辣根過(guò)氧化物酶)。(iii)人源化抗體和人抗體人源化非人體抗體的方法是本領(lǐng)域中廣為人知的。通常，一個(gè)人原化抗體中有引入的一個(gè)或多個(gè)非人源來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人源的氨基酸殘基經(jīng)常被稱作“輸入”殘基，一般來(lái)自一個(gè)“輸入”可區(qū)。人源化過(guò)程的基本操作根據(jù)Winter及其合作者的方法(Jones等，Nature，321522-525；Riechmann等，Nature，332323-327；Verhoeyen等，Science，2391534-1536)，以鼠CDRs或CDR序列置換相應(yīng)的人抗體序列。于是，這種“人源化”抗體屬于嵌合抗體(Cabilly等，同上)，其中，少于一個(gè)完整人可變區(qū)的序列被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所置換。實(shí)際上，人源化抗體一般是人抗體的一些CDR殘基和可能的一些FR殘基被來(lái)自鼠抗體中類似位點(diǎn)的殘基置換。
為減少抗原性，對(duì)用于制備人源化抗體重鏈和輕鏈的人可變區(qū)的選擇是非常重要的。根據(jù)所謂的“最適”方法，對(duì)已知的人可變區(qū)序列的完整文庫(kù)篩選鼠抗體可變區(qū)的序列。于是，與鼠序列最接近的人序列被當(dāng)作了人源化抗體的骨架(FR)(Sims等，J.Immunol.，1512296；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196901)。另一個(gè)方法使用一個(gè)特殊的骨架，該骨架來(lái)自所有人抗體的共有序列，是重鏈或輕鏈的一個(gè)特殊亞型。相同的骨架可用于幾個(gè)不同的人源化抗體(Carter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等，J.Immnol.，1512623)。
更重要的是，人源化的抗體應(yīng)保留對(duì)抗原的高親和性和其他優(yōu)化的生物特性。為了達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選方法，人源化抗體的制備通過(guò)用親代和人源化序列的三維模型分析親代序列和多種概念性的人源化產(chǎn)物。三維免疫球蛋白模型是很常見(jiàn)的，并且對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很熟悉的。可以獲得計(jì)算機(jī)程序來(lái)顯示選出的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。通過(guò)檢查這些顯示內(nèi)容就可以對(duì)殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用進(jìn)行分析，即對(duì)殘基對(duì)候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的影響進(jìn)行分析。通過(guò)這個(gè)方法，可以從共有和輸入序列中選出FR殘基，以得到所需的抗體特性，如增加對(duì)靶抗原的親和性。通常，CDR殘基直接和在大多數(shù)時(shí)候基本上影響抗原結(jié)合。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見(jiàn)1992年8月21日歸檔的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)07/934,373，而該文件部分延續(xù)了1991年7月14日歸檔的申請(qǐng)系列號(hào)07/715,272。
或者，現(xiàn)在已經(jīng)能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如鼠)，能在免疫接種后，在缺少內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)物時(shí)，生成一個(gè)人抗體的完整庫(kù)。例如，已經(jīng)有這樣的描述，在嵌合和種系突變鼠中的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在這種種系突變型鼠中，人種系免疫球蛋白基因排列的轉(zhuǎn)入將根據(jù)抗原的攻擊導(dǎo)致產(chǎn)生人抗體。參見(jiàn)Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551-255；Jakobovits等，Natjuer，362255-258；Bruggermann等，Year in Immune.，733。人抗體也可以在噬菌體顯示文庫(kù)中生成(Hoogenboom和Winter，J.Mol.biol.227,381；Marks等，J.Mol.Biol.222,581)。(iv)雙重特異性抗體雙重特異性抗體是單克隆的，最好是人或人源化的抗體，對(duì)至少兩個(gè)不同的抗原有結(jié)合特異性。本領(lǐng)域已知制備雙重特異性抗體的方法。
傳統(tǒng)上，雙重特異性抗體的重組產(chǎn)物是基于兩個(gè)免疫球蛋白重-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中，兩個(gè)重鏈有不同的特異性(Millstein和Cuello，Nature，305537-539)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)組合，這些雜交瘤(四聯(lián)瘤)產(chǎn)生一個(gè)有10個(gè)不同抗體分子的潛在混合物，但其中只有一個(gè)有正確的雙重特異性結(jié)構(gòu)。一般通過(guò)親和色譜步驟來(lái)純化該正確的分子，但純化過(guò)程相當(dāng)笨重，且得率低。類似的程序參見(jiàn)PCT出版號(hào)WO93/08829(1993年5月13日出版)和Traunecker等，EMBO，103655-3659。
依照一個(gè)不同的但更好的方法，將帶有所需結(jié)合特異性的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合的部位最好是免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)，其中至少含有部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。最好使含有輕鏈結(jié)合所需的位點(diǎn)的第一個(gè)重鏈恒定區(qū)在至少一個(gè)融合體中出現(xiàn)。編碼免疫球蛋白重鏈融合體以及(如有需要)免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到獨(dú)立的表達(dá)載體并被共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物中。這樣，就提供了在對(duì)各例子中三條多肽鏈相互比例的調(diào)節(jié)上具有很大的彈性，而結(jié)構(gòu)中這三條多肽鏈的不相等比例能獲得最佳的產(chǎn)量。但是，當(dāng)至少兩條相等比例的多肽鏈的表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量或當(dāng)比例不是特別重要時(shí)，就有可能將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。在本方法的一個(gè)優(yōu)選例子中，雙重特異性抗體的構(gòu)成為，在一條臂上有具備第一個(gè)結(jié)合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈和在另一條臂上有一個(gè)雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供了第二個(gè)結(jié)合特異性)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)促進(jìn)了所需的雙重特異性成份從不需要的免疫球蛋白復(fù)合鏈上分離下來(lái)，如同只有一半雙重特異性分子上有一條免疫球蛋白輕鏈時(shí)，分離更容易一些。本方法參見(jiàn)1992年8月17日歸檔的copending申請(qǐng)序列號(hào)07/931,811。
生成雙重特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見(jiàn)Suresh等，Methodsin Enzymology，121210等。(v)異源共軛抗體異源共軛抗體也屬于本發(fā)明范疇之內(nèi)。異源共軛抗體由兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體構(gòu)成。例如這種抗體的作用使免疫系統(tǒng)細(xì)胞針對(duì)不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利號(hào)4,676,980)和治療HIV感染(PCT出版號(hào)WO91/00360和WO92/00373；EP03089)。異源共軛抗體可使用傳統(tǒng)的交聯(lián)方法來(lái)制成。合適的交聯(lián)試劑在本領(lǐng)域廣為人知，可參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,676,980，其中還包括有一系列交聯(lián)技術(shù)。IV.巨核細(xì)胞生成蛋白mpl配體在治療上的應(yīng)用有造血效應(yīng)子功能和在這里被稱為巨核細(xì)胞生成或血小板生成蛋白(TPO)的生物活性mpl配體可用于無(wú)菌的藥物制備配方，以促進(jìn)病人的巨核細(xì)胞生成和血小板生成活性，該種病人為由血小板生成受損、隔離或破壞增加引起的血小板減少。本發(fā)明的合成物可有效地治療血小板減少相關(guān)的骨髓發(fā)育不全(如化學(xué)治療或骨髓移植后的發(fā)育不全貧血)以及各種病癥如彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、免疫性血小板減少(包括HIV誘導(dǎo)的或非HIV誘導(dǎo)的ITP)、慢性特發(fā)性血小板減少、先天性血小板減少、骨髓發(fā)育不良和血栓血小板減少。另外，這些巨核細(xì)胞生成蛋白也可用于治療骨髓增生性血小板疾病以及炎癥條件和缺鐵血小板情況下的。
本發(fā)明的巨核細(xì)胞生成和血小板生成蛋白(TPO)的優(yōu)選用途在于用于白血病或?qū)嶓w瘤的骨髓毒化學(xué)治療、用于自體或同種異體骨髓移植的化學(xué)治療、骨髓發(fā)育不全、特發(fā)性發(fā)育不全貧血、先天性血小板減少和免疫性血小板減少。
本發(fā)明的巨核細(xì)胞生成蛋白還能用于一些其他疾病的治療，如藥物、中毒或人工表面活化引起的血小板缺陷或破壞。在這些情況下，迫切需要一種化合物能促進(jìn)新的“未破壞”血小板的“流出”。一個(gè)有效應(yīng)用的更完整的表參見(jiàn)“背景”(同上)，尤其是(a)至(f)部分以及本文提及的參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的巨核細(xì)胞生成蛋白用于治療上述疾病或狀況時(shí)，可單獨(dú)使用，也可與其他的細(xì)胞因子、紅細(xì)胞生成素、白細(xì)胞介素、生長(zhǎng)因子或抗體結(jié)合使用。因此，該迫切需要的化合物可與其他有血小板生成活性的蛋白質(zhì)或肽結(jié)合使用，如G-CSF、GM-CSF、LIF、M-CSF、IL-1、IL-3、紅細(xì)胞生成素(EPO)、成套配體、IL-6和IL-11。
本發(fā)明的巨核細(xì)胞生成蛋白的制備在一個(gè)含有藥學(xué)上可接受的載體的混合物中進(jìn)行。治療組合物的給藥通過(guò)靜脈注射或經(jīng)過(guò)鼻或肺。根據(jù)需要，這些組合物還可胃腸外或皮下給藥。當(dāng)系統(tǒng)地給藥時(shí)，治療組合物應(yīng)該不含熱原，并處在pH、等滲性和穩(wěn)定性都合適的胃腸外可接受溶液中。這些條件是本領(lǐng)域已知的。簡(jiǎn)而言之，制備本發(fā)明的化合物的劑量配方后，將有所需純度的化合物與生理上可接受的載體、賦行劑或穩(wěn)定劑混合地儲(chǔ)存或給藥。在使用的劑量和濃度方面，這些物質(zhì)對(duì)于受體是無(wú)毒的，這些物質(zhì)中還包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其他有機(jī)酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(約少于10個(gè)殘基)肽如聚精氨酸，蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；疏水性多聚物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二糖和其他糖類如纖維素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖；平衡離子如鈉和/或非離子表面活性劑如吐溫、普魯蘭尼克或聚乙二醇。
根據(jù)可行的制藥實(shí)踐需要，將約0.5至500毫克的巨核細(xì)胞生成蛋白質(zhì)(以游離酸或堿形式或藥學(xué)上可接受的鹽形式存在)化合物或混合物與生理上可接受的媒介、載體、賦行劑、黏合劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑等等復(fù)合。在這些組合組中，活性成份的量應(yīng)該能在指定的范圍內(nèi)可得到合適的劑量。
加入注射所需的無(wú)菌成份是根據(jù)傳統(tǒng)的制藥實(shí)踐。例如，也許需要將活性成份在媒介中溶解或懸浮，媒介如水、天然植物油如芝麻、花生或棉籽油或者合成脂肪媒介如乙基油酸或類似物。緩沖液、防腐劑、抗氧化劑和類似物可根據(jù)可行的制藥實(shí)踐結(jié)合到其中。
緩釋制劑的合適例子包括含多肽的固體疏水多聚物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以有形形式存在，如薄膜或微型膠囊。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠[如Langer等，J.biomed.Mater.Res.，15167-277和Langer，Chem.Tech.，1298-105中所述的聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或聚乙烯乙醇]、聚丙交酯(美國(guó)專利號(hào)3,773,919，EP58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sid-man等，Biopolymers，22547-556)、不可降解的乙烯-乙烯乙酸(Langer等，同上)、可降解的乳酸-乙二酸共聚物如Lupron De-potTM(由乳酸-乙二酸共聚物和leuprolide乙酸鹽組成的可注射微球)和多聚D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。
如乙烯-乙烯乙酸和乳酸-乙二酸這樣的多聚物能夠使分子的釋放超過(guò)100天，而某些水凝膠在較短的時(shí)間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。如果被裝在膠囊中的蛋白質(zhì)在體內(nèi)保留一段長(zhǎng)時(shí)間，這些蛋白質(zhì)也許會(huì)如同37℃時(shí)暴露于潮濕條件下一樣地變性或聚集，而導(dǎo)致生物活性的丟失和可能的致免疫性變化。根據(jù)所涉及的機(jī)制，可以設(shè)計(jì)出合理的策略來(lái)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集的機(jī)制是由于分子間二硫鍵的互換而形成的S-S鍵，穩(wěn)定的實(shí)現(xiàn)就可以通過(guò)修飾羥基殘基、從酸溶液中凍干、控制濕度、使用合適的附加劑和開(kāi)發(fā)特殊的多聚物基質(zhì)成份。
緩釋巨核細(xì)胞生成蛋白組合物也包括了脂質(zhì)體中的巨核細(xì)胞生成蛋白。含有巨核細(xì)胞生成蛋白的脂質(zhì)體的制備方法根據(jù)DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030-4034；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請(qǐng)83-118008；美國(guó)專利號(hào)4,485,045和4,544,545和EP102,324。通常，脂質(zhì)體是小的(約200-800埃)單層類型，其液體內(nèi)容物中膽固醇的含量大于約30摩爾％，這是一個(gè)被調(diào)整到最佳巨核細(xì)胞生成蛋白治療的比例。
劑量的多少由醫(yī)生根據(jù)多種因素的考慮來(lái)確定，已知能改變藥物作用的因素有疾病的類型和嚴(yán)重程度、體重、性別、飲食、給藥的方式和時(shí)間、施用的其他藥物以及其他相關(guān)的臨床因素。通常，每天的用量在每公斤體重0.1至100微克之間。較合適地，用量在每公斤體重0.1至50微克之間。更合適地，初期的用量在1至5微克/公斤/天之間?；蛘?，劑量的范圍與其他細(xì)胞因子相同，尤其是G-CSF、GM-CSF和EPO。治療的有效劑量可通過(guò)離體或在體方法確定。
實(shí)施例在沒(méi)有進(jìn)一步說(shuō)明的情況下，通過(guò)使用以下所描述和說(shuō)明的實(shí)施例，可以相信本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以最大程度地利用和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。以下的實(shí)施例是本發(fā)明極好的具體表現(xiàn)，但本發(fā)明的范圍并不局限于這些。
實(shí)施例1豬mpl配體的部分純化由正常的或再生障礙性貧血的豬收集缺少血小板的血漿。通過(guò)使用4mEV線性加速器對(duì)豬進(jìn)行900cGy的照射使豬發(fā)育不全。照射后的豬通過(guò)肌肉注射cefazolin繼續(xù)維持6-8天。然后在一般的麻醉法下取出它們的全部血液，肝素抗凝，并在1800×g下離心30分鐘來(lái)產(chǎn)生缺少血小板的血漿。巨核細(xì)胞刺激活性在照射6天后達(dá)到高峰。
取自照射后豬的再生障礙性豬血漿用4M NaCl處理，并于室溫下攪拌30分鐘。通過(guò)在Sorvall RC3B上以3800rpm(轉(zhuǎn)/分)離心以除去所得的沉淀，并將上清液移至一個(gè)用含有4M NaCl的10mMNaPO4平衡的Phenyl-Toyoperal柱中(220ml)。該柱用此緩沖液洗滌至A280＜0.05并用重蒸水(dH2O)洗脫。洗脫的蛋白峰用重蒸水溶解至傳導(dǎo)率15mS并上樣至一用PBS平衡的(Blue-Sepharose)柱中(240ml)。然后，柱用分別含有2M尿素的5倍體積PBS和10mM NAPO4(pH7.4)洗滌。用含有2M尿素和1M NaCl的10mMNaPO4(pH7.4)將蛋白質(zhì)從柱中洗脫。洗脫的蛋白峰用0.01％正辛基葡糖苷(正辛基β-D-葡糖吡喃糖苷)和1mM的EDTA和Pefa-bloc(Boehinges Mannheim公司)處理，然后直接上樣于串聯(lián)的CD4-IgG(Capon，D，.J.等Nature 337525-531)和mpl-IgG Ultralink(Pierce)柱(見(jiàn)下述)。當(dāng)樣品被裝入并且mpl-IgG(4ml)柱被用10倍體積的PBS和含有2M NaCl的PBS洗滌并且用0.1M pH2.25的甘氨酸-HCl洗脫后，去除CD4-IgG柱(2ml)。洗脫組分懼于1/10體積的1M Tris-HCl(pH8.0)中。
通過(guò)在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE(4-10％，Novex膠)電冰來(lái)分析由mpl-親和柱洗脫的蛋白組分。結(jié)果顯示存在幾種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通過(guò)銀染法證明了幾種蛋白質(zhì)的分子量為66,000、55,000、30,000、28,000和14,000。為了確定這些蛋白質(zhì)中哪種能夠促進(jìn)Ba/F3-mpl細(xì)胞培養(yǎng)物的增殖，這些蛋白用如下實(shí)施例2中描述的方法從膠中洗脫。
Ultralink親和柱10-20mg溶解于PBS的mpl-IgG或CD4-IgG與0.5克的Ul-tralink樹(shù)脂(Pierce)偶聯(lián)(根據(jù)制造商的說(shuō)明)。
mpl-IgG的構(gòu)建和表達(dá)一種包含人mpl的全部胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-491)的人IgG1的Fc區(qū)域的嵌合分子在293細(xì)胞中表達(dá)。一個(gè)編碼人mpl的氨基酸1-491的cDNA片段通過(guò)從人巨核細(xì)胞CMK細(xì)胞cDNA庫(kù)中進(jìn)行PCR而獲得并進(jìn)行測(cè)序。在5′端插入一個(gè)Cla1位點(diǎn)，3′端插入一個(gè)BstEII位點(diǎn)。因?yàn)樵贒NA編碼的mpl胞外結(jié)構(gòu)域中有2個(gè)BstEII位點(diǎn)，該P(yáng)CR產(chǎn)物被部分消化后克隆于Bluescropt載體上Cla1和BstEII之間的IgG1Fc編碼區(qū)域的上游。mpl PCR產(chǎn)物3′端引入的BstE11位點(diǎn)是用于與Fc區(qū)域一起位于mpl胞外結(jié)構(gòu)域的框架中。所得的構(gòu)建物被亞克隆入pRK5-tkneo載體的ClaI和XbaI位點(diǎn)之間并通過(guò)磷酸鈣法轉(zhuǎn)染入293人胚腎細(xì)胞。通過(guò)用0.4mg/ml的G418篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞并分離單個(gè)克隆。通過(guò)使用人Fc特異的ELISA來(lái)確定分離克隆的mpl-IgG表達(dá)。最好的表達(dá)克隆具有1-2mg/ml的mpl-IgG表達(dá)水平。
Ba/F3 IgG P表達(dá)細(xì)胞一個(gè)相應(yīng)于人mpl P完整編碼區(qū)域的cDNA被克隆入pRK5-tkneo，然后用NotI使之線性化并通過(guò)電穿孔法(1×107細(xì)胞，9605F，250伏)將其轉(zhuǎn)染入IL-3依賴的細(xì)胞系Ba/F3中，三天后，用2mg/ml G418開(kāi)始篩選。通過(guò)在96孔板中的有限稀釋來(lái)篩選集合的或單個(gè)的克隆。篩選的細(xì)胞保持于含有15％FBS、1mg/ml G418、20mM谷氨酰胺、10mM HEPES和100μg/ml Pen-Strep的RPMI中。通過(guò)使用抗mpl P兔多克隆抗體進(jìn)行FACS分析來(lái)確定篩選克隆中的mpl P的表達(dá)。
Ba/F3 mpl配體檢測(cè)mpl配體的檢測(cè)如圖2所示。為了確定各種來(lái)源的mpl配體的存在，mpl P Ba/F3細(xì)胞在缺乏IL-3時(shí)以5×105細(xì)胞/ml的密度在濕度培養(yǎng)箱中(37℃，5％的CO2和空氣)培養(yǎng)24小時(shí)。IL-3饑餓處理后以每200μl培養(yǎng)基50,000細(xì)胞的密度將細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板上，其中含有或不含有洗脫的樣品，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在最后的6-8小時(shí)，20μl沒(méi)有RPMI培養(yǎng)基但含有1μCi3H-胸苷的血清被加于各孔中。然后用96孔GF/C過(guò)濾板收集細(xì)胞，并用水洗滌5次。過(guò)濾物在40μl閃爍液體(Microsciut 20)存在下用PackardTop Count計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。
實(shí)施例2高度純化的豬mpl配體膠洗脫步驟等體積親和純化的mpl配體(洗脫自mpl-IgG柱的組分6)和2倍Laemmli樣品緩沖液在沒(méi)有還原試劑存在的情況下室溫混合并盡可能快地上樣于Novex 4-2％聚丙烯酰胺凝膠中。樣品不用加熱。作為對(duì)照，沒(méi)有配體的樣品緩沖液在鄰近的泳道電泳。凝膠在4-6℃于135伏電泳2小時(shí)15分鐘。電泳緩沖液開(kāi)始時(shí)為室溫。凝膠從凝膠盒中移出并且凝膠板置于移出凝膠的一面。
如下將締造膠復(fù)制于硝酸纖維膜上一張硝酸纖維素膜被用無(wú)菌水濕潤(rùn)后小心置于暴露的凝膠面上，趕走氣泡。準(zhǔn)標(biāo)被置于硝酸纖維膜和凝膠板上，以便在染色后準(zhǔn)確地進(jìn)行復(fù)制物的重定位。大約2分鐘后，小心移去硝酸纖維素膜，用塑料膜包封凝膠并置于冰箱中。硝酸纖維素膜用Biorad′s fold tolal prorcin stain染色，首先將膜在3×10ml 0.1％ Tween 20＋0.5M NaCl，+0.1M Tris-HCl pH7.5中攪動(dòng)超過(guò)45分鐘，接著在3×10ml純水中超過(guò)5分鐘。然后加入gold stain直至標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)條帶。再用水漂洗膜上的復(fù)制物，將其置于凝膠的塑料膜上，小心與準(zhǔn)標(biāo)對(duì)齊，標(biāo)記凝膠上Novex標(biāo)準(zhǔn)樣品的位置并且劃線指示需切割的部分。棄去硝酸纖維膜和塑料膜，用一鋒利剃刀沿指示線切割凝膠。所切割的部分應(yīng)超過(guò)樣品泳道以便當(dāng)膠被染色時(shí)可以用來(lái)確定切割部分位置。當(dāng)移去切割部分后，剩余的膠進(jìn)行銀染并測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)樣品和切割部分的位置。由Novex標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)確定與切割部分相對(duì)應(yīng)的分子量。
12個(gè)凝膠部分被置于Biorad型號(hào)422的電洗脫儀的槽中。12-14K分子量截?cái)嗄どw被用于槽中。50mM碳酸氫銨和0.05％SDS(大約pH7.8)是洗脫緩沖液。一升緩沖液在使用前于冷室中(4-6℃)預(yù)冷約1小時(shí)。凝膠切割部分在4-6℃冷室中于10ma/槽(初始40伏)進(jìn)行冼脫。洗脫大約需4小時(shí)。小心移去槽并用移液器移去孔上的液體。用移液器移去截?cái)嗄どw上的液體并保存，將50微升等分的純水置于膜蓋上，攪動(dòng)SDS晶體溶解后移去。這些液體與以上所保存的液體一起。每個(gè)凝膠部分的全部洗脫樣品體積約為300-500μl。樣品被置于預(yù)先已于純水中浸泡數(shù)小時(shí)的10mm Spec-trapor 4 12-14K截?cái)嗤肝龉苤小Ｋ鼈冊(cè)?-6℃下每六個(gè)樣品對(duì)600ml磷酸鹽緩沖液(PBS大約是4mM鉀離子)透析過(guò)夜。第二天替換緩沖透析2.5小時(shí)，從透析袋中移去樣品，并置于微型離心管中，離心管在冰上置放1小時(shí)后，于14,000 2pm離心3分鐘，小心自SDS沉淀上移出上清，然后將上清在冰上放置約1小時(shí)或更長(zhǎng)并再次離心4分鐘，上清稀釋于磷酸鹽緩沖液中以進(jìn)行活力測(cè)定，其余的樣品凍存于-70℃。
實(shí)施例3豬配體微測(cè)序由mpl-IgG親和柱得到的組分6(2.6ml)在Microcon-10(Amicou)上濃縮。為了防止mpl配體吸附于Microcon，用1％SDS漂洗膜并且將5μl 10％SDS加至組分6中。在Microcon上濃縮后(2μl)，將2倍樣品緩沖液(20μl)加至組分6中，所有體積(40μl)被加入4-20％丙烯酰胺梯度凝膠(Novex)的單個(gè)泳道內(nèi)。凝膠按Novex程度電泳。然后將凝膠平衡5分鐘，于包含10％甲醇的10mM 3-環(huán)己基氨基-1-丙磺酸(CAPS)緩沖液(pH11.0)中電印跡。電印跡至Immobilon-PSQ膜(Millipore)進(jìn)行45分鐘，于250mA恒定電流下在Biohad Trans-Blot transfer call中進(jìn)行。PVDF膜在溶于40％甲醇、0.1％乙酸的0.1％考馬斯亮藍(lán)R-250溶液中染色1分鐘。然后用溶于50％甲醇中的10％乙酸脫色2-3分鐘。唯一可見(jiàn)的在印跡的分子量18,000-35,000范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)分子量為30,000、28,000和22,000。
30、28和22KDa的蛋白條帶被進(jìn)行測(cè)序，自動(dòng)蛋白測(cè)序于配備一個(gè)PTH分析儀的470型號(hào)apploed Biosystem測(cè)序儀上。測(cè)序儀被改進(jìn)為注入80-90％的樣品(rodrignez，J.Chromatogr.，350217-225(1985))。丙酮(約12μl/l)被加入溶劑A以平衡紫外(UV)吸收。電印跡的蛋白質(zhì)于Blott膠片中測(cè)序。蛋白峰通過(guò)NelsonAnalytical 970界面進(jìn)入Justice lnnovation軟件。序列譯解分析于VAX5900上進(jìn)行(Henzel et al.，J.Chromatogr.，40441-52(1987))N-末端序列(用一個(gè)字母表示括號(hào)內(nèi)不確定殘基)和所得材料的數(shù)量(方括號(hào)內(nèi))結(jié)果見(jiàn)表2′。
表2′mpl配體氨基端序列
實(shí)施例4液體懸浮巨核細(xì)胞生成檢測(cè)人外周干細(xì)胞(PSC)(取自經(jīng)同意的病人)用IMDM培養(yǎng)液(Gibco公司)稀釋5倍，然后于室溫下以800×g離心15分鐘，細(xì)胞沉淀重新懸浮于IMDM培養(yǎng)基并且鋪板于60％的Percoll上(密度為1.077mg/ml)(Pharmacia公司)并于800×g離心30分鐘。位于界面的低密度單核細(xì)胞被抽出并用IMDM洗二次，然后鋪于含30％FBS(終體積為1ml)的IMDM中(密度為1－2×106細(xì)胞/ml)，置于24孔組織培養(yǎng)板(Costar公司)。App或缺少APP的mpl配體被加至10％，并且培養(yǎng)物于濕度培養(yǎng)箱中(37℃，含5％CO2和空氣)培養(yǎng)12-14天。在培養(yǎng)天數(shù)0、2、4時(shí)在含有0.5μg mpl-IgG的10％APP存在下繼續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)mpl-IgG親和柱來(lái)去除mpl配體中的APP。
為了定量分析這些液體懸浮培養(yǎng)物中的巨核細(xì)胞生成，采用Solberg等改進(jìn)的方法以及利用放射性標(biāo)記的針對(duì)GPIIbIIIa的鼠IgG單克隆抗體(HP1-1D)(由Nichols博士提供，Mayo Cilinic)100μg的HP1-1D(參見(jiàn)Grant，B等，Blood 691334-1339(1987))用1mCi Na125I根據(jù)制造商說(shuō)明的酶珠法(Enzymobeads)(Biorad，Richmond，CA)進(jìn)行放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記的HP1-1D儲(chǔ)存于含0.01％正辛基-葡糖苷的PBS中，存放于-70℃。典型的特異性活力為1－2×6cpm/μg(由12.5％三氯乙酸沉淀時(shí)超過(guò)95％)。
液體懸浮培養(yǎng)物在每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行三次。12-14天培養(yǎng)后，1ml培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf管中并于室溫下以800×g離心10分鐘。所得的細(xì)胞沉淀重懸浮于含有0.02％EDTA和20％小牛血清的100μl PBS中。50μl的檢測(cè)緩沖液(含10ng1251-HP1-1D)被加至重懸浮的培養(yǎng)物中并于室溫下孵育60分鐘，偶而搖動(dòng)。然后，通過(guò)以800×g在室溫下離心10分鐘來(lái)收集細(xì)胞。并用檢測(cè)緩沖液洗2次。沉淀用γ計(jì)數(shù)器(Packazd公司)計(jì)數(shù)1分鐘。非特異性結(jié)合通過(guò)在加入標(biāo)記的HP1-1D前加入1μg非標(biāo)記的HP1-1D(60分鐘)來(lái)確定。特異性結(jié)合通過(guò)用總的1251-HD1-1D的結(jié)合減去在過(guò)量非標(biāo)高HP1-1D存在下的結(jié)合來(lái)確定。
實(shí)施例5寡核苷酸PCR引物基于由30kDa、28kDa和20kDa所得的氨基-末端的氨基酸順序，簡(jiǎn)并性寡核苷酸被設(shè)計(jì)用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物(見(jiàn)表4)。兩個(gè)引物集合物被合成，正義10聚體集合物編碼氨基酸殘基2-8(mpl 1)，反義21聚體集合物編碼氨基酸18-24(mpl 2)。
表4簡(jiǎn)并寡核苷酸引物集合物
由豬外周血液淋巴細(xì)胞分離的豬基因組DNA被用做PCR的模板。50μl的反應(yīng)體系包括0.8μg溶于10mM Tris-HCl(pH8.3)中的豬基因組DNA、50mM KCl、3mM MgCl2、100μg/ml BSA、400μM dNTPs、1μM各個(gè)引物集合物和2.5單位Taq聚合酶。初始模板變性為94℃8分鐘，然后35個(gè)循環(huán)為94℃45秒、55℃1分鐘、72℃1分鐘。最后一個(gè)后接72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物于12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離并用溴化乙銀染色來(lái)鑒別。如果氨基末端的氨基酸由單一密碼子來(lái)編碼，正確的PCR產(chǎn)物應(yīng)為69堿基。這種大小的一個(gè)DNA片段被從膠中洗脫并亞克隆入pGEMT(Promega公司)。三個(gè)克隆的序列見(jiàn)下表5。
表569bp豬基團(tuán)組DNA片段
序列中有下劃線的堿基為PCR引物的位置。這些結(jié)果證實(shí)了對(duì)30kDa、29kDa和20kDa蛋白質(zhì)的氨基酸9-17所得到的N-末端序列并且指出這個(gè)序列由豬DNA的單一密碼子編碼。
實(shí)施例6人mpl配體基因基于實(shí)施例5的結(jié)果，一個(gè)被稱為pR45的45聚體的脫氧寡核苷酸被設(shè)計(jì)和合成用來(lái)篩選基團(tuán)組文庫(kù)。45聚體具有以下序列5′GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3′(SEQ ID No28)這個(gè)寡核苷酸用(γ32P)-ATP和T4激酶進(jìn)行32P-標(biāo)記并且三物在低嚴(yán)緊雜交和洗滌條件(實(shí)施例7)下對(duì)人基團(tuán)組文庫(kù)進(jìn)行篩選。陽(yáng)性克隆被挑選出并且純化噬菌斑，通過(guò)限制酶切圖譜和Southern印跡進(jìn)行分析。克隆#4被選擇出以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
一個(gè)2.8kb的可與45聚體雜并的Bam HI-XbaI片段被亞克隆入pBlupscript sk-。通過(guò)使用豬mpl配體DNA序列特異的寡核苷酸引物對(duì)這個(gè)克隆的DNA序列進(jìn)行部分測(cè)序。所得的序列證明，與豬mpl配體同源的人DNA序列已被分離。序列中的一個(gè)EcoRI限制酶切位點(diǎn)被確定，從而可從2.8kb的Bam HI-XbaI片段上分離出來(lái)一個(gè)390bp的EcoRI-XbaI片段，并亞克隆入pBluescript sk-。
這個(gè)片段的雙鏈都已被測(cè)序，人DNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖9(SEQ ID NOS 3和4)。用剪頭指示出基團(tuán)組序列中預(yù)測(cè)的內(nèi)含子位置，并確定了一個(gè)假定的外顯子(“外顯子3”)。
對(duì)預(yù)測(cè)氨基酸序列的檢測(cè)證實(shí)了一個(gè)絲氨酸殘基是成熟mpl配體的第一個(gè)氨基酸，這與由氨基酸直接分析所得結(jié)果相同。緊接這個(gè)密碼子上游序列的預(yù)測(cè)氨基酸很可能是涉及成熟mpl配體分泌的信號(hào)序列。這個(gè)信號(hào)序列的編碼區(qū)域可能在核苷酸位置68處被一個(gè)內(nèi)含子中斷。
在3′方向上，外顯子中止于核苷酸196。這個(gè)外顯子編碼一段42個(gè)氨基酸的序列，其中16個(gè)可能是信號(hào)序列的部分，26個(gè)是人成熟mpl配體的部分。
實(shí)施例7全長(zhǎng)人mpl配體cDNA基于人的“外顯子3”的序列(實(shí)施例6)，合成2個(gè)與“外顯子3”序列3′和5′端相對(duì)應(yīng)的非簡(jiǎn)并寡核苷酸。
表6人cDNA非簡(jiǎn)并PCR寡核苷酸引物
這兩個(gè)引物被用于PCR反應(yīng)，其中的模板DNA為來(lái)自于不同的cDNA文庫(kù)或通過(guò)如實(shí)施例5所描述的來(lái)源于不同組織的1ngQuick Clone cDNA(Clonefeoh公司)。正確的PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為140bp。在12％聚丙烯酰胺凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析之后，一個(gè)來(lái)源于成人腎cDNA文庫(kù)的預(yù)期大小的DNA片段被確定，該cDNA文庫(kù)分別來(lái)自成人腎、293胎腎細(xì)胞和人胎肝(ClonerdchCat.#7171-1)。
篩選人基因組文庫(kù)的45聚體寡核苷酸被用來(lái)篩選一個(gè)λDR2中的胎肝cDNA文庫(kù)。使用T4多聚核苷酸激酶將(γ32-P)-ATP標(biāo)記寡核苷酸。在低嚴(yán)緊雜交條件下對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。膜首先預(yù)雜交2小時(shí)，然后在20％甲酰胺、5×SSC、10×Denhardt′s、0.05M磷酸鈉(pH6.5)、0.1％焦磷酸鈉、50μg/ml鮭魚(yú)精子DNA中于42℃與探針雜交過(guò)夜。然后用2×SSC漂洗膜，在42℃下于0.5×SSC、0.1％SDS中洗膜一次。然后膜與kodak X-Ray片曝光過(guò)夜。挑選陽(yáng)性克隆純化噬菌斑，用λDR2(clonetech cat.#6475-1)克隆中BamHI-XbaI兩側(cè)的寡核苷酸進(jìn)行PCR來(lái)確定插入片段的大小。5μl的噬菌體儲(chǔ)液用做模板。初始變性為94℃7分鐘。然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(94℃1分鐘；52℃1分鐘和72℃1.5分鐘)，最后延伸為72℃15分鐘，clone#Fl2b有一個(gè)1.8kb的插入片段并被選擇出進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
根據(jù)制造商的說(shuō)明獲得包含于λDR2噬菌體臂中的質(zhì)粒pDR2(clonetech，λDR2和pDR2克隆和表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，p42)(clonerech，λDR2和pDR2克隆和表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)p29-30)。用BamHI和XbaI對(duì)質(zhì)粒pDR2-FL2b進(jìn)行限制酶分析表明在大約650位置的插入片段中有一個(gè)BamHI限制酶切位點(diǎn)。用BanHI-XbaI對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行消化，將插入片段切出2個(gè)片段，一個(gè)為0.65kb，另一個(gè)為1.15kb。對(duì)由質(zhì)粒pDR2-FL2b得到的三種不同的模板進(jìn)行序列測(cè)定，用AB1371(applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California)自動(dòng)熒光DNA測(cè)序儀，使用染料標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸終止子(染料-終止子)的標(biāo)準(zhǔn)方法和傳統(tǒng)的合成步移引物(Sanger等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，745463-5467(1977))；Smith等，Natwre，321674-679(1986))進(jìn)行雙鏈質(zhì)粒DNA測(cè)序。質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)充通過(guò)使用傳統(tǒng)的引物和染料-終止子反應(yīng)在AB1373測(cè)序儀上進(jìn)行。單鏈模板用M13 Janus載體產(chǎn)生(DNASTAR公司，Madison，Wisconsin)(Burland等，Nucl，AcidsRes.，21；3385-3390(1993))。BamHI-XbaI(1.15kb)和BamHI(0.65kb)自段從質(zhì)粒pDR2-FL2b中分離得到，在脫氧核苷酸存在下，其片段末端用T4 DNA聚合酶填平。然后亞克隆入M13 Janus的SmaI位點(diǎn)。用染料標(biāo)記的M13的通用和反向引物或步移引物和染料終止子通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行測(cè)序。使用步移引物和標(biāo)準(zhǔn)的雙脫氧終止子化學(xué)(Sanger等，Proc.Natl.Acad，Sci，USA，745463-5467(1977))、33P標(biāo)記的α-dATP和測(cè)序酶(United States Biochen-ital Corp.，Clevcland，Ohio)，通過(guò)單鏈M13 DNA進(jìn)行人工測(cè)序反應(yīng)。用Sequencher V2.1b12(Gene Codes Corporation，Ann Ar-bor，Michigem)進(jìn)行DNA序列分布分析。核苷酸和推導(dǎo)的hML序列見(jiàn)圖1(SEQ ID NO1)。
實(shí)施例8人mpl配體(TPO)基因的分離用pR45質(zhì)粒對(duì)λ-Gem12中的人基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選來(lái)分離人TPO基因的基因組DNA克隆，pR45是一個(gè)前文已描述過(guò)的寡核苷酸探針，它在低嚴(yán)緊條件下(見(jiàn)實(shí)施例7)或高度嚴(yán)緊條件下都可與一個(gè)對(duì)應(yīng)于人mpl配體cDNA3′一半的片段雜交(從BamHI位點(diǎn)至3′端)。分離出兩個(gè)跨度為35kb的重疊克隆。亞克隆含整個(gè)TPO基因的兩個(gè)重疊片段(BamHI和EcoRI)并測(cè)序。該人基因的結(jié)構(gòu)由7kb基因組DNA內(nèi)的6個(gè)外顯子構(gòu)成(圖14A，B和C)。所有外顯子/內(nèi)含子的連接邊界都與哺乳動(dòng)物的共有序列一致(Shapiro，M.B.等，Nucl.Acids Res.157155(1987))。外顯子1和外顯子2含5′非翻譯序列和信號(hào)肽的最初4個(gè)氨基酸。分泌信號(hào)的其余部分和成熟蛋白的前26個(gè)氨基酸由外顯子3編碼。完整的羧基結(jié)構(gòu)域和3′非翻譯結(jié)構(gòu)域以及紅細(xì)胞生成素樣結(jié)構(gòu)域的～50個(gè)氨基酸由外顯子6編碼。與在ML-2(hTPO-2)中觀察到的缺失相關(guān)的4個(gè)氨基酸由外顯子6的5′末端編碼。
實(shí)施例9人mpl配體(hML)的瞬時(shí)表達(dá)為了亞克隆含于pDR2-FL2b內(nèi)的全長(zhǎng)插入片段，用XbaI將質(zhì)粒消化完全，然后用BamHI部分消化。凝膠電泳純化對(duì)應(yīng)于1.8kb插入片段的DNA片段并將其亞克隆入pRK5(pRK5-hmpl 1)(有關(guān)pRK5的構(gòu)建參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,258,287)并使其置于巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子的調(diào)控下。來(lái)自構(gòu)建物pRK5-hmpl 1的DNA是通過(guò)PEG法制備的，并被轉(zhuǎn)染入人胚腎293細(xì)胞，該細(xì)胞被培養(yǎng)于補(bǔ)充有F-12營(yíng)養(yǎng)混合物、20mM Hepes(pH7.4)和10％胎牛血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。用磷酸鈣法(Gorman，C.(1985)在DNA Cloning中A Practical Approach(Glover，D.M.，編)Vol.II，pp.143-190，IRL Press，Woshing-ton，D.C.)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，在增殖測(cè)定中，分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中的活性(實(shí)施例1)。只用pRK載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清液對(duì)Ba/F3或Ba/F3-mpl細(xì)胞無(wú)刺激作用(圖12A)。用pRK5-hmpl 1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液對(duì)Ba/F3細(xì)胞無(wú)作用但極大地刺激了Ba/F3-mpl細(xì)胞的增殖(如12A)，由此表明該cDNA編碼了一種有功能活性的人mpl配體。
實(shí)施例10人mpl配體同種型hML2，hML3和hML4為了鑒定hML的可變剪接形式，合成了對(duì)應(yīng)于hML編碼序列各末端的引物。這些引物被用于RT-PCR以擴(kuò)增成人肝RNA。另外，構(gòu)建了選定的目標(biāo)區(qū)域側(cè)翼的內(nèi)引物(如下)并進(jìn)行同樣的使用。PCR產(chǎn)物末端的直接測(cè)序揭示了精確對(duì)應(yīng)于分離自人胚肝基因文庫(kù)cDNA序列的一段單一序列(見(jiàn)圖1(SEQ ID NO1)。但是，靠近EPO結(jié)構(gòu)域C端一段區(qū)域(在PCR產(chǎn)物的中部)表現(xiàn)出一種復(fù)合序列形式，表明該區(qū)域中存在著可能的剪接變異體。為了分離這些剪接變異體，表7中提供的目標(biāo)區(qū)域側(cè)翼的引物在PCR中被用作成人肝cDNA的模板。
表7人ML同種型PCR引物
將PCR產(chǎn)物以平末端亞克隆入M13。對(duì)各亞克隆的測(cè)序揭示至少存在3種ML同種型。其中之一是hML(也稱為hML332)，它是最長(zhǎng)的形式，與分離自胚肝文庫(kù)的序列精確對(duì)應(yīng)。(圖11(SEQ IDNO6、8、9、10)給出了所列的從最長(zhǎng)hML到最短hML-4這4種人mpl配體同種型的序列。
實(shí)施例11人Mpl配體同種型和取代性變異體的構(gòu)建和瞬時(shí)表達(dá)hML2、hML3和hML(R153A，R154)利用重組PCR技術(shù)(Russell Higuchi，PCR Protocols，Aguide to Methods and Applications，Acad.Press，M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky&T.J.White編)，由hML重建同種型hML2和hML3以及取代性變體hML(R153A，R154)。
在所有的構(gòu)建中，所用的“外”引物列于表8，“重疊”引物列于表9。
表8外引物
表9重疊引物
全部PCR擴(kuò)增都用克隆的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)，以下列條件進(jìn)行最初的模板變性為94℃、7分鐘，然后循環(huán)30次(94℃，1分鐘；55℃，1分鐘；72℃，1.5分鐘)。最后一輪在72℃延伸10分鐘。用ClaI-XbaI消化PCR終產(chǎn)物，凝膠電泳純化并克隆入pRK5tkneo。用各種構(gòu)建物如前所述轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用Ba/F3-mpl增殖測(cè)定分析上清液。在該測(cè)定中，hML-2和hML-3沒(méi)有表現(xiàn)出可測(cè)得的活性，但是hML(R153A，R154A)的活性與hML相似表明在該雙堿性位置的加工并不是活性所必須的(見(jiàn)圖13)。
實(shí)施例12鼠mpl配體cDNAmML、mML-2和mML-3mML cDNA的分離利用PCR獲得一段對(duì)應(yīng)于人mpl配體全編碼區(qū)域的DNA片段，凝膠電泳純化并利用有32P-dATP和32P-dCTP存在的隨機(jī)引物法進(jìn)行標(biāo)記。將該探針用于篩選λGT10中的鼠肝cDNA文庫(kù)的106克隆(Clontech cat# ML3001a)。
取復(fù)制的濾膜在35％甲酰胺、5×SSC、10×Denhardt′s、0.1％SDS，0.05M磷酸鈉(pH6.5)、0.1％焦磷酸鈉、100μg/ml超聲波粉碎的鮭精子DNA中與探針雜交過(guò)夜。在2×SSC中漂洗濾膜、然后在0.5×SSC、0.1％SDS中42℃洗滌一次。純化噬菌斑以得到雜交噬菌體，將cDNA插入片段亞克隆入Bluestript SK-質(zhì)粒的Eco RI位置。挑選出帶1.5kb的插入片段的“LD”克隆用于進(jìn)一步的分析，如前述對(duì)人ML cDNA進(jìn)行雙鏈測(cè)序。圖14(SEQ ID NO1和11)提供了LD克隆的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。推導(dǎo)的來(lái)自該克隆的成熟ML序列長(zhǎng)331個(gè)氨基酸殘基，確定為mML331(或出于下文的某些原因稱為mML-2)。在這些ML的EPO樣結(jié)構(gòu)域中觀察到了核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的高度一致性。但是，將人和鼠的ML的推導(dǎo)氨基酸序列對(duì)齊時(shí)，鼠的序列表現(xiàn)出有一個(gè)人殘基111-114之間的四肽缺失，對(duì)應(yīng)于在人(見(jiàn)上文)和豬(見(jiàn)下文)的cDNA都見(jiàn)到的618位核苷酸后的一段12個(gè)核苷酸缺失。所以，檢查了另外的克隆以查找可能的鼠ML同種型?？寺　癓7”有包含“丟失”四肽LPLQ的一段335氨基酸推導(dǎo)序列的一個(gè)1.4kb的插入片段。這種形式據(jù)信是全長(zhǎng)鼠ML，被稱為mML或mML335。圖16(SEQ ID NO12和13)給出了mML的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。最后，分離出克隆“L2”并測(cè)序。該克隆有與hML3對(duì)應(yīng)的116個(gè)核苷酸的缺失，所以命名為mML3。圖16顯示了這兩者同種型的推導(dǎo)氨基酸序列的比較。重組mML的表達(dá)鼠ML的表達(dá)載體的制備與實(shí)施例8中所述基本相同。編碼mML和mML-2的克隆被亞克隆入pRK5tkneo，這是一個(gè)可以在CMV啟動(dòng)子和SV40聚腺苷酸化信號(hào)調(diào)控下表達(dá)的表達(dá)載體。利用磷酸鈣法將所得的表達(dá)載體mML pRK5tkneo和mML2pRK5tkneo瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。將細(xì)胞維持于補(bǔ)充有10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中。鼠mpl(mmpl)在Ba/F3細(xì)胞中的表達(dá)用mmpl pRK5tkneo轉(zhuǎn)染來(lái)獲取表達(dá)c-mpl的穩(wěn)定細(xì)胞系，與實(shí)施例1中所述的對(duì)人mpl進(jìn)行的方法基本相同。簡(jiǎn)而言之，利用電穿孔(5×106個(gè)細(xì)胞，250V，960μF)將含有鼠mpl的全編碼序列(Skoda，R.C.等，EMBO J.122645-2653(1993))的表達(dá)載體(20μg；線性化的)轉(zhuǎn)染入Ba/F3細(xì)胞，然后用2mg/ml G418進(jìn)行新霉素抗性選擇。用兔抗鼠mpl-IgG抗血清，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析評(píng)價(jià)mpl的表達(dá)。Ba/F3細(xì)胞被維持于來(lái)自作為IL-3源的WEHI-3B細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)基中。如實(shí)施例1所述，在轉(zhuǎn)染了mmpl和hmpl的Ba/F3細(xì)胞中分析來(lái)自用mML和mML-2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的上清液。
實(shí)施例13豬mpl配體cDNApML和pML-2利用RACE PCR分離豬ML(pML)cDNA。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)編碼純化自再生障礙性貧血豬血清ML氨基端的豬ML基因的外顯子序列，設(shè)計(jì)一段寡聚dT引物和2段特異性引物。獲取由各種再生障礙性豬組織中制備的cDNA，并擴(kuò)增。在腎中發(fā)現(xiàn)了一種1342bp的PCR cDNA產(chǎn)物并將其亞克隆。對(duì)幾個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們編碼成熟的豬mpl配體(不包括完整的分泌信號(hào)肽)。該cDNA被發(fā)現(xiàn)編碼一段具有圖18(SEQ ID NO9和16)所示序列的332氨基酸的成熟蛋白pML332。
方法pML基因和cDNA的分離用pR45篩選EMBL3(Clontech Inc)中的豬基因組文庫(kù)來(lái)分離豬ML基因的基因組克隆?；蛭膸?kù)的篩選基本同實(shí)施例7所述。分離出幾個(gè)克隆并對(duì)編碼相同于得自純化的ML氨基酸序列的外顯子進(jìn)行了測(cè)序。利用RACE PCR改進(jìn)程序獲取豬ML cDNA。根據(jù)豬ML基因序列設(shè)計(jì)兩段特異性引物?；救缜八?，由再生障礙性貧血豬的腎分離聚腺苷酸化的mRNA。用與mRNA的聚腺苷酸尾直接相對(duì)的BamdT引物逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。
(BamdT5′GACTCGAGGA TCCATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 3′)(SEQ ID NO55)用ML特異性的h-正向-1引物(h-正向-15′GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 3′)(SEQ ID NO43)和BAMAD引物(BAMAD5′GACTCGAGGA TCCATCG 3′)(SEQ ID NO56)在100ml反應(yīng)體積中(50mM KCl、1.5mM MgCl、10mM Tris pH8.0、0.2mM dNTP，0.05U/ml Amplitaq聚合酶[Perkin ElmerInc.])進(jìn)行PCR初擴(kuò)增(循環(huán)28次95℃60秒，58℃60秒，72℃90秒)。然后用ClaI消化PCR產(chǎn)物，用苯酚-氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀，連接到已用ClaI和KpnI切割的Bluestript SK-載體(StratageneInc.)上。室溫下培育2小時(shí)后，1/4的連接混合物被直接加入使用第二種特異性的前-1引物(正向-15′GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 3′)(SEQ ID NO57)和T3-21(與Bluestript SK-載體內(nèi)多克隆區(qū)域附近的一段序列結(jié)合的一段寡核苷酸)
5′CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 3′(SEQ ID NO58)的第二輪PCR(如前所述循環(huán)22次)。得到的PCR產(chǎn)物用XbaI和ClaI消化，并亞克隆入Bluestript SK-。對(duì)得自獨(dú)立PCR反應(yīng)的幾個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序。
又重復(fù)了一次，鑒定出第二種形式pML-2，它編碼帶4氨基酸殘基缺失(328個(gè)氨基酸殘基)的蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖21[SEQ ID NO21])。pML和pML-2氨基酸序列的比較顯示，后一種形式除了缺失對(duì)應(yīng)于殘基111-114(包括端值)的QLPP四肽外完全一致(見(jiàn)圖22[SEQ ID NO18和21]。在鼠、人和豬中觀察到的4氨基酸缺失出現(xiàn)在預(yù)測(cè)蛋白內(nèi)完全相同的部分。
實(shí)施例14血小板生成素(TPO)對(duì)血小板抗原GPIIbIIIa表達(dá)的誘導(dǎo)作用的CMK測(cè)試CMK細(xì)胞被維持于補(bǔ)充有10％胎牛血清和10mM谷氨酰胺的RMPI1640培養(yǎng)基(Sigma公司)中。在測(cè)試的準(zhǔn)備階段，收獲細(xì)胞，洗滌，并將其在補(bǔ)以5mg/l牛胰島素，10mg/l脫鐵運(yùn)鐵蛋白、1×微量元素的無(wú)血清GIF培養(yǎng)基中重懸成5×105細(xì)胞/ml。在一96孔平底板中，在每一孔中加入按適當(dāng)比例稀釋的100μl TPO標(biāo)準(zhǔn)或?qū)嶒?yàn)樣品。將100μl CMK細(xì)胞懸浮液加入每一孔，將板在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，板以100rpm在4℃離心5分鐘。棄去上清液，在每一孔中加入FITC共軛的GPIIbIIIa單克隆2D2抗體。在4℃培養(yǎng)1小時(shí)后，測(cè)試板以1000rpm再離心5分鐘。棄去含未結(jié)合抗體的上清液，在每一孔中加入200μl0.1％BSA-PBS洗液。0.1％BSA-PBS洗滌步驟重復(fù)三次。在FASCAN上利用測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度的單參數(shù)分析法分析細(xì)胞。
實(shí)施例15
通過(guò)在96孔微量滴定板上測(cè)定DAMI細(xì)胞核內(nèi)有絲分裂活性進(jìn)行血小板生成素(TPO)的DAMI測(cè)定DAMI細(xì)胞被維持于補(bǔ)充有10mM谷氨酰胺、100ng/ml青霉素G和50μg/ml鏈霉素的IMDM＋10％馬血清(Gibco公司)中。在測(cè)試準(zhǔn)備階段，收獲細(xì)胞，洗滌，并在IMDM＋1％馬血清中重懸成1×106細(xì)胞/ml。在一96孔圓底測(cè)試板中，將100μl TPO標(biāo)準(zhǔn)或測(cè)試樣品加入DAMI細(xì)胞懸浮液。然后在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，測(cè)試板在Sorvall 6000B離心機(jī)上以1000rpm、4℃離心5分鐘。棄去上清液，重復(fù)200μl PBS-0.1％BSA的洗滌步驟。加入200μl冰冷的70％乙醇-PBS來(lái)固定細(xì)胞，并利用通氣重懸。在4℃培養(yǎng)15分鐘后，測(cè)試板以2000rpm離心5分鐘，在每一孔中加入150μl含0.1mg/ml碘丙錠(propidim iodide)的1mg/mlRNAse(RNA酶)和0.05％Tween-20。在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DNA含量變化。如下測(cè)定和定量多倍性正常化的多倍體比(NPR)＝加TPO的(＞G2＋M的細(xì)胞％/＜G2＋M的細(xì)胞％)/對(duì)照的(＞G2＋M的細(xì)胞％/＜G2＋M的細(xì)胞％)實(shí)施例16血小板生成素的體內(nèi)測(cè)試(鼠血小板回跳測(cè)試)用于血小板生成的體內(nèi)35S確定的測(cè)定在第一天給C57BL6鼠(得自Charles River)腹膜內(nèi)(IP)注射1ml羊抗鼠血小板血清(6amps)以產(chǎn)生血小板減少。在第5天和第6天，給鼠IP兩次注射因子或作為對(duì)照的PBS。在第7天，靜脈注射溶于0.1ml生理鹽水的30μCiNa235SO4，測(cè)定得自接受治療和作為對(duì)照的鼠血樣中注射劑量中的35S摻入循環(huán)血小板中百分比。同時(shí)對(duì)取自后眶竇血樣中的血小板和白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)施例17通過(guò)測(cè)定mpl-Rse.gD嵌合受體磷酸化進(jìn)行血小板生成素(TPO)的KIRA ELISAVigon等(PNAS，USA 895640-5644(1992))已揭示了人mpl受體。含mpl受體胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)和Rse的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)以及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)的嵌合受體(Mark等，J.of Biol.Chem.269(14)10720-10728)與一種羧基端尾(flag)多肽一起被用于此處所述的KIRA ELISA。有關(guān)該測(cè)試的圖示說(shuō)明可參見(jiàn)圖30和31。
(a)俘獲劑的制備用一種取自單純皰疹病毒糖蛋白D的肽來(lái)產(chǎn)生單克隆抗gD(克隆5B6)(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)547-553)。將純化的儲(chǔ)備液在磷酸鹽緩沖液(PBS)中調(diào)至3.0mg/ml、pH7.4，分成1.0ml的等份，保存于-20℃。
(b)抗磷酸酪氨酸抗體的制備從UBI(Lake Placid，NY)購(gòu)得單克隆抗磷酸酪氨酸抗體即克隆4G10，并利用長(zhǎng)臂生物素-N-羥基琥珀酰胺(Biotin-X-NHS，Research Organics，Cleveland，OH)進(jìn)行生物素標(biāo)記。
(c)配體利用本文所述的重組技術(shù)制備mpl配體。將純化的mpl配體制成儲(chǔ)備液保存于4℃。
(d)Rse.gD核酸的制備合成的雙鏈寡核苷酸被用于重建人Rse C端10個(gè)氨基酸(880-890)的編碼序列并另外加上21個(gè)氨基酸，其中含抗體5B6的抗原決定基和一個(gè)終止密碼子。表10表示了這種融合基因合成部分的最終序列。
表10人Rse融合基因的合成雙鏈部分
該合成DNA在PstI與HindIII位置與編碼人Rse的1-880氨基酸的cDNA連接，PstI位點(diǎn)起始于公開(kāi)的人Rse cDNA序列第2644位核苷酸，而HindIII位點(diǎn)則在表達(dá)載體pSV17.ID.LL(參見(jiàn)圖32，SEQ ID NO22)的多接頭中，連接后構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pSV.ID.Rse.gD。簡(jiǎn)而言之，該表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)二順?lè)醋釉蹀D(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中含有由5′剪切供體和3′剪切受體內(nèi)含子剪接位置界定的DHFR編碼序列，其后是編碼Rse.gD的序列。全長(zhǎng)(非剪接的)信使RNA含有作為最初開(kāi)放讀框的DHFR，所以，可產(chǎn)生用于挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的DHFR蛋白。
(e)mpl-Rse.gD核酸的制備修飾如上產(chǎn)生的表達(dá)質(zhì)粒pSV.ID.Rse.gD以生成質(zhì)粒pSV.ID.M.tmRd6，該質(zhì)粒含有與Rse.gD(氨基酸429-911)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的人mplECD(氨基酸1-491)的編碼序列。在Mark等，J.Biol.Chem.26726166-26171(1992)中所述的兩步PCR克隆反應(yīng)中，用合成有寡核苷酸連接人mpl胞外結(jié)構(gòu)域的一部分編碼序列與Rse.gD編碼序列。第一步PCR反應(yīng)對(duì)mplcDNA模板所用的引物是M1
(5′-TCTCGCTACC GTTTACAG-3′)(SEQ ID NO61)和M2(5′-CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT-3′)(SEQ ID NO62)對(duì)Rse模板所用的引物是R1(5′-GGGCCATGAC ACTGTCAA-3′)(SEQ ID NO63)和R2(5′-GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT-3′)(SEQ ID NO64)。
該融合連接體的PvuII-SmaI部分被用于構(gòu)建全長(zhǎng)嵌合受體。
(f)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化用已在質(zhì)粒構(gòu)架的單一NotI位置打開(kāi)成線形的pSV.ID.tm-Rd6電穿孔DP12.CHO細(xì)胞(1989年3月15日公告的EP307,247)。在酚/氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA并重懸在20μl 1/10 TrisEDTA中。然后，在以400V、330μf電穿孔前將10μg DNA與107個(gè)CHO DP12細(xì)胞在冰上孵育10分鐘。在非選擇性培養(yǎng)基上鋪平板前將細(xì)胞重新在冰中放10分鐘。24小時(shí)后，給細(xì)胞補(bǔ)料以無(wú)核酸的培養(yǎng)基以挑選穩(wěn)定的DHFR+克隆。
(g)用于KIRA ELISA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的挑選用檢測(cè)gD決定基的抗體5B6通過(guò)SDS-PAGE對(duì)整個(gè)細(xì)胞裂解液的分離組分進(jìn)行western印跡來(lái)鑒定表達(dá)mpl/Rse.gD的克隆。
(h)培養(yǎng)基細(xì)胞在F12/DMEM 50∶50(Gibco/BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)中生長(zhǎng)。培養(yǎng)基被補(bǔ)以10％透濾過(guò)的FBS(Hy-Clone，Logan，Utah)、25mM HEPES和2mM L-谷胺酰胺。
(i)KIRA ELISA將mpl-Rse.gD轉(zhuǎn)化的DP12.CHO細(xì)胞加入平底96孔培養(yǎng)板，各孔為100μl培養(yǎng)基(3×104個(gè)/格)，在37℃、5％CO2中培養(yǎng)過(guò)夜。次日早晨，傾析法去除上清液，將培養(yǎng)板置于紙巾上。每孔加入含實(shí)驗(yàn)樣品或200、50、12.5、3.12、0.78、0.19、0.048或0ng/ml mpl的50μl培養(yǎng)基。在37℃刺激細(xì)胞30分鐘，傾析法棄去上清液，再將培養(yǎng)板在紙巾上輕輕壓干。為了裂解細(xì)胞并溶解嵌合受體，每孔加入100μl裂解緩沖液。裂解緩沖液由含50mM HEPES(Gibco)的150mM NaCl溶液、0.5％Triton-X 100(Gibco)、0.01％硫柳汞、30KIU/ML抑肽酶(ICN Biochemicals，Aurora，OH)、1mM 4-(2-氨基乙基)-苯磺?；瘹?AEBSF；ICN Biochemicals)、50μM亮肽素(ICN Biochemicals)和2mM正釩酸鈉(Na3VO4；Sigma Chemi-cal Co.St.Louis，MO)組成，pH7.5。培養(yǎng)板在培養(yǎng)板振蕩器(Bell-co Istruments，Vineland，NJ)上室溫下溫和攪拌60分鐘。
溶解細(xì)胞的同時(shí)，包被有4℃過(guò)夜的5B6單克隆抗體(在50mM碳酸鹽緩沖液中配成5.0μg/ml，pH9.6，100μl/格)的ELISA微量滴定板(Nunc Maxiscorp，Inter Med，Denmark)傾去上清液，在紙巾上壓干，用150μl/孔封閉緩沖液(含0.5％BSA(Intergen Compa-ny，Purchansa，NY)和0.01％硫柳汞的PBS)室溫下封閉60分鐘，同時(shí)溫和攪拌。60分鐘后，包被有抗gD56的試驗(yàn)板用自動(dòng)洗板器(ScanWasher300，Skatron Instruments，Inc.Sterling，VA)以洗滌緩沖液(含0.05％Tween-20和0.01％硫柳汞的PBS)洗滌6次。
將含有從細(xì)胞培養(yǎng)物微量滴定孔中溶解的MPL/Rse.gD的裂解液(85μl/格)轉(zhuǎn)移至包被有抗gD56且被封閉的ELISA孔中，室溫下孵育2小時(shí)，同時(shí)溫和攪拌。用洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的mpl-Rse.gD，并在每孔中加入100μl按1∶18000稀釋在稀釋緩沖液(含0.5％BSA，0.05％Tween-20，5mMEDTA和0.01％硫柳汞的PBS)中的生物素標(biāo)記的4G10(抗磷酸酪氨酸)，即每孔加入56ng/ml。室溫下孵育2小時(shí)后，洗板并每孔加入按1∶60000稀釋在稀釋緩沖液中的辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)共軛的鏈霉親和素(Zymed實(shí)驗(yàn)室，S.San Francisco，CA)。室溫下，溫和攪拌，孵育30分鐘。游離的親和素共軛物被洗去，每孔加入100μl新制備的底物溶液(N-四甲聯(lián)苯胺(TMB)；2組份底物套配試劑；Kirkegaard和Perry，Gaighersburg，MD)。反應(yīng)10分鐘，然后加入100μl/孔1.0mMH3PO4終止顯色反應(yīng)。參照650nm處的吸光度讀出450nm處的值(ABS450/650)，使用的是用Macintosh Centris650(Apple計(jì)算機(jī)，Cupertino，CA)和DeltaSoft軟件(BioMetallics，Inc，Princeton，NJ)控制的vmax板讀數(shù)器(Molecular Divices，Plao Alto CA)。
用200、50、12.5、3.12、0.78、0.19、0.048或0ng/ml mpl配體刺激dp12.trkA、B或C.gD細(xì)胞，利用DeltaSoft程序繪制成ng/mlTPO對(duì)平均ABS450/650±標(biāo)準(zhǔn)差的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用內(nèi)插法由吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取樣品濃度，表示為ng/mlTPO活性。
mpl-配體被發(fā)現(xiàn)能夠以濃度依賴性或配體特異性方式激活mpl-Rse.gD嵌合受體。另外，mpl-Rse.gD KIRA-ELISA被發(fā)現(xiàn)能耐受高達(dá)100％的人血清(已顯示)或100％的血漿(未顯示)，從而使該測(cè)試可用于方便地篩選病人和pK樣品。
293-產(chǎn)生的TPO332標(biāo)準(zhǔn)曲線
TPO EC50′s的概括
實(shí)施例18
用于血小板生成素的基于受體的ELISAELISA板包被以于pH9.6碳酸鹽緩沖液中的兔F(ab′)2抗人IgG(Fc)，于4℃放置過(guò)夜。用溶于PBS中的0.5％牛血清白蛋白室溫下封閉1小時(shí)。在試驗(yàn)板上加含嵌合受體，mpl-IgG，的發(fā)酵器收獲物并孵育2小時(shí)。在試驗(yàn)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品(由293細(xì)胞產(chǎn)生的TPO332，其濃度由定量氨基酸分析確定)的兩倍連續(xù)稀釋液和在0.5％牛血清白蛋白、0.05％Tween20中連續(xù)稀釋的樣品，孵育2小時(shí)。用純化的蛋白A、在E.coli中產(chǎn)生的TPO155的生物素標(biāo)記的免抗體檢測(cè)結(jié)合的TPO(孵育1小時(shí))，然后加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶(孵育30分鐘)并以3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺為底物。讀取450nm處的吸光度。在每步之間都要洗滌試驗(yàn)板。為了進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Kaleidagraph的4參數(shù)曲線擬合程序擬合一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度。
實(shí)施例19293細(xì)胞TPO的表達(dá)與純化1. 293細(xì)胞表達(dá)載體的制備通過(guò)以下列寡核苷酸為引物的PCR，可以得到相應(yīng)于TPO整個(gè)開(kāi)放讀框的一個(gè)cDNA。
表11293PCR引物
在加入pfuDNA聚合酶(Stratagene公司)的反應(yīng)中，PRK5-hmplI(參見(jiàn)實(shí)施例9)被用作模板。在最初的94℃7分鐘變性之后，續(xù)以25個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94℃，1分鐘；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘)。最后的延伸為72℃，15分鐘。純化PCR產(chǎn)物并在質(zhì)粒pRK5tkneo的限制性位點(diǎn)Clal和Xbal之間克隆產(chǎn)物以獲得載體pRK5tkneo.ORF，pPK5tkneo是修飾pRK5后得到的載體，能在胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)新霉素抗性。相應(yīng)于epo同源結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)構(gòu)建物由同樣的方法生成，但所用的引物正向?yàn)镃la.FL.F，反向?yàn)锳rg.STOP.Xba5′TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3′(SEQ ID NO66)最后的構(gòu)建物稱為pRK5-tkneoEPO-D。這兩個(gè)構(gòu)建物的序列參見(jiàn)實(shí)施例7。2.人胚腎細(xì)胞的轉(zhuǎn)染用CaPO4方法將這兩個(gè)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞中，參見(jiàn)實(shí)施例9。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，在0.4mg/ml的G418中，開(kāi)始選擇對(duì)新霉素抗性的克隆。10至15天后，將單個(gè)的集落轉(zhuǎn)移到96孔板中并使之生長(zhǎng)至匯合。來(lái)自這些克隆的ML153和ML332在條件培養(yǎng)基中的表達(dá)可通過(guò)Ba/F3-mpl增殖測(cè)定來(lái)評(píng)估(參見(jiàn)實(shí)施例1)。3.rhML332的純化將293-rhML332培養(yǎng)基上樣于在10mM磷酸鈉pH7.4(緩沖液A)中平衡的Blue-Sepharose(pharmacia公司)柱。隨后，各以10倍柱體積的緩沖液A和含2M脲的緩沖液A洗滌柱。然后，用含2M脲和1MNaCl的緩沖液A洗脫柱。接著，將Blue-Sepharose柱的洗脫集合物直接上樣于用緩沖液A平衡的麥胚凝集素Sepharose柱。麥胚凝集素Sepharose柱的洗滌用10倍柱體積含2M脲和1MNaCl的緩沖液A，而洗脫用同樣的緩沖液但還含有0.5M N-乙酰-D-葡糖胺。麥胚凝集素Sepharose柱的洗脫物上樣于在0.1％TFA中平衡的C4高效液相色譜柱(synchrom公司)。C4高效液相色譜柱是用不連續(xù)的丙醇梯度來(lái)洗脫(0-25％、25-35％、35-70％)。發(fā)現(xiàn)rhML332在28-30％丙醇梯度區(qū)域被洗脫。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，被提純的rhML332在凝膠的68-80千道爾頓區(qū)域以一條寬帶遷移(參見(jiàn)圖15)。4.rhML153的純化293-rhML153條件培養(yǎng)基以與rhML332相同的方式在Blue-Sepharose上被分離。與上述方法相同，Blue-Sepharose洗脫物被直接上樣于一個(gè)mpl親和柱。在與上述rhML332相同的條件下，使用一個(gè)C4高效液相色譜柱純化從mpl親和柱上洗脫下來(lái)的rhML153，使之達(dá)到均一性。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將被純化的rhML153分離成兩條主帶和兩條次帶，分子量約18,000-21,000(參見(jiàn)圖15)。
實(shí)施例20CHO的TPO表達(dá)與純化1.CHO表達(dá)載體的描述在下述的電穿孔法方案中使用的表達(dá)載體已經(jīng)被指明pSV15.ID.LL.MLORF(全長(zhǎng)的或hTPO332)，和pSV15.ID.LL.MLEPO-D(截短的或hTPO153)。有關(guān)這些質(zhì)粒的性質(zhì)見(jiàn)圖23和圖24。2.CHO表達(dá)載體的制備通過(guò)以表12所示的寡核苷酸為引物的PCR，可以得到相應(yīng)于TPO整個(gè)開(kāi)放讀框的一個(gè)cDNA。
表12CHO表達(dá)載體PCR引物
在加入pfuDNA聚合酶(Stratagene公司)的反應(yīng)中，PRK5-hmplI(參見(jiàn)實(shí)施例7和9)被用作模板。在最初的94℃、7分鐘變性之后，續(xù)以25個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(94℃，1分鐘；55℃，1分鐘和72℃，1分鐘)。最后的延伸為72℃，15分鐘。純化PCR產(chǎn)物并在質(zhì)粒pSV15.ID.LL的限制性位點(diǎn)Clal和Sall之間克隆產(chǎn)物以獲得載體pSV15.ID.LL.MLORF。相應(yīng)于epo同源結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)構(gòu)建物由同樣的方法生成，但所用的引物正向?yàn)镃la.FL.F2，反向?yàn)镋POD.Sal 5′AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3′(SEQ ID NO68)最后的構(gòu)建物被稱為pSV15.ID.LL.MLEPO-D。這兩個(gè)構(gòu)建物的序列都參見(jiàn)實(shí)施例7和9。
本質(zhì)上，全長(zhǎng)和截短配體的編碼序列被引入CHO表達(dá)載體pSV15.ID.LL的多克隆位點(diǎn)。該質(zhì)粒含有SV40的早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域、一個(gè)含有鼠DHFR cDNA的修飾剪接單位、一個(gè)引入所需基因的多克隆位點(diǎn)(這里，TPO的序列已被描述)、一個(gè)SV40的聚腺苷酸化信號(hào)和復(fù)制起點(diǎn)，以及細(xì)菌中用于質(zhì)粒選擇和擴(kuò)增的β內(nèi)酰胺酶基因。3.建立穩(wěn)定的表達(dá)重組人TPO332和TPO153的CHO細(xì)胞系的方法a.CHO親代細(xì)胞系的描述本文所述用于TPO分子表達(dá)的宿主CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞系已知為CHO-DP12(參見(jiàn)1989年3月15日出版的EP307,247)。為了得到對(duì)胰島素需求降低的克隆，用表達(dá)前胰島素原的一個(gè)載體轉(zhuǎn)染親代系(CHO-K1 DUX-B11(DHFR-)-，經(jīng)Dr.L.Chasin同意，從斯坦福大學(xué)的Dr.Frank Lee處得到)，從克隆中選擇出這個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。這些細(xì)胞也是DHFR缺陷的，且通過(guò)在缺少核苷補(bǔ)充(甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷)的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，對(duì)DHFR cDNA載體序列存在的選擇而獲得克隆。這一作為穩(wěn)定表達(dá)CHO細(xì)胞系的選擇系統(tǒng)是通常所使用的。
b.轉(zhuǎn)染方法(電穿孔法)TPO332和TPO153表達(dá)細(xì)胞系經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染DP12細(xì)胞而產(chǎn)生(參見(jiàn)如Andreason，G.L.J.Tiss.Cult.Meth.，15，56)，并相應(yīng)地使用線性化質(zhì)粒pSV15.ID.LL.MLORF或pSV.ID.LL.MLEPO-D。對(duì)每一個(gè)質(zhì)粒的切割建立了三個(gè)限制性酶反應(yīng)10微克、25微克和50微克載體及酶NOTI，并用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法。該限制性位點(diǎn)只在載體中發(fā)現(xiàn)一次，位于線性化區(qū)域3′和TPO配體轉(zhuǎn)錄單位以外(參見(jiàn)圖23)。建立100微升反應(yīng)體系并37℃溫育過(guò)夜。第二天，用酚-氯仿-異戊醇(50∶49∶1)抽提一次并在干冰上用乙醇沉淀約1小時(shí)。然后，經(jīng)15分鐘微量離心分離和干燥收集沉淀物。將線性化的DNA重懸于50微升補(bǔ)充了標(biāo)準(zhǔn)抗生素和2mM谷氨酰胺的Ham′s DMEM-F12 1∶1培養(yǎng)基中。
收集懸浮生長(zhǎng)的DP12細(xì)胞，在用于重懸DNA的培養(yǎng)基中洗滌一次并最終以每750微升107細(xì)胞的濃度重懸于同樣的培養(yǎng)基中。細(xì)胞的等分試樣(750微升)和每個(gè)線性化DNA混合物一起在室溫中溫育1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到一個(gè)BRL電穿孔槽中。接著，在350伏特、330微法和低電容的標(biāo)準(zhǔn)BRL電穿孔儀中電穿孔每一個(gè)反應(yīng)混合物。在電穿孔之后，可將細(xì)胞在儀器中再放置5分鐘，然后在冰上再培育10分鐘。將電穿孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到60毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿中，其中含有5毫升用于培養(yǎng)CHO細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)完全培養(yǎng)基(High葡萄糖DMEM-F12 50∶50，不含甘氨酸，補(bǔ)充了1X GHT、2mM谷氨酰胺和5％胎牛血清)，并在5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱中生長(zhǎng)過(guò)夜。
c.選擇和篩選方法第二天，細(xì)胞以標(biāo)準(zhǔn)方法從平板上被胰酶消化并被轉(zhuǎn)移到含有DHFR選擇培養(yǎng)基的150毫米組織培養(yǎng)皿中(Ham′s DMEM-F12，1∶1培養(yǎng)基，如上所述，補(bǔ)充了2％或5％的透析胎牛血清，但缺少甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷，這是我們所使用的標(biāo)準(zhǔn)DHFR選擇培養(yǎng)基)。來(lái)自每一個(gè)60毫米平板的細(xì)胞隨后被重新涂布到5/150平板。然后，細(xì)胞在37℃/5％CO2中溫育10至15天(中間換一次培養(yǎng)基)直到克隆出現(xiàn)且達(dá)到適合轉(zhuǎn)移到96孔板的大小。在過(guò)了4至5天后，用設(shè)置為50毫升的無(wú)菌移液管將細(xì)胞系轉(zhuǎn)移到96孔板上。使細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合后(通常3至5天)，胰酶消化培養(yǎng)皿并復(fù)制出原來(lái)培養(yǎng)皿的兩個(gè)拷貝。這兩個(gè)拷貝被短期儲(chǔ)存于冷凍器，且每個(gè)孔中的細(xì)胞都稀釋于50微升含10％FCS的DMSO中。通過(guò)基于Ba/F3細(xì)胞的活性測(cè)定，從第三個(gè)培養(yǎng)皿中的匯合生長(zhǎng)孔測(cè)定5天不含血清的條件培養(yǎng)基中樣品的TPO表達(dá)?；谶@一測(cè)定的最高表達(dá)克隆從儲(chǔ)存中復(fù)蘇，并被擴(kuò)大到兩個(gè)匯合生長(zhǎng)的150毫米T-燒瓶中，用于為了懸浮適應(yīng)性、再測(cè)定和儲(chǔ)存而進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)物組的轉(zhuǎn)移。
d.擴(kuò)增方案通過(guò)上述選擇得到的幾個(gè)最高效價(jià)的細(xì)胞系隨后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)氨甲喋呤擴(kuò)增方法而生成更高效價(jià)的克隆。CHO細(xì)胞克隆被擴(kuò)展并涂布于10厘米培養(yǎng)皿，其中有4個(gè)氨甲喋呤濃度(如50nM、100nM、200nM和400nM)，2至3個(gè)細(xì)胞數(shù)量(每皿105、5×105和106個(gè)細(xì)胞)。然后，將這些培養(yǎng)物37℃/5％CO2溫育，直至克隆形成且適合于轉(zhuǎn)移到96孔板進(jìn)行進(jìn)一步的分析。從這一選擇中得到的幾個(gè)高效價(jià)克隆再被加入到更高濃度(如600nM、800nM、1000nM和1200nM)的氨甲喋呤中并如前所述，抗性克隆可以形成并被轉(zhuǎn)移到96孔板中用于測(cè)定。4.培養(yǎng)表達(dá)重組人TPO332和TPO153的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系儲(chǔ)存的細(xì)胞被解凍，且在不含血清或含血清的培養(yǎng)基中，以標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長(zhǎng)方法將細(xì)胞群擴(kuò)展。在擴(kuò)展到足夠的細(xì)胞密度后，洗滌細(xì)胞以除去不再使用的細(xì)胞培養(yǎng)基。然后，用任何標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞，包括分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)或者在25-40℃、中性pH值、溶氧含量不低于5％的條件下連續(xù)培養(yǎng)直至組成型分泌的TPO聚集。隨后，以離心等機(jī)械方法將細(xì)胞培養(yǎng)液與細(xì)胞分離。5.來(lái)自CHO培養(yǎng)液的重組人TPO的純化收集到的細(xì)胞培養(yǎng)液(HCCL)被直接上樣于Blue Sepharose 6Fast Flow柱(Pharmacia公司)，柱的平衡用0.01M pH7.4的磷酸鈉和0.15M NaCl，在直線流速約50毫升/小時(shí)/平方厘米時(shí)，按每升樹(shù)脂約100升HCCL的比率來(lái)上樣。然后，用3至5倍柱體積平衡液、續(xù)以3至5倍柱體積的0.01M磷酸鈉pH7.4、2.0M脲和1.0MNaCl來(lái)洗滌柱。
然后，將含TPO的Blue Sepharose集合物上樣于麥胚凝集素Sepharose 6MB柱(Pharmacia公司)，柱的平衡用0.01M磷酸鈉pH7.4，2.0M脲和1.0MNaCl，在直線流速約50毫升/小時(shí)/平方厘米時(shí)，按每毫升樹(shù)脂約8至16毫升Blue Sepharose集合物的比率來(lái)上樣。隨后，以2至3倍柱體積的平衡緩沖液洗滌柱。接著，TPO的洗脫用2至5倍柱體積的0.01磷酸鈉pH7.4、2.0M脲和0.5MN-乙酰-D-葡糖胺。
然后，將麥胚凝集素集合物的終濃度調(diào)整到0.04％C12E8和0.1％三氟醋酸(TFA)。得到的集合物被上樣于C4反相柱(Vydac214TP1022)，柱的平衡用0.1％TFA和0.04％C12E8，在流速為157毫升/小時(shí)/平方厘米時(shí)，按每毫升樹(shù)脂約0.2至0.5毫克蛋白質(zhì)的比率上樣。
蛋白質(zhì)在含0.1％TFA和0.04％C12E8的乙腈雙相線性梯度中洗脫。第一相由15分鐘內(nèi)0-30％的乙腈線性梯度構(gòu)成。第二相由60分鐘內(nèi)30-60％的乙腈線性梯度構(gòu)成。在乙腈濃度約50％時(shí)，TPO被洗脫。在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上獲得一個(gè)集合物。
然后，用2倍體積的0.01M磷酸鈉pH7.4和0.15M NaCl稀釋C4集合物，并以約6倍體積的0.01M磷酸鈉pH7.4和0.15M Na-Cl在一個(gè)Amicon YM或有一個(gè)10,000至30,000道爾頓分子量截?cái)嗟念愅笧V膜上透濾。得到的透濾液可隨后經(jīng)超濾進(jìn)一步濃縮。透濾液/濃縮液被調(diào)整到一個(gè)0.01％吐溫80的終濃度。
隨后，等于總和柱體積2-5％的全部或部分透濾液/濃縮液被上樣于Sephacryl S-300 HR柱(Phamacia公司)，柱的平衡用0.01M磷酸鈉、pH7.4、0.15M NaCl和0.01％吐溫80，并以17毫升/小時(shí)/平方厘米的速率進(jìn)行色譜分析。含有無(wú)聚集體或蛋白水解降解產(chǎn)物組分的TPO通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳被集合。得到的集合物用0.22μ濾紙、Millex-GV或類似物過(guò)濾，并儲(chǔ)存于2-8℃。
實(shí)施例21大腸桿菌中TPO蛋白合成的轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)1.大腸桿菌TPO表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒pMP21、pMP151、pMP41、pMP57和pMP202都被設(shè)計(jì)成用于表達(dá)在一個(gè)短前導(dǎo)區(qū)下游的，TPO前155個(gè)氨基酸，該短前導(dǎo)區(qū)因不同的構(gòu)建物而有變化。這個(gè)前導(dǎo)區(qū)主要提供高水平的翻譯起始和快速純化。質(zhì)粒pMP210-1、-T8、-21、-22、-24和-25被設(shè)計(jì)用于表達(dá)在一個(gè)起始甲硫氨酸下游的TPO前153個(gè)氨基酸，它們的區(qū)別僅在于對(duì)TPO前6個(gè)氨基酸的密碼子的用法，其中質(zhì)粒pMP251是pMP210-1的一個(gè)在TPO羧基末端延伸兩個(gè)氨基酸而得到的衍生物。在色氨酸啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下，所有的上述質(zhì)粒能在大腸桿菌中產(chǎn)生高水平的TPO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Yansura，D.G.等，Method in Enzymology(Goeddel，D.V.，編輯)18554-60，A-cademic Press，San Diego)。質(zhì)粒pMP1和pMP172是上述TPO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中的中間物。
(a)質(zhì)粒pMP1質(zhì)粒pMP1是TPO前155個(gè)氨基酸的一個(gè)分泌型載體，它的構(gòu)建是通過(guò)如圖33所示的將5個(gè)DNA片段連接在一起。其中的第一個(gè)片段是已經(jīng)除去短MluI-BamHI片段的pPho21載體。pPho21是phGH1(Chang，C.N.等，Gene 55189-196)的一個(gè)衍生物，其中人生長(zhǎng)激素基因已經(jīng)被大腸桿菌phoA基因替代，且在氨基酸20-21處的STII信號(hào)序列的編碼序列中，已經(jīng)插入一個(gè)Mlul限制性位點(diǎn)。
接下來(lái)的兩個(gè)片段中，一個(gè)是來(lái)自pRK5-hmplI(實(shí)施例9)的258個(gè)堿基對(duì)的DNA HinfI-PstI片段，編碼TPO氨基酸19-103，另一個(gè)是下述的編碼氨基酸1-18的合成DNA5＇-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGTGATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGACGAAGCACTGA-5′(SEQ ID NO69)(SEQ ID NO70)這兩個(gè)片段以T4 DNA連接酶預(yù)先連接，接著以PstI切割。第四個(gè)片段是一個(gè)來(lái)自pRK5hmpl I的152個(gè)堿基對(duì)的PstI-HaeIII片段，編碼TPO的104-155位置的氨基酸。最后一個(gè)片段是一個(gè)來(lái)自pdh108的412個(gè)堿基對(duì)的StuI-BamHI片段，含有如上述的轉(zhuǎn)錄終止子λ(Scholtissek，S.等，NAR 153185)。
(b)質(zhì)粒pMP21質(zhì)粒pMP21是為了表達(dá)TPO的前155個(gè)氨基酸而設(shè)計(jì)出來(lái)的，該表達(dá)過(guò)程需要一個(gè)包含部分STII信號(hào)序列的13個(gè)氨基酸的前導(dǎo)區(qū)的幫助。如圖34所示，該質(zhì)粒的構(gòu)建是通過(guò)將3個(gè)DNA片段連接在一起。其中的第一個(gè)是除去了短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。載體pVEG是pHGH207-1(de Boer，H.A.等，in Pro-moter Structure and Function(Rodriguez，R.L.and Chamber-lain，M.J.，編輯)，462，Praeger，New York)的一個(gè)衍生物，其中的人生長(zhǎng)激素基因被血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因所替代(同樣的載體片段可以從稍后的質(zhì)粒獲得)。
連接的第二部分是有下述序列的合成DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAATTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5′(SEQ ID NO71)(SEQ ID NO72)最后一個(gè)片段是來(lái)自pMP1的1072個(gè)堿基對(duì)的MluI-SphI片段，編碼TPO的155氨基酸。
(c)質(zhì)粒pMP151質(zhì)粒pMP151是為了表達(dá)一個(gè)前導(dǎo)區(qū)下游的TPO前155個(gè)氨基酸而設(shè)計(jì)的，該前導(dǎo)區(qū)由STII信號(hào)序列的7個(gè)氨基酸、8個(gè)組氨酸和一個(gè)因子X(jué)a斷裂位點(diǎn)組成。如圖35所示，pMP151通過(guò)三個(gè)DNA片段的連接而構(gòu)建。其中的第一個(gè)就是上述的除去XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個(gè)是有下列序列的合成DNA雙螺旋5＇-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAAGGTCGTAGCCTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTCCAGCAT-5′(SEQ ID NO73)(SEQ ID NO74)最后一個(gè)是來(lái)自pMP11的1064個(gè)堿基對(duì)的BglI-SphI片段，編碼TPO的154氨基酸。除了在STII信號(hào)序列(該片段可從pMP1中獲得)中一些密碼子的變化外，質(zhì)粒pMP11與pMP1完全一樣。
(d)質(zhì)粒pMP202除了前導(dǎo)區(qū)中的因子X(jué)a斷裂位點(diǎn)被一個(gè)凝血酶斷裂位點(diǎn)替代外，質(zhì)粒pMP202與表達(dá)載體pMP151非常相似。如圖36所示，pMP202通過(guò)連接3個(gè)DNA片段而構(gòu)建。其中的第一個(gè)就是上述的除去短XbaI-SphI片段的pVEG31。第二個(gè)是有下述序列的DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCACATCGAACCACGTAGCCTTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTAGCTTGGTGCAT-5′ (SEQ ID NO75)(SEQ ID NO76)最后一個(gè)片段是來(lái)自上述質(zhì)粒pMP11的1064個(gè)堿基對(duì)的BglI-SphI片段。
(e)質(zhì)粒pMP172質(zhì)粒pMP172是TPO前153個(gè)氨基酸的一個(gè)分泌型載體，也是構(gòu)建pMP210的中間物。如圖37所示，pMP172的制備通過(guò)將3個(gè)DNA片段連接在一起。其中的第一個(gè)是除去了短EcoRI-HindIII部分的載體pLS32lamB。第二個(gè)是來(lái)自上述質(zhì)粒pMP11的946個(gè)堿基對(duì)的EcoRI-HgaI片段。最后一個(gè)片段是下述的合成DNA雙螺旋。5′-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO77)GGAGACGCAGTCCATCGA-5′ (SEQ ID NO78)(f)質(zhì)粒pMP210質(zhì)粒pMP210是為了表達(dá)在一個(gè)翻譯起始甲硫氨酸后的TPO前153個(gè)氨基酸而設(shè)計(jì)的。該質(zhì)粒實(shí)際上被制成一個(gè)質(zhì)粒庫(kù)，其中TPO前6個(gè)密碼子中的每一個(gè)都在第三個(gè)位置隨機(jī)變化。如圖38所示，該質(zhì)粒由三個(gè)DNA片段通過(guò)連接而構(gòu)建。其中的第一個(gè)是如上述的除去短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個(gè)是合成DNA雙螺旋，首先用DNA聚合酶(Klenow)處理，然后用XbaI和HinfI消化，編碼起始甲硫氨酸和TPO前6個(gè)隨機(jī)密碼子，其序列如下5′-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGAACACTGGAGGCT
GTTCTCAGTAAA(SEQ ID NO79)CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5′(SEQ ID NO80)第三個(gè)片段是來(lái)自pMP172的890個(gè)堿基對(duì)的HinfI-SphI片段，編碼TPO的19-153氨基酸。
約3700個(gè)克隆的質(zhì)粒pMP210庫(kù)被重新轉(zhuǎn)化到高四環(huán)素(50微克/毫升)LB平板上以選出高翻譯起始克隆(Yansura，D.G.等，MethodsA Companion to Methods in Enzymology 4151-158)。在8個(gè)培養(yǎng)于高四環(huán)素平板的集落中，選出5個(gè)TPO表達(dá)最好的進(jìn)行DNA測(cè)序，其結(jié)果如圖39所示(SEQ ID NOS23、24、25、26、27和28)。
(g)質(zhì)粒pMP41質(zhì)粒pMP41是為了表達(dá)TPO前155個(gè)氨基酸而設(shè)計(jì)的，其中TPO已融入了由7個(gè)氨基酸的STII信號(hào)序列后接一個(gè)因子X(jué)a斷裂位點(diǎn)而組成的前導(dǎo)區(qū)。如圖40所示，該質(zhì)粒通過(guò)將3個(gè)DNA片段連接在一起而構(gòu)建。其中的第一個(gè)是如上述的切除短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個(gè)是如下述的合成DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGT CGTAGCC (SEQ ID NO81)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT (SEQ ID NO82)最后的一個(gè)片段是來(lái)自上述質(zhì)粒pMP11的1064個(gè)堿基對(duì)的BglI-SphI片段。
(h)質(zhì)粒pMP57質(zhì)粒pMP57表達(dá)由9個(gè)氨基酸的STII信號(hào)序列和雙堿性位點(diǎn)Lys-Arg構(gòu)成的前導(dǎo)區(qū)下游的TPO前155個(gè)氨基酸。該雙堿性位點(diǎn)提供了一個(gè)用蛋白酶ArgC除去前導(dǎo)區(qū)的方法。如圖41所示，該質(zhì)粒通過(guò)三個(gè)DNA片段的連接而構(gòu)建。其中的第一個(gè)是上述的除去短XbaI-SphI片段的載體pVEG31。第二個(gè)是如下所示的合成DNA雙螺旋5′-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAA CGTAGCC(SEQ ID NO83)TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5′ (SEQ ID NO84)第三個(gè)片段是來(lái)自上述質(zhì)粒pMP11的1064個(gè)堿基對(duì)的BglI-SphI片段。
(i)質(zhì)粒pMP251質(zhì)粒pMP251是pMP210-1的一個(gè)衍生物，其中，在TPO的羧基末端加入兩個(gè)氨基酸。如圖42所示，該質(zhì)粒由兩個(gè)DNA片段連接而構(gòu)建。其中的第一個(gè)是上述的除去短XbaI-SphI片段的pMP21。連接的第二部分是來(lái)自pMP210-1的316個(gè)堿基對(duì)的XbaI-ApaI片段。2.帶有TPO表達(dá)載體的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)使用氯化鈣熱休克法(Mandel，M.等，J.Mol.Biol.，53159-162，)，上述的TPO表達(dá)質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)化大腸桿菌菌株44C6(w3110 tonAΔrpoHtslonΔclpPΔgalE)。首先，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在37℃和含50微克/毫升羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，直到培養(yǎng)物的光密度(600納米)達(dá)到約2至3。然后，在含0.49％酪蛋白氨基酸(w/v)和50微克/毫升羧芐青霉素的M9培養(yǎng)基中將LB培養(yǎng)基稀釋20倍。在30℃換氣條件下生長(zhǎng)1小時(shí)后，加入吲哚-3-乙酸使終濃度為50微克/毫升。然后，使培養(yǎng)物在30℃和換氣條件下繼續(xù)生長(zhǎng)15小時(shí)，最后用離心法收集細(xì)胞。
實(shí)施例22大腸桿菌中生物活性TPO(Met-1 1-153)的產(chǎn)生下述產(chǎn)生具有生物活性的重折疊TPO(Met-11-153)的程序可類似地應(yīng)用于包括N和C末端延伸形式在內(nèi)的其他TPO變異體的回收(參見(jiàn)實(shí)施例23)。A.不溶性TPO(Met-11-153)的回收以上述方法發(fā)酵表達(dá)由質(zhì)粒pMP210-1編碼的TPO(Met-11-153)的大腸桿菌。通常，用Polytron勻漿器，使約100克細(xì)胞重懸于1升(10倍體積)細(xì)胞裂解緩沖液(10mM Tris、5mM EDTA，pH6)，并以5,000×g離心細(xì)胞30分鐘。再次用Polytron勻漿器將經(jīng)洗滌的細(xì)胞沉淀重懸于1升細(xì)胞裂解緩沖液，并根據(jù)使用手冊(cè)，使細(xì)胞懸浮液通過(guò)一臺(tái)LH Cell Disrupter(LH Inceltech公司)或一臺(tái)Microfluidizer(Microgluidics International公司)。將懸浮液5,000g離心30分鐘后，再次重懸和離心以得到一個(gè)經(jīng)洗滌的折射體沉淀。該經(jīng)洗滌的沉淀需立即使用或冷凍儲(chǔ)存于-70℃。B.單體TPO(Met-11-153)的增溶和純化由上述步驟得到的沉淀重懸于5倍體積(按重量計(jì)算)的20mMTris pH8，加入6-8M胍和25mM DTT(二硫蘇糖醇)，并在4℃下，攪拌1至3小時(shí)或過(guò)夜使TPO蛋白質(zhì)增溶。也可使用高濃度的脲(6-8M)，但與胍相比，通常得到的產(chǎn)量較低。增溶之后，30,000xg離心溶液30分鐘以得到含變性單體TPO蛋白質(zhì)的上清液。然后，將上清液以2毫升/分鐘的流速在Superdex×200凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia公司，2.6×60厘米)上色譜，并用含10mM DTT的200mM磷酸鈉pH6.0洗脫。在160和200毫升之間洗脫的含單體變性TPO的組分被收集。TPO蛋白質(zhì)在半制備的C4反相柱(2×20厘米VYDAC)上被進(jìn)一步純化。樣品以5毫升/分鐘的速率上樣于用含30％乙腈的0.1％TFA(三氟醋酸)平衡的柱。以乙腈的線性梯度(60分鐘內(nèi)30-60％)洗脫蛋白質(zhì)。在約50％乙腈濃度時(shí)，純化的還原蛋白質(zhì)被洗脫。該產(chǎn)物經(jīng)重折疊后獲得生物活性的TPO變異體。C.生物活性TPO(Met-11-153)的產(chǎn)生在40毫升0.1％TFA/50％乙腈中的約20毫克單體、還原性和變性TPO蛋白質(zhì)被稀釋于360毫升重折疊緩沖液，其中最好含有下列試劑50mM Tris0.3M NaCl5mM EDTA2％CHAPS去垢劑25％甘油5mM氧化谷胱甘肽1mM還原谷胱甘肽pH調(diào)節(jié)到8.3在混合以后，4℃下溫和攪拌重折疊緩沖液12至48小時(shí)，從而獲得以正確的二硫鍵形式(參見(jiàn)下文)重折疊的TPO最高產(chǎn)量。然后，以終濃度0.2％TFA使溶液酸性化，經(jīng)0.45或0.22微米的濾紙過(guò)濾溶液，并加入1/10體積的乙腈。該溶液隨即被直接泵入C4反相柱并以與上文所述相同的梯度洗脫純化的重折疊TPO(Met-11-153)。在這些條件下，有生物活性的重折疊TPO在乙腈濃度約45％時(shí)被洗脫。不適當(dāng)?shù)亩蜴I的TPO形式被較早地洗脫下來(lái)。經(jīng)SDS凝膠和C4反相色譜分析的評(píng)估，最終的TPO(Met-11-153)純度大于95％。對(duì)于動(dòng)物研究，C4純化的物質(zhì)被透析入生理性可容緩沖液。使用含150mM NaCl和0.01％吐溫80的等滲緩沖液(10mM乙酸鈉pH5.5，10mM琥珀酸鈉pH5.5或10mM磷酸鈉pH7.4)。
由于TPO在Ba/F3測(cè)定中的高效價(jià)(約3皮克/毫升時(shí)達(dá)到最大刺激的一半)，有可能使用許多不同的緩沖液、去垢劑和氧化還原條件來(lái)得到生物活性物質(zhì)。但是，在大多數(shù)情況下，只能得到少量(＜10％)適當(dāng)折疊的物質(zhì)。對(duì)于商業(yè)性制造過(guò)程，希望重折疊的產(chǎn)量至少10％，30至50％更好，而大于50％則最好。已經(jīng)評(píng)估了許多不同的去垢劑(Triton X-100、十二烷基-β-麥芽苷、CHAPS、CHAPSO、SDS、十二烷基肌氨酸鈉、吐溫20和吐溫80、Zwittergent3-14和其他去垢劑)對(duì)支持高重折疊產(chǎn)量的效能。在這些去垢劑中，只發(fā)現(xiàn)CHAPS家族(CHAPS和CHAPSO)通常能用于在重折疊反應(yīng)中限制蛋白質(zhì)聚集和不適當(dāng)?shù)亩蜴I形成。高于1％CHAPS的水平最起作用。最佳的產(chǎn)量需要氯化鈉，其最適水平在0.1M和0.5M之間。加入EDTA(1-5mM)能限制某些制備物中的一些金屬催化氧化作用(和聚集作用)。大于5％的甘油濃度提供了最適的重折疊條件。為了得到最高的產(chǎn)量，必需同時(shí)加入氧化和還原谷胱甘肽或者氧化和還原半胱氨酸作為氧化還原對(duì)。通常，在氧化還原對(duì)中的氧化劑等于或多于還原劑時(shí)，可觀察到更高的產(chǎn)量。這些TPO變異體重折疊的最適pH值在7.5和約9之間。濃度為10至15％或更低的有機(jī)溶劑(如乙醇、乙腈和甲醇)可以被耐受。更高水平的有機(jī)溶劑增加不適當(dāng)折疊形式的量。Tris和磷酸鹽緩沖液通常是有用的。4℃溫育也能得到適當(dāng)折疊的TPO的更高水平。
通過(guò)第一個(gè)C4步驟純化的TPO制備物中通常有40至60％的重折疊產(chǎn)量(根據(jù)用于重折疊反應(yīng)的還原和變性TPO量)。在低純度的制備物中(如直接在Superdex200柱或最初的折射體抽提之后)可以得到活性物質(zhì)，雖然會(huì)因?yàn)門(mén)PO重折疊過(guò)程中過(guò)多的沉淀作用和非TPO蛋白質(zhì)的干擾而使產(chǎn)量減少。
由于TPO(Met-11-153)含有4個(gè)半胱氨酸殘基，它可能生成該蛋白質(zhì)的三個(gè)不同的二硫鍵形式形式1二硫鍵在半胱氨酸殘基1-4和2-3之間形式2二硫鍵在半胱氨酸殘基1-2和3-4之間形式3二硫鍵在半胱氨酸殘基1-3和2-4之間。
在確定重折疊條件的最初嘗試中，通過(guò)C4反相色譜分離出了幾個(gè)含TPO蛋白質(zhì)的不同峰。用Ba/F3測(cè)定法確定了其中只有一個(gè)峰有顯著的生物活性。隨后，調(diào)整重折疊條件以得到該形式的最高產(chǎn)量。在這些條件下，得到的全部單體TPO中，錯(cuò)誤折疊形式低于10-20％。
通過(guò)質(zhì)譜法和蛋白質(zhì)測(cè)序，已經(jīng)確定生物活性TPO的二硫鍵形式為1-4和2-3(即形式1)。多種C4分離峰的等分試樣(5-10納摩爾)用胰蛋白酶消化(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的摩爾比為1∶25)。在DTT還原作用之前或之后，通過(guò)基質(zhì)輔助的激光解吸質(zhì)譜法，分析消化混合物。在還原作用之后，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于TPO的大多數(shù)較大胰酶解肽的團(tuán)塊。在非還原樣品中，這些團(tuán)塊中的一些消失了而新的團(tuán)塊可觀察到。新峰的團(tuán)塊基本上對(duì)應(yīng)于涉及二硫鍵對(duì)的單個(gè)胰酶解肽的數(shù)目。因此，有可能明確地確認(rèn)重折疊、重組、生物活性的TPO的二硫鍵形式是1-4和2-3。這與相關(guān)的紅細(xì)胞生成素分子已知的二硫鍵形式是一致的。D.重組、重折疊TPO(Met-11-153)的生物活性重折疊和純化的TPO(Met-11-153)在體內(nèi)和體外的測(cè)定中都有活性。在Ba/F3測(cè)定中，在3.3皮克/毫升(0.3pM)時(shí)，摻入Ba/F3細(xì)胞的胸苷的刺激達(dá)到最大的一半。在基于mpl受體的ELISA中，1.9納克/毫升時(shí)，達(dá)到最大活性的一半。在正常的和用低致死X射線處理的骨髓抑制動(dòng)物中，TPO(Met-11-153)有刺激新的血小板生成的高潛力(在劑量低達(dá)30納克/鼠時(shí)可見(jiàn)到活性)。
實(shí)施例23大腸桿菌中其他生物活性TPO變異體的產(chǎn)生下文提供了在大腸桿菌中產(chǎn)生的被純化和重折疊成生物活性形式的三種不同TPO變異體。
(1)來(lái)自細(xì)菌的信號(hào)序列STII的MLF-13殘基被融入TPO的N-末端結(jié)構(gòu)域(殘基1-155)。得到的序列為MKKNIAFLLNAYASPAPPAC……CVRRA(SEQ ID NO85)其中的前導(dǎo)序列為下劃線部分，而C……C代表從半胱氨酸7到半胱氨酸151。該變異體的構(gòu)建提供一個(gè)酪氨酸用于受體和生物研究的TPO放射性碘化作用。
(2)由STII序列、8個(gè)組氨酸殘基和因子X(jué)a酶斷裂序列IEGR組成的H8MLF-7殘基被融入TPO的N-末端結(jié)構(gòu)域(殘基1-155)。其序列為MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC……CVRRA(SEQ ID NO86)其中的前導(dǎo)序列為下劃線部分，而C……C代表從半胱氨酸7到半胱氨酸151。當(dāng)被純化和重折疊時(shí)，該變異體可用酶因子X(jué)a處理，因子X(jué)a在序列IEGR的精氨酸殘基后進(jìn)行斷裂，以產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)度為155個(gè)殘基、有天然絲氨酸N-末端氨基酸的TPO變異體。
(3)除了一個(gè)凝血酶敏感序列IEPR被融入TPO的N末端結(jié)構(gòu)域外，T-H8MLF-以與上述變異體(2)相同的方法制備。得到的序列為MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC……CVRRA(SEQ ID NO87)其中的前導(dǎo)序列為下劃線部分，而C……C代表從半胱氨酸7到半胱氨酸151。在純化和重折疊之后，可用凝血酶處理該變異體以得到一個(gè)155個(gè)殘基長(zhǎng)度的TPO天然N-末端變異體。A.單體的生物活性TPO變異體(1)、(2)和(3)的回收、增溶和純化在大腸桿菌中能表達(dá)所有的變異體。如關(guān)于TPO(Met-11-153)的實(shí)施例22中所述，在折射體中發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)變異體。可以用與實(shí)施例22所述相同的程序回收、增溶和純化單體TPO變異體。使用與TPO(Met-11-153)所用相同的重折疊條件可獲得30至50％的總產(chǎn)量。在重折疊之后，用如上文所述的乙腈梯度，通過(guò)0.1％TFA中的C4反相色譜，提純TPO變異體。根據(jù)Ba/F3測(cè)定的評(píng)估，所有的TPO變異體(在它們的非蛋白水解形式)有生物活性，2-5pM時(shí)達(dá)到最大活性的一半。B.產(chǎn)生真N-末端TPO(1-155)的變異體(2)和(3)的蛋白水解過(guò)程上述的變異體(2)和(3)被設(shè)計(jì)成在TPO的正常N-末端氨基酸殘基前帶有一個(gè)可酶致斷裂的前導(dǎo)肽。在上述的變異體(2)和(3)的重折疊和純化之后，每一個(gè)都被合適的酶消化。對(duì)于每一個(gè)變異體，通過(guò)向溶液中吹入緩氣流氮來(lái)除去C4反相步驟中的乙腈。隨后，如下文所述，用因子X(jué)a或凝血酶處理兩種變異體。
對(duì)于TPO變異體(2)，將pH8的1M Tris緩沖液加入不含乙腈的溶液，使終濃度為50mM，且如有必要，將pH調(diào)節(jié)到8。加入NaCl和CaCl2，使?jié)舛认鄳?yīng)為0.1M和2mM。加入因子X(jué)a(New EnglandBiolabs公司)使酶和變異體的摩爾比為1∶25到1∶100。室溫溫育樣品1至2小時(shí)使斷裂達(dá)到最大值，通過(guò)表明前導(dǎo)序列丟失的SDS凝膠上的遷移變化可以評(píng)估出這個(gè)最大值。隨后，用與上述正確折疊變異體的純化相同的梯度和條件，通過(guò)C4反相色譜純化反應(yīng)混合物。通過(guò)這些條件，未斷裂的變異體B與斷裂的變異體(2)分離。N-末端氨基酸為SPAPP，表示N-末端前導(dǎo)序列被成功地除去。因子X(jué)a也在TPO結(jié)構(gòu)域內(nèi)產(chǎn)生不同數(shù)量的內(nèi)部斷裂；在位置118的精氨酸殘基生成一個(gè)額外的N-末端序列TTAHKDP(SEQ ID NO88)后，可以觀察到斷裂。在非還原SDS凝膠上，對(duì)應(yīng)于因子X(jué)a斷裂的變異體，可以觀察到約17,000道爾頓的單一條帶；在還原SDS凝膠上，對(duì)應(yīng)于在精氨酸118的斷裂，可以觀察到分子量約12,000和5,000道爾頓的兩個(gè)條帶。這一觀察也證實(shí)了，該分子的兩個(gè)部分通過(guò)第一和第四個(gè)半胱氨酸間的二硫鍵連在一起，這與上文所述胰酶消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的推斷是一致的。在Ba/F3生物測(cè)定中，除去N-末端前導(dǎo)序列和帶有內(nèi)部斷裂的純化TPO(1-155)變異體能在0.2至0.3pM時(shí)達(dá)到最大活性的一半。
對(duì)變異體(3)來(lái)說(shuō)，消化緩沖液含有pH8的50mM Tris、2％CHAPS、0.3M NaCl、5mM EDTA和人或牛凝血酶(Calbiochem公司)，其中后者(酶)和TPO變異體蛋白質(zhì)的重量比為1∶25至1∶50。消化作用為室溫下2-6小時(shí)。通過(guò)上述的因子X(jué)a斷裂反應(yīng)的SDS凝膠來(lái)評(píng)估消化進(jìn)程。通常，大于90％的前導(dǎo)區(qū)斷裂發(fā)生在這一時(shí)間。得到的TPO用如上所述的C4反相柱提純并通過(guò)氨基酸測(cè)序顯示出有所需的N-末端。如上述的通過(guò)因子X(jué)a在精氨酸-蘇氨酸鍵之間的內(nèi)部斷裂只得到很少量(＜5％)。得到的TPO蛋白質(zhì)有高生物活性，在Ba/F3測(cè)定中，0.2-0.4pM蛋白質(zhì)能達(dá)到最高應(yīng)答值的一半。在基于mpl受體的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中，2-4納克/毫升的純化蛋白質(zhì)(120-240pM)能達(dá)到最高應(yīng)答值的一半，而含有前導(dǎo)序列的完整變異體在兩個(gè)測(cè)定中的效能都要降低5至10倍。對(duì)于動(dòng)物研究，HPLC純化的斷裂蛋白質(zhì)被透析入生理性可容的緩沖液，其中含有150mM NaCl、0.01％吐溫80和pH5.5的10mM琥珀酸鈉、或pH5.5的10mM乙酸鈉、或pH7.4的磷酸鈉。通過(guò)HPLC和SDS凝膠，純化的蛋白質(zhì)在4℃保存中可穩(wěn)定幾個(gè)星期。在正常的和骨髓抑制的鼠中，這一有真N-末端序列的純化TPO是具有高度活性的，在低達(dá)30納克/鼠的低劑量下，能促進(jìn)血小板的生成。
實(shí)施例24合成mpl配體雖然通常用重組方法制備人mpl配體(hML)，但是也可以通過(guò)合成的肽片段的酶促連接來(lái)合成，其方法如下文所述。hML的合成生產(chǎn)允許非天然氨基酸或合成功能物如聚乙二醇的摻入。以前，已經(jīng)設(shè)計(jì)出了一個(gè)絲氨酸蛋白酶枯草蛋白酶DPN的突變體。構(gòu)建枯草連接酶(subtiligase)(8221C/P225A)，可用以有效地在水溶液中連接肽酯(Abrahmsen等，Biochem.，304151-4159)?，F(xiàn)在，已經(jīng)表明，合成肽能夠按順序地被酶促連接并產(chǎn)生具有酶促活性的長(zhǎng)肽和蛋白質(zhì)如核糖核酸酶A(Jackson等，Science，)。該技術(shù)使我們得以化學(xué)合成長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，而在以前，長(zhǎng)的蛋白質(zhì)只能用重組DNA技術(shù)來(lái)制得。更詳細(xì)的細(xì)節(jié)如下文所述。
使用枯草連接酶合成hML153的一般策略如方案1所示。以相應(yīng)于蛋白質(zhì)C-末端片段的完全去保護(hù)的肽為起點(diǎn)，將一條N-末端已保護(hù)的，C-末端激活的酯肽與枯草連接酶一起加入。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)反相高效液相色譜分離出產(chǎn)物，并將保護(hù)基團(tuán)從N-末端除去。連接下一個(gè)肽片段和去保護(hù)并使用一系列肽來(lái)重復(fù)這個(gè)過(guò)程直至得到全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)過(guò)程類似于這樣的固相方法一個(gè)N-末端被保護(hù)的、C-末端被激活的肽連接到前一個(gè)肽的N-末端，并使蛋白質(zhì)按照C→N的方向合成。雖然因?yàn)槊看闻鋵?duì)將導(dǎo)致多達(dá)50個(gè)殘基的加入且產(chǎn)物在每一次連接后被分離，但是較長(zhǎng)的高純度蛋白質(zhì)能夠以一個(gè)合理的產(chǎn)量被合成。
方案1.用枯草連接酶合成hML的策略R-NH-肽2-CO-R′+H2N-肽1-CO2↓1)枯草連接酶R-NH-肽2-CO-NH-肽1-CO2↓2)Zn/CH3CO2HH2N-肽2-CO-NH-肽1-CO2↓3)重復(fù)1+2H2N-肽3-CO-NH-肽2-CO-NH-肽1-CO2
根據(jù)對(duì)枯草連接酶序列特異性以及對(duì)hML生物活性“EPO結(jié)構(gòu)域”氨基酸序列的認(rèn)識(shí)，我們將hML153分割成長(zhǎng)度18至25個(gè)殘基的7個(gè)片段。合成測(cè)試的連接四肽用以確定18至25聚體的合適的連接接合點(diǎn)。表13顯示了這些測(cè)試連接的結(jié)果。
表13hML測(cè)試連接。在22℃、100mM麥黃酮中，溶解供體和親核體肽，使?jié)舛葹?0mM。從1.6mg/ml(約70μM)的儲(chǔ)備液中，取出連接酶并加入溶液，使終濃度為10μM。連接過(guò)程可過(guò)夜。產(chǎn)量根據(jù)相對(duì)于供體肽水解的連接百分率計(jì)算。
根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)，表14所示的連接肽應(yīng)該被枯草連接酶有效地連接。對(duì)于每個(gè)供體酯肽都需要一個(gè)合適的N末端保護(hù)基團(tuán)來(lái)防止自身連接。我們選擇異煙酰(iNOC)保護(hù)基團(tuán)(Veber等，J.Org.Chem.，423286-3289)，因?yàn)樗撬苄缘?，能在固相肽合成的最后一步被摻入，并且它在用于去保護(hù)和將肽從固相樹(shù)脂上分離下來(lái)的無(wú)水HF中能保持穩(wěn)定。另外，在弱還原條件下(鋅/乙酸)，它能夠在每一次連接之后從肽上被除去，從而生成一個(gè)用于隨后連接反應(yīng)的游離N末端。羥乙酸鹽-賴氨酰-酰胺(glc-K-NH2)酯被用作激活C-末端，其根據(jù)是以前的實(shí)驗(yàn)顯示它能被枯草連接酶有效地?；?Abrahmsen等，Biochem.，304151-4159)。被iNOC保護(hù)和被glc-K-amide激活的肽能使用標(biāo)準(zhǔn)的固相方法來(lái)合成，其要點(diǎn)見(jiàn)于方案2。然后，將肽按順序連接直至生成完整的蛋白質(zhì)，并且終產(chǎn)物在體外被重折疊。根據(jù)與EPO的同源性，相信在半胱氨酸殘基7和151以及28和85之間會(huì)形成二硫化物對(duì)。只需在氧化環(huán)境中攪拌該還原物幾個(gè)小時(shí)，就能使二硫化物氧化。重折疊產(chǎn)物隨后用高效液相色譜法純化并將含活性蛋白質(zhì)的組分合并且凍干保存。另外，可用不同的方法來(lái)保護(hù)二硫化物以控制在特定的二硫化物對(duì)之間的一系列氧化作用。用乙酰胺甲基(acm)基團(tuán)對(duì)半胱氨酸7和151的保護(hù)保證了28和85的氧化作用。隨后，可將acm基團(tuán)除去并將殘基7和151氧化。反之，在需要一系列氧化作用來(lái)使折疊正確時(shí)，可將殘基28和85用acm保護(hù)并氧化。或者，半胱氨酸28和85可被另一個(gè)除半胱氨酸以外的天然或非天然氨基酸置換，以保證半胱氨酸7和151的正確氧化。
表14.用枯草連接酶進(jìn)行合成完整hML所使用的肽片段片段序列1(SEQ ID NO110)iNOC-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-K-NH2(1-22)2(SEQ ID NO111)iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-K-NH2(23-46)3(SEQ ID NO112)iNOC-HN-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-K-NH2(47-69)4(SEQ ID NO113)iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH2(70-90)5(SEQ ID NO114)iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-K-NH2(90-106)6(SEQ ID NO115)iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-K-NH2(107-128)7(SEQ ID NO116)H2N-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO2(129-153)完成肽連接的條件為25℃，100mM麥黃酮pH8(新鮮制備并經(jīng)5μM濾紙的真空過(guò)濾排氣)。通常，C-末端片段被溶解于緩沖液(2-5mM肽)中，且加入枯草連接酶10×儲(chǔ)備液(pH8的100mM麥黃酮中，濃度1mg/ml)使最終的酶濃度達(dá)到約5μM。3至5摩爾的過(guò)量glc-K-NH2激活的供體肽隨后以不溶性的固體形式加入并使混合物于25℃靜止。連接的監(jiān)測(cè)通過(guò)反相C18高效液相色譜分析(0.1％三氟醋酸中的CH3CN/H2O梯度)。連接產(chǎn)物通過(guò)制備的高效液相色譜純化并凍干。異煙酰(iNOC)的去保護(hù)通過(guò)在乙酸中將由鹽酸活化的鋅屑與被保護(hù)的肽一起攪拌。鋅屑通過(guò)過(guò)濾除去，乙酸則通過(guò)真空蒸發(fā)。得到的肽能直接用于下一步連接并重復(fù)上述過(guò)程。合成的hML153能夠以類似上文所述的步驟連接于合成的或重組hML154-332，從而產(chǎn)生合成或半合成的全長(zhǎng)hML。
合成的hML相對(duì)于重組體有很多優(yōu)勢(shì)?？梢砸敕翘烊坏膫?cè)鏈以提高效能或特異性?？梢該饺攵嗑垠w功能物如聚乙二醇，以增加作用的延續(xù)時(shí)間。例如，在一步或多步連接完成之前或之后，聚乙二醇可以被連接于個(gè)別片段的賴氨酸殘基(表14)。蛋白酶敏感肽鍵可以被除去或改變以提高在體內(nèi)的穩(wěn)定性。另外，可以合成重原子衍生物以幫助確定結(jié)構(gòu)。
方案2.用于片段連接的肽片段的固相合成 a)賴氨酰-對(duì)甲基苯hydrylamine(MBHA)樹(shù)脂1(0.63meq./gm.，Advanced ChemTech)在甲基乙酰胺(DMA)溶液中和25℃時(shí)，與溴乙酸(5eq.)和二異丙基碳化二亞胺(5eq.)一起攪拌1小時(shí)，從而得到溴乙酸衍生物2。b)用DMA大量洗滌樹(shù)脂并在二甲基甲酰胺(DMF)中和50℃時(shí)，與二碳酸鈉一起攪拌24小時(shí)以酯化單個(gè)的Boc保護(hù)的氨基酸，從而得到相應(yīng)的羥乙酸鹽-苯丙氨酰-氨酰-樹(shù)脂3。氨基乙?；瘶?shù)脂用DMF(3×)和二氯甲烷(CH2Cl2)(3×)洗滌并可在室溫保存數(shù)月。隨后，可將樹(shù)脂3上樣于一臺(tái)自動(dòng)肽合成儀(Ap-plied Biosystems 430A)并使用標(biāo)準(zhǔn)固相程序(5)使肽延伸。c)用45％三氟乙酸的CH2Cl2溶液除去N-α-Boc基團(tuán)。d)隨后的Boc保護(hù)氨基酸(5eq.)預(yù)先用DMA中的苯并三唑-1-yl-oxy-tris-(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP，4eq.)和N-甲基嗎啉(NMM，10eq.)激活并偶聯(lián)1至2小時(shí)。e)除去最后的N-α-Boc基團(tuán)(TFA/CH2Cl2)以得到4，并且如前文所述，通過(guò)在DMA中和25℃時(shí)與4-異煙酰-2-4-二硝基苯碳酸鹽(3eq.)和NMM(6eq.)一起攪拌24小時(shí)，引入異煙酰(iNOC)保護(hù)基團(tuán)。f)通過(guò)0℃無(wú)水HF(5％苯甲醚/5％乙基甲基sufide)處理1小時(shí)，使肽斷裂和去保護(hù)，從而得到iNOC保護(hù)的，羥乙酸鹽激活的肽5，并用反相C1 8高效液相色譜(CH3CN/水梯度，0.1％TFA)純化。所有底物的鑒定由質(zhì)譜法來(lái)完成。
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *補(bǔ)充的可實(shí)現(xiàn)性根據(jù)上述的說(shuō)明和易獲得的參考文獻(xiàn)以及起始材料，可以實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求書(shū)所提出的本發(fā)明內(nèi)容。不過(guò)，申請(qǐng)人已經(jīng)在AmericanType Culture Collection，Rockville，Md.，USA(ATCC)中保存了下列細(xì)胞系大腸桿菌，DH10B-pBSK-hmpl I 1.8，ATCC登記號(hào)CRL69575，1994年2月24日保存；質(zhì)粒，pSV15.ID.LL.MLORF，ATCC登記號(hào)75958，1994年12月2日保存；和CHO DP-12細(xì)胞，ML 1/50 MCB(標(biāo)記#1594)，ATCC登記號(hào)CRL11770，1994年12月6日保存。
該保存物是在Budapest Treaty的規(guī)定下，受到微生物保存的國(guó)際性認(rèn)可，并以專利程序及其規(guī)則(Budapest Treaty)為目的而制成的。這保證了自保存之日起，能維持有活力的培養(yǎng)物30年。在Bu-dapest Treaty規(guī)定的期限內(nèi)，依據(jù)申請(qǐng)人和ATCC之間的協(xié)議，可以從ATCC得到所需的生物，其中ATCC應(yīng)在有關(guān)的美國(guó)專利的保證下，確保不受限制的可獲得性。被保存菌株的可獲得性不能解釋為在違反由任何政府依據(jù)其專利法而授予的權(quán)利時(shí)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用。
* * * * * * * * * * * * * * * * * * *雖然本發(fā)明的描述必然要結(jié)合優(yōu)選例子和特定的操作性實(shí)施例，但是在閱讀了前述的說(shuō)明以后，只要不偏離本發(fā)明的精神和范疇，一名普通的技術(shù)人員將可以實(shí)現(xiàn)本文中所述的多種變化、等價(jià)物的置換和題材的變更。因此，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)的方法不僅僅是本文中所特別描述的那些。因而，希望此處由書(shū)面專利賦予的保護(hù)只受本文所附權(quán)利要求書(shū)及其等價(jià)物的限制。
所有在本文中被引用的參考內(nèi)容都籍此一并作為參考。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Genetech，Inc.
Eaton，Dan L.
de Sauvage，F(xiàn)rederic J.(ii)發(fā)明名稱血小板生成素(iii)序列數(shù)目144(iv)通信地址(A)地址Genentech，Inc.
(B)街道460 Point San Bruno Blvd(C)城市South San Francisco(D)州加利福尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編94080(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型3.5英寸，1.44Mb軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WinPatin(Genentech)(vi)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/374540(B)申請(qǐng)日03-5月-1995(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US94/14553(B)申請(qǐng)日28-12月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)
(A)申請(qǐng)?zhí)?8/249376(B)申請(qǐng)日25-5月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/223263(B)申請(qǐng)日04-4月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/196689(B)申請(qǐng)日15-2月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/348658(B)申請(qǐng)日02-12月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/185607(B)申請(qǐng)日21-1月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/348657(B)申請(qǐng)日02-12月-1994(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/176553(B)申請(qǐng)日03-1月-1994(viii)律師/代理人信息(A)姓名Winter，Daryl B.
(B)登記號(hào)32,637(C)卷宗/檔案號(hào)P0871P5(ix)通訊信息(A)電話415/225-1249(B)傳真415/952-9881
(C)電傳910/371-7168(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度353個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr1 5 1015Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu202530Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser354045Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val505560Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln657075Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu808590Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr95100 105Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu110 115 120Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro125 130 135Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu140 145 150Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu155 160 165Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr
170 175 180Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu185 190 195Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser200 205 210Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe215 220 225Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu230 235 240Asp Gln Ile Pro Cly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn245 250 255Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly260 265 270Ala Pro Asp Ile Ser Ser Cly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro275 280 285Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro290 295 300Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr305 310 315Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro320 325 330Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His335 340 345Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly350 353(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1795堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO2TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG TGGTCATGCT 250TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCCAG CCCGGCTCCT CCTGCTTGTG 300ACCTCCGAGT CCTCAGTAAA CTGCTTCGTG ACTCCCATGT CCTTCACAGC 350AGACTGAGCC AGTGCCCAGA GGTTCACCCT TTGCCTACAC CTGTCCTGCT 400GCCTGCTGTG GACTTTAGCT TGGGAGAATG GAAAACCCAG ATGGAGGAGA 450CCAAGGCACA GGACATTCTG GGAGCAGTGA CCCTTCTGCT GGAGGGAGTG 500ATGGCAGCAC GGGGACAACT GGGACCCACT TGCCTCTCAT CCCTCCTGGG 550GCAGCTTTCT GGACAGGTCC GTCTCCTCCT TGGGGCCCTG CAGAGCCTCC 600TTGGAACCCA GCTTCCTCCA CAGGGCAGGA CCACAGCTCA CAAGGATCCC 650AATGCCATCT TCCTGAGCTT CCAACACCTG CTCCGAGGAA AGGTGCGTTT 700CCTGATGCTT GTAGGAGGGT CCACCCTCTG CGTCAGGCGG GCCCCACCCA 750CCACAGCTGT CCCCAGCAGA ACCTCTCTAG TCCTCACACT GAACGAGCTC 800CCAAACAGGA CTTCTGGATT GTTGGAGACA AACTTCACTG CCTCAGCCAG 850AACTACTGGC TCTGGGCTTC TGAAGTGGCA GCAGGGATTC AGAGCCAAGA 900TTCCTGGTCT GCTGAACCAA ACCTCCAGGT 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(i)序列特征(A)長(zhǎng)度328個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO21Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 1015Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gln Cys Pro202530Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp354045Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Thr Lys Ala505560Gln Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met657075Thr Ala Arg Gly Gln Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu808590Val Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln95100 105Asp Leu Leu Gly Met Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro110 115 120Ser Ala Ile Phe Leu Asn Phe Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135Arg Phe Leu Leu Leu Val Val Gly Pro Ser Leu Cys Ala Lys Arg140 145 150Ala Pro Pro Als Ile Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Pro Phe His155 160 165Thr Leu Asn Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr170 175 180Asn Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Phe Leu Lys185 190 195Arg Leu Gln Ala Phe Arg Ala Lys IlePro Gly Leu Leu Asn Gln200 205 210Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln IlePro Gly His Gln Asn Gly Thr215 220 225His Gly Pro Leu Ser Gly IleHis Gly Leu Phe Pro Gly Pro Gln230 235 240Pro Gly Ala Leu Gly Ala Pro Asp IlePro Pro Als Thr Ser Gly245 250 255Met Gly Ser Arg Pro Thr Tyr Leu GlnPro Gly Glu Ser Pro Ser260 265 270Pro Ala His Pro Ser Pro Gly Arg TyrThr Leu Phe Ser Pro Ser275 280 285Pro Thr Ser Pro Ser Pro Thr Val GlnLeu Gln Pro Leu Leu Pro290 295 300Asp Pro Ser Ala Ile Thr Pro Asn SerThr Ser Pro Leu Leu Phe305 310 315Ala Ala His Pro His Phe Gln Asn LeuSer Gln Glu Glu320 325 328(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5141堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO22TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGAGTCGATC GACAGCTGTG 50GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 150TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG 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NO24ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO25ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO26ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO27ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO28ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO29Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg20 25(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO30Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu20 25 26(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO31Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg20 25(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO32Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys1 5 10 14(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO33Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg1 5 9(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO34GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45(2)SEQ ID NO35的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO35CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO36NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO37CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50TGACCACGTT CAGCACGGC69(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO38GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT 50ACTGGTGCAA GTCGTGCCG69(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO39CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50CGACCACGTC CATCACGGC69(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO40GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50GCTGGTGCAG GTAGTGCCG 69(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO41CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50CGATCATGTC TATCACGGT 69(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO42GGTCGTGGCG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT 50GCTAGTACAG ATAGTGCCA 69(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO43GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO44CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO45TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO46GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO47ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO48GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO49CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO50GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24(2)SEQ ID NO51(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO51CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27(2)SEQ ID NO52(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO52AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27(2)SEQ ID NO53(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO53CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28(2)SEQ ID NO54
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO54GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28(2)SEQ ID NO55(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO55GACTCGAGGA TCCATCGATT TTTTTTTTTT TTTTT 35(2)SEQ ID NO56(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO5 6GACTCGAGGA TCCATCG 17(2)SEQ ID NO57(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO57GCTACCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32(2)SEQ ID NO58(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO58CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21(2)SEQ ID NO59(i)序列特征(A)長(zhǎng)度103堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO59TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100GCT103(2)SEQ ID NO60(i)序列特征(A)長(zhǎng)度103堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO60AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100GCA 103(2)SEQ ID NO61(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO61TCTCGCTACC GTTTACAG 18(2)SEQ ID NO62(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO62CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25(2)SEQ ID NO63(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO63GGGCCATGAC ACTGTCAA 18(2)SEQ ID NO64(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO64GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40(2)SEQ ID NO65(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO65ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32(2)SEQ ID NO66(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO66TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35(2)SEQ ID NO67
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO67AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33(2)SEQ ID NO68(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO68AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36(2)SEQ ID NO69(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO69CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50AACTGCTTCG TG 62(2)SEQ ID NO70(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度61堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO70ATACGGTCGG GCCGAGGAGG ACGAACACTG GAGGCTCAGG AGTCATTTGA 50CGAAGCACTG A 61(2)SEQ ID NO71(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO71CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37(2)SEQ ID NO72(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO72TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTGCGC 37(2)SEQ ID NO73(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO73CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50CACATCGAAG GTCGTAGCC69(2)SEQ ID NO74(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO74TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50AGCTTCCAGC AT 62(2)SEQ ID NO75(i)序列特征(A)長(zhǎng)度69堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO75CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50CACATCGAAC CACGTAGCC69(2)SEQ ID NO76
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO76TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGTAGT GGTAGTGGTA GTGGTAGTGT 50AGCTTGGTGC AT 62(2)SEQ ID NO77(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO77TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19(2)SEQ ID NO78(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO78GGAGACGCAG TCCATCGA 18(2)SEQ ID NO79(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度62堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO79GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50GTTCTCAGTA AA 62(2)SEQ ID NO80(i)序列特征(A)長(zhǎng)度49堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO80ACACTGGAGG CTCAAGAGTC ATTTGACGAA GCACTGAGGG TACAGGAAG 49(2)SEQ ID NO81(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO81CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45(2)SEQ ID NO82(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO82TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAATAGCT TCCAGCAT 38(2)SEQ ID NO83(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO83CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45(2)SEQ ID NO84(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO84TTAATACTTT TTCTTATAGC GTAAAGAAGA ATTTGCAT 38(2)SEQ ID NO85(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO85Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Asn Ala Tyr Ala Ser Pro1 5 10 15Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg Ala20 25(2)SEQ ID NO86(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO86Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His1 5 10 15Ile Glu Gly Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg20 25 30Ala31(2)SEQ ID NO87(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO87Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His His His His His His His His1 5 10 15Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Cys Val Arg Arg20 25 30Ala31(2)SEQ ID NO88(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO88Thr Thr Ala His Lys Asp Pro1 5 7(2)SEQ ID NO89(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO89His Val Leu His1 4(2)SEQ ID NO90(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO90Ser Arg Leu Ser1 4(2)SEQ ID NO91(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO91Ser His Val Leu1 4(2)SEQ ID NO92(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO92His Ser Arg Leu1 4(2)SEQ ID NO93(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO93Ala Val Asp Phe1 4(2)SEQ ID NO94
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO94Ser Leu Gly Glu1 4(2)SEQ ID NO95(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO95Ala Val Thr Leu1 4(2)SEQ ID NO96(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO96Leu Leu Glu Gly1 4(2)SEQ ID NO97(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO97Leu Ser Ser Leu1 4(2)SEQ ID NO98(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO98Leu Gly Gln Leu1 4(2)SEQ ID NO99(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO99Cys Xaa Leu Ser Ser1 5(2)SEQ ID NO100(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO100Leu Leu Gly Gln1 4(2)SEQ ID NO101(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO101Ser Ser Leu Leu1 4(2)SEQ ID NO102(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO102Gly Gln Leu Ser1 4(2)SEQ ID NO103(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO103Cys Leu Ser Ser1 4(2)SEQ ID NO104(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO104Leu Gln Ser Leu1 4(2)SEQ ID NO105(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO105Leu Gly Thr Gln1 4(2)SEQ ID NO106(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO106Ala Leu Gln Ser1 4(2)SEQ ID NO107(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO107Leu Leu Gly Thr1 4(2)SEQ ID NO108(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO108Asn Ala Ile Phe1 4(2)SEQ ID NO109(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO109Leu Ser Phe Gln1 4(2)SEQ ID NO110(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO110Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 10 15Leu Arg Asp Ser His Val Leu20 22(2)SEQ ID NO111(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO111His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr1 5 10 15Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe20 24(2)SEQ ID NO112(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO112Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln1 5 10 15Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu20 23(2)SEQ ID NO113(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO113Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr1 5 10 15Cys Leu Ser Ser Leu Leu20 21(2)SEQ ID NO114(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO114Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln1 5 10 15Ser16(2)SEQ ID NO115(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO115Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His1 5 10 15Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe20 22(2)SEQ ID NO116(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO116Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met1 5 10 15Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg20 25(2)SEQ ID NO117(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO117Met Pro Pro Ala1 4(2)SEQ ID NO118(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO118Met Ala Pro Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO119(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO119Met Pro Ala Pro Pro Ala1 5 6(2)SEQ ID NO120(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO120Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala1 5 7(2)SEQ ID NO121(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO121Ala Pro Pro Ala1 4(2)SEQ ID NO122(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO122Pro Ala Pro Pro Ala1 5(2)SEQ ID NO123(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO123Ser Pro Ala Pro Pro Ala1 56(2)SEQ ID NO124(i)序列特征(A)長(zhǎng)度4個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO124Val Arg Arg Ala1 4(2)SEQ ID NO125(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO125Val Arg Arg Ala Pro1 5(2)SEQ ID NO126(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO126Val Arg Arg Ala Pro Pro1 5 6(2)SEQ ID NO127(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO127Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr1 5 7(2)SEQ ID NO128(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO128Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr1 5 8(2)SEQ ID NO129(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO129Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala1 5 9(2)SEQ ID NO130(i)序列特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO130Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val1 5 10(2)SEQ ID NO131(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO131Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro1 5 10 11(2)SEQ ID NO132(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO132Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser1 5 10 12(2)SEQ ID NO133
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO133Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg1 5 10 13(2)SEQ ID NO134(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO134Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr1 5 10 14(2)SEQ ID NO135(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO135Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO136(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO136Val Arg Arg Ara Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu16(2)SEQ ID NO137(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO137Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val17(2)SEQ ID NO138(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO138Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu18(2)SEQ ID NO139(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO139Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr19(2)SEQ ID NO140(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO140Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu20(2)SEQ ID NO141(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO141Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn20 21(2)SEQ ID NO142(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO142Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu20 22(2)SEQ ID NO143(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO143Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu20 23(2)SEQ ID NO144(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO144Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser1 5 10 15Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro20 2權(quán)利要求
1.一種分離的、基本均一的mpl配體多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的mpl配體多肽，其特征在于，它選自下組(a)片段多肽；(b)變異多肽；和(c)嵌合多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的mpl配體多肽，其特征在于，它選自下組(a)從哺乳動(dòng)物分離出的多肽；(b)通過(guò)重組手段制得的多肽；和(c)通過(guò)合成手段制得的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的mpl配體多肽，其特征在于，它選自下組(a)人的多肽；和(b)人的非免疫原性多肽。
5.一種分離的、基本均一的mpl激動(dòng)劑，其特征在于，(a)該激動(dòng)劑刺激標(biāo)記的核苷(3H-胸苷)摻入用人mplP轉(zhuǎn)染的、IL-3依賴型Ba/F3細(xì)胞的DNA中；或(b)該激動(dòng)劑在血小板回跳測(cè)定中刺激35S摻入循環(huán)的血小板。
6.如權(quán)利要求2所述的片段多肽，其特征在于，該片段多肽由以下結(jié)構(gòu)式表示X-hTPO(7-151)-Y其中的hTPO(7-151)表示人TPO(hML)中Cys7至Cys151之間的氨基酸序列(包括首尾)；X表示Cys7的氨基或選自下組的氨基-末端氨基酸殘基M，MA，MPA，MPPA，(SEQ ID NO117)MAPPA，(SEQ ID NO118)MPAPPA，(SEQ ID NO119)MSPAPPA，(SEQ ID NO120)A，PA，PPA，APPA，(SEQ ID NO121)PAPPA，(SEQ ID NO122)SPAPPA，(SEQ ID NO123)Y表示Cys151的羧基端基團(tuán)或選自下組的羧基-末端氨基酸殘基V，VR，VRR，VRRA，(SEQ ID NO124)VRRAP，(SEQ ID NO125)VRRAPP，(SEQ ID NO126)VRRAPPT，(SEQ ID NO127)VRRAPPTT，(SEQ ID NO128)VRRAPPTTA，(SEQ ID NO129)VRRAPPTTAV，(SEQ ID NO130)VRRAPPTTAVP，(SEQ ID NO131)VRRAPPTTAVPS，(SEQ ID NO132)VRRAPPTTAVPSR，(SEQ ID NO133)VRRAPPTTAVPSRT，(SEQ ID NO134)VRRAPPTTAVPSRTS，(SEQ ID NO135)VRRAPPTTAVPSRTSL，(SEQ ID NO136)VRRAPPTTAVPSRTSLV，(SEQ ID NO137)VRRAPPTTAVPSRTSLVL，(SEQ ID NO138)VRRAPPTTAVPSRTSLVLT，(SEQ ID NO139)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL，(SEQ ID NO140)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN，(SEQ ID NO141)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE，(SEQ ID NO142)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL，(SEQ ID NO143)VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP，(SEQ ID NO144)氨基-末端氨基酸殘基延伸物含有圖1所示的人ML(SEQ ID NO1)及其聚合化形式的殘基176-332中的一個(gè)或多個(gè)。
7.如權(quán)利要求6所述的片段多肽，其特征在于，該多肽選自TPO(1-153)和TPO(1-245)組成的組。
8.如權(quán)利要求2所述的片段多肽，其特征在于，該片段多肽的氨基酸序列含有SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL，(SEQ ID NO110)HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF，(SEQ ID NO111)SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL，(SEQ ID NO112)LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL，(SEQ ID NO113)GQLSGQVRLLLGALQS，(SEQ ID NO114)LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF，(SEQ ID NO115)LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR，(SEQ ID NO116)及其組合。
9.如權(quán)利要求6所述的多肽，其特征在于，該多肽是未糖基化的。
10.一種分離的多肽，它由核酸編碼，其特征在于，該核酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與具有圖1所示核酸序列(SEQ ID NO2)的核酸分子雜交的序列。
11.如權(quán)利要求11所述的多肽，其特征在于，它具有生物活性。
12.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，它選自下組hML、hML153、hML(R153A、R154A)、hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2。
13.如權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于，多肽的氨基酸序列含有圖1(SEQ ID NO1)中的氨基酸殘基1至X，其中X選自下組153、155、164、174、191、205、207、217、229、245和332。
14.一種分離的、基本均一的mpl配體多肽，其特征在于，它與權(quán)利要求13所述的多肽至少有80％序列相同。
15.如權(quán)利要求13所述的多肽，其特征在于，X為153。
16.一種嵌合體，其特征在于，它含有與異源多肽融合的權(quán)利要求13所述的mpl配體。
17.如權(quán)利要求16所述的嵌合體，其特征在于，異源多肽是免疫球蛋白多肽。
18.如權(quán)利要求16所述的嵌合體，其特征在于，異源多肽是白細(xì)胞介素多肽。
19.一種嵌合體，其特征在于，它含有hML的N末端殘基1至約153-157，并被一個(gè)或多個(gè)但不包括全部的人EPO殘基取代，其中在對(duì)應(yīng)于圖10所示的排列中位置處加入或取代入hML的N-末端殘基。
20.一種能夠與權(quán)利要求13所述的mpl配體多肽結(jié)合的抗體。
21.一種產(chǎn)生權(quán)利要求20所述的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
22.一種分離的、編碼權(quán)利要求1所述的mpl配體多肽的核酸分子。
23.一種分離的、編碼權(quán)利要求13所述的mpl配體多肽的核酸分子。
24.一種分離的核酸分子，其特征在于，含有圖1所示的開(kāi)放讀框核酸序列(SEQ ID NO2)。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的核酸分子，其特征在于，它編碼選自下組的mpl配體多肽hML、hML153、hML(R153AR154A)、hML2、hML3、hML4、mML、mML2、mML3、pML和pML2。
26.一種分離的核酸分子，其特征在于，該分子選自下組(a)含有mpl配體基因編碼區(qū)域核苷酸序列的cDNA克??；(b)能在嚴(yán)緊條件下與(a)克隆雜交的DNA序列；(c)編碼具有天然存在的mpl配體多肽生物性能的多肽的任何(a)和(b)DNA序列的基因變異體。
27.一種分離的DNA分子，其特征在于，它具有能夠在中度嚴(yán)緊條件下與圖1所示DNA序列(SEQ ID NO2)雜交的序列，而且該DNA分子編碼具有生物活性的mpl配體多肽。
28.如權(quán)利要求25所述的核酸分子，其特征在于，還含有可操作地連于核酸分子的啟動(dòng)子。
29.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求25所述的核酸序列，該序列可操作地連于被該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所識(shí)別的調(diào)控序列。
30.用權(quán)利要求29所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
31.一種用編碼mpl配體多肽的核酸分子以產(chǎn)生mpl配體多肽的方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求30所述的宿主細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，從宿主細(xì)胞中回收該mpl配體多肽。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中回收該mpl配體多肽。
34.一種確定mpl配體多肽存在的方法，其特征在于，包括用編碼mpl配體多肽的DNA與測(cè)試樣品核酸進(jìn)行雜交，以及確定mpl配體多肽DNA的存在。
35.一種擴(kuò)增核酸測(cè)試樣品的方法，其特征在于，用編碼mpl配體多肽的核酸引發(fā)核酸聚合酶鏈反應(yīng)。
36.一種組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的mpl配體多肽和藥物上可接受的載體。
37.一種治療患有或可能患有血小板減少的哺乳動(dòng)物的方法，其特征在于，向需要治療的哺乳動(dòng)物施用有效治療量的權(quán)利要求36所述的組合物。
38.如權(quán)利要求36所述的組合物，其特征在于，還含有有效治療量的選自下組的試劑細(xì)胞因子、集落刺激因子和白細(xì)胞介素。39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其特征在于，該試劑選自KL、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、IL-1、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和IL-11。
40.一種生物合成人mpl配體多肽的方法，該多肽具有一種人mpl配體多肽的氨基酸序列例如圖1中所公開(kāi)的序列，其特征在于，包括(a)培養(yǎng)含有編碼人mpl配體多肽的DNA分離物的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，(b)從培養(yǎng)物中回收人mpl配體多肽，和(c)純化mpl配體多肽從而獲得基本均一的、具有生物活性的人mpl配體多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分離的血小板生成素(TPO)、分離的編碼TPO的DNA以及制備和純化TPO的重組或合成方法。已表明，各種不同形式的TPO會(huì)影響血細(xì)胞尤其是巨核細(xì)胞和巨核細(xì)胞遠(yuǎn)祖細(xì)胞的復(fù)制、分化或成熟。因此，這些化合物可用于治療血小板減少。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1141061SQ94194751
公開(kāi)日1997年1月22日 申請(qǐng)日期1994年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月3日
發(fā)明者D·L·伊頓, F·J·德索瓦熱 申請(qǐng)人:基因技術(shù)股份有限公司