專利名稱：將c-7糖轉(zhuǎn)化為c-7羥基紫杉烷類的酶催化水解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于將帶C-7糖的，尤其是帶C-7木糖基的紫杉烷類化合物(taxanes)轉(zhuǎn)化為帶C-7羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)的酶催化水解方法。所述產(chǎn)品化合物可以是具有藥理活性的紫杉烷類化合物(taxanes)，例如paclitaxel和paclitaxel的類似物，或者可以是用作為在這些具有藥理活性的紫杉烷類化合物(taxanes)的制備中的中間體的化合物。
紫杉烷類化合物(taxanes)是在藥學領(lǐng)域中具有效用的雙萜化合物。例如paclitaxel(Taxol )，即下式結(jié)構(gòu)的紫杉烷(taxane)，已被發(fā)現(xiàn)是一種有效的抗癌藥劑 其中Ph為苯基，Ac為乙?；褺z為苯甲?；?br> 天然存在的紫杉烷類化合物(taxanes)例如paclitaxel可在植物材料中發(fā)現(xiàn)，并已由其中分離出來。然而，這類紫杉烷類化合物(taxanes)可能以相對少量存在于植物材料中，所以，對于paclitaxel來講，可能需要例如大量的構(gòu)成該化合物來源的生長緩慢的紫杉屬樹木。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員繼續(xù)尋找用于制備天然存在的紫杉烷類化合物(taxanes)例如paclitaxel，以及用于制備其人工合成的類似物的合成途徑，包括半合成途徑。
具有在C-7位的羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)，不論作為藥理活性最終產(chǎn)品(例如paclitaxel)還是作為用于半合成制備這類藥理活性最終產(chǎn)品的中間體(例如漿果赤霉素Ⅲ和10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ)均特別令人感興趣。但是，紫杉烷類化合物(taxanes)可以例如通過萃取植物材料而獲得，這些植物材料含有例如通過配糖鍵鍵合在C-7位的木糖基，而不含有在該位置的羥基。因此，用于將帶糖的，尤其是帶有木糖基的紫杉烷類化合物(taxanes)轉(zhuǎn)化為含有C-7位羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)的方法可用于提高上述優(yōu)選的羥基化合物的產(chǎn)量。
本發(fā)明提供了從相應的帶有C-7糖，尤其是帶有C-7木糖基的紫杉烷類化合物(taxanes)制備帶有C-7羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)的方法。具體地講，本發(fā)明提供了用于制備至少一種含有直接鍵合在C-7位的羥基的紫杉烷(taxane)的方法，該方法包含下列步驟使含有直接鍵合在C-7位的糖基的至少一種紫杉烷(taxane)與能夠催化所述糖基水解成羥基的水解反應的酶或微生物接觸，并進行所述水解反應。
本發(fā)明提供了從帶有C-7糖的紫杉烷類化合物(taxanes)制備帶有C-7位羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)的有效方法。按照本發(fā)明方法，可以水解單一的紫杉烷(taxane)，或者可以按順序或同時水解不同的紫杉烷類化合物(taxanes)的混合物。在一種優(yōu)選的實施方案中，按照本發(fā)明方法，水解例如可通過萃取植物材料獲得的紫杉烷類化合物(taxanes)的一種混合物。欲用作起始原料的上述混合物，除包含欲水解的一種或多種帶有C-7糖的紫杉烷類化合物(taxanes)外，還可包含在C-7位含有非糖基的基團，例如羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)。進一步對本發(fā)明描述如下。
在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備至少一種帶有C-7羥基的下列式Ⅰ的紫杉烷(taxane)或其鹽的方法 其中R1為羥基或酰氧基，尤其是R1具有下述式Ⅲ結(jié)構(gòu);
R2為酰氧基(尤其是烷基羰基氧基)或羥基;和R3和R4獨立地為氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基或雜環(huán)基;
該方法包含下列步驟使至少一種帶有C-7糖的下列式Ⅱ的紫杉烷(taxane)或其鹽與能夠催化將所述C-7糖基水解為羥基的水解反應的酶或微生物接觸，并進行所述水解反應 其中R1、R2、R3和R4如上所定義，并且“sugar”是直接鍵合在C-7位的糖基。
式Ⅰ和式Ⅱ化合物中未特別指出的手性中心的所有立體構(gòu)型，或者單獨地(即，基本上沒有其它立體異構(gòu)體)或者以與其它立體異構(gòu)體形式的混合物形式存在的，均包含在本發(fā)明水解方法中。
如上所述，本發(fā)明方法在下述情況下特別有用當?shù)玫降氖亲仙纪轭惢衔?taxanes)的混合物時，例如通過萃取植物材料得到paclitaxel與其他紫杉烷類化合物(taxanes)(其中之一種或多種含有C-7位的糖基)的混合物，以及當最終需要C-7羥基紫杉烷(taxane)例如paclitaxel時。
在本發(fā)明方法中，起始的紫杉烷(taxane)中的C-7基團的立體構(gòu)型優(yōu)選保留在產(chǎn)物中。C-7取代基優(yōu)選具有與paclitaxel中的C-7羥基相同的絕對立體構(gòu)型。
本文所用術(shù)語“酶催化過程”或“酶催化方法”是指使用酶或微生物的本發(fā)明的過程或方法。本文所用術(shù)語“水解反應”是指將糖基向羥基的轉(zhuǎn)化，并且可通過例如本發(fā)明方法使之與水和/或適宜的有機醇接觸來實現(xiàn)。在本發(fā)明方法中使用“一種酶或微生物”包括使用兩種或多種甚至一種酶或微生物。
本文所用術(shù)語“糖”是指單糖、雙糖、低聚糖或多糖類，尤其是五元及六元環(huán)糖類例如半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖或優(yōu)選木糖，或其雙糖類例如木糖基-木糖。術(shù)語“直接鍵合在C-7位的糖基”是指直接通過配糖鍵鍵合到紫杉烷(taxane)部分的C-7位的糖。優(yōu)選的糖基為具有如下結(jié)構(gòu)的木糖基團 其中波狀線代表α，或優(yōu)選β構(gòu)型。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“烷基”或“alk”是指任選取代的直鏈和支鏈的飽和烴基，優(yōu)選在正鏈上具有1～12個碳原子的上述烴基。未取代的這類基團的實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。取代基的實例可包括一種或多種下列基團鹵素、烷氧基、烷硫基、鏈烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、羥基或被保護的羥基、羧基(-COOH)、烷氧羰基、烷基羰基氧基、氨基甲?；?NH2-CO-)、氨基(-NH2)、一烷基氨基或二烷基氨基、或巰基(-SH)。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“低級alk”或“低級烷基”是指諸如如上對在正鏈中具有1～4個碳原子的烷基所述的優(yōu)選取代的基團。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“烷氧基”或“烷硫基”是指如上所述的分別通過氧鍵(-O-)或硫鍵(-S-)鍵合的烷基。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“烷氧羰基”是指通過羰基鍵合的烷氧基。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“烷基羰基氧基”是指通過羰基鍵合的烷基，而該羰基本身又通過氧鍵鍵合。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“一烷基氨基”或“二烷基氨基”是指分別被如上所述的一個或兩個烷基所取代的氨基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“鏈烯基”是指如上對進一步含有至少一個碳-碳雙鍵的烷基所述的任選取代的基團。取代基的實例包括一個或多個如上所述的烷基，和/或一個或多個如上作為烷基取代基所述的基團。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“鏈烯基氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的如上所述的鏈烯基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“炔基”是指如上對進一步含有至少一個碳-碳叁鍵的烷基所述的任選取代的基團。取代基的實例包括一種或多種如上所述的烷基，和/或一種或多種如上作為烷基取代基所述的基團。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“炔基氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的如上所述的炔基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指任選取代的飽和的碳環(huán)系統(tǒng)，優(yōu)選含有1～3個環(huán)和每環(huán)含有3～7個碳原子的上述碳環(huán)系統(tǒng)。未取代的這類基團的實例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)癸基、環(huán)十二烷基和金剛烷基。取代基的實例包括一種或多種如上所述的烷基，和/或一種或多種如上作為烷基取代基所述的基團。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“環(huán)烷基氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的如上所述的環(huán)烷基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“環(huán)烯基”是指諸如如上對進一步含有至少一個形成部分不飽和環(huán)的碳-碳雙鍵的環(huán)烷基所述的任選取代的基團。取代基的實例包括一個或多個如上所述的烷基，和/或一個或多個如上作為烷基取代基所述的基團。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“環(huán)烯基氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的如上所述的環(huán)烯基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所述的術(shù)語“ar”或“芳基”是指任選取代的碳環(huán)芳基，優(yōu)選含有1或2個環(huán)及6～12個環(huán)碳原子的上述碳環(huán)芳基。未取代的這類基團的實例包括苯基、聯(lián)苯基和萘基。取代基的實例包括一個或多個，優(yōu)選三個或更少的硝基、如上所述的烷基和/或如上作為烷基取代基所述的基團。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“芳氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的上述芳基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指在至少一個環(huán)中具有至少一個雜原子的任選取代的全飽和或不飽和的芳環(huán)基或非芳環(huán)基，優(yōu)選在每個環(huán)中具有5或6個原子的單環(huán)基或雙環(huán)基。雜環(huán)基可以例如在所述環(huán)中具有1或2個氧原子、1或2個硫原子，和/或1～4個氮原子。各雜環(huán)基可以通過環(huán)系統(tǒng)的任何碳原子或雜原子鍵合。雜環(huán)基的實例包括如下噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、哌啶基、氮雜 基、吲哚基、異吲哚基、喹啉基、異喹啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噁二唑基、和苯并呋咱基。取代基的實例包括一個或多個如上所述的烷基，和/或如上作為烷基取代基所述的一個或多個基團。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“雜環(huán)基氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的上述雜環(huán)基。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“鹵素”或“鹵”是指氯、溴、氟和碘。
本文所用術(shù)語“taxane”是指如下所述含有taxane部分的化合物。本文所用術(shù)語“taxane部分”是指含有核心結(jié)構(gòu)的部分(本文所用環(huán)系統(tǒng)的位置的編號如下所示) 該核心結(jié)構(gòu)可以是取代的，并且它可在其環(huán)系統(tǒng)中含有烯的不飽和結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的這種部分具有在4-和5-位稠合的環(huán)氧丙烷(oxetane)環(huán)，及在C-11和C-12間的烯雙鍵，例如在paclitaxel中所發(fā)現(xiàn)的那樣。
本文中所用術(shù)語“羥基保護基團”是指任何能夠保護游離的羥基的基團，這些基團在使用它的反應之后，可以被除去而不破壞分子的剩余部分。這類基團及其合成的實例可參見T.W.Greene，JohnWiley&Sons，“ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis”，1981，或Fieser&Fieser。
本文所用術(shù)語“鹽”包括與無機和/或有機酸和堿形成的酸式和/或堿式鹽。
本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“?；笔侵竿ㄟ^從有機羧酸的-COOH基中除去羥基所形成的部分。本文中單獨或作為其他基團的一部分所用的術(shù)語“酰氧基”是指通過氧鍵(-O-)鍵合的上述的酰基。
用作本發(fā)明起始原料的帶有C-7糖的紫杉烷類化合物(taxanes)可以是能夠進行本文所述的酶催化水解方法的任何這類化合物。所述起始原料優(yōu)選為可天然形成的帶有木糖基的紫杉烷類化合物(taxanes)，例如7-木糖基紫杉醇(taxol)、7-木糖基-10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)、7-木糖基漿果赤霉素Ⅲ、7-木糖基-10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ、7-木糖基cephalomannine、7-木糖基-10-脫乙酰基cephalomannine、7-木糖基紫杉醇(taxol)C或7-木糖基-10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)C，這些化合物可以單獨存在或者以其相互間的混合物或與其他紫杉烷類化合物(taxanes)的混合物形式存在。“天然形成”的紫杉烷(taxane)起始原料優(yōu)選通過產(chǎn)生紫杉烷(taxane)的植物組織的植物細胞培養(yǎng)物，和/或萃取產(chǎn)生紫杉烷(taxane)的植物組織而得到，所述的產(chǎn)生紫杉烷(taxane)的植物組織特別是取自或衍自于下列紫杉屬植物的組織，例如漿果紫杉、東北紅豆杉、短葉紅豆杉、喜馬拉雅紅豆杉、Taxusmedia、Taxushicksii、尤其是TaxusX.mediahicksii。植物組織的實例包括根、針葉、莖皮和整個籽苗。為描述本發(fā)明方法獲得帶有C-7木糖基的紫杉烷(taxane)起始原料的優(yōu)選方法，參見例如D.G.I.Kingston，Pharmac.Ther.，Vol.52，pp1-34(1991);K.V.Rao，PharmaceuticalResearch，Vol.10，No.4，pp.521-524(1993);及V.Senilh等人，J.Nat.Prod.，47，pp131-137(1984)。
用于本發(fā)明水解方法的帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)起始原料也可以通過在紫杉烷(taxane)的C-7位加上糖基而獲得。提供這種原料的一種方法是通過將帶有C-7羥基的紫杉烷(taxane)進行酶催化轉(zhuǎn)化為相應的在C-7位帶有糖基的紫杉烷(taxane)，該方法是新的。因此，本發(fā)明進一步提供了制備至少一種含有直接鍵合在C-7位的糖基的紫杉烷(taxane)(優(yōu)選上述式Ⅱ的紫杉烷(taxane)的方法，該方法包含下步驟在有糖的存在下，使至少一種含有直接鍵合在C-7位的羥基的紫杉烷(taxane)(優(yōu)選上述式Ⅰ的紫杉烷(taxane))與能夠?qū)⑺隽u基催化轉(zhuǎn)化為在C-7位的糖基的酶或微生物接觸，并進行所述轉(zhuǎn)化。所用的酶或微生物可以是任何能夠催化上述轉(zhuǎn)化為糖基的酶或微生物，并優(yōu)選為下述用于本發(fā)明水解方法中的酶或微生物，但在有利于逆反應的條件下使用。反應條件例如反應介質(zhì)、溫度、pH等也可以選自用于本發(fā)明的酶催化水解方法的下述反應條件，盡管這些條件可以改良，例如通過將所存在的水減至最少，以有利于糖基的加入。
在一種實施方案中，帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)可以從相應的帶有C-7羥基的紫杉烷(taxane)通過上述酶催化方法制備，并且所制備的紫杉烷(taxane)可以在非C-7的位置按需要例如在下面應用部分進一步所述進行改良，其中糖基用作羥基保護基，接著按本發(fā)明方法進行酶催化水解反應，得到帶有直接鍵合在C-7位的羥基的最終紫杉烷(taxane)。
在本發(fā)明水解方法中所用的酶或微生物可以是能夠催化本文所述的酶催化水解方法的任何酶或微生物。所述酶催化物質(zhì)或微生物物質(zhì)，不論其來源或純度如何，均可以以游離狀態(tài)使用，或例如通過物理吸附或截留固定于載體上。
微生物的實例包括下列各屬的微生物黃桿菌屬、不動桿菌屬、莫拉氏菌屬、芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、芽孢八疊球菌屬、顫螺菌屬、動性球菌屬、乳桿菌屬、庫特氏菌屬、微球菌屬、口腔球菌屬(Stomatococcus)、葡萄球菌屬、節(jié)桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或Kingella。優(yōu)選的微生物為微球菌屬的各種，例如藤黃微球菌、Micrococcuslylae、變易微球菌、玫瑰色微球菌、活潑微球菌、Micrococcuskristinae、Micrococcusnishinomiyaensis、Micrococcussedentarius、或Micrococcushalobius;芽孢桿菌屬的各種，例如炭疽芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、苛求芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、異常芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、泛酸芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、Bacillusmarinus、緩病芽孢桿菌、巴氏芽孢桿菌、Bacillusazotoformans、馬闊里芽孢桿菌、圓孢芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、日本甲蟲芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、栗褐芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、蜂房芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、浸麻芽孢桿菌、酸熱芽孢桿菌、Bacillusschlegelii、或幼蟲芽孢桿菌;黃桿菌屬的各種，例如Flavobacteriumacquatile、短黃桿菌、大比目魚黃桿菌、腦膜膿毒性黃桿菌、Flavobacteriumodoratum、Flavobacteriummultivorum、或Flavobacteriumspiritivorum;和特別是莫拉氏菌屬，例如莫拉氏菌屬亞屬的各種，例如腔隙莫拉氏菌(Moraxella(Moraxella)lacunata)、牛莫拉氏菌(Moraxella(Moraxella)bovis)、不液化莫拉氏菌(Moraxella(Moraxella)nonliquefaciens)、Moraxella(Moraxella)atlantae、苯丙酮酸莫拉氏菌(Moraxella(Moraxella)phenylpyruvica)、或奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella(Moraxella)osloensis)、或布蘭漢氏球菌屬亞屬的各種，例如粘膜炎布蘭漢氏球菌(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)、Moraxella(Branhamella)caviae、Moraxella(Branhamella)ovis、或Moraxella(Branhamella)cuniculi。
尤其優(yōu)選的微生物為莫拉氏菌屬ATCC55475、浸麻芽孢桿菌ATCC55476、環(huán)狀芽孢桿菌ATCC55477和微球菌屬ATCC55478。本文所用術(shù)語“ATCC”是指AmericanTypeCultureCollection，12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland，20852，所涉及的生物體的保藏處的登記號。上述微生物于1993年9月30日保藏。
生物學純的微生物莫拉氏菌屬ATCC55475、浸麻芽孢桿菌ATCC55476、環(huán)狀芽孢桿菌ATCC55477和微球菌屬ATCC55478是新的微生物。不言而喻，這些微生物的突變體也在本發(fā)明中被考慮用于本文所述的水解方法中，例如通過使用化學手段、物理手段(例如紫外線照射)或生物學手段(例如，通過分子生物學技術(shù))進行的改良方法中。
莫拉氏菌屬ATCC55475可以在含有牛肉膏(3.0g)、蛋白胨(10.0g)、氯化鈉(5.0g)的調(diào)至pH7.0并在121℃滅菌20分鐘的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。該微生物的特征如下革蘭氏陰性桿狀(1～2μm);不動的;無芽孢形成;在各種培養(yǎng)基上需氧生長;只有在使用四甲基-P-亞苯基二胺時才顯示過氧化氫酶陽性和氧化酶陽性(由從DelawareGapNationalRecreationalArea，NewJersey獲得的土壤試樣中分離出)。
浸麻芽孢桿菌ATCC55476可以在含有牛肉膏(3.0g)、蛋白胨(10.0g)、氯化鈉(5.0g)的調(diào)至pH7.0并在121℃滅菌20分鐘的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。該微生物的特征如下革蘭氏陽性桿狀;可運動的;形成孢子;在各種培養(yǎng)基上需氧生長;過氧化氫酶陽性和氧化酶陽性;弱的葡糖利用性;明膠液化(由從Arlington，Texas得到的土壤試樣中分離出)。
環(huán)狀芽孢桿菌ATCC55477可以在含有牛肉膏(3.0g)、蛋白胨(10.0g)、氯化鈉(5.0g)的調(diào)至pH7.0并在121℃滅菌20分鐘的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該微生物的特征如下革蘭氏陽性桿狀;可運動的;形成孢子;在各種培養(yǎng)基上需氧生長;過氧化氫酶陽性和氧化酶陽性;弱的葡糖利用性;不液化明膠(由從HamiltonSquare，NewJersey獲得的木材試樣中分離出來)。
微球菌屬ATCC55478可以在含有牛肉膏(3.0g)、蛋白胨(10.0g)、氯化鈉(5.0g)的調(diào)至pH7.0并在121℃滅菌20分鐘的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該微生物的特征如下革蘭氏陽性球菌(直徑0.5～1.5μm);細胞成對存在，或成簇存在，不動的;無芽孢形成;在各種培養(yǎng)基上需氧生長;過氧化物酶陽性和氧化酶陽性;發(fā)酵葡糖(由從HarrimanPark，Tuxedo，NewYork獲得的土壤試樣中分離得到)。
本發(fā)明還提供了篩選用于選擇能夠進行本發(fā)明酶催化水解反應的微生物的方法。用于選擇能夠按本發(fā)明方法酶催化水解起始的帶C-7糖的紫杉烷(taxane)的微生物的優(yōu)選方法是使用下列新的篩選方法，該方法包含下列步驟(ⅰ)選擇能夠支持待篩選的微生物的生長的菌種生長培養(yǎng)基;
(ⅱ)選擇一種指示劑糖苷;
(ⅲ)使微生物與步驟(ⅰ)的菌種生長培養(yǎng)基接觸，以便使微生物進行生長，并使上述物質(zhì)與步驟(ⅱ)的指示劑糖苷接觸;
(ⅳ)在指示劑糖苷的存在下，觀察微生物，以確定是否存在水解反應;和(ⅴ)檢驗微生物以確定所述帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)的水解反應。
本文所用術(shù)語“糖苷”是指這樣的化合物，該化合物可通過使糖的醛或酮基團與醇(該醇也可為糖)羥基反應來產(chǎn)生配糖鍵(-O-)來形成，該化合物在水解裂解時形成作為產(chǎn)物的糖和糖苷配基(即，裂解的醇)。本文所用術(shù)語“指示劑糖苷”是指這樣的糖苷，其中的糖苷配基在紫外光下呈現(xiàn)熒光(例如4-甲基umbelliferyl-β-D-吡喃木糖苷(xylopyranoside))或在水解反應中變色(例如p-硝基苯基-β-D-木糖苷)，因此可以通過觀察與指示劑糖苷相接觸的微生物來確定所給的微生物是否能夠酶催化水解反應。優(yōu)選，指示劑糖苷為指示劑木糖苷。帶有龐大的糖苷配基的指示劑木糖苷類化合物對于選擇能夠水解C-7木糖基紫杉烷類化合物(taxanes)的微生物來說是優(yōu)選的。
在上面步驟(ⅰ)中，菌種生長培養(yǎng)基優(yōu)選含有作為碳源的糖苷，例如木聚糖或能夠在配糖鍵被水解的其他木糖苷，所以該培養(yǎng)基富含能夠水解配木糖鍵(xylosidicbonds)的微生物，因而促進其選擇。在步驟(ⅲ)中，微生物可以與菌種生長培養(yǎng)基接觸，例如通過將稀釋的含有微生物的溶于水中的土壤懸浮液置于瓊脂菌種生長培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)。微生物可以與指示劑糖苷接觸，例如通過將含有指示劑糖苷的軟瓊脂覆蓋在菌種生長培養(yǎng)基的平板上，在此平板上已生長微生物的菌落，或通過將指示劑糖苷加至菌種生長培養(yǎng)基中，之后使微生物與之接觸。
在應用本發(fā)明的篩選方法中的迅速而有效的步驟(ⅰ)至(ⅳ)后，可以在步驟(ⅴ)中，將正在生長或已經(jīng)生長的微生物的菌落與帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)接觸一段適宜的培養(yǎng)期，以驗證糖基的水解反應。例如，個別的菌落可以從瓊脂平板中取出，并在含7-木糖基紫杉烷(taxane)的小振動燒瓶中生長，然后取出細胞，分析產(chǎn)品(例如通過HPLC)，以檢定糖基的水解。
用于本發(fā)明水解方法中的酶的實例為水解酶，特別是糖苷酶或聚糖酶。優(yōu)選的酶包括由微生物衍生的酶，特別是由上述的那些微生物衍生的酶。這些酶可以例如通過萃取和純化方法而分離出。
當使用微生物時，可以使用以完整的濕細胞或干細胞例如凍干的、噴霧干燥的或加熱干燥的細胞形式存在的細胞，或者以處理過的細胞材料例如破裂的細胞或細胞萃取物形式存在的細胞。也考慮了使用遺傳工程改進的生物體。宿主細胞可以是任何細胞，例如經(jīng)改良的以含有一種或多種用于表達能夠進行本文所述催化反應的一種或多種酶的基因的大腸埃希氏菌。
當使用一種或多種微生物時，本發(fā)明的酶催化水解方法可以在微生物發(fā)酵后進行(兩步驟的發(fā)酵與水解)，或與之同時進行，即在后一種情況中，通過就地發(fā)酵和水解進行(單一步驟的發(fā)酵和水解)。
微生物的生長可以通過使用適宜的培養(yǎng)基由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員之一來實現(xiàn)。用于生長微生物的適宜培養(yǎng)基包括提供微生物細胞生長所必需的營養(yǎng)素的培養(yǎng)基。典型的生長培養(yǎng)基包括必需的碳源、氮源和(例如以痕量存在的)元素。也可以加入誘導物。本文所用的術(shù)語“誘導物”包括促進在微生物細胞中形成所需的酶催化活性的任何化合物。
碳源可以包括糖類，例如麥芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、山梨糖醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇、木聚糖等;有機酸的鹽類，例如乙酸鈉、檸檬酸鈉等;以及醇類，例如乙醇、丙醇等。
氮源可以包括N-Z胺A、玉米漿、大豆粉、牛肉膏、酵母抽提物、糖蜜、面包酵母、胰(蛋白)胨、nutrisoy、蛋白胨、yeastamin、氨基酸類例如谷氨酸鈉等、硝酸鈉、硫酸銨等。
痕量元素可以包括鎂鹽、錳鹽、鈣鹽、鈷鹽、鉬鹽、銅鹽、鎳鹽、鐵鹽、鈉鹽和鉀鹽。也可加入痕量，或優(yōu)選大于痕量的磷酸鹽。
所用培養(yǎng)基可以包括多于一個碳或氮源或其他營養(yǎng)素。
優(yōu)選的用于生長的培養(yǎng)基包括含水的培養(yǎng)基，例如在本文實施例中所述的培養(yǎng)基。
對反應混合物的攪拌和通氣影響生長過程中可獲得的氧的量。優(yōu)選攪拌范圍為100～250RPM;優(yōu)選每體積培養(yǎng)基每分鐘通氣約1～10體積空氣。
為了微生物的生長和/或按本發(fā)明方法進行水解反應，培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約4至約8.5，溫度優(yōu)選為約24℃至約37℃。水解反應例如可以在體外進行例如1～72小時的時間，或優(yōu)選進行至所需產(chǎn)物的產(chǎn)率達到最大為止。優(yōu)選在水解反應期間，將pH保持在7或低于7，例如此時理想地是可使在C-7位的差向異構(gòu)作用減至最小(例如，在10-脫乙?；仙即?taxol)或10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ存在的情況下)。優(yōu)選在pH為4～7，特別是在非堿性條件下進行本發(fā)明的水解反應。
還優(yōu)選使用含水液體作為水解反應介質(zhì)，盡管也可使用有機液體、或可混溶的或不可混溶的(兩相)有機/含水液體混合物。優(yōu)選使用0.0025～2.5%(重量)帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)起始原料，按起始原料與水解反應介質(zhì)的合并重量計。
對于相對于起始原料所用的酶或微生物的量進行選擇以使之能催化本發(fā)明的酶催化水解反應。在使用本發(fā)明的水解方法時優(yōu)選得到超過90%的產(chǎn)率(按起始的帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)計，所得到的C-7位被水解的產(chǎn)物的%)。水解反應可以選擇性地在起始的紫杉烷(taxane)的C-7位進行。即可得到產(chǎn)物中較大部分(例如全部)只在C-7位水解而不在其他位置水解的產(chǎn)物。
本發(fā)明方法中的帶有C-7羥基的產(chǎn)物和其他紫杉烷(taxane)產(chǎn)物例如下述的那些紫杉烷(taxane)產(chǎn)物，可以例如通過下述方法分離和純化例如萃取、蒸餾、結(jié)晶及柱色譜法。
紫杉烷類化合物(taxanes)是如上所述含有紫杉烷(taxane)部分的雙萜化合物。特別令人感興趣的是含有其中13位含有側(cè)鏈的紫杉烷(taxane)部分的紫杉烷類化合物(taxanes)，該類化合物的實例為paclitaxel。具有藥理活性的紫杉烷類化合物(taxanes)例如paclitaxel可以用作抗腫瘤藥劑，以治療患有癌癥例如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌或肺癌、黑瘤及白血病的患者。
通過本發(fā)明水解方法獲得的化合物作為具藥理活性的紫杉烷類化合物(taxanes)本身(例如paclitaxel)、或作為制備上述具藥理活性的紫杉烷類化合物(taxanes)的中間體均特別有用。因此，例如在通過本發(fā)明方法制備的化合物也帶有C-13位的羥基時(例如漿果赤霉素Ⅲ或10-脫乙?；鶟{果赤霉素Ⅲ)，這些化合物可以與產(chǎn)生C-13酰氧基側(cè)鏈的中間體化合物例如β-內(nèi)酰胺類偶合，以得到帶有C-13位酰氧基側(cè)鏈的紫杉烷類化合物(taxanes)，例如paclitaxel或其類似物。根據(jù)本發(fā)明方法制備的帶有C-7羥基的化合物可以在用于上述C-13酰氧基側(cè)鏈偶合之前被任選修飾。例如，在非C-13位的一個或多個羥基可以在偶合之前被保護，之后再去保護。此外，在使用本發(fā)明方法之前、期間或之后可以進行在C-13位的修飾(按照美國專利申請序列號08/077，979，Hanson等人，1993年6月15日提交(AttorneyDocketNo.LD58))(將C-13位的酰氧基酶催化水解為C-13位的羥基)，和/或在C-10位的修飾(按照美國專利申請序列號08/077，980，Hanson等人，1993年6月15日提交(AttorneyDocketNo.LD59))(在C-10位，將酰氧基酶催化水解為羥基，或?qū)⒘u基酶催化酯化為酰氧基)，上述兩個文獻并入本文作為參考。
通過本發(fā)明水解方法制得的、任選進行如上修飾的帶有C-7羥基的紫杉烷類化合物(taxanes)可以例如用于制備帶有C-13酰氧基側(cè)鏈的紫杉烷類化合物(taxanes)，例如上述那些紫杉烷類化合物(taxanes)，并可按下列文獻中所述的方法制備歐洲專利公開No.400，971、美國專利第4，876，399號、美國專利第4，857，653號、美國專利第4，814，470號、美國專利第4，924，012號、美國專利第4，924，011號、和Kingston，Pharm.Ther.，Vol.52，1-34(1991)，尤其是美國專利申請序列號07/995，443(該申請由Poss等人于1992年12月23日提交)(AttorneyDocketNo.LD60)、美國專利申請序列號08/033，598(由Thottathil等人于1993年3月19日提交)(AttorneyDocketNo.LD57)及美國專利申請序列號08/154，840(1993年11月24日提交)，所有上述文獻并入本文作為參考。
優(yōu)選將式Ⅱ的紫杉烷類化合物(taxanes)或其鹽應用于本發(fā)明水解方法中，由此酶催化水解反應提供了相應的式Ⅰ化合物或其鹽。
在式Ⅰ和Ⅱ中，R2優(yōu)選為羥基或R5-C(O)-O-，尤其是其中R5為烷基例如甲基;R3優(yōu)選為烷基例如甲基;R4優(yōu)選為芳基例如苯基;和R1優(yōu)選為羥基或下列式Ⅲ的基團 其中R6和R7獨立地為烷基、烷氧基、鏈烯基、鏈烯基氧基、炔基、炔氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基氧基、環(huán)烯基、環(huán)烯基氧基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基或雜環(huán)基氧基;和R8為氫、烷氧羰基或羥基保護基。
式Ⅱ的紫杉烷類化合物(taxanes)的實例為7-木糖基紫杉醇(taxol)、7-木糖基-10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)、7-木糖基漿果赤霉素Ⅲ、7-木糖基-10-脫乙?；鶟{果赤霉素Ⅲ、7-木糖基cephalomannine、7-木糖基-10-脫乙酰基-cephalomannine、7-木糖基紫杉醇(taxol)C或7-木糖基-10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)C。式Ⅰ的紫杉烷類化合物(taxanes)的實例為paclitaxel、10-脫乙?；仙即?taxol)、漿果赤霉素Ⅲ、10-脫乙?；鶟{果赤霉素Ⅲ、cephalomannine、10-脫乙?；鵦ephalomannine、紫杉醇(taxol)C、或10-脫乙?；仙即?taxol)C。
paclitaxel優(yōu)選通過本文所述方法最終制備。
反應物或產(chǎn)物的鹽類或溶劑化物例如水合物可以被使用或如果需要以本發(fā)明的任何方法制備。
本發(fā)明通過下列實施例進一步闡述，這些實施例是僅用于說明性的，而不是以任何方式限制本發(fā)明未決權(quán)利要求書的范圍。
實施例1木糖酶(xylosidases)的選擇制備含有取自樺樹木的1%木聚糖、0.1%酵母抽提物、0.1%胰(蛋白)胨和1.5%瓊脂的瓊脂平面。將2g土壤試樣或腐木試樣懸浮于40ml水中，并向每個平面涂布0.1ml按1∶200稀釋的該稀釋液。在室溫(約22℃)下將各平面保溫1周，然后將其在4℃貯存2周。各平面上涂以含有1mM4-甲基umbelliferyl-β-D-吡喃木糖苷(xylopyranoside)的4ml0.8%瓊脂糖(約40℃)。挑出在遠(long)紫外光下呈熒光的125個菌落并在28℃在瓊脂平面上保溫3天。
搖動含有取自樺樹木的1%木聚糖、0.2%胰(蛋白)胨、0.2%酵母抽提物和足夠的磷酸鉀以將pH調(diào)至7的燒瓶。將燒瓶接種以菌環(huán)量的取自平面上的培養(yǎng)物，并在28℃和175rpm條件下保溫。2天后，加入1mg7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)在0.2ml甲醇中的溶液，并繼續(xù)保溫2天。另一組分離菌在加入7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)之前保溫1天，而在加入之后保溫3天。向每個燒瓶中加入10ml甲醇，并用HPLC方法1(下面所述)測定樣品中的7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)和10-脫乙?；仙即?taxol)。在所篩選的86個分離菌中，有9個產(chǎn)生可檢測量的10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)。用莫拉氏菌屬ATCC55475可得到最高濃度的10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)，將該菌通過反復劃線法(restreaking)純化，并用于下面的實施例中。
實施例27-木糖基-10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)的水解反應在4升錐形瓶中，將含有1%樺樹木木聚糖、0.2%胰(蛋白)胨、0.2%酵母抽提物、0.1%KH2PO4和0.1%K2HPO4的pH7的1升培養(yǎng)基用10ml莫拉氏菌屬ATCC 55475培養(yǎng)物接種，并在28℃搖動3天。離心收集細胞，用50ml50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)洗滌，離心并再懸浮于30ml該緩沖液(0.122g濕細胞/ml)中。向1.5ml細胞懸浮液中加入溶于0.2ml甲醇和0.3ml水中的0.5mg 7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)。將該懸浮液在28℃在12rpm條件下極向混合21小時;然后用2ml甲醇停止反應，并用HPLC方法1測定樣品。沒有7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)剩余，并發(fā)現(xiàn)有0.230mg/ml 10-脫乙?；仙即?taxol)(產(chǎn)率107%)。
該實施例的反應說明如下。
實施例37-木糖基紫杉醇(taxol)的水解反應向按實施例2所述方法制備的1.5ml細胞懸浮液中加入溶于0.2ml甲醇和0.3ml水中的0.5mg7-木糖基紫杉醇(taxol)。將懸浮液在28℃在12rpm的條件下極向混合21小時，然后用2ml甲醇停止反應，并用HPLC方法1測定樣品。剩下0.011mg/ml7-木糖基紫杉醇(taxol)并發(fā)現(xiàn)有0.167mg/ml紫杉醇(taxol)(77%產(chǎn)率)。
HPLC方法11柱HewlettPackardhypersil5micronODSC18，200×4.6mm流動相60%甲醇，40%水流速1毫升/分鐘柱溫環(huán)境溫度檢測波長235nm1B.Monsarrat，E.Mariel，S.Cros，M.Gares，D.Guenard，F(xiàn).Gueritte-Voegelein和M.Wright，Drug Metabolism and Disposition，18，895-901(1990)。
實施例47-木糖基漿果赤霉素-Ⅲ的水解反應將莫拉氏菌屬ATCC 55475在搖動燒瓶中在28℃在含有下列成分的pH7的培養(yǎng)基中生長2%甘油、0.2%胰(蛋白)胨、0.2%酵母抽提物、0.1%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.02%MgSO4·7H2O、0.001%NaCl、0.001%FeSO4·7H2O和0.001%MnSO4·4H2O。用1ml的小瓶接種100ml培養(yǎng)基。4天后，在4升錐形瓶中用15ml的部分該培養(yǎng)物接種1升培養(yǎng)基。3天后，通過離心收集細胞，用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)洗滌，再次離心，并冷凍貯存。
將1mg7-木糖基紫杉醇(taxol)、200mg(108毫單位)取自NocardioidesalbusATCC55425(描述于上述美國專利序列號08/077，979中)的C-13脫酰酶、0.2ml甲醇、0.2ml1M磷酸鉀緩沖液(pH7)和3.6ml水在24℃在48rpm條件下極向混合17小時。15小時后，用方法1(如上所述)進行HPLC分析表明從底物中完全除去了C-13側(cè)鏈?，F(xiàn)將含有7-木糖基漿果赤霉素-Ⅲ的2ml該溶液加入到1ml在50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中的上述莫拉氏菌屬細胞(0.24g濕細胞重量)中，并在48rpm條件下極向混合24小時。反應混合物用6ml CH2Cl2萃取。干燥萃取物，并將其再溶于甲醇中以進行用方法1的HPLC分析。發(fā)現(xiàn)有0.101mg/ml漿果赤霉素-Ⅲ(產(chǎn)率102%，按起始的7-木糖基紫杉醇(taxol)濃度計)。
實施例57-木糖基-10-脫乙?；鶟{果赤霉素-Ⅲ的水解反應按實施例4所述方法制備細胞。將1mg 7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)、200mg(108毫單位)C-13脫酰酶(如實施例4中所述)、0.2ml甲醇、0.2ml 1M磷酸鉀緩沖液(pH7)和3.6ml水在24℃在48rpm條件下極向混合17小時。15小時后，用方法1進行HPLC分析表明從底物中完全除去了C-13側(cè)鏈?，F(xiàn)將2ml含有7-木糖基-10-脫乙?；鶟{果赤霉素-Ⅲ的溶液加入到1ml在50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中的上述莫拉氏菌屬細胞(0.24g濕細胞重量)中，并在48rpm條件下極向混合24小時。反應混合物用6ml CH2Cl2萃取。干燥萃取物并再溶于甲醇中用于進行經(jīng)方法1的HPLC分析。發(fā)現(xiàn)有0.099mg/ml 10-脫乙酰基漿果赤霉素-Ⅲ(產(chǎn)率103%，按起始的7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)濃度計)。
實施例6通過亞細胞部分對7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)的水解反應將莫拉氏菌ATCC55475在28℃在6個每個含有1升實施例2所述的培養(yǎng)基的4升錐形瓶中振蕩培養(yǎng)3天。將上述培養(yǎng)基在28℃用2ml/LNovoSP431木聚糖酶處理2天，以在接種前部分水解木聚糖。通過離心收集細胞，用50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)洗滌，再次離心，然后用該緩沖液使體積達到210ml。細胞通過用聲處理破裂，在27504×g離心20分鐘，然后在47807×g將上清液在100，100×g離心1小時，并將100，100×g球狀沉淀物(pellet)再懸浮于17ml50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中。在100，100×g上清液中的蛋白質(zhì)濃度為4.72mg/ml，而在再懸浮的球狀沉淀物(pellet)中的蛋白質(zhì)濃度為1.65mg/ml。將在0.1ml甲醇中的0.5mg7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)加入到1.9ml球狀沉淀物(pellet)或上清液部分中，并將試管在25℃保溫15小時。通過加入2ml甲醇使反應停止，并通過HPLC方法1分析。
所得結(jié)果如下樣品產(chǎn)物底物10-脫乙10-脫乙7-木糖基-10-?；仙减；仙济撘阴；仙即即?taxol)醇(taxol)(taxol)的產(chǎn)率mg/mlmg/ml%沒有酶0.0000.256上清液0.0380.23718球狀沉淀物(pellet)0.2060.03896
實施例7紫杉(Yew)萃取物的水解反應按實施例4中所述方法在搖動燒瓶中培養(yǎng)生長莫拉氏菌ATCC55475。按實施例6所述方法收集細胞并洗滌，然后以12，000psi在顯微流體儀(microfluidizer)通過2次而將細胞破裂。未破裂的細胞通過在27504×g離心20分鐘而除去。上清液在100，100×g離心1小時，而將100，100×g球狀沉淀物(pellet)再懸浮于50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)中，蛋白質(zhì)濃度為17mg/ml。將0.05ml1M磷酸鉀緩沖液(pH7)、0.2mlTaxusHicksii籽苗的乙醇萃取物、20mg聚乙烯吡咯烷酮(用以除去抑制植物的酚醛塑料)和0.75ml水在25℃在12rpm條件下混合1小時。加入1ml球狀沉淀物(pellet)懸浮液或1ml50mM磷酸鉀緩沖液(pH7)，并在12rpm和25℃繼續(xù)保溫3天。
樣品通過HPLC方法2(如下所述)分析，并得到下列結(jié)果樣品產(chǎn)物底物10-脫乙7-木糖基-10-?；仙济撘阴；仙即即?taxol)(taxol)mg/mlmg/ml沒有酶0.0200.020100,100×g0.0280.009球狀沉淀物(pellet)
HPLC方法2柱phaseSeparationsInc.(Norwalk，CT)microborespherisorbphenyl150×2.0mm，3微米流動相溶劑A用三氟乙酸調(diào)至pH4的15mM KH2PO4。
溶劑B乙腈時間/分鐘溶劑A(%)溶劑B(%)07525205545234060242575287525柱溫35℃檢測波長230nm。
權(quán)利要求
1.用于制備至少一種含有直接鍵合在C-7位的羥基的紫杉烷(taxane)的方法，該方法包含下列步驟使至少一種含有直接鍵合在C-7位的糖基的紫杉烷(taxane)與能夠催化所述糖基水解為羥基的水解反應的酶或微生物接觸，并進行所述水解反應。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述糖基為木糖基。
3.權(quán)利要求1的方法，其中制備了至少一種帶有C-7羥基的下列式Ⅰ的紫杉烷(taxane)及其鹽 其中R1為羥基或酰氧基;R2為酰氧基或羥基;和R3和R4獨立地為氫、烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基或雜環(huán)基;其制備是通過將至少一種下列式Ⅱ的帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)或其鹽與能夠催化將所述C-7糖基水解為羥基的水解反應的酶或微生物接觸， 其中R1、R2、R3和R4如上所定義，并且“糖基”為直接鍵合在C-7位的糖基。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述糖基為木糖基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述式Ⅱ的紫杉烷(taxane)為7-木糖基紫杉醇(taxol)、7-木糖基-10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)、7-木糖基漿果赤霉素Ⅲ、7-木糖基-10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ、7-木糖基cephalomannine、7-木糖基-10-脫乙?；鵦ephalomannine、7-木糖基紫杉醇(taxol)C、和/或7-木糖基-10-脫乙?；仙即?taxol)C、并且所述式Ⅰ的紫杉烷(taxane)為paclitaxel、10-脫乙酰基紫杉醇(taxol)，漿果赤霉素Ⅲ、10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ、cephalomannine、10-脫乙酰基cephalomannine、紫杉醇(taxol)C和/或10-脫乙?；仙即?taxol)C。
6.權(quán)利要求2的方法，其中在所述水解方法中使用的帶有木糖基的紫杉烷(taxane)起始原料包括帶有木糖基的紫杉烷類化合物(taxanes)的混合物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述紫杉烷類化合物(taxanes)的混合物是通過植物組織的植物細胞培養(yǎng)物，和/或由植物組織萃取得到的，其中所述植物為紫杉屬之一。
8.權(quán)利要求1的方法，其中使用了在下列各屬之一范圍內(nèi)的微生物黃桿菌屬、不動桿菌屬、莫拉氏菌屬、芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、芽孢八疊球菌屬、顫螺菌屬、動性球菌屬、乳桿菌屬、庫特氏菌屬、微球菌屬、口腔球菌屬(Stomatococcus)、葡萄球菌屬、節(jié)桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或Kingella。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所用的微生物在下列各屬范圍內(nèi)黃桿菌屬、莫拉氏菌屬、微球菌屬或芽孢桿菌屬。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述微生物選自莫拉氏菌屬ATCC 55475、浸麻芽孢桿菌ATCC 55476、環(huán)狀芽孢桿菌ATCC 55477和微球菌屬ATCC 55478。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶衍生自在下列各屬之一范圍內(nèi)的微生物黃桿菌屬、不動桿菌屬、莫拉氏菌屬、芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、芽孢八疊球菌屬、顫螺菌屬、動性球菌屬、乳桿菌屬、庫特氏菌屬、微球菌屬、口腔球菌屬(Stomatococcus)、葡萄球菌屬、節(jié)桿菌屬、奈瑟氏球菌屬或Kingella。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述酶衍生自在下列各屬范圍內(nèi)的微生物黃桿菌屬、莫拉氏菌屬、微球菌屬或芽孢桿菌屬。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述酶衍生自選自下列的微生物莫拉氏菌屬ATCC 55475、浸麻芽孢桿菌ATCC 55476、環(huán)狀芽孢桿菌ATCC 55477和微球菌屬ATCC 55478。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所得紫杉烷(taxane)產(chǎn)物為paclitaxel，或為隨后轉(zhuǎn)化為paclitaxel的紫杉烷(taxane)。
15.用于選擇能夠酶催化水解起始的帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)以形成相應的帶有C-7羥基的紫杉烷(taxane)的微生物的方法，該方法包含下列步驟(ⅰ)選擇能夠支持待篩選的微生物的生長的菌種生長培養(yǎng)基;(ⅱ)選擇一種指示劑糖苷;(ⅲ)使微生物與步驟(ⅰ)的菌種生長培養(yǎng)基接觸，以便使微生物進行生長，并使上述物質(zhì)與步驟(ⅱ)的指示劑糖苷接觸;(ⅳ)在指示劑糖苷的存在下，觀察微生物，以確定是否存在水解反應;和(ⅴ)檢驗微生物以確定所述帶有C-7糖的紫杉烷(taxane)的水解反應。
16.微生物莫拉氏菌屬ATCC 55475，其為生物學純的。
17.微生物浸麻芽孢桿菌ATCC 55476，其為生物學純的。
18.微生物環(huán)狀芽孢桿菌ATCC 55477，其為生物學純的。
19.微生物微球菌屬ATCC 55478，其為生物學純的。
20.能夠催化權(quán)利要求1的水解反應的酶，該酶是從下列菌屬分離出來的莫拉氏菌屬ATCC 55475、浸麻芽孢桿菌ATCC 55476、環(huán)狀芽孢桿菌ATCC 55477、或微球菌屬ATCC 55478。
21.用于制備至少一種含有直接鍵合在C-7位的糖基的紫杉烷(taxane)的方法，該方法包含下列步驟在糖的存在下，使至少一種含有直接鍵合在C-7位的羥基的紫杉烷(taxane)與能夠催化所述C-7位的羥基轉(zhuǎn)化為所述C-7位的糖基的酶或微生物接觸，并進行所述轉(zhuǎn)化反應。
全文摘要
一種酶催化水解方法，其中將一種或多種帶有C-7糖，優(yōu)選帶有C-7木糖基的紫杉烷類化合物(taxanes)與一種能夠?qū)⑺鎏腔鉃榱u基的酶或微生物接觸。
文檔編號C12Q1/34GK1111229SQ9510124
公開日1995年11月8日 申請日期1995年1月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月13日
發(fā)明者R·L·漢森, R·N·帕特爾, L·J·施扎卡 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司