專利名稱：含有jeryl-lynn病毒株的抗流行性腮腺炎疫苗的制作方法
流行性腮腺炎基本上是一種兒童患疾病，通常只有輕微的臨床癥狀。但某些病例中流行性腮腺炎感染的臨床結果是嚴重的。例如，在英國流行性腮腺炎是15歲以下兒童患腦膜腦炎的最常見病因，也是兒童永久性感覺神經性耳聾的一個病因。盡管30～40％的自然腮腺炎感染不出現(xiàn)癥狀，但會累及唾液腺，而且在成年人群中，除了上面提到的神經性并發(fā)癥外，流行性腮腺炎還會導致第一個三月期流產和睪丸炎，這些都是勿容置疑的事實，它使許多國家都施行了人群預防接種的計劃。
屬于副粘病毒科的腮腺炎病毒由一條單鏈基因組RNA構成，該RNA為負鏈，約15.3kb，基因順序是3′N-P-M-F-SH-HN-L5′(N為核衣殼蛋白，P為磷蛋白，M為基質蛋白，F(xiàn)為融合蛋白，SH為有潛在表達性的一種小疏水性蛋白，HN為血凝素神經氨酸酶，L為大蛋白)。在眾多腮腺炎病毒株中，Jeryl-Lynn(B-水平)是一種減毒活變種，經序列分析，它攜有F，P，HN，M基因。
到最近為止，已批準的用于抗流行性腮腺炎預防接種的腮腺炎病毒株有兩種Urabe Am 9和Jeryl-Lynn。但1992年9月，在報道的一個事例中其副作用達到無法接受的程度[European Journal of Pediatrics(1993)152387]后Urabe Am 9被取消。
Jeryl-Lynn病毒株多年來一直由Merck Sharp and Dohme以“Mumps Vax”的商品名售出。它是從一例患流行性腮腺炎的病人身上取得臨床標本，經雞胚羊膜接種而得的(Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.123(3)(1966))。
Afzal等人最近報道(J.of Gen.Virology 1993 74 917)說在英國用作腮腺炎疫苗的Jeryl-Lynn病毒株事實上是兩種毒的混合物，這兩種病毒的名稱是JL-2和JL-5。
Takeuchi等人在Virology(1991)181 p364-366也報道說不同的腮腺炎病毒株在SH基因水平上會產生實質性的核苷酸序列的變異。
Afzal等人還強調目前商品化的“MumpsVax”疫苗是在嚴格控制的條件下制備出的，這些條件包括一個細胞庫，有傳代限度，以及可能在不同批的產品之間保持兩種病毒的均衡比例的條件。然而隨著Jeryl-Lynn株的進一步傳代，無法保證能繼續(xù)維持兩種病毒間的平衡。而且也很難估計這兩種病毒在任何一批疫苗里的比例。
本發(fā)明人意外地鑒定出一種完全不同于Afzal等的JL-2和JL-5的進一步的分離物。經核苷酸序列分析測知，它們的不同之處是在SH基因及其周圍區(qū)域，特別是SH編碼序列的3′端和NH基因5′端的非翻譯的基因間區(qū)段。這種分離物在臨床試驗中能誘導出比商品化的腮腺炎有效疫苗更高的零轉化，而且它誘導出的腮腺炎抗體的幾何平均滴度達到了最高值。
因而本發(fā)明人提供出一種減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，它包含如

圖1所示的核苷酸序列。這個序列能編碼SH基因以及HN基因的N末端片段。這種病毒株在本文中被稱為SBB JL-1。
在圖1中，顯示的是JL-1腮腺炎病毒分離物的cDNA序列，它覆蓋了SH基因編碼區(qū)以及SH-HN基因間區(qū)段。
本發(fā)明還提供了一種腮腺炎疫苗，它包括基本上均一的免疫原性的Jeryl-Lynn分離株。
所謂基本上均一是指這種分離株被由上述序列區(qū)段定義的其他Jeryl-Lynn分離株的污染程度不超過10％，優(yōu)選少于5％，更優(yōu)選少于1％。在本發(fā)明的一個較優(yōu)選實施方案中，該疫苗包含一個純系Jeryl-Lynn分離株，即它沒有其它Jeryl-Lynn腮腺炎病毒分離株的污染，該其它Jeryl-Lynn分離株在前面圖1所示的基因區(qū)段內不相同。
本發(fā)明的實施方案之一提供了一種疫苗，它包含無JL-2污染的純系SBB JL-1。
這種純化的分離株不會有亞毒株之間因不同批生產而潛在的差異所帶來的不便，并提供一種更易保證安全性符合質量標準的產品。
根據(jù)本發(fā)明，純系Jeryl-Lynn可以是通過把商品MumpsVax在雞胚成纖維細胞(CEF)中傳代，再經有限稀釋并對所得分離物檢測，或經單個空斑分離，而篩選出純培養(yǎng)物才得到的。其它合適的細胞系包括Vero細胞和MRC5細胞。這就要求存在能有效檢測出群體中較小比例的已知病毒變異株的方法。這類檢查方法包括由Chumakov等人提出的針對減毒的脊髓灰質炎病毒的Maprec檢測(WO 92/07958和PNAS 1991，88；199-203)，還有直接對病毒空斑進行測序和對病毒空斑的差異雜交。
本發(fā)明的疫苗其有利之處還在于它可包含其它成分，諸如減毒麻疹病毒，和/或減毒風疹病毒(或是滅活病毒或其亞單位)，從而能抗麻疹和/或風疹感染。三價的腮腺炎、麻疹和風疹疫苗在本領域已廣為人知，本發(fā)明中的腮腺炎分離株也可與現(xiàn)有疫苗相似的方式配制成三價疫苗。另外本發(fā)明的疫苗還可包括一種減毒的話的水痘-帶狀皰疹病毒，從而提供針對水痘或帶狀皰疹的免疫保護。在一個優(yōu)選實施方案中，水痘-帶狀皰疹病毒是由Andre F E Postgraduate MED J.(1985)61(Suppl.4)，113-120或是Veskari T等人于Acta paediatr.Scand.801051-1057，1991所公開的OKa株。優(yōu)選的本發(fā)明的疫苗是四價的，能提供針對腮腺炎病毒，風疹麻疹病毒和水痘-帶狀皰疹病毒的免疫保護作用。
本發(fā)明還提供了制備全病毒疫苗的方法，例如用凍干法將病毒保存在合適的穩(wěn)測序儀(373A DNA Sequencer)按儀器配有的操作程序和說明進行分析，從而從兩個方向對相應于SH基因的PCR產物進行測序。發(fā)現(xiàn)在基因序列中有好幾處無法讀出，用兩條鏈的序列進行印證。所得序列與Takeuchi等人(Viroloy 1991，181364-366)從Jeryl-Lynn病毒株得到的基團序列相比在361個堿基中有17個不同，其中包括4個未確定堿基。所得基因序列與分Afzal等人(J.Gen.Virol.1993，74；917-920)從他們的JL-5分離株中得到的基因也有部分差別，319個堿基中有9個不同，其中有4個未確定堿基。若不經Vero細胞傳代，而是直接用超速離心收獲4.0～5.0log TCID50的MumpsVax病毒，再將這些病毒的RNA以隨機引物逆轉錄出cDNA，然后以寡核苷酸NH 30 bis和NH 31 bis作引物進行PCR擴增，那么對同一區(qū)段的測序還是會發(fā)現(xiàn)有無法讀出的片段。2)SH基因的克隆用MumpsVax病毒感染Vero細胞，再按上述方法制備總RNA。以隨機引物逆轉錄這種RNA，并用寡核苷酸NH22和NH23作引物進行PCR擴增。(NH22內有一HindIII限制位點，NH23內有一個BamHI限制位點，從而便于對擴增的DNA片段進行克隆)。將擴增的DNA用HindIII和BamHI這兩種限制性核酸內切酶切割后克隆到載體pUC9上。最后得到11個克隆，各有一個相應于腮腺炎病毒SH基因區(qū)段的插入子。所有11個克隆所具有的序列與Takeuchi等的(在上述引文中)相當。此外，有5個克隆有一DdeI酶切位點，而其它6個克隆沒有。未發(fā)現(xiàn)哪個插入子與JL-5序列相應。這個結果，以及序列無法讀出都暗示由Afzal等人鑒定出的JL-2病毒變異體是MumpsVax病毒中的一個重要或容易檢測的部分。
3)直接從MumpsVax傳代MumpsVax也直接在雞胚成纖維細胞(CEF)上傳代。病毒是從不同的5批細胞的第三代培養(yǎng)中回收的，這5批包括1批MJ05，它被用來制備MJ05A42的凍干樣品，以便注射動物。將這5種病毒制備物感染Vero細胞，回收RNA，按上述方法以NH8和NH14作引物擴增以備DNA測序，唯一不同的是用隨機引物啟動逆轉錄反應。所有5批病毒均顯示出與JL-2(Takeuchi等人)相同的序列，而且沒有無法讀出片段。
為了更進一步調查這一點，按上述方法對病毒空斑做了直接測序。將5批病毒分別感染Vero細胞培養(yǎng)物，得到的空斑都用NH30bis和NH31bis作引物進行了加工處理以備測序。5批中測了總數(shù)為26個的空斑，其中13個空斑有與Takeuchi等的JL-2序列相同的序列；5個空斑給出與JL-5非常相似的序列，只有在第270和279位置上的兩個堿基有差別，如圖2所示；有8個空斑的序列有無法讀出之處，暗示它是病毒混合物。4)對病毒空斑的直接測序三種MumpsVax病毒稀釋液，分別每份每0.50ml約有100，50和10個病毒顆粒。在5cm的Petri細菌培養(yǎng)皿中已長好的融合單層Vero細胞棄去培養(yǎng)液，用不定劑中，或用合適的載體、佐劑與本發(fā)明的病毒株混合。另一有利方面是可以在脂質體中或是用載體顆料配制本發(fā)明中的病毒株。此外，在配劑中還可加入免疫刺激物，如3-脫氧酰基化的單磷酰類脂A(Ribi Immunochem)或是皂素衍生物QS21(Cambridge Biotech)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種治療人類流行性腮腺感染的方法，包括給必須進行治療的病人服用有效免疫劑量的本發(fā)明的疫苗。
施用本發(fā)明疫苗的方式可以是通過任一種合適的途徑，通過該途徑將免疫保護量的病毒株和其它免疫誘導成分釋放給受體。不過疫苗的最好用法是非腸道式，經肌肉或深部皮下途徑。當然根據(jù)需要其它用藥方式也可采用，如口服或經其他非腸胃途徑，即皮內、鼻內、靜脈。
此種疫苗的既能提供免疫保護作用又無毒的適當劑量可以由本領域的技術人員很容易地測定出來，意即，本發(fā)明的疫苗中所含有的既引起免疫保護又無毒性的病毒量可能是在傳統(tǒng)的全病毒疫苗所含有的有效抗原量的范圍之內。不管怎樣，應該可以理解到，任何一個特定病人的特定劑量水平將取決于多種因素，包括年齡，總體健康水平，性別和飲食；用藥的時間，用藥的途徑；與服用的任何其他藥物的協(xié)同效應；以及想要達到的保護反應程度。當然，如果需要的話，可以以適當?shù)拈g隔重復施用。在單價疫苗中較典型的是每劑至少3.7log TCID50的病毒，而更常用的是每劑4.5log TCID50。在三價的腮腺炎、麻疹、風疹疫苗中，腮腺炎病毒成分將達到4.8log TCID50左右，以補償其他兩種病素成分的干擾。實施例1)對SH基因的初步測序在25cm2的培養(yǎng)瓶內生長的融合單層Vero細胞上，用dMEM Biorich培養(yǎng)基(50/50V/V)加0.5％胎牛血清，對商品MumpsVax病毒以約3.0log TCID50的接種量進行傳代。34℃溫育7天后收獲受感染的細胞，用Ferre′和Garduno(NucleicAcids Research 1989，17；2141)的方法提取的RNA置于100mcl水中，用二乙基焦碳酸鹽于100℃處理5分鐘。取5mcl這樣的提取物加入以下試劑進行逆轉錄RNAsin(RNA酶蛋白抑制劑)40單位(Boehringer Mannheim，Germany)，4mcl五倍濃縮的逆轉錄酶緩沖液(Bethesda Besearch Labs)，2mcl四種脫氧核苷三磷酸的混合物濃度為10mM，10pmole NH2的寡核苷酸引物，1mcl Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶(Bethesda Research Labs，每mcl 200單位)，最后加水使終體積為20mcl。寡核苷酸NH2與腮腺炎病毒Urabe株的F基因具有同源性。將混合物在37℃溫育45分鐘后，于95℃加熱5分鐘，得到的cDNA經連續(xù)兩輪的PCR反應，以寡核苷酸NH8和NH14作引物進行擴增，用1mcl 1000倍稀釋的第一輪反應物作為第二輪反應的起始物。每輪PCR由25個循環(huán)組成，每個循環(huán)均是94℃加熱1分鐘，53℃加熱1分鐘，72℃加熱1分鐘。在有氟二脫氧核甘酸終止物和以NH8或NH14作引物的情況下進一步進行PCR擴增，其產物用Applied Biosystems自動含血清的dMEM Biorich(50∶50 V/V)培養(yǎng)液(Biorich)洗后，用三種不同稀釋度的病毒液感染。在34℃進行病毒吸收30分鐘。用保持42℃溫度的瓊脂覆蓋細胞，瓊脂層包括2.5ml dMEM Biorich培養(yǎng)液，內含0.5％胎牛血清，及2.5ml 3％(W/V)的低膠化溫度瓊脂糖。固定后，瓊脂層又用3ml dMEM Biorich培養(yǎng)液(含0.5％胎牛血清)覆蓋，并在34℃溫育。溫育7天后，棄去表面的液體培養(yǎng)基，加0.03％(W/V)中性紅溶液擴散1小時后，就可見到空斑。然后去掉液體和瓊脂，將一張干尼龍濾紙用手指壓在培養(yǎng)皿的底部。加數(shù)滴2x SSC浸濕濾紙再提起濾紙。通過將它浸泡在2xSSC中5分鐘，再浸泡在含0.2％(W/V)SDS的2x SSC中30分鐘，然后暴露在紫外光下3至5分鐘，病毒就被固定在濾紙上。從尼龍濾紙上剪下20個獨立的空斑，將這一片片的膜浸在100mcl水中，加1mcl RNAsin(RNA酶蛋白質抑制劑)(Boehringer Mannheim，40單位)后65℃加熱30分鐘。將這100mcl的液體轉移到新試管里，加10mcl 3M的醋酸鈉，再加250mcl乙醇，核酸就被沉淀出來。此混合物在離心前先于-20℃過夜或于-70℃放置1小時。離心后的沉淀物干燥后，加入以下溶液進行逆轉錄4mcl 5x濃縮的逆轉錄酶緩沖液(Bethesda ResearchLabs)，2mcl 0.1M二硫蘇糖醇1mcl混合脫氧核苷三磷酸(Perkin Elmer-Cetus，10mM濃度)，1mcl N6隨機引物寡核苷酸(New England Biolabs，濃度為每ml 100mcg)，11mcl水。然后加1mcl MMLV逆轉錄酶，37℃溫育1小時后95℃5分鐘。取此混合物10mcl，加寡核苷酸引物NH 30 bis和NH 31 bis各500ng和PCR緩沖液，還有1mcl Stoffel DNA聚合酶(Perkin Elmer-Cetus，10μg/mcl濃度)至終體積為100mcl。將此混合物加熱30個循環(huán)，每循環(huán)于95℃ 1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。最后的片段用Magicprep試劑盒(Promega Biotech A7170)照其說明進行純化。在以NH30bis或NH31bis作引物，以氟二脫氧核苷酸為終止物對逆轉錄所得的cDNA完成不對稱的PCR擴增，并在Applied Biosystems(373A)自動測序儀上用廠家提供的方法和反應物進行非放射性測定，而進行測序。這20個空斑(MumpsVax)中，發(fā)現(xiàn)有19個與Takeuchi等人(上述引文)的JL-2序列的275個堿基中的11個堿基不同，與Afzal等人(上述引文)的JL-5序列上的2個堿基不同。有1個空斑無法讀出其序列。該結果暗示MumpsVax在這個區(qū)段內可能包含一個或多個不同于Afzal等發(fā)現(xiàn)的JL-5優(yōu)勢株的變異體。JL-5與空斑序列不同的兩個堿基經測序是在279和290的位置，位于SH和HN編碼區(qū)之間的基因間區(qū)段。5)空斑雜交為了更直接測定MumpsVax及其衍生培養(yǎng)物中JL-5和JL-2型變異株的比例，采用了一種空斑雜交方法。以MumpsVax病毒和傳代的MJ05病毒感染Vero單層細胞，得到空斑，印到尼龍膜上，按前述方法固定核酸。尼龍濾膜先在200ml下列溶液中于65℃預雜交3小時5x SSC(SSC是0.15M氯化鈉0.01M檸檬酸鈉pH 7.2)，10x濃縮的Denhardts溶液(它是0.2％W/V Ficoll 400，0.2％小牛血清，0.2％聚氯乙烯，0.1％(W/V)SDS，鮭精DNA每ml 50mcg。然后在50ml與前述溶液成分相同的溶液中于65℃溫度和輕微振蕩2.5小時并加入預熱至65℃的加放射性探針和冷的竟爭探針溶液，進行雜交。用作變異體特異性探針的寡核苷酸是BC 252(能與JL-5變異體雜交)和BC 253(能與JL-2變異體雜交)。它們都要在包含下列成分的溶液中激活而標記上gamma32P-ATP100ng待標記的寡核苷酸，3mcl 10x濃縮的激酶緩沖液(包括0.5M Tris-HClpH7.6，0.1M MgCl2，50mM二硫蘇糖醇，1mM亞精胺和1mM EDTA pH8.0)，3mcl32P-ATP(Amersham International，3000 Ci/nmole，10mCi/mcl)和2mcl T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)，用無菌水補足30mcl。此混合溶液于37℃溫育30分鐘后，在95℃加熱5分鐘終止反應，然后加入重量比為100∶1的冷竟爭寡核苷酸探針，即每100ng標記探針要加10mcg冷竟爭寡核苷酸，然后將混合物加入雜交溶液中。雜交完成后，尼龍膜用100ml與雜交溶液成分相同的溶液于65℃30分鐘洗滌一次，再在65℃用100ml下述溶液洗2個30分鐘 SSC 5x，0.1％SDS。然后干燥尼龍膜，用增感屏在X-射線膠片上曝光。當MumpsVax用這種技術檢測時，相比較于與BC 253的雜交，有大大過量的空斑是與BC 252(JL-5特異的)雜交的。當檢查MJ05時，雖然與兩種探針雜交的空斑數(shù)基本相等，但與BC253的雜交要比BC252的雜交相對多一點。6)對純Jeryl-Lynn分離株的純化為獲得純的JL-5和JL-2變異體分離株，將一份標明滴度為4-6log TCID50感染單位的商品化MumpsVax樣品(批號92A06，來自Merck Sharp and Dohme，存放在Public Heath Laboratory Services，Porton Down，Wiltshire，UK，登記號為Jeryl-Lynn Mumps strainV93110585，1993年11月5日)進行有限稀釋，然后在96孔微滴板上以約每孔0.1感染單位的接種量感染雞成纖維細胞。96孔板在34℃溫育11天以使病毒增殖。全部192個接種孔中有17孔出現(xiàn)細胞病變效應，說明有病毒生長。將這些孔進一步接種到CEF細胞培養(yǎng)物中。把滴度約為4.9log TCID50的第二次傳代后的病毒制備液經0.8μm濾膜過濾，42,000rpm離心1小時，并將沉淀100mcl水重新懸浮進行該病毒分離株的鑒定。加入1mcl核酸酶抑制物(BoehringerMannheim，每mcl 40單位)，65℃溫育30分鐘，再加1/10體積的3M醋酸鈉(pH4.5)，和2.5倍體積的乙醇。-20℃沉淀過夜或-70℃沉淀1小時，然后在Eppendorf臺式離心機中4℃離心30分鐘，將沉淀干燥。
所獲的病毒RNA沉淀加入20mcl下面的混合物進行逆轉錄4mcl 5x核心RT緩沖液(Bethesda Research Labs)，2mcl 10nM脫氧核苷三磷酸混合物(PerkinElmer，Cetus)，1mcl隨機引物N6(Biolabs，100mcg/ml)，11mcl水，1mcl MMLV逆轉錄酶(Bethsda Research Labs)。37℃溫育1小時后，95℃處理5分鐘以抑制逆轉錄酶。取以上加熱后的混合物10mcl，加引物NH30bis和NH31bis，并使終體積為100mcl，進行PCR擴增。按以下程序擴增30個循環(huán)95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。最后所得片段用Magic Prep(Promega)按廠家提供的實驗程序進行純化。
將6個只與JL-5探針反應的分離株接種到Vero細胞中以獲得空斑。再轉印到尼龍膜上，用已按前述方法32P標記的BC252和BC253寡核苷酸作膜雜交。雜交是在5x SSC中，用約100ng標記寡核苷酸和10mcg冷竟爭寡核苷酸(終體積為50ml)，于65℃進行2.5小時。每種分離株測了大約200個空斑，無一與JL-2探針(寡核苷酸BC253)反應。所有空斑全都與BC 252反應。
有一株病毒分離株，源自微滴板上的9H2A孔，后進一步鑒定為JL-1的SBB株，將它在CEF細胞上再傳兩代。最后一次傳代后(從最初的MumpsVax材料算起一共傳了四代)，用該病毒感染Vero細胞以得空斑。轉印至尼龍膜上，用32P標記的寡核苷酸BC 252和BC253雜交檢驗。用JL-2特異性探針BC253檢測了2000多個空斑，沒有一個有反應。用寡核苷酸BC 252測試了較少數(shù)量的空斑，所有均呈陽性反應。對CEF細胞上的第四代傳代物中獲得的JL-1株的病毒集合物，經離心，乙醇沉淀，并用隨機引物按前述方法逆轉錄之后進行直接測序。其cDNA用寡核苷酸NH14和BC265作引物并按下列程序94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘，作30個循環(huán)的PCR反應進行擴增。所得最終DNA片段在Magic Prep柱(Promega Biotech)上按廠家的說明進行純化，再在Applied Biosystems 373A自動測序儀上依廠家說明并使用NH14，BC265，NH30bis和NH31bis作引物進行測序。于是得到如圖1所示的序列。令人意外的是，這個序列與Afzal等得到的JL-5分離株的序列在SH和HN基因編碼區(qū)之間的基因間區(qū)段(圖2所示)有6個位點不同?？梢奐L-1分離株代表了MumpsVax制品中的一種更進一步的變異形式。
第二個病毒分離株，鑒定為10H5F，也只與JL-5探針反應，通過感染Vero細胞，經兩次傳代，將空斑轉至尼龍膜上，經NH14和BC265寡核苷酸作引物進行PCR擴增后，來進行測序。它給出的序列與前面9H2A的一樣，與公開的JL-5分離株序列在SH-HN基因間區(qū)段有6個堿基不同。7)免疫原性實施例6中的JL-1株的免疫原性是在猴身上測試的。將一種名為MJ11A42的JL-1病毒凍干制品，它是MumpsVax的第四代傳代物并是在CEF細胞上于34℃生長6天后獲得的，以4.2 log TCID50的劑量通過皮下注射方式免疫一組4只非洲綠猴。另三組的每組4只猴子注射(a)濃度為4.3log TCID50的MumpsVax；(b)MJ21A42凍干制品，是經32℃生長9天后收獲到的并在CEF細胞中直接傳三代而衍生出的MumpsVax，濃度為每劑4.3logTCID50，(c)MJ05A42凍干品，濃度是每劑4.3 TCID50，是在CEF細胞中在34℃生長7天后收獲的病毒并是在三次直接傳代后衍生的MumpsVax，其中的傳代方式不同于MJ21A42制品中病毒的傳代方式。
注射前(第0天)，以及預防接種后的第28和42天分別抽取血標本，用Behring的商品抗腮腺炎病毒酶反應診斷試劑盒(Behringwerke AG，Marburg，Germany)以廠家提供的方法測試血標本中是否產生了腮腺炎病毒的IgG抗體。如表1所示，從純JL-1病毒株得的制品在動物體內誘導出的抗腮腺炎病毒的抗體的滴度比其他制品的高，包括高于MumpsVax。這些血清還用MumpsVax作測試病毒在空斑減少試驗中，以系列倍比稀釋作了測試。那些注射了MJ11A42的動物的血清產生的空斑減少的平均數(shù)要高于其他血清。8)臨床研究JL-1病毒株被進一步用來對血清腮腺炎抗體陰性反應的15個月大的兒童進行臨床試驗。配制麻疹、腮腺炎和風疹三價疫苗，并冷凍干燥，或使用純的JL-1株作為腮腺炎疫苗成分或使用如以上實施例6所述的在CEF細胞上直接傳代而得到的病毒作為腮腺炎疫苗成分。試驗中還使用了Merck和CoInc生產的M-M-RRII商品疫苗(它可從Merck Frossr Inc Kirkland，Quebec，Canada得到)；它含有Jeryl-Lynn(B-水平)株作為腮腺炎疫苗成分。
三種疫苗制品中腮腺炎病毒的滴度經測為批號為MJR111D42(含純JL-1株)的疫苗為每劑4.5log TCID，批號為MJR121C42(含傳代的Mumps Vax病毒)疫苗的為每劑4.7 logTCID，批號為80391 OU商品化M-M-RRII疫苗的為每劑4.5 logTCID。
接種前和接種后第42天抽取受試兒童的血標本。
針對腮腺炎病毒的IgG抗體的存在用與實施例6中相同的商品試劑盒進行測試。如表3所示，帶純JL-1株的MMR疫苗誘導出最高的血清轉換率和三種制品中最高的幾何平均滴度。
表1
表2
表3血清抗體反應陰性的受試者對腮腺炎病毒的血清轉換和幾何平均滴度(GMT)
序列表(1)一般資料(i)申請人Smithkline Beecham Biologicals sa(ii)發(fā)明題目疫苗(iii)序列數(shù)目13(iv)通訊地址(A)收信人Smithkline BeechamCorporate Intellectual Property(B)街道SB House L/5 Great West Road(C)城市Brentford(D)州Middlesex(E)國家United Kingdom(F)郵編TW8 9BD(v)計算機的可讀形式(A)介質類型Floppy disk(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii)代理/代理人資料(A)姓名Dalton，Marcus JW(ix)電訊資料(A)電話44 181 975 4093(B)傳真44 181 975 3688(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度393bp
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否(iv)反義否(vi)來源(A)生物體腮腺炎病毒(B)株系Jeryl lynn-1(xi)序列說明SEQ ID NO1TGAATCTCCT AGGGTCGTAA CGTCTCGTGA CCCTGCCGTC GCACTATGCC GGCAATCCAA60CCTCCCTTAT ACCTAACATT TCTAGTGCTA ATCCTTCTCT ATCTCATCAT AACCCTGTAT 120GTCTGGACTA TATTGACTAT TAACTATAAG ACGGCGGTGC GATATGCAGC ACTGTACCAG 180CGATCCTTCT CTCGCTGGGG TTTTGATCAC TCACTCTAGA AAGATCCCCA ATTAGGACAA 240GTCCCGATCC GTCACGCTAG AACAAGCTGC ATTCAAATGA AGCTGTGCTA CCATGAGACA 300TAAAGAAAAA AGCAAGCCAG AACAAACCTA GGATCATAAC ACAATACAGA ATATTAGCTG 360CTATCACAAC TGTGTTCCGG CCACTAAGAA AAT393(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度15bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬否
(iv)反義否(vi)來源(A)生物體nh2(xi)序列說明SEQ ID NO2GTAGCACTGG ATGGA 15(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH8(xi)序列說明SEQ ID NO3TCTGTGTTGT ATTGTGATCC 20(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vi)來源(A)生物體NH14(xi)序列說明SEQ ID NO4GTCGATGATC TCATCAGGTA C 21(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度33bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(vi)來源(A)生物體NH22(xi)序列說明SEQ ID NO5CGGTAGAAGC TTGTCGATGA TCTCATCAGG TAC 33(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度32bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH23(xi)序列說明SEQ ID NO6CGCTGAGGAT CCTCTGTGTT GTATTGTGAT CC32(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度18bp
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH30(xi)序列說明SEQ ID NO7ATCTCCTAGG GTCGTAAC18(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH31(xi)序列說明SEQ ID NO8TTTGGATGCA GCTTGTTC18(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度28bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源
(A)生物體NH 30 BIS(xi)序列描述SEQ ID NO9AATCTCCTAG GGTCGTAACG TCTCGTGA28(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體NH 31 BIS(xi)序列說明SEQ ID NO10TTTGAATGCA GCTTGTTCTA GCGT 24(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度29bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體BC265(xi)序列說明SEQ ID NO11CCGACATTAT GAATAGTTTC GAGGGCTCC29(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體bc252(xi)序列說明SEQ ID NO12ATATCGCACC GCCGTCTTAT AGTTAATAGT C 31(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度31bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)來源(A)生物體BC253(xi)序列說明SEQ ID NO13ATACCGAACC GCCGTATTAT GGTTAATGGT C31
關于微生物保藏的說明(細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權利要求
1.一種減毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，其特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含圖1所示的核酸序列。
2.一種腮腺炎疫苗，它含有基本上均一免疫原性的Jeryl-Lynn分離株。
3.如權利要求2所述的腮腺炎疫苗，它包含權利要求1的均一分離株。
4.一種聯(lián)合疫苗，它含有基本上均一免疫原性的Jeryl-Lynn分離株和一種或多種減毒麻疹病毒、或減毒風疹病毒或滅活的麻疹或風疹病毒，或是這些病毒的亞單位。
5.如權利要求3或4所述的疫苗，另外還含有一種藥劑以提供抗水痘或帶狀痘疹感染的保護。
6.一種生產基本上均一免疫原性的Jeryl-Lynn分離株的方法，此方法包括在適當細胞系上對Jeryl-Lynn制品傳代；用以下任意一個步驟篩選純培養(yǎng)物a)有限稀釋；或b)單個空斑分離。
7.一種均一免疫原性的Jeryl-Lynn分離株在醫(yī)藥中的應用。
8.一種在易于感染腮腺炎的哺乳動物體內誘導免疫力的方法，它包括給哺乳動物施用有效量的根據(jù)權利要求2-5中任一項的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種新的流行性腮腺炎疫苗，它包括從腮腺炎病毒的Jeryl-Lynn株衍生來的一種均一純化分離株。本發(fā)明優(yōu)選實施方案中這種疫苗產生的血清轉化率和抗體滴度都比已知的商品化疫苗要高。
文檔編號C12N7/01GK1150819SQ94194807
公開日1997年5月28日 申請日期1994年11月15日 優(yōu)先權日1993年11月19日
發(fā)明者奈杰爾·M·哈福德, 布里格特·D·A·科勞, 讓·迪德萊茲 申請人:史密斯克萊·比奇曼生物公司