專利名稱：人dna連接酶iii的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒別的多核苷酸、這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途、以及這些多核苷酸和多肽的產(chǎn)生方法。更具體地說，本發(fā)明的多肽是人DNA連接酶III。本發(fā)明也涉及抑制這些多肽作用的方法。
在復(fù)制、修復(fù)和重組期間產(chǎn)生DNA鏈的中斷和間隙。在哺乳動物細(xì)胞核中，這樣的間斷的重新加入取決于若干不同的DNA聚合酶和DNA連接酶。通過純化酶的生物化學(xué)和免疫學(xué)特征以前已產(chǎn)生了三種不同的DNA連接酶(Tomkinson，A.E，等，生物化學(xué)雜志，26621728-21735(1991))。DNA連接酶是在哺乳動物細(xì)胞中的催化DNA復(fù)制，切補修復(fù)和重組修復(fù)的酶(Li，J.J.和Kelly，T.J.，PNAS，美國，816973-77(1984)和Wook，R.O.等，細(xì)胞，5397-106(1988))。在細(xì)菌中，已發(fā)現(xiàn)了三種DNA連接酶，即是DNA連接酶I、DNA連接酶II以及DNA連接酶III，而在人中，發(fā)現(xiàn)了所有上述三種酶，但僅克隆了DNA連接酶I。
編碼DNA連接酶I的人全長cDNA已通過啤酒糖酵母cdc9溫度-敏感性DNA連接酶突變體的功能性互補作用獲得(Barker，D.G，歐洲生物化學(xué)雜志，162659-67(1987))。全長cDNA編碼919個氨基酸殘基的102-kDa蛋白質(zhì)。除了微生物DNA連接酶外，其與其它已知蛋白質(zhì)沒有明顯的序列同源性。所說的活性位點賴氨酸殘基位于第568位。DNA連接酶I表現(xiàn)出活性需要鎂和ATP。DNA連接酶I的主要功能是在后隨鏈DNA復(fù)制期間連接岡崎片段。它也有效地封堵單鏈DNA中的間斷，并且連接限制性內(nèi)切酶DNA片段和交錯末端。所說酶也能夠純化DNA平端的連接。DNA連接酶I能夠連接氫鍵合到聚(脫氧腺苷)上的寡(脫氧胸苷)，但所說的酶與T4DNA連接酶不同，其不能連接寡(脫氧胸苷)與聚(rA)互補鏈。
人DNA連接酶II更穩(wěn)定地與細(xì)胞核相關(guān)。該酶是一種易變的蛋白質(zhì)，其在42℃迅速失活。DNA連接酶II類似其它真核DNA連接酶，需要ATP作為輔因子，但是所說酶不同于DNA連接酶I，其具有與ATP更高的相關(guān)性。DNA連接酶II催化與寡(脫氧胸苷)·聚(rA)底物(而不是與寡(rA)·聚(脫氧胸苷)底物)的磷酸二酯鍵的形成，因此在這一點上，其完全不同于DNA連接酶I(Arrand，J.E.等，生物化學(xué)雜志，2619079-82(1986))。
新近檢測到的較DNA連接酶II大并與該蛋白質(zhì)明顯不相關(guān)的酶被命名為DNA連接酶III(Tomkinson，AE等，生物化學(xué)雜志，26621728-35(1991))。DNA連接酶III類似于DNA連接酶I并不同于DNA連接酶II之處在于，僅微弱地結(jié)合羥基磷灰石(具有對例如ATP的低的親和性)。然而DNA連接酶I和III不是密切相關(guān)的。DNA連接酶III在DNA中有效地修復(fù)單鏈間斷，但不能完成平端連接或超卷曲DNA的腺苷一磷酸依賴性松弛(Elder，R.H.等，歐洲生物化學(xué)雜志，20353-58(1992))。
經(jīng)DNA連接酶連接連接DNA鏈中斷的機制已有廣泛描述。所說的反應(yīng)由共價酶-腺苷酸復(fù)合物的形成開始。哺乳動物和病毒DNA連接酶利用ATP作為輔因子，而細(xì)菌DNA連接酶利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸來產(chǎn)生腺苷酰基。ATP裂解成腺苷一磷酸和焦磷酸，后者具有經(jīng)氨基磷酸酯鍵與在蛋白質(zhì)活性位點上的E-氨基特異性賴氨酸殘基連接腺苷酰殘基(Gumport，R.I.等，PNAS，682559-63(1971))。DNA連接酶-腺苷酸中間體的再活化腺苷一磷酸殘基轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA中的單鏈間斷的5’磷酸基末端，產(chǎn)生具有5’-5’磷酸酐鍵的共價DNA-腺苷一磷酸復(fù)合物。對微生物和哺乳動物的DNA連接酶，也分離了這一反應(yīng)的中間體，但其存在時間比腺苷?；傅母?。在DNA連接的最后步驟，需要用來產(chǎn)生磷酸二酯鍵的未腺苷酰化的DNA連接酶通過進攻?；稽c上的鄰近3’-羥基催化腺苷一磷酸殘基的取代。
作為氨基酸序列同源性的結(jié)果，本發(fā)明的多肽被推斷性地鑒別為人DNA連接酶III。
依據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了新的成熟的多肽(其是人DNA連接酶III)以及生物學(xué)活性的和診斷上和治療上有用的片段，其類似物和衍生物。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了編碼人DNA連接酶III的分離的核酸分子，包括的mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其生物學(xué)活性的和診斷上和治療上有用的類似物和衍生物。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這些多肽的方法，該方法包括在有利于所說蛋白質(zhì)表達和后續(xù)所說蛋白質(zhì)回收的條件下，培養(yǎng)包含人DNA連接酶III核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了為與體外科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體制造有關(guān)的目的利用這些多肽、編碼這些多肽的多核苷酸的方法。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)基因療法治療與不足的DNA連接酶III活性有關(guān)的疾病的方法，該方法包括體內(nèi)或體外將DNA連接酶III基因插入到病人的細(xì)胞中。所說基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中表達，結(jié)果該基因所編碼的蛋白質(zhì)可以治療性地用于例如預(yù)防與DNA缺損有關(guān)的疾病，如異常細(xì)胞增殖(例如腫瘤)，用于治療嚴(yán)重的免疫抑制、發(fā)育障礙性生長和淋巴瘤以及對DNA損傷劑的細(xì)胞過敏癥。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了包含長度足以特異性地與人序列雜交的核酸分子的核酸探針，其可以診斷性地用于檢測在編碼DNA連接酶III之基因中的突變。
依據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了這些多肽的拮抗劑，其可以被胞內(nèi)制造或經(jīng)基因療法施用，以抑制這些肽的活性，例如導(dǎo)向并消滅不需要的細(xì)胞(如癌細(xì)胞)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚本發(fā)明的這些和其它方面。
后面的附圖用來說明本發(fā)明的實施方案，無意于用來限制本發(fā)明的權(quán)利要求所包含的范圍。


圖1顯示DNA連接酶III多肽的cDNA序列和相應(yīng)的推斷的氨基酸序列。標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫用來表示氨基酸。
圖2說明人DNA連接酶I(上面的)和人DNA連接酶III(下面的)之間的氨基酸同源性。
圖3是說明在不同的人組織中DNA連接酶III存在的凝膠的拷貝。A組是人DNA連接酶III基因Northern分析的放射自顯影圖。B組是作為上樣參照的溴化乙錠染色凝膠。結(jié)果顯示，人DNA連接酶III主要在胸腺、精巢和心臟中表達。
依據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了編碼圖1的推斷的氨基酸序列的成熟多肽或編碼由以保藏號ATCC 75880保藏(1994年8月31日)的克隆之cDNA編碼的成熟多肽的分離的核酸(或多核苷酸)。
本發(fā)明的編碼多肽的多核苷酸可以從精巢，胸腺和心臟獲得。本發(fā)明的多核苷酸在得自人激活的T-細(xì)胞的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。其結(jié)構(gòu)上與DNA連接酶族相關(guān)，包含編碼899個氨基酸殘基之蛋白質(zhì)的開放讀框。所說蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與兔DNA連接酶最高程度的同源性，整個蛋白質(zhì)有29％的等同性，和51％的相似性。之處。也重要的是有一個保守的活性賴氨酸殘基，其在疏水氨基酸的殘基兩側(cè)之邊界上。序列E-KYDG-R對不同來源的(如哺乳動物細(xì)胞、酵母、牛痘病毒和噬菌體T7)酶是相同的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或者DNA形式，該DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。所說DNA可以是雙鏈或者單鏈，如果是單鏈，則其可以是編碼鏈或者非編碼(反義)鏈。所說的編碼成熟多肽的編碼序列編碼序列可以與圖1所示的編碼序列或保藏的克隆的序列相同，或者可以是不同的編碼序列，作為豐余和簡并的結(jié)果，該編碼序列編碼與圖1的DNA和保藏的cDNA相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸包括僅成熟多肽的編碼序列；成熟多肽(和可有可無的附加的編碼序列)的編碼序列和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’-非編碼序列。
這樣，術(shù)語″編碼多肽的多核苷酸″包括僅包含多肽的編碼序列的多核苷酸，以及包含附加編碼和/或非編碼序列的的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的的變體，其編碼圖1的推斷的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。所說的多核苷酸變體可以是多核苷酸的天然產(chǎn)生的等位變體或多核苷酸的非天然產(chǎn)生的變體。
這樣，本發(fā)明包括編碼與圖1所示的或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變體，該變體編碼圖1的推斷的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這樣的核苷酸變體包括缺失變體，取代變體和添加或插入變體。
如上所述，所述的多核苷酸可以具有這樣一種編碼序列，其是圖1所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產(chǎn)生的等位變體。如本領(lǐng)域所知的，等位變體是多核苷酸的另一種形式，其具有一個或多個核苷酸的取代，缺失或者添加，而實質(zhì)上不改變編碼的多肽的功能。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有讀框中融合進標(biāo)記序列的編碼序列，所述的標(biāo)記序列使得可以純化本發(fā)明的多核苷酸，在細(xì)菌宿主的情況下，所述的標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記，其使得融合進標(biāo)記的成熟多肽可以純化，或者例如當(dāng)使用哺乳動物細(xì)胞(如COS-7細(xì)胞)時，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)。所說的血細(xì)胞凝集標(biāo)記相應(yīng)于源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位(Wilson，I.，等，細(xì)胞，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(如果兩個序列之間具有至少50％，優(yōu)選的具有70％的等同性)。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語″嚴(yán)格條件″指僅在序列間具有至少95％，優(yōu)選的具有97％的同源性時雜交才可以發(fā)生。在一個優(yōu)選的實施方案中，雜交到以上所述的多核苷酸上的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實質(zhì)上保持與由圖1的cDNA或保藏cDNA編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
本文所提及的保藏物將按照用于專利程序的國際承認(rèn)的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定保持。這些保藏物僅僅是為了給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，并不是35U.S.C112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的氨基酸序列本文一并參考，并且用于解決本文序列描述上的任何矛盾，對保藏材料的任何制造，使用或者銷售需要經(jīng)過許可，在此未給予任何這樣的許可。
本發(fā)明還涉及DNA連接酶III多肽以及其片段，類似物以及衍生物，所述的多肽具有圖1的推斷的氨基酸序列或者其具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列。
術(shù)語″片段″、″衍生物″和″類似物″，當(dāng)有關(guān)圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優(yōu)選地是重組多肽。
所說的圖1的或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代并且取代的氨基酸可以是可以不是由遺傳密碼子編碼的?；蛘?II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基包含取代基，或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)，或者(IV)這樣一種，其中附加氨基酸融合進成熟多肽，其用來純化成熟-多肽。通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物以及類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并且最好純化至均質(zhì)。
術(shù)語″分離的″意指所述的物質(zhì)脫離了其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然產(chǎn)生的)。例如，一種存在于活的動物中的天然-產(chǎn)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中某些或全部共存的物質(zhì)分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分的這樣的和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因為這種載體或者組合物不是其天然環(huán)境的一部分。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體和用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所說的載體可以是克隆載體或表達載體，該載體可以是例如，質(zhì)粒、病毒顆粒噬菌體等形式。所說的工程宿主細(xì)胞可以在修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基修飾得適于激活啟動子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴增DNA連接酶III基因。培養(yǎng)條件，例如pH值和溫度等，是以前用于選擇來表達的宿主細(xì)胞的那些。對普通技術(shù)人員是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來經(jīng)重組體技術(shù)產(chǎn)生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種表達多肽的表達載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體，非染色體和合成的DNA序列，例如猿猴病毒40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生的載體；病毒DNA(如牛痘，腺病毒，家禽痘病毒，和假狂犬病病毒)。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領(lǐng)域已知的分將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點。這樣的方法和其它方法被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
在表達載體中的所說的DNA序列可有效連接到適當(dāng)?shù)谋磉_控制序列(啟動子)上，以指導(dǎo)mRNA合成。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或猿猴病毒40啟動子，大腸桿菌、lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細(xì)胞或它們的病毒中控制基因表達的其它啟動子。所說的表達載體也包含用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點。該載體也可以包含供擴增表達的合適的序列。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型特征，例如真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或例如大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
包含以上所述的適當(dāng)?shù)腄NA序列以及適當(dāng)?shù)膯幼踊蛘呖刂菩蛄械妮d體可以用于轉(zhuǎn)變適當(dāng)?shù)乃拗?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
作為合適宿主的代表性例子，這里可以提到的是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲細(xì)胞如Drosorphila和Sf9；動物細(xì)胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞，等。通過本文的闡述，對適當(dāng)?shù)乃拗鞯倪x擇被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明也包括重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構(gòu)建體包含載體，如質(zhì)?；虿《镜妮d體，其中已正向或方向插入了本發(fā)明的序列。在這一實施方案的更為理想的情況下，構(gòu)建體還包括可有效連接到所述序列上的調(diào)節(jié)序列，包括，例如，啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是通過商業(yè)途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體。細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)。真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質(zhì)?；蜉d體，只要它們在宿主中可復(fù)制和穩(wěn)定，都可以使用。
可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶的基因)載體或者其它帶有選擇性標(biāo)記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區(qū)。兩種合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和完全SV40、得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-F。對適當(dāng)?shù)妮d體與啟動子的選擇健康在普通的技巧本領(lǐng)域的水平之內(nèi)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含以上所述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。所說的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞?？梢杂闪姿徕}轉(zhuǎn)染、DHAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔有效地將構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學(xué)中的基本方法，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可以用來以常規(guī)方式產(chǎn)生由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。此外，本發(fā)明的多肽可以由常規(guī)肽合成器合成產(chǎn)生。
成熟蛋白質(zhì)可以在哺乳動物細(xì)胞，酵母，細(xì)菌，或適當(dāng)?shù)膯幼拥目刂浦碌钠渌?xì)胞中表達，采用得自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA，無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并參考)描述了與原核和真核宿主一起使用合適的克隆和表達載體。
高等生物編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄被插入到載體中的增強子序列增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉(zhuǎn)錄。例子包括復(fù)制起點后側(cè)100至270bp上的猿猴病毒40增強子，細(xì)胞肥大病毒早期啟動子增強子，復(fù)制起點后側(cè)上的多瘤增強子和腺病毒增強子。
一般地，重組表達載體包括復(fù)制起點和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(例如，大腸桿菌啤酒糖酵母TRP1基因的氨芐青霉素抗性基因)以及源于高表達基因的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，α-因子，酸性磷酸酶或熱休克蛋白質(zhì)等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列在適當(dāng)?shù)碾A段與翻譯起始和終止序列裝配，優(yōu)選地，與能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌進周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列裝配。任選地，異源序列可以編碼融合蛋白，包括賦予所需特征的N-末端鑒別肽，所需特征例如，表達的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或純化簡單。
通過在具有功能性啟動子的可操作閱讀相(operable reading phase)中插入合適的翻譯起始和終止信號和編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列來構(gòu)建用于細(xì)菌的有用的表達載體。所說載體包含一個或多個表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點，以保證載體的保持和在合適時在宿主內(nèi)提供擴增。適合轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，假單胞菌屬，鏈霉菌屬，和葡萄球菌屬的各個種，當(dāng)然其它的也可以選擇來使用。
作為一個代表性的但不是限制性的例子，用于細(xì)菌的有用的表達載體可以包含源于市售質(zhì)粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件)的選擇性標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學(xué)品公司，Vppsala，瑞典)和GEMl(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322″骨架″片段與適當(dāng)?shù)膯幼雍痛磉_的結(jié)構(gòu)序列組合。
在合適的宿主菌株轉(zhuǎn)化和合適的宿主菌株生長至適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用合適的方法(例如溫度變換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞培養(yǎng)另外一段時間。
典型地經(jīng)離心收獲細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞，保留所形成的粗產(chǎn)物用于進一步的純化。
可以經(jīng)任何常規(guī)的方法破碎用于表達蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍結(jié)-解凍循環(huán)，超聲處理，機械破碎或使用細(xì)胞裂解劑，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。
各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于表達重組體蛋白質(zhì)。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括由Gluzman，細(xì)胞，23175(1981)，描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達相容載體的細(xì)胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動物的表達載體包括復(fù)制起點，適合的啟動子和增強子，也可以包含任何必需的核糖體結(jié)合位點，聚腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用來提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
所說的DNA連接酶III多肽可以用多種方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽取、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，經(jīng)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細(xì)菌，酵母，高等植物，培養(yǎng)的昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)產(chǎn)生的。依據(jù)重組產(chǎn)生方法中使用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸殘基。
DNA連接酶III多肽和以下描述的可以是多肽的興奮劑和拮抗劑，可以依據(jù)本發(fā)明用于體內(nèi)表達這樣的多肽，這常被稱作″基因治療″。
這樣，例如，可以對來自體內(nèi)的病人細(xì)胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)進行基因工程操作，用工程細(xì)胞向被治療的病人提供所說的多肽。這樣的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可以經(jīng)本領(lǐng)域公知的方法用包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對細(xì)胞進行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領(lǐng)域已知的方法體內(nèi)對細(xì)胞進行基因工程操作，以便體內(nèi)表達多肽。如本領(lǐng)域已知的，可以將產(chǎn)生包含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞施用給病人，以在體內(nèi)對細(xì)胞進行基因工程處理和體內(nèi)表達多肽。通過本發(fā)明的闡述，由這種方式施用本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，工程化細(xì)胞的載體可以不是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如，在與合適的運送載體結(jié)合后，腺病毒可以用于體內(nèi)工程化細(xì)胞。
一旦經(jīng)基因治療，DNA連接酶III多肽被胞內(nèi)表達，則它就可以用于修復(fù)DNA-損害劑(如，UV輻射)產(chǎn)生的DNA單鏈間斷。幾種人綜合癥由DNA連接酶基因的正染色體隱性遺傳引起。由于不修復(fù)DNA，這些綜合癥造成嚴(yán)重的免疫缺陷并極大地增加異常細(xì)胞分化的敏感性，而在細(xì)胞水平上，它們以染色體不穩(wěn)定和對DNA-損害劑免疫過敏為特征。這些綜合癥包括范康尼氏貧血癥和Blackfan-diamond貧血。
本發(fā)明的多肽也可以用于治療嚴(yán)重的免疫抑制，所述免疫抑制是DNA連接酶III基因缺陷和發(fā)育障礙性生長以及淋巴瘤的結(jié)果，這種淋巴瘤導(dǎo)致DNA有缺陷的重新連接。
同樣地，本發(fā)明的多核苷酸對鑒別具有類似的生物活性的其它分子來說也有用。篩選這樣的分子的例子采用已知的DNA序列分離DNA連接酶III基因的編碼區(qū)以合成寡核苷酸探針。具有與本發(fā)明的基因序列互補的序列的標(biāo)記的寡核苷酸用于篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫，以確定文庫的哪一成員與探針雜交。
在有關(guān)的科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體制造上也可以使用本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸。本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸可以出售到研究市場。這樣，例如DNA連接酶III可以用于以類似于本領(lǐng)域其它連接酶的方式體外裂解DNA序列。
本發(fā)明也提供了篩選鑒別提高(刺激劑)或阻斷(拮抗劑)由人DNA連接酶III純化的DNA-連接反應(yīng)的那些化合物的方法。這樣的方法的一個例子包括將ATP、DNA連接酶III，具有單鏈間斷處的DNA和被篩選的化合物組合，這種組合是在DNA連接酶IIII可以正常切割A(yù)TP成AMP，AMP轉(zhuǎn)移進雙鏈DNA中的單鏈間斷的5’磷酸基末端以產(chǎn)生與后續(xù)被修復(fù)的單鏈間斷的DNA-AMP復(fù)合物的條件下進行的。以上例子中的具有單鏈間斷的DNA可以由對單鏈間斷修復(fù)反應(yīng)性的蛋白質(zhì)缺損突變細(xì)胞供給，所述細(xì)胞例如XRCC1缺損的突變嚙齒動物細(xì)胞和cdc9啤酒糖酵母DNA連接酶突變體。然后，可以測定提高或阻斷這一反應(yīng)的催化作用的化合物的能力，以確定所述化合物是否是有效的興奮劑或拮抗劑。
人DNA連接酶III在胞內(nèi)產(chǎn)生并在胞內(nèi)發(fā)生作用，因此任何拮抗劑都必須是胞內(nèi)的。人DNA連接酶III潛在的拮抗劑包括胞內(nèi)產(chǎn)生的抗體。例如，被鑒別拮抗DNA連接酶III的抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法作為信號鏈抗體產(chǎn)生，所述方法例如用編碼單鏈抗體的DNA轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，以阻止人DNA連接酶III的功能。
另一個潛在的拮抗劑是采用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體，反義技術(shù)可以用于通過三螺旋形成或反義DNA或者RNA控制基因表達，兩種方法都基于多核苷酸結(jié)合DNA或者RNA。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分可以用來設(shè)計長度約10至40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設(shè)計成與轉(zhuǎn)錄所涉及的基因區(qū)互補(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學(xué)，291456(1988)；和Dervan等，科學(xué)，2511360(1991))，進而阻止轉(zhuǎn)錄和DNA連接酶III的產(chǎn)生。反義RNA體內(nèi)寡核苷酸雜交到mRNA上，并阻斷mRNA分子翻譯成為DNA連接酶III(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡核苷酸作為基因表達的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細(xì)胞中，以便可以體內(nèi)表達反義RNA和DNA，抑制DNA連接酶III的產(chǎn)生。
另一中潛在的拮抗劑包括DNA連接酶III的突變形式或突變蛋白，其識別DNA但不修復(fù)單鏈間斷，因此，阻止人DNA連接酶III起作用。
所說的拮抗劑可以用于靶向不需要的細(xì)胞，例如，癌細(xì)胞，由于DNA連接酶III的阻止作用阻止DNA中的單鏈間斷的修復(fù)，最終將導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。
本發(fā)明的小分子興奮劑和拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包括治療的有效量所述分子和藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇，和它們的組合。配方應(yīng)該適宜于施用的方式。
本發(fā)明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個或多個填裝有本發(fā)明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。附在這種容器中的可以是管理藥物和生物制品制造、使用或銷售的政府機構(gòu)所規(guī)定的告示，這一告示反映出制造、使用或銷售該藥供人類使用得到政府機構(gòu)的同意。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以與其它治療化合物結(jié)合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服，局部，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預(yù)防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數(shù)情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數(shù)情況之下，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重，考慮用藥途徑和病癥等因素。
全長人DNA連接酶III基因的片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，用來分離全長DNA連接酶III基因和與DNA連接酶III基因有高度的序列相似性的其它基因。這種類型的探針可以是，例如，30，40，50，75，90，100或150個堿基。然而，優(yōu)選的探針具有在30和50個堿基對。所說的探針也可以用于鑒別相應(yīng)于與全長轉(zhuǎn)錄物和基因組克隆或包含包括調(diào)節(jié)和啟動子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子之內(nèi)的完全基因的克隆之cDNA克隆。所說的探針也可以用例如放射性標(biāo)記，以利于雜交鑒別。
本發(fā)明也提供了人DNA連接酶III基因作為診斷劑的用途。例如，一些疾病引起遺傳缺陷基因。這些基因可以通過把有缺陷的基因與正常的基因比較來檢測。即，突變基因與對DNA-損害劑的過敏性和對異常細(xì)胞生長(例如腫瘤和癌)的提高的敏感性相關(guān)。
可以用各種技術(shù)在DNA水平上檢測人DNA連接酶III基因中具有突變的個體?？梢詮牟∪说募?xì)胞(如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和尸體解剖材料)獲得用于診斷的核酸?；蚪MDNA可以直接用于檢測，或者在分析前用PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的?？梢酝ㄟ^與正常遺傳型比較擴增產(chǎn)物大小的變化檢測缺失或者插入。點突變可以經(jīng)將擴增的DNA與放射性標(biāo)記的DNA連接酶III RNA或者放射性標(biāo)記的DNA連接酶III反義DNA序列雜交鑒別。通過核糖核酸酶A消化，或者從解鏈溫度的不同辨別完美配對的序列和錯配雙鏈體。
可以通過檢測在有或沒有變性劑時凝膠上DNA片段電遷移率的改變進行基于DNA序列差異的遺傳試驗。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上區(qū)別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的解鏈或部分解鏈溫度停留在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers等，科學(xué)，2301242(1985))。
也可以由核酸酶保護測定法揭示特定位置上的序列變化，所述測定法如核糖核酸酶保護和Sl保護以及化學(xué)裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測特定DNA序列，所述方法例如雜交，核糖核酸酶保護，化學(xué)裂解，直接DNA測序，或使用限制酶(例如，限制片段長度多態(tài)性)和基因組DNA的Southern印跡法。也可以經(jīng)原位分析檢測突變。
此外，某些疾病是被mRNA改變指導(dǎo)的基因表達的改變的結(jié)果或者以其為特征。另外，DNA連接酶III基因可以用作通過例如，Northern印跡法鑒別個體降低的DNA連接酶III蛋白質(zhì)的水平的參照。
本發(fā)明的序列對染色體鑒別也有價值。所說的序列特異性地導(dǎo)向單個人染色體的特定位置，并與之雜交。此外，目前也需要鑒別染色體上的特定位點。目前僅有極少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可用來標(biāo)記染色體位置。在關(guān)聯(lián)與疾病有關(guān)的那些序列中，按照本發(fā)明的染色體的cDNA作圖是重要的第一步。
簡言之，可以通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選地15-25bp)將序列定位于染色體。對cDNA的計算機分析用來迅速選擇引物，該引物不跨越一個以上的基因組DNA中的外顯子，這樣使擴增方法復(fù)雜化。然后，這些引物用于PCR篩選包含單獨的人染色體的體細(xì)胞雜種。僅包含相應(yīng)于引物的人基因的那些雜種產(chǎn)生擴增片段。
體細(xì)胞雜種的PCR作圖是將特定DNA定位到特定染色體的快速方法。本發(fā)明采用相同的寡核苷酸引物，可以由一組特定染色體的片段或一組大的基因組克隆以類似的方式獲得亞定位。其它作圖策略可以類似地用于對其染色體作圖，所述策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選染色體預(yù)篩選和經(jīng)雜交預(yù)選擇構(gòu)建染色體特異性-cDNA文庫。
中期染色體涂片與cDNA克隆的熒光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的一步染色體定位。這一技術(shù)可以與短至500或000堿基的cDNA一起使用；然而，比2,000bp更大的克隆有結(jié)合到獨特染色體位置，并具有使檢測簡單所需的足夠信號強度的更大的可能性。FISH需要使用衍生EST的克隆，越長越好。例如，2,000bp是好的，4,000是更好的，超過4,000對獲得好的結(jié)果時間的合理的百分比很可能是不必要的。這種技術(shù)的綜述，參見Verma等，人染色體基本技術(shù)手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列精確定位于染色體位置，染色體上的序列的物理位置就可以與遺傳圖數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。這樣的數(shù)據(jù)可以在例如V.McKusick，在人中的孟德爾式遺傳(可聯(lián)機到JohnsHopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館上使用)中找到。然后，基因和已對相同的染色體區(qū)作圖的疾病之間的相互關(guān)系經(jīng)鏈分析(物理鄰近基因的共遺傳)鑒別。本發(fā)明的基因定位于染色體13q33-34。
接著，有必要確定感染和未感染個體之間cDNA或者基因組序列中的不同。如果在某些或全部感染個體中觀察到突變，但在任何正常個體中觀察不到，則，所述的突變很可能是疾病的病因。
采用現(xiàn)有分辨率的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)，精確定位到與疾病相關(guān)的染色體區(qū)上的cDNA是50-500個致病性基因中的一個(這假定1兆堿基作圖分辨率，每20kb一個基因)。
所說的多肽，其片段或衍生物或類似物，或表達它們的細(xì)胞可以用作免疫原由此產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈和人化的抗體以及Fab片段，或Fab表達文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域中已知的各種方法可以用于產(chǎn)生這樣的抗體和片段。
可以通過對動物直接注射多肽或者對動物(優(yōu)選的是非人動物)施用多肽可以獲得針對相應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽的抗體。然后如此獲得的抗體結(jié)合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個片段的序列也可以用于產(chǎn)生結(jié)合完整天然多肽的的抗體。這種抗體可以用于從表達多肽的組織中分離多肽。
對于單克隆抗體的制備，可以使用任何通過傳代細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、三瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，當(dāng)今免疫學(xué)，472)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EB病毒-雜交瘤技術(shù)(Cole，等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
有關(guān)產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)可以采用來生產(chǎn)針對本發(fā)明的免疫原性多肽的單鏈抗體。
將進一步參照以下實施例描述本發(fā)明，然而應(yīng)該清楚本發(fā)明不限于這些實施例。除非特別指明，所有份或量均指重量。
為了有利于理解下列實施例，以下描述一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)?！庇汕懊娴男憄和/或后續(xù)的大寫字母和/或數(shù)字命名。本文的起始質(zhì)粒是市售的、無限制的公眾可獲得的或者是可以按已出版的方法從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建的。此外，所描述的質(zhì)粒的等同質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，對普通技術(shù)人員是顯而易見的。
DNA的″消化″指以限制性內(nèi)切酶催化切割DNA，這種限制性內(nèi)切酶在DNA中僅作用在一定的序列上。本發(fā)明所有的各種限制酶是市售的，普通技術(shù)人員了解使用它們的反應(yīng)條件，輔因子和其它需要。就分析目的而言，典型地是在約20微升緩沖液中使用1微克質(zhì)?；駾NA片段以及約2單位的酶。就分離DNA片段構(gòu)建質(zhì)粒而言，典型地是在較大體積中用20至250單位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的緩沖液和底物的量由制造者規(guī)定。通常使用37℃下的約1小時的溫育時間，但可以按照供應(yīng)者的說明變化。在消化之后，反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，84057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝膠進行切割片段的大小分離。
″寡核苷酸″指單鏈多脫氧核苷酸或兩條互補的多脫氧核苷酸鏈，其可以是化學(xué)合成的。這樣的合成的寡核苷酸沒有5’磷酸基，同時在激酶存在下不添加磷酸鹽與ATP時，其就不連接另一個寡核苷酸。合成的寡核苷酸將連接到?jīng)]有去磷酸化的片段。
″連接″指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，等，Id，p.145)。除非提供其它方式，可以采用已知緩沖液和條件用每0.5微克大約等摩爾量的待連接的DNA片段10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)進行連接。
除非有其它說明，如Graham，F(xiàn).和van der Eb，A.，病毒學(xué)，52456-457(1973)的描述進行轉(zhuǎn)化。
實施例1DNA連接酶III的細(xì)菌表達和純化用相應(yīng)于加工過的DNA連接酶III蛋白質(zhì)的5’序列的PCR寡核苷酸引物起始擴增編碼DNA連接酶III的DNA序列，ATCC#75880。所說的5’寡核苷酸引物具有序列5’GCGGGATCCATGAGACTAATTCTTCCTCAG 3’，含有Bam HI限制性內(nèi)切酶位點(下劃線)，其后為DNA連接酶III編碼序列(從假定的加工的蛋白質(zhì)密碼子的末端氨基酸開始)的21個核苷酸。3’序列5’GCGCTGCAGTTAAATCAAATACTGGTTTTG 3’含有PstI位點互補序列(下劃線)，其后為DNA連接酶III C-末端上的DNA連接酶III的21個核苷酸。限制性內(nèi)切酶位點相應(yīng)于細(xì)菌表達載體pQE-9(Qiagen，C.9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)上的選擇性內(nèi)切酶位點。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)，細(xì)菌復(fù)制起點(ori)的和IPTG-調(diào)節(jié)啟動子操縱子(P/O)，核糖體結(jié)合位點(RBS)，6組氨酸標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶位點。然后用BamHI和PstI消化pQE-9。將擴增序列連接進pQE-9，并插入進具有組氨酸標(biāo)記和RBS的序列的讀框中。按SambrookJ.等，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989)中描述的方法用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rip 4(可從Qiagen以M15/rip 4商標(biāo)獲得)。M15/rep 4包含質(zhì)粒pR6P4的多個拷貝，所說質(zhì)粒表達lacI阻遏物并賦予卡那霉素抗性(Kan1)。依據(jù)它們在LB平板上的生長能力鑒別轉(zhuǎn)化體，并選擇氨芐青霉素/卡那霉素抗性菌落。分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制分析確認(rèn)。在補充有氨芐青霉素(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)兩者的LB培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)中培養(yǎng)包含所需構(gòu)建體的克隆一夜(O/N)。所說的O/N培養(yǎng)物用來以1∶100到1∶250的比率接種大量培養(yǎng)物。使細(xì)胞生長至0.4和0.6之間的光密度600(O.D.600)。添加IPTG(異丙基-B-D-硫代葡萄糖吡喃糖苷)至終濃度1mM。IPTG誘導(dǎo)通過失活lacI阻遏物，清除P/O導(dǎo)致增加的基因表達。將細(xì)胞培養(yǎng)另外的3至4小時。然后由離心收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀在離液劑6摩爾鹽酸胍中溶解。離心后，溶解蛋白質(zhì)提取物在鎳螯合柱上在允許包含6-組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下(Hochuli，E.等，層析學(xué)雜志，411177-184(1984))經(jīng)層析從所說溶液中純化，以6摩爾鹽酸胍pH值5.0(和為了再變性目的，調(diào)節(jié)至3摩爾鹽酸胍、100mM磷酸鈉，10mM谷胱甘肽(還原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型))從柱上洗脫。在這種溶液中溫育12小時后，將蛋白質(zhì)對10mM磷酸鈉透析。
實施例2采用桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆和表達DNA連接酶III采用相應(yīng)于基因5’和3’序列的寡核苷酸引物擴增編碼全長DNA連接酶III蛋白質(zhì)的DNA序列，ATCC#758805’引物具有序列5’GCGCCCGGGATGAGACTAATTCTTCTCCAG 3’，包含SmaI限制性內(nèi)切酶位點(粗體)，其后首先為裝配真核細(xì)胞中翻譯起始有效信號的21個核苷酸(Kozak，M.，分子生物學(xué)雜志，196947-950，(1987))(翻譯起始密碼子″ATG″下劃線)。
3’引物具有序列5’GCGGGTACCTTAAATCAAA TACTGGTTTTC 3’，包含限制性核酸內(nèi)切酶Asp718切割位點(粗體)和與DNA連接酶III基因的C末端序列互補的21個核苷酸。用市售的試劑盒(“Geneclean” BIO101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴增序列。然后用核酸內(nèi)切酶SmaI和Asp718消化該片段，再次在1％瓊脂糖凝膠上純化。這一片段指定為F2。
使用載體pRG1(pVL941載體的修飾物，下面討論)采用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達DNA連接酶III蛋白質(zhì)(綜述參見Summers，MD和Smith，G.E.1987，用于桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)過程的方法手冊，得克薩斯農(nóng)業(yè)試驗站公報1555)。這一表達載體包含苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強多角體啟動子，接著是限制性核酸內(nèi)切酶Sma I與Asp718的識別位點。猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組體病毒，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子相同的方向插入到多角體蛋白基因聚腺苷酸化信號后。多角體蛋白序列兩側(cè)是共轉(zhuǎn)染野生型病毒的細(xì)胞介導(dǎo)同源重組的病毒序列。許多其它桿狀病毒載體可以用于替代pRG1，例如pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒學(xué)，17031-39)。
然后，質(zhì)粒用限制酶SmaI和Asp718消化，并按本領(lǐng)域已知的方法用小牛小腸磷酸酶脫磷酸化。使用市售試劑盒(″Geneclean″BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離所說的DNA。這一載體DNA指定為V2。
片段V2和脫磷酸化質(zhì)粒V2用T4 DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，用酶SmaI與Asp718鑒別包含具有DNA連接酶III基因的質(zhì)粒(pBac DNA連接酶III)的細(xì)菌。通過DNA測序確認(rèn)克隆片段的序列。
用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，美國科學(xué)院學(xué)報，847413-7417(1987))將5微克質(zhì)粒pBac DNA連接酶III用1.0微克市售的線性桿狀病毒(″BaculoGoldTM桿狀病毒DNA″，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉(zhuǎn)染。
將1微克BaculoGoldTM病毒DNA和5微克質(zhì)粒pBac DNA連接酶III在含有50微升無血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。添加10微升Lipofectin和90微升Grace’s的培養(yǎng)基后，混合并于室溫下培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL1711)中，所說細(xì)胞接種在具有無血清Grace’s培養(yǎng)平板上。來回?fù)u動平板以混合新添加的溶液。然后將平板在27℃下培養(yǎng)5小時。5小時后，從平板除去轉(zhuǎn)染溶液，添加1微升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。作為一種改變，使用具有“Blue Gal”的瓊脂糖凝膠(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分離染藍的噬斑。(″噬斑測定″的詳盡的描述也可以在LifeTechnologies公司(Gaithersburg)發(fā)布的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南9-10頁中找到)。
四天后，將系列稀釋的病毒添加到細(xì)胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然后將包含重組病毒的瓊脂重懸于包含200微升Grace’s培養(yǎng)基的Eppendcrf管中。經(jīng)簡短離心除去瓊脂，將包含重組桿狀病毒的上清液用于感染接種到35毫米培養(yǎng)皿中的Sf9細(xì)胞。4天后，收獲這些培養(yǎng)皿中的上清液，于4℃貯存。
將Sf9細(xì)胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace’培養(yǎng)基中生長。在感染復(fù)數(shù)(MOI)2下用重組桿狀病毒V-DNA連接酶III感染細(xì)胞。6小時后，除去培養(yǎng)基，用SF900 II培養(yǎng)基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(Life Technologies公司，Gaithersburg)替代。42小時后，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。在經(jīng)離心收獲之前，進一步培養(yǎng)細(xì)胞16小時，標(biāo)記蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影顯示出。
實施例3重組DNA連接酶III在COS細(xì)胞中的表達質(zhì)粒，DNA連接酶III HA的表達來源于載體pcDNAI Amp(Invitrogen)，所述載體包含1)SV40復(fù)制起點，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起點，4)CMV啟動子，接著是多接頭區(qū)、SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸化位點。將編碼完整的DNA連接酶III前體的DNA片段和融合進其3’末端讀框的HA標(biāo)記克隆進載體的多接頭區(qū)。由此，重組蛋白質(zhì)的表達在CMV啟動子指導(dǎo)下。HA標(biāo)記相應(yīng)于以前描述(I.Wilson，HNiman，R Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，細(xì)胞，37767(1984))的源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白質(zhì)的表位。HA標(biāo)記注入到我們的靶蛋白中使得易于用識別HA表位的抗體檢測重組蛋白質(zhì)。
所說的質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下經(jīng)在克隆的原始EST上的PCR構(gòu)建編碼DNA連接酶III的序列，ATCC#75880，其中使用兩種引物5’引物5’GCGGAATTCATGAGACTAATTCTTCC TCAG 3’包含Eco RI位點(下劃線)，其后為從起始密碼子開始的DNA連接酶III編碼序列的21個核苷酸，3’序列5’GCGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAAATCAAATACTGGTTTTGTTC 3’包含XhoI位點(下劃線)的互補序列，翻譯終止密碼子，HA標(biāo)記和DNA連接酶III編碼序列的最后21核苷酸(不包括終止密碼子)。因此，PCR產(chǎn)物包含EcoRI位點，DNA連接酶III編碼序列，接著是融合進讀框的HA標(biāo)記，HA標(biāo)記相鄰的終止密碼子和XhoI位點。用Eco RI和XhoI限制性內(nèi)切酶消化PCR擴增DNA片段和載體，pcDNAI/Amp，并連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進大腸桿菌菌株SURE(從Stratagene Cloning Systems，11099 NorthTorrey Pines Road，La Jolla，CA 92037獲得)，將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物平板接種到氨芐青霉素培養(yǎng)基平板，選擇抗性克隆。從轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，并經(jīng)限制性分析檢查正確片段的存在。為了表達重組DNA連接酶III，經(jīng)DEAE-DEXTRAN方法(J.Sambraok，EFritsch，T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊，冷泉實驗室出版社，(1989))用表達載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。用放射性標(biāo)記和免疫沉淀法(EHarlow，D.Lane，抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，(1988))檢測DNA連接酶III HA蛋白質(zhì)的表達。細(xì)胞用35S-半胱氨酸標(biāo)記，兩天后轉(zhuǎn)染。收集培養(yǎng)物，用去垢劑(RIPA緩沖液(150mMNaCl，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH值7.5)Wilson，I.等，ID.37767(1984))裂解細(xì)胞。用HA特異性單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)物兩者。在15％SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白質(zhì)。
實施例4DNA連接酶III在人組織中的表達模式可以進行Northern印跡以檢查在人組織中DNA連接酶的表達水平。用RNAzolTMB系統(tǒng)(Biotecx實驗室，Inc.6023 South Loop East，Houston，，TX 77033)分離總細(xì)胞RNA樣品。從各特異性人組織分離的約15微克總RNA在1％瓊脂糖凝膠上分離并印跡到尼龍濾膜(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，分子克隆，冷泉港出版社，(1989))上。按照Stratagene Prime-It試劑盒的說明用50ngDNA片段標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記的DNA用Slect-G-50柱(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 Arapafioe Road，Boulder，CO 80303)純化。于65℃在0.5M NaPO4，pH7.4和7％SDS中將包含特定RNA印跡的濾膜與放射性標(biāo)記的全長DNA連接酶III基因(1,000,000cpm/毫升)雜交過夜。在用0.5×SSC，0.1％SDS于室溫洗滌兩次，60℃洗滌兩次后，將濾膜置于-70℃增感屏下過夜。在胸腺，精巢和心臟中RNA和DNA連接酶III的mRNA豐富(參見圖3)。
通過以上教導(dǎo)，本發(fā)明的許多修改和變化是可能的，這些修改和變化因而在本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以用不同于以上具體描述的方式來實施。序列表(1)一般信息(i)申請人WEI，Y.(ii)發(fā)明名稱人DNA連接酶III(iii)序列數(shù)2(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)ZIP07068(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸磁盤(B)計算機IBMPS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)當(dāng)前的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(Vii)在先申請的數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36,134(C)證書號325800-229(ix)電信信息(A)電話201994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度3325個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CCACAGCGCT GTAGACTGCG CCGCATTAGA AGCCTGGCCT CCTGATGCTG TGCTCTTCAT 60CTAGACCCAA GCCCCAGGTC GTGGGACGAT TTCTCCCGTT TTTGACTCCC TGGAACTGTA 120TTGCCTGCTT TACCTGCGTA CATGTTGATT CTTTCTCATG GCAACCCCGC AGGAAACCAT 180CAAGATCTCA TTTTACAGCT GGGATTCTCT GGTTCACAGA GGTAACGGAG CTTGCCCGAG 240GCCAGTTAAA CGAGAAGATT CATCACCGCT TTGATGGCTG CCTCACAAAC TTCACAAACT 300GTTGCATCTC ACGTTCCTTT TCGAGATTTG TGTTCAACTT TAGAACGAAT ACAGAAAAGT 360AAAGGACGTG CAGAAAAAAT CAGACACTTC AGGGAATTTT TAGATTCTTG GAGAAAATTT 420CATGATGCTC TTCATAAGAA CCACAAAGAT GTCACAGACT CTTTTTATCC AGCAATGAGA 480CTAATTCTTC CTCAGCTAGA AAGAGAGAGA ATGGCCTATG GAATTAAAGA AACTATGCTT 540GCTAAGCTTT ATATTGAGTT GCTTAATTTA CCTAGAGATG GAAAAGATGC CCTCAAACTT 600TTAAACTACA GAACACCCAC TGGAACTCAT GGAGATGCTG GAGACTTTGC AATGATTGCA 660TATTTTGTGT TGAAGCCAAG ATGTTTACAG AAAGGAAGTT TAACCATACA GCAAGTAAAC 720GACCTTTTAG ACTCAATTGC CAGCAATAAT TCTGCTAAAA GAAAAGACCT AATAAAAAAG 780AGCCTTCTTC AACTTATAAC TCAGAGTTCA GCACTTGAGC AAAAGTGGCT TATACGGATG 840ATCATAAAGG ATTTAAAGCT TGGTGTTAGT CAGCAAACTA TCTTTTCTGT TTTTCATAAT 900GATGCTGCTG AGTTGCATAA TGTCACTACA GATCTGGAAA AAGTCTGTAG GCAACTGCAT 960GATCCTTCTG TAGGACTCAG TGATATTTCT ATCACTTTAT TTTCTGCATC AAAACCAATG 1020CTAGCTGCTA TTGCAGATAT TGAGCACATT GAGAAGGATA TGAAACATCA GAGTTTCTAC 1080ATAGAAACCA AGCTAGATGG TGAACGTATG CAAATGCACA AAGATGGAGA TGTATATAAA 1140TACTTCTCTC GAAATGGATA TAACTACACT GATCAGTTTG GTGCTTCTCC TACTGAAGGT 1200TCTCTTACCC CATTCATTCA TAATGCATTC AAAGCAGATA TACAAATCTG TATTCTTGAT 1260GGTGAGATGA TGGCCTATAA TCCTAATACA CAAACTTTCA TGCAAAAGGG AACTAAGTTT 1320GATATTAAAA GAATGGTAGA GGATTCTGAT CTGCAAACTT GTTATTGTGT TTTTGATGTA 1380TTGATGGTTA ATAATAAAAA GCTAGGGCAT GAGACTCTGA GAAAGAGGTA TGAGATTCTT 1440AGTAGTATTT TTACACCAAT TCCAGGTAGA ATAGAAATAG TGCAGAAAAC ACAAGCTCAT 1500ACTAAGAATG AAGTAATTGA TGCATTGAAT GAAGCAATAG ATAAAAGAGA AGAGGGAATT 1560ATGGTAAAAC AACCTCTATC CATCTACAAG CCAGACAAAA GAGGTGAAGG GTGGTTAAAA 1620ATTAAACCAG AGTATGTCAG TGGACTAATG GATGAATTGG ACATTTTAAT TGTTGGAGGA 1680TATTGGGGTA AAGGATCACG GGGTGGAATG ATGTCTCATT TTCTGTGTGC AGTAGCAGAG 1740AAGCCCCCTC GTGGTGAGAA GCCATCTGTG TTTCATACTC TCTCTCGTGT TGGGTCTGGC 1800TGCACCATGA AAGAACTGTA TGATCTGGGT TTGAAATTGG CCAAGTATTG GAAGCCTTTT 1860CATAGAAAAG CTCCACCAAG CAGCATTTTA TGTGGAACAG AGAAGCCAGA AGTATACATT 1920GAACCTTGTA ATTCTGTCAT TGTTCAGATT AAAGCAGCAG AGATCGTACC CAGTGATATG 1980TATAAAACTG GCTGCACCTT GCGTTTTCCA CGAATTGAAA AGATAAGAGA TGACAAGGAG 2040TGGCATGAGT GCATGACCCT GGACGACCTA GAACAACTTA GGGGGAAGGC ATCTGGTAAG 2100CTCGCATCTA AACACCTTTA TATAGGTGGT GATGATGAAC CACAAGAAAA AAAGCGGAAA 2160GCTGCCCCAA AGATGAAGAA AGTTATTGGA ATTATTGAGA ACTTAAAAGC ACCTAACCTT 2220AACTAACGTA ACAAAATTTC TAATATATTT GAAGATGTAG AGTTTTGTGT TATGAGTGGA 2280ACAGATAGCC AGCCAAAGCC TGACCTGGAG AACAGAATTG CAGAATTTGG TGGTTATATA 2340GTACAAAATC CAGGCCCAGA CACGTACTGT GTAATTGCAG GGTCTGAGAA CATCAGAGTG 2400AAAAACATAA TTTTGTCAAA TAAACATGAT GTTGTCAAGC CTGCATGGCT TTTAGAATGT 2460TTTAAGACCA AAAGCTTTGT ACCATGGCAG CCTCGCTTTA TGATTCATAT GTGCCCATCA 2520ACCAAAGAAC ATTTTGCCCG TGAATATGAT TGCTATGGTG ATAGTTATTT CATTGATACA 2580GACTTGAACC AACTGAAGGA AGTATTCTCA GGAATTAAAA ATTCTAACGA GCAGACTCCT 2640GAAGAAATGG CTTCTCTGAT TGCTGATTTA GAATATCGGT ATTCCTGGGA TTGCTCTCCT 2700CTCAGTATGT TTCGACGCCA CACCGTTTAT TTGGACTCGT ATGCTGTTAT TAATGACCTG 2760AGTACCAAAA ATGAGGGGAC AAGGTTAGCT ATTAAA CCT TGGAGCTTCG GTTTCATGGA 2820GCAAAAGTAG TTTCTTGTTT AGCTGAGGGA GTGTCTCATG TAATAATTGG GGAAGATCAT 2880AGTCGTGTTG CAGATTTTAA AGCTTTTAGA AGAACTTTTA AGAGAAAGTT TAAAATCCTA 2940AAAGAAAGTT GGGTAACTGA TTCAATAGAC AAGTGTGAAT TACAAGAAGA AAACCAGTAT 3000TTGATTTAAA GCTAGGTTTC CTAGTGAGGA AAGCCTCTGA TCTGGCAGAC TCATTGCAGC 3060AGGTGGTAAT GATAAAATAC TAAACTACAT TTTATTTTTG TATCTTAAAA ATCTATGCCT 3120AAAAAGTATC ATTACATATA GGAAAACAAT AATTTTAACT TTTAAGGTTG AAAAGACAAT 3180AGCCCAAAGC CAAGAAAGAA AAATTATCTT GAATGTAGTA TTCAATGATT TTTTATGATC 3240AAGGTGAAAT AAACAGTCTA AAGAAGAGGT GTTTTTATAA TATCCATATA GAAATCTAGA 3300ATTTTTACTT AGATACTAAT AAAAT3325(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度910個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ala Ser Gln Thr Ser Gln Thr Val Ala Ser His Val Pro5 10 15Phe Ala Asp Lys Cys Ser Thr Leu Glu Arg Ile Gln Lys Ser Lys20 25 30Gly Arg Ala Glu Lys Ile Arg His Phe Arg Glu Phe Leu Asp Ser35 40 45Trp Arg Lys Phe His Asp Ala Leu His Lys Asn His Lys Asp Val50 55 60Thr Asp Ser Phe Tyr Pro Ala Met Arg Leu Ile Leu Pro Gln Leu65 70 75Glu Arg Glu Arg Met Ala Tyr Gly Ile Lys Glu Thr Met Leu Ala80 85 90Lys Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Asn Leu Pro Arg Asp Gly Lys Asp95 100 105Ala Leu Lys Leu Leu Asn Tyr Arg Thr Pro Thr Gly Thr His Gly110 115 120Asp Ala Gly Asp Phe Ala Met Ile Ala Tyr Phe Val Leu Lys Pro125 130 135Arg Cys Leu Gln Lys Gly Ser Leu Thr Ile Gln Gln Val Asn Asp140 145 150Leu Leu Asp Ser Ile Ala Ser Asn Asn Ser Ala Lys Arg Lys Asp155 160 165Leu Ile Lys Lys Ser Leu Leu Gln Leu Ile Thr Gln Ser Ser Ala170 175 180Leu Glu Gln Lys Trp Leu Ile Arg Met Ile Ile Lys Asp Leu Lys185 190 195Leu Gly Val Ser Gln Gln Thr Ile Phe Ser Val Phe His Asn Asp200 205 210Ala Ala Glu Leu His Asn Val Thr Thr Asp Leu Glu Lys Val Cys215 220 225Arg Gln Leu His Asp Pro Ser Val Gly Leu Ser Asp Ile Ser Ile230 235 240Thr Leu Phe Ser Ala Ser Lys Pro Met Leu Ala Ala Ile Ala Asp245 250 255Ile Glu His Ile Glu Lys Asp Met Lys His Gln Ser Phe Tyr Ile260 265 270Glu Thr Lys Leu Asp Gly Glu Arg Met Gln Met His Lys Asp Gly275 280 285Asp Val Tyr Lys Tyr Phe Ser Arg Asn Gly Tyr Asn Tyr Thr Asp290 295 300Gln Phe Gly Ala Ser Pro Thr Glu Gly Ser Leu Thr Pro Phe Ile305 310 315His Asn Ala Phe Lys Ala Asp Ile Gln Ile Cys Ile Leu Asp Gly320 325 330Glu Met Met Ala Tyr Asn Pro Asn Thr Gln Thr Phe Met Gln Lys335 340 345Gly Thr Lys Phe Asp Ile Lys Arg Met Val Glu Asp Ser Asp Leu350 355 360Gln Thr Cys Tyr Cys Val Phe Asp Val Leu Met Val Asn Asn Lys365 370 375Lys Leu Gly His Glu Thr Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Ile Leu Ser380 385 390Ser Ile Phe Thr Pro Ile Pro Gly Arg Ile Glu Ile Val Gln Lys395 400 405Thr Gln Ala His Thr Lys Asn Glu Val Ile Asp Ala Leu Asn Glu410 415 420Ala Ile Asp Lys Arg Glu Glu Gly Ile Met Val Lys Gln Pro Leu425 430 435Ser Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Arg Gly Glu Gly Trp Leu Lys Ile440 445 450Lys Pro Glu Tyr Val Ser Gly Leu Met Asp Glu Leu Asp Ile Leu455 460 465Ile Val Gly Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Ser Arg Gly Gly Met Met470 475 480Ser His Phe Leu Cys Ala Val Ala Glu Lys Pro Pro Pro Gly Glu485 490 495Lys Pro Ser Val Phe His Thr Leu Ser Arg Val Gly Ser Gly Cys500 505 510Thr Met Lys Glu Leu Tyr Asp Leu Gly Leu Lys Leu Ala Lys Tyr515 520 525Trp Lys Pro Phe His Arg Lys Ala Pro Pro Ser Ser Ile Leu Cys530 535540Gly Thr Glu Lys Pro Glu Val Tyr Ile Glu Pro Cys Asn Ser Val545 550 555Ile Val Gln Ile Lys Ala Ala Glu Ile Val Pro Ser Asp Met Tyr560 565 570Lys Thr Gly Cys Thr Leu Arg Phe Pro Arg Ile Glu Lys Ile Arg575 580 585Asp Asp Lys Glu Trp His Glu Cys Met Thr Leu Asp Asp Leu Glu590 595 600Gln Leu Arg Gly Lys Ala Ser Gly Lys Leu Ala Ser Lys His Leu605 610 615Tyr Ile Gly Gly Asp Asp Glu Pro Gln Glu Lys Lys Arg Lys Ala620 625 630Ala Pro Lys Met Lys Lys Val Ile Gly Ile Ile Glu His Leu Lys635640 645Ala Pro Asn Leu Thr Asn Val Asn Lys Ile Ser Asn Ile Phe Glu650 655 660Asp Val Glu Phe Cys Val Met Ser Gly Thr Asp Ser Gln Pro Lys665 670 675Pro Asp Leu Glu Asn Arg Ile Ala Glu Phe Gly Gly Tyr Ile Val680 685 690Gln Asn Pro Gly Pro Asp Thr Tyr Cys Val Ile Ala Gly Ser Glu695 700 705Asn Ile Arg Val Lys Asn Ile Ile Leu Ser Asn Lys His Asp Val710715 720Val Lys Pro Ala Trp Leu Leu Glu Cys Phe Lys Thr Lys Ser Phe725 730 735Val Pro Trp Gln Pro Arg Phe Met Ile His Met Cys Pro Ser Thr740 745 750Lys Glu His Phe Ala Arg Glu Tyr Asp Cys Tyr Gly Asp Ser Tyr755 760 765Phe Ile Asp Thr Asp Leu Asn Gln Leu Lys Glu Val Phe Ser Gly770 775 780Ile Lys Asn Ser Asn Glu Gln Thr Pro Glu Glu Met Ala Ser Leu785 790 795Ile Ala Asp Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Trp Asp Cys Ser Pro Leu800 805 810Set Met Phe Arg Arg His Thr Val Tyr Leu Asp Ser Tyr Ala Val815 820 825Ile Asn Asp Leu Ser Thr Lys Asn Glu Gly Thr Arg Leu Ala Ile830 835 840Lys Ala Leu Glu Leu Arg Phe His Gly Ala Lys Val Val Ser Cys845 850 855Leu Ala Glu Gly Val Ser His Val Ile Ile Gly Glu Asp His Ser860 865 870Arg Val Ala Asp Phe Lys Ala Phe Arg Arg Thr Phe Lys Arg Lys875 880 885Phe Lys Ile Leu Lys Glu Ser Trp Val Thr Asp Ser Ile Asp Lys890 895 900Cys Glu Leu Gln Glu Glu Asn Gln Tyr Leu Ile905 910
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組(a)編碼具有圖1的推斷的氨基酸序列的多肽或者所說多肽的片段，類似物或衍生物之多核苷酸；(b)編碼具有由包含在ATCC 75880中的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽或者所說多肽的片段，類似物或衍生物之多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是DNA，
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼具有圖1的推斷的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由ATCC 75880 cDNA編碼的多肽。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，其具有圖1所示多肽的編碼序列。
8.權(quán)利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC保藏號75880保藏的多肽的編碼序列。
9.一種包含權(quán)利要求2之DNA的載體。
10.一種用權(quán)利要求9的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
11.一種產(chǎn)生多肽的方法，該方法包括從權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞表達所說DNA編碼的多肽。
12.一種產(chǎn)生能夠表達多肽之細(xì)胞的方法，該方法包括用權(quán)利要求9的載體遺傳工程化細(xì)胞。
13.一種分離的DNA，其可以與權(quán)利要求2的DNA雜交，并編碼具有DNA連接酶III活性的多肽。
14.一種多肽，該多肽選自下組(I)具有圖1的推斷的氨基酸序列的多肽及其片段，類似物和衍生物；(II)具有由ATCC 75880 cDNA編碼的氨基酸序列的多肽及其片段，類似物和衍生物。
15.權(quán)利要求14的多肽，其中所說的多肽具有圖1的推斷的氨基酸序列。
16.一種針對權(quán)利要求14的多肽的抗體。
17.一種針對權(quán)利要求14的多肽的拮抗劑。
18.一種用于治療需要DNA連接酶III活性的病人的方法，該方法包括通過給病人提供編碼所說多肽的DNA并在體內(nèi)表達所說的多肽來給病人施用治療有效量的權(quán)利要求14的多肽。
19.一種用于治療需要抑制DNA連接酶III的病人的方法，該方法包括給病人施用治療有效量的權(quán)利要求17的拮抗劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所說的拮抗劑是通過給病人提供編碼所說拮抗劑的DNA并在體內(nèi)表達所說的拮抗劑施用的。
21.一種用于鑒別拮抗劑和興奮劑的方法，該方法包括將DNA連接酶III，具有單鏈間斷處的DNA和被篩選的化合物組合，這種組合是在單鏈間斷處通過DNA連接酶III可以修復(fù)的條件下進行的；和檢測所說的化合物是否增強或阻斷所說的修復(fù)。
22.一種用于在病人中診斷異常細(xì)胞增殖和異常細(xì)胞增殖易感性的方法，該方法包括在得自病人的樣品中檢測權(quán)利要求1的核酸中的突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人DNA連接酰III多肽、編碼這種多肽的DNA(RNA)和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。本發(fā)明也公開了采用這種多肽經(jīng)基因療法治療與DNA連接酶III缺損有關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明還公開了針對這種多肽的拮抗劑和它們作為治療劑在清除不需要的細(xì)胞上的用途。此外，本發(fā)明還公開了用于檢測突變DNA連接酶III基因的測定法。
文檔編號C12N15/52GK1167502SQ94195210
公開日1997年12月10日 申請日期1994年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月8日
發(fā)明者衛(wèi)穎飛, 威廉·A·赫塞爾廷 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司