專利名稱：新疆紫草細(xì)胞固體兩步培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說它是一種新疆紫草細(xì)胞固體培養(yǎng)的方法。
新疆紫草(Arnebia euchroma)為我國傳統(tǒng)中草藥，其有效成分紫草寧及其衍生物為萘醌類化合物。主要用于治療皮膚燒傷、凍傷、燙傷、潰瘍久治不愈及婦科炎癥等。臨床還用于各種皮膚疾癥，如濕疹、丘疹、粉刺、角皮癥、婦女色斑及頭部淺在性白蘚等。尤其是紫草寧衍生物中的乙酰紫草素具有抗腫瘤活性。此外紫草寧及其衍生物還是極好的天然色素，色價高，理化性能穩(wěn)定?？捎糜诨瘖y品，食品和染料等。但是由于新疆紫草生長在海拔3000米左右的高山地帶，故引種栽培至今尚未成功，目煎仍果用果挖野生紫草提取紫草寧及其衍生物的方法。該技術(shù)的缺點(diǎn)在于①新疆紫草為多年生植物，紫草寧及其衍生物只存在于天然植棟的根部，故采集根部無疑是“殺雞取卵”，對野生資源具有嚴(yán)重的破壞性。為此，新疆紫草早已被林業(yè)部列為國家級保護(hù)植物。
②紫草野生植株生長在不同的生長地帶，其根中有效成份的含量不穩(wěn)定，而且含量較低，通常為干重的1-4％。
③從天然植株根中提取的紫草寧及其衍生物中含有15-30％的蠟質(zhì)。
除從野生新疆紫草根中提取紫草寧及其衍生物外，近年來我國東北地區(qū)，已將不同屬的遼寧紫草(Lithospermum erythorhizon)引種栽培成功。此種生產(chǎn)紫草寧及其衍生物的途徑也存在如下缺點(diǎn)
①我國臨床實(shí)踐證明，新疆紫草臨床藥效遠(yuǎn)超過遼寧紫草。
②新疆紫草根中紫草寧及其衍生物的含量亦比遼寧紫草根中更高。
③人工栽培要占據(jù)大量農(nóng)田，在可耕面積日漸縮小的形勢下，這一舉措應(yīng)視為下策。
④人工栽培不能擺脫自然環(huán)境的影響，如不良?xì)夂驐l件，病蟲害等，故有效成份的含量和質(zhì)量將不穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的在于針對上述問題和存在缺陷，提出一種新疆紫草細(xì)胞固體兩步培養(yǎng)生產(chǎn)方法。該方法采用植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧及其衍生物。
以下是本發(fā)明的主要內(nèi)容1.新疆紫草細(xì)胞系的制取A.果用新疆紫草種子苗的不同器官(根、胚軸、子葉及真葉等)作外植體誘導(dǎo)愈傷組織。具體操作如下將采自新疆地區(qū)的新疆紫草種子，經(jīng)8％的次氯酸鈉浸泡12分鐘以進(jìn)行表面消毒，播于經(jīng)高壓滅菌而浸有無菌水的濾紙上，在溫度為25±1℃下暗培養(yǎng)，5天后開始發(fā)芽。待幼苗真葉形成，根和胚軸生長到0.8--1.2cm，將幼苗分成根、胚軸、子葉和真葉。把這四部分外植體分別接種在附加KT 0.5mg和2，4-D1mg/l的LS培養(yǎng)基上，放置于25±1℃暗室培養(yǎng)。經(jīng)6周培養(yǎng)，即可在外植體的切口部位形成愈傷組織。
B.愈傷組織在生長培養(yǎng)基(AG—7)上繼代培養(yǎng)(25±1℃暗培養(yǎng))，每25天轉(zhuǎn)代一次，經(jīng)過10-30代的繼代培養(yǎng)可獲得A-1細(xì)胞系。
2.新疆紫草細(xì)胞固體二步培養(yǎng)法中培養(yǎng)基組成
A.生長培養(yǎng)基 B.生產(chǎn)培養(yǎng)基AG-7生長培養(yǎng)基組成成分 AP-5生產(chǎn)培養(yǎng)基組成成分(單位mg/L)(單位mg/L)KNO3 1,900.0 KNO330.0(NH4)2SO4 463.0Ca(NO3)·4B2O 694.0KH2PO4170.0MgSO4·7H2O 750.0MgSO4·7H2O 370.0NaH2PO4·2H2O 19.0CaCl2·2H2O 440.0KCl 65.0B3BO3 6.2 Na2SO4 1480.0KI0.83MnSO4·4H2O 22.3 FeSO4·7H2O 27.8ZnSO4·7H2O 8.6 Na2EDTA 37.3Na2MoO4·2H2O 0.25 ZnSO4·7H2O 3.0CuSO4·5H2O 0.025H3BO3 4.5CoCl·6H2O0.025CuSO4·5H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8 KT 1.0NNa2EDTA 37.3 Suerosse20,000.0—50,000.0Inosiiol 100.0Agar7,000.0—10,000.0VitamineBl-HCl0.1 *在高壓消毒之前pH至4.8—6.2IAA 0.2KT1.0Sucrosse 20,000.0—50,000.0Ager 7,000.0—10,000.0*在高壓消毒之前pH調(diào)至4.8—6.2
3.新疆紫草細(xì)胞固體二步培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程(A)按本發(fā)明AG-7生長培養(yǎng)基的配方組成，配制生長培養(yǎng)基。用pH計測定pH值，并用1N的HCl及1N的KOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值在4.8—6.2范圍內(nèi)。加入0.7-1％瓊脂，煮沸后分裝至5號中方瓶(北京玻璃5廠出品)內(nèi)，每瓶20—60毫升。用封口膜封口后，進(jìn)行高壓消毒，壓力為1.0-1.2kg/cm2，時間為15—25分鐘。
(B)將經(jīng)過繼代培養(yǎng)獲得的A-1細(xì)胞系，在超凈工作臺中接種于上述生長培養(yǎng)基中，接種量為1.5-5.0％(w/v，g.fw/ML)。將接種后的培養(yǎng)瓶放入暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)18—28天，溫度為15—30℃。
(c)按(A)項所述的程序，按本專利申請AP-5生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方組成，配制生產(chǎn)培養(yǎng)基。將(B)項在生長培養(yǎng)基上生長18—28天的愈傷組織，在超凈工作臺中轉(zhuǎn)接至生產(chǎn)培養(yǎng)基中，接種量為3.0-7.0克鮮重/瓶，培養(yǎng)室條件同(B)項。培養(yǎng)20—25天后，用不銹鋼勺將培養(yǎng)物全部取出，放入塘瓷盤內(nèi)，送入50℃的烘箱中烘干，進(jìn)行下述第4項的紫草寧衍生物的分離提取。


圖1為新疆紫草細(xì)胞固體二步培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程示意圖。
4.紫草寧衍生物的分離提取工藝取紫草細(xì)胞培養(yǎng)物于空氣循環(huán)干燥器60℃烘干后，以粉碎機(jī)粉碎成20目的粗粉，裝于組合式連續(xù)提取器中，用30-60沸程的石油醚做浸出溶劑進(jìn)行循環(huán)浸出。浸出液的出液系數(shù)控制在5以下。浸出液經(jīng)過濾后再用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器減壓回收石油醚，將浸出液濃縮成膏狀，再于60℃干燥得紫草寧衍生物(AC-90)產(chǎn)品。
試驗證明在固體培養(yǎng)下，用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，其細(xì)胞生長速率可迭10.0克·干重/升/月，紫草寧衍生物的含量最高可達(dá)培養(yǎng)物干重的7.0％；液體懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長速率可達(dá)22.0克·干重/升/月，紫草寧衍生物的含量可達(dá)17.0％；應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)(10—30升)細(xì)胞生長速率可達(dá)18.0干重/升/月，紫草寧衍生物的含量最高可達(dá)培養(yǎng)物干重的12.0％。
圖2為紫草寧衍生物提取工藝流程圖。
本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及積極效果(1).新疆紫草為國家保護(hù)植物，利用植物細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧衍生物，走工業(yè)化生產(chǎn)的途徑，可有效地保護(hù)野生資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
(2).應(yīng)用細(xì)胞大量培養(yǎng)生物合成紫草寧衍生物，可獲得穩(wěn)定的質(zhì)量和產(chǎn)量，不受自然條件的限制和影響。
(3).不需要占用農(nóng)田，只需要占用有限的廠房和培養(yǎng)室，高度集約化。
(4).通過人工調(diào)節(jié)與控制細(xì)胞的生長和次生產(chǎn)物的合成，可極大地提高紫草寧衍生物的產(chǎn)量與含量(見表1)，尤其是提高紫草寧衍生物中具抗菌(見表2)、抗腫瘤活性的乙酰紫草素(Acetylsbikonin)的含量比例(見表3)。比原植株根中的紫草寧衍生物含量高4-8倍，乙酰紫草素的含量高6-10倍，蠟質(zhì)含量僅為天然提取物的1/16。
(5).該項技術(shù)，不使用生物反應(yīng)器進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，故可免去購置生物反應(yīng)器的昂貴投資。一次性投資量小，產(chǎn)量與含量穩(wěn)定，污染率極低。
以下敘述
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1按本發(fā)明AG—7生長培養(yǎng)基的配方組成，配制生長培養(yǎng)基，蔗糖濃度為30克/升，調(diào)pH值為5.8，瓊脂濃度為0.7％。用5號中方瓶，每瓶裝培養(yǎng)液40毫升。高壓消毒，壓力為1.0Kg/CM2，2分鐘。接入A—1細(xì)胞系，接種量為3.0％，效入暗培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度為24°±1℃。培養(yǎng)23天后每瓶鮮重可達(dá)15.0克。將其轉(zhuǎn)接至AP—5生產(chǎn)培養(yǎng)基中(配制程序同生長培養(yǎng)基)，接種量為5.0克鮮重/瓶，培養(yǎng)室條件同生長階段。培養(yǎng)23天后收獲，每瓶可獲培養(yǎng)物0.68克干重，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)分離提取后，用高壓液相色譜分析，并與天然植株中提取的紫草寧衍生物進(jìn)行對照結(jié)果如下表1 新疆紫草細(xì)胞培養(yǎng)物與天然植棟紫草寧衍生物含量及特性的比較
*.A.去氧紫草素，B.β，β—二甲基丙烯酰紫草素C.乙酰紫草素， 0.2，3—二甲基戊烯酰紫草素E.β—羥基異戊酰紫草素實(shí)施例2按實(shí)施例1通過培養(yǎng)物提取分離獲得的紫草寧衍生物其抗菌活性超過天然植株提取的紫草寧衍生物。試驗結(jié)果如下表。表中BA—I代表β，β—二甲基丙烯酰紫草素，BA—II代表乙酰紫草素，BA—P代表從植物中提取的總紫草寧化合物，BA—C代表從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的總紫草寧化合物。
表2對15種細(xì)菌的抗菌作用
實(shí)施例3按實(shí)施例1通過培養(yǎng)物提取分離獲得的紫草寧衍生物其抗腫瘤活性超過天然植株提取的紫草寧衍生物。試驗結(jié)果如下表。表中BA—P代表從植物中提取的總紫草寧化合物，BA—C代表從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的總紫草寧化合物，BA—II代表乙酰紫草素。
表3紫草寧衍生物抗艾氏腹水癌(EC)的活性比較
權(quán)利要求
1.一種紫草細(xì)胞系，其特征在于A.將新疆紫草幼苗的根或胚軸或子葉或真葉外植體接種于附加KT 0.5mg/l和2，4-D 1mg/l的LS培養(yǎng)基上，放置于25±1℃暗室培養(yǎng)，6周后，即可獲得愈傷組織；B.愈傷組織在下列培養(yǎng)基(AG—7)上繼代培養(yǎng)，每25天轉(zhuǎn)代一次，經(jīng)過10-30代的繼代培養(yǎng)可獲得A-1細(xì)胞系。AG-7生長培養(yǎng)基組成成分(單位mg/L)KNO3 1,900.0(NH4)2SO4 463.0KB2PO4 170.0MgSO4·7H20370.0CaCl2·2H2O440.0B3BO3 6.2KI 0.83MnS04·4H2O22.3ZnSO4·7H2O3.6Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl·6H2O 0.025FeSO4·7H2O27.8Na2EDFA37.3Inositol 100.0VitamineB1-HC1 0.1IAA0.2KT 1.0Sucrosse 20,000.0—50,000.0Agar 7,000.0—10,000.0
2.一種紫草細(xì)胞系的生產(chǎn)方法，其特征在于A.將新疆紫草幼苗的根或胚軸或子葉或真葉外植體分別接種在附加KT 0.5mg/1和2，4-D1mg/l的LS培養(yǎng)基上，放置于25±1℃暗室培養(yǎng)，6周后，即可獲得愈傷組織；B.愈傷組織在下列培養(yǎng)基(AG—7)上繼代培養(yǎng)，每25天轉(zhuǎn)代一次，經(jīng)過10-30代的繼代培養(yǎng)可獲得A-1細(xì)胞系。AG-7生長培養(yǎng)基組成成分(單位mg/L)KNO3 1,900.0(KN4)2SO4 463.0KH2PO4 170.0MgSO4·7H2O370.0CaCl2·2H2O440.0H3BO3 6.2KI 0.83MnSO4·4H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl·6H2O 0.025FeSO4·7H2O27.8Na2EDTA37.3Inositol 100.0VitamineBl-HCl 0.1IAA0.2KT 1.0Sucrosse 20,000.0—50,000.0Agar 7,000.—10,000.0
3.一種利用新疆紫草細(xì)胞固體二步培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧衍生物的方法，其特征在于(A)將權(quán)利要求1所述的A-1細(xì)胞系接種于下述AG-7生長培養(yǎng)基中，接種量為1.5-5.0％(w/v，g.fw/ML)；接種后放入暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)18—28天，溫度為15—30℃；(B)將(A)中得到的細(xì)胞系轉(zhuǎn)接至下述AP-5生產(chǎn)培養(yǎng)基中，接種量為3.0-7.0克鮮重/瓶，培養(yǎng)室條件同(A)項；培養(yǎng)20—28天后，獲得新疆紫草培養(yǎng)物；(C)將(B)中得到的培養(yǎng)物送入60℃的烘箱中烘干，用粉碎機(jī)粉碎成20目的粗粉，裝于組合式連續(xù)提取器中，用石油醚浸提浸出液過濾、濃縮、干燥得紫草寧衍生物(AC-90)產(chǎn)品。A. 生長培養(yǎng)基B.生產(chǎn)培養(yǎng)基AG-7生長培養(yǎng)基組成成分 AP-5生產(chǎn)培養(yǎng)基組成成分(單位mg/L) (單位mg/L)KNO31,900.0 KNO3 30.0(KH4)2SO4 463.0 Ca(NO3)·4H2O 694.0KH2PO4 170.0 MgSO4·TH2O 750.0MgSO4·7H2O 370.0 NaH2PO4·2H2O 19.0CaCl2·2H2O 440.0 KCl 65.0H3BO3 6.2 Na2SO41480.0KI 0.83MnSO4·4H2O 22.3FeSO4·7H2O 27.8ZnSO4·7H2O 8.6 Na2EDTA 37.3Na2MoO4·2H2O 0.25ZnSO4·7H2O 3.0CuSO4·5H2O 0.025 H3BO3 4.5CoCl·6H2O 0.025 CuSO4·5H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8KT1.0Na2EDTA 37.3Sucrosse 20,000.0—50,000.0Inositol100.0 Agar 7,000.0—10,000.0VitamineBl-HCl 0.1IAA 0.2KT 1.0Sucrosse20,000.0—50,000.0Agar7,000.0—10,000.0
全文摘要
采用新疆紫草幼苗的不同器官作外植體誘導(dǎo)愈傷組織并獲細(xì)胞系；建立了細(xì)胞固體二步培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程，包括AG-7生長培養(yǎng)基與AP-5生產(chǎn)培養(yǎng)基。試驗證明用本方法其細(xì)胞培養(yǎng)物中紫草寧衍生物的含量較原植物中高4-8倍。具抗菌、抗腫瘤活性的乙酰紫草素的含量比原植物高6-10倍，蠟質(zhì)含量僅為天然提取物的1/16。
文檔編號C12P7/66GK1117525SQ9510633
公開日1996年2月28日 申請日期1995年6月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月13日
發(fā)明者葉和春, 李國鳳, 宋海液, 陳建林 申請人:中國科學(xué)院植物研究所