專(zhuān)利名稱(chēng)：定點(diǎn)誘變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域使用的定點(diǎn)誘變的簡(jiǎn)化方法以及用于此方法的試劑盒。
近年來(lái)，定點(diǎn)誘變已成為闡明基因工程領(lǐng)域克隆基因的結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系所必不可少的技術(shù)。在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，定點(diǎn)誘變也是修飾蛋白質(zhì)以改變其特性所必不可少的技術(shù)。
例如，常規(guī)下定點(diǎn)誘變可按下列步驟進(jìn)行。
(1)將需要引入定向突變的DNA插入載體。對(duì)于雙鏈質(zhì)粒DNA而言，還需通過(guò)熱變性分離互補(bǔ)鏈，或者也可以使用M13噬菌體載體以得到單鏈DNA。
(2)將依據(jù)定向突變化學(xué)合成的寡核苷酸與上述單鏈DNA一起退火，再經(jīng)受聚合酶反應(yīng)和連接酶反應(yīng)以得到除定向突變處以外皆為互補(bǔ)的雙鏈DNA。
(3)用上述DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)并篩選出其中引入突變的菌落。
這種定點(diǎn)誘變法需要復(fù)雜而麻煩的步驟。
另外，已知的幾個(gè)蛋白質(zhì)可催化鏈交換反應(yīng)。在這些蛋白質(zhì)中，對(duì)來(lái)源于大腸桿菌、被稱(chēng)作RecA的蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行了詳細(xì)研究，并嘗試將此RecA蛋白質(zhì)用于誘變[Tanpakushitsu.Kakusan.Koso(Protein，Nucleic Acid and Enzyme).32(1)，73～14(1987)]。但在此方法中，不是直接通過(guò)鏈交換反應(yīng)而是隨機(jī)地通過(guò)誘變劑處理來(lái)引入突變。因此很難將突變引入確定的位點(diǎn)，此方法因此也不能被當(dāng)作定點(diǎn)誘變。
本發(fā)明的目的是提供定點(diǎn)誘變的簡(jiǎn)化方法以及實(shí)施此方法的試劑盒。
本發(fā)明第一方面涉及包括以下步驟的定點(diǎn)誘變的方法(1)在體外用能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)處理含有定點(diǎn)誘變靶DNA的載體以及誘變DNA，由此可制得其中已通過(guò)鏈交換反應(yīng)引入突變的載體；和(2)將其中已引入突變的載體引入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明第二方面涉及定點(diǎn)誘變的試劑盒，它包含能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明將在下文詳細(xì)描述。
例如，根據(jù)本發(fā)明方法的定點(diǎn)誘變可按下列方法進(jìn)行。
(1)在體外用能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)處理已插入定點(diǎn)誘變靶DNA的載體以及誘變DNA以誘導(dǎo)同源重組。
(2)將上述(1)中制得的載體引入宿主細(xì)胞。在此步驟中，優(yōu)選使用選擇壓力以避免篩選出未引入突變的載體。
(3)通過(guò)提取載體可得到已引入突變的DNA。如有必要，可將提取出的載體再引入適當(dāng)宿主以得到必定已引入了突變的DNA。
用作誘變靶子的DNA無(wú)需作特別限制，只要它在宿主細(xì)胞中不產(chǎn)生致死活性。當(dāng)載體是雙鏈時(shí)，誘變DNA(單鏈)和載體使用的摩爾比約為1∶2。
能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)的典型例子當(dāng)推來(lái)源于大腸桿菌的RecA蛋白質(zhì)。然而本發(fā)明并不局限于此，也即本文中還可使用類(lèi)似于RecA但為其它來(lái)源及其變異體的蛋白質(zhì)。其它來(lái)源蛋白質(zhì)的例子是來(lái)源于裂殖酵母的Rad 51基因產(chǎn)物。已克隆了鼠和人類(lèi)的類(lèi)似基因，這些基因的產(chǎn)物也可使用。當(dāng)使用RecA蛋白質(zhì)引入突變時(shí)，反應(yīng)可在含有鎂鹽，如醋酸鎂或氯化鎂，和腺苷三磷酸(ATP)的，如Tris-HCl或者HEPES的緩沖液中進(jìn)行。例如，優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)所具有的組分包括25mM Tris-HCl(或Tris醋酸)(pH7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT和1mM ATP，或者含有30mM HEPES(pH7.2)、15mM醋酸鎂、2mM DTT、1.2mM ATP和100μg/ml BSA。此時(shí)，所使用的RecA蛋白質(zhì)的濃度應(yīng)能有效地允許鏈交換反應(yīng)得以進(jìn)行。例如，當(dāng)載體是雙鏈時(shí)，載體和蛋白質(zhì)可使用的濃度分別約為2.5至20μM和5至40μM。
反應(yīng)介質(zhì)可進(jìn)一步含有ATP再生系統(tǒng)，例如可含有8mM磷酸肌酸和10U/ml肌酸磷酸激酶。此時(shí)，該蛋白質(zhì)的量可減少為約2μM。
將除該蛋白質(zhì)以外的成分混合，預(yù)熱此混合物，在其中加入該蛋白質(zhì)并在37℃下溫育此反應(yīng)混合物1至2小時(shí)以進(jìn)行鏈交換反應(yīng)。
在步驟(2)中所使用的宿主細(xì)胞的例子包括已建立了宿主-載體系統(tǒng)的細(xì)胞，即如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的細(xì)菌、酵母菌、真菌、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。從方便操作的觀點(diǎn)出發(fā)可優(yōu)選使用大腸桿菌。盡管大腸桿菌的任何菌株都可不受限制地被使用，但更優(yōu)選使用具有mut S突變的菌株，如BMH 71-18 mutS菌株。也可使用其它錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺陷的菌株，如mut T或mut D。
步驟(1)中所使用的載體既可以是單鏈載體也可以是雙鏈載體?？筛鶕?jù)所使用的宿主細(xì)胞選擇適當(dāng)?shù)妮d體。當(dāng)大腸桿菌被用作宿主細(xì)胞時(shí)，所使用的載體的例子包括pUC系列，pBR系列或M13。
誘變DNA是含有定向突變的天然的或合成DNA。例如可使用單鏈合成的寡核苷酸，此寡核苷酸所具有的長(zhǎng)度必須能使之與靶序列穩(wěn)定雜交，通常為20個(gè)單體或更長(zhǎng)。
在分子間同源重組的情況下，較長(zhǎng)的同源序列可確保重組的發(fā)生。通過(guò)使用如PCR產(chǎn)物等的長(zhǎng)鏈DNA作為誘變DNA可使定點(diǎn)誘變更有效地進(jìn)行。例如，使用含有定向突變的寡核苷酸和與載體上除了計(jì)劃引入突變的區(qū)域外的位點(diǎn)互補(bǔ)的另一個(gè)寡核苷酸作為一對(duì)引物以進(jìn)行PCR。然后將所得PCR產(chǎn)物用作誘變DNA。因此難以通過(guò)化學(xué)合成的長(zhǎng)鏈DNA可輕易地制備到。長(zhǎng)鏈DNA的使用使得提供更穩(wěn)定的效率成為可能。誘變DNA的長(zhǎng)度通常在幾十個(gè)堿基對(duì)至幾千個(gè)堿基對(duì)之間變化，它小于引入該DNA的載體的大小。
在通過(guò)使用寡核苷酸難以建立穩(wěn)定雜交(由于與除了誘變位點(diǎn)外的寡核苷酸高度互補(bǔ)的位點(diǎn)的存在使得定向突變不能被引入)或者所使用的宿主轉(zhuǎn)化率低的情況下這種方法特別有效。
載體和誘變DNA的結(jié)合可以形成所謂的D-環(huán)或雙D-環(huán)[NatureGenetics，3，365-371(1993)]。
為了將DNA引入宿主，可選擇使用依賴(lài)于宿主能得到高轉(zhuǎn)化率的方法，例如可使用電穿孔法。
通過(guò)在步驟(2)中使用選擇壓力，可更有效地篩選出目標(biāo)DNA。例如選擇壓力可以下列方式使用。當(dāng)大腸桿菌被用作宿主時(shí)，先通過(guò)在相應(yīng)于誘變DNA區(qū)域內(nèi)的適當(dāng)限制性酶切位點(diǎn)處切開(kāi)，使載體直線(xiàn)化，再進(jìn)行鏈交換反應(yīng)。當(dāng)由于鏈交換反應(yīng)而發(fā)生同源重組時(shí)，載體重新環(huán)化。而當(dāng)鏈未反應(yīng)因此沒(méi)發(fā)生同源重組時(shí)，載體保持線(xiàn)型。當(dāng)大腸桿菌被用作宿主時(shí)，線(xiàn)型DNA的引入率通常比環(huán)型DNA要低10-2至10-3。因此其中引入了定向突變的環(huán)狀DNA被優(yōu)先引入宿主，結(jié)果就可更加有效地篩選出目標(biāo)DNA。由于它與通過(guò)琥珀突變使用選擇壓力的情況相類(lèi)似，可不受限制地適用于任何載體，因而特別優(yōu)選此方法。當(dāng)不使用上述選擇壓力時(shí)，也可使用β-半乳糖苷酶或綠色熒光素蛋白(GFP)通過(guò)顏色選擇篩選出所需菌落。
在本發(fā)明方法中，無(wú)需如常規(guī)方法中那樣，通過(guò)噬菌體感染或變性來(lái)制備單鏈DNA，因?yàn)榭墒褂秒p鏈載體。而且，無(wú)需使用兩個(gè)或更多個(gè)酶催化的反應(yīng)步驟(聚合酶反應(yīng)、連接酶反應(yīng)等)。由于使用了可催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而本發(fā)明方法與包括退火步驟的常規(guī)方法相比，使得穩(wěn)定地引入突變成為可能而不管誘變DNA的堿基序列。
通過(guò)將所使用的試劑組裝成試劑盒可使本發(fā)明的定點(diǎn)誘變方法進(jìn)一步地簡(jiǎn)單進(jìn)行。此試劑盒至少含有能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)。它可包括反應(yīng)緩沖液。它也可包括都用作對(duì)照的載體和合成的寡核苷酸。每種成分都可以溶液的形式提供。
下文給出的實(shí)施例是為了進(jìn)一步更詳細(xì)闡明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1(1)pUC19-Mut的構(gòu)建將質(zhì)粒pUC19-Mut構(gòu)建為以下實(shí)施例中使用的載體，其中質(zhì)粒pUC19的lac Z′基因多克隆位點(diǎn)的下游30-位置處的G被A所置換。當(dāng)編碼lac Z α-肽的lac Z′基因被引入具有l(wèi)ac Z′ΔM15基因型的宿主時(shí)可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶活性。有IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)存在時(shí)，未經(jīng)受堿基置換的lac Z′基因由于X-gal作為底物的反應(yīng)而顯示出藍(lán)色菌落。相反，由于堿基置換而導(dǎo)致突變的lac Z′基因不能產(chǎn)生其固有的活性因而只能顯示白色菌落。
利用這些現(xiàn)象，通過(guò)計(jì)數(shù)藍(lán)色和白色菌落可計(jì)算出由定點(diǎn)誘變而突變的pUC19-Mut lac Z′基因中堿基置換的回復(fù)突變率。(2)合成用作誘變DNA的寡核苷酸合成序列表中SEQ ID NO.1所示的5′-末端磷酸化寡核苷酸(dR2)以作為目的在于lac Z′基因中堿基置換回復(fù)突變的誘變DNA。也即，dR2被設(shè)計(jì)成可激活lac Z′基因，其中通過(guò)12-位置處的C堿基置換得以回復(fù)。(3)由RecA蛋白質(zhì)催化的鏈交換反應(yīng)在1μl 10×反應(yīng)緩沖液[250mM Tirs醋酸(pH 7.5)、100mM醋酸鎂、10mM二硫蘇糖醇、25mM ATP]中加入200 pmol RecA蛋白質(zhì)(Pharmacia Biotech制品)、50 ng PUC19-Mut和100 pmol dR2。用無(wú)菌水將總體積調(diào)至10μl后，將混合物于37℃下反應(yīng)1至2小時(shí)。
反應(yīng)完成后，以濃度為10mg/ml的方式將蛋白酶K(由TakaraShuzo，Co.，Ltd.制備)加入其中以除去RecA蛋白質(zhì)。接著使用Microcon 100(Takara Shuzo Co.，Ltd.制品)除去過(guò)量的dR2。(4)通過(guò)電穿孔引入宿主大腸桿菌使用基因脈沖發(fā)生器(由Bio-Rad制造)以下述方法引入宿主大腸桿菌(BMH 71-18 mut S菌株)。
首先，將100μl BMH-71-18 mut S感受態(tài)細(xì)胞(由TakaraShuzo Co.，Ltd.制備)加入含有1mM硫胺素的M9培養(yǎng)基中，37℃下振蕩溫育過(guò)夜。將5ml這種培養(yǎng)物再接種于500ml LB培養(yǎng)基中。當(dāng)600nm下的光吸收值約達(dá)到0.8時(shí)，在4,000rpm下離心8分鐘以收獲細(xì)胞并懸浮于1ml 10％的甘油溶液中。
然后，將上述(3)中制備的幾μl反應(yīng)混合物加入50μl上述懸浮液中。將所得混合物倒入預(yù)先在冰中冷卻的寬度為0.1cm的小槽中，再對(duì)它施用1.5KV的脈沖。之后立即加入1ml SOC培養(yǎng)基，在37℃下振蕩溫育1小時(shí)。溫育完成后，收獲細(xì)胞，涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素和X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)基中，并在37℃下溫育過(guò)夜。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落?；貜?fù)突變的lac Z′基因的菌落為藍(lán)色，而那些未回復(fù)突變的為白色。
結(jié)果，藍(lán)色菌落出現(xiàn)的頻率為每約1,000個(gè)菌落中1個(gè)。在既未加入RecA蛋白質(zhì)又未加入dR2的對(duì)照中未觀察到藍(lán)色菌落，換句話(huà)說(shuō)，所有菌落都是白色的。此外通過(guò)測(cè)序分析突變位點(diǎn)。因而藍(lán)色菌落顯出對(duì)應(yīng)于A的帶，另一個(gè)對(duì)應(yīng)于G的帶是反向的，而白色菌落只顯出A帶。
然后，將由此得到的藍(lán)色菌落接種于2ml含有100μg/ml氨芐青毒素的L-培養(yǎng)基中并在37℃下溫育過(guò)夜。從由此得到的細(xì)胞中提取質(zhì)粒，用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109并涂布于含有氨芐青霉素和X-gal的L-瓊脂培養(yǎng)基上。結(jié)果，藍(lán)色菌落和白色菌落出現(xiàn)的頻率約為1∶1。使用從藍(lán)色菌落中提取的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，未觀察到A只觀察到反向的G。
這些結(jié)果表明，當(dāng)在體外用RecA蛋白質(zhì)進(jìn)行處理時(shí)，即使在含有錯(cuò)配的寡核苷酸中也會(huì)發(fā)生由于鏈交換的同源重組。
實(shí)施例2(1)由PCR制備誘變DNA
使用含有定向突變并由序列表中SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸(dR1)，以及與模板中除引入突變的位點(diǎn)外的位點(diǎn)互補(bǔ)并由SEQ IDNO.3所示的另一個(gè)寡核苷酸(dR3)作為一對(duì)引物，以實(shí)施例1-(1)中的pUC19-Mut作為模板按下列方法進(jìn)行PCR。反應(yīng)系統(tǒng)包含10ngpUC19-Mut、20 pmol一份的引物dR1和dR3、200μM一份的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，2.5U的Ampli Taq DNA聚合酶(由Takara Sh-uzo Co.，Ltd.制備)，10mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，2.5mM MgCl2和0.02％明膠(總體積100μl)。鋪上礦物油后，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含94℃下30秒、60℃下30秒和72℃下1分鐘。
反應(yīng)完成后，除去上鋪的礦物油。然后取出10μl一份的反應(yīng)混合物，電泳以確證目的大小的DNA片段已經(jīng)擴(kuò)增。然后，將反應(yīng)混合物濃縮至約為10μl并用Microcon 100純化。(2)載體的制備用限制性酶BamHI消化以使上述實(shí)施例1-(1)中制備的pUC19-Mut線(xiàn)型化。消化完成后，用苯酚抽提載體，用乙醇沉淀再溶于適量TE緩沖液中。(3)用RecA蛋白質(zhì)催化鏈交換反應(yīng)并引入宿主大腸桿菌重復(fù)上述實(shí)施例1-(3)和(4)中的步驟，只是用實(shí)施例2-(2)中制備的線(xiàn)形DNA和實(shí)施例2-(1)中所得的PCR產(chǎn)物分別替代pUC19-Mut和dR2，以此轉(zhuǎn)化BMH71-18 mut S菌株。結(jié)果，藍(lán)色菌落形成的頻率約為50％。然后從這些藍(lán)色菌落中提取質(zhì)粒，并以與實(shí)施例1-(4)中描述的相同方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。從由此形成的藍(lán)色菌落中得到其中引入了定向突變的DNA。
實(shí)施例3用RecA蛋白質(zhì)、反應(yīng)緩沖液、對(duì)照用的載體和寡核苷酸(表1)裝配定點(diǎn)誘變的試劑盒(50次操作)。
表1成分 含量RecA蛋白質(zhì)溶液(7.4mg/ml) 50μl10×反應(yīng)緩沖液 50μlpUC19-Mut溶液(10ng/μl) 10μldR1溶液(100pmol/μl) 10μl本發(fā)明已被詳細(xì)描述，根據(jù)其特定的實(shí)施例，本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員顯然可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出不同的變化和修飾。
序列表SEQ ID NO(序列編號(hào))1序列長(zhǎng)度22序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)形分子類(lèi)型其它核酸(合成的DNA)序列描述CAGGGTTTTC CCAGTCACGA CGSEQ ID NO2序列長(zhǎng)度31序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)形分子類(lèi)型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGGTAACGCC AGGGTTTTCC CAGTCACGAC GSEQ ID NO3序列長(zhǎng)度24序列類(lèi)型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)形分子類(lèi)型其它核酸(合成的DNA)序列描述GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGG
權(quán)利要求
1.一種定點(diǎn)誘變的方法，包括以下步驟(1)在體外用能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)處理含有定點(diǎn)誘變靶DNA的載體以及含有引入靶DNA所需突變的DNA，以使鏈交換反應(yīng)得以進(jìn)行；和(2)將所得載體引入宿主細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的定點(diǎn)誘變的方法，其中所說(shuō)能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)是RecA蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的定點(diǎn)誘變的方法，其中所說(shuō)宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母菌、真菌、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的定點(diǎn)誘變的方法，其中所說(shuō)載體選自pUC-系列、pBR-系列和M13，宿主是大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的定點(diǎn)誘變的方法，其中所說(shuō)載體在鏈交換反應(yīng)之前用限制性酶在相應(yīng)于與靶DNA互補(bǔ)的DNA區(qū)域內(nèi)的位點(diǎn)處切開(kāi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的定點(diǎn)誘變的方法，進(jìn)一步包含從宿主細(xì)胞中回收載體(其中已引入所需突變)的步驟(3)。
7.一種定點(diǎn)誘變的試劑盒，包含能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的定點(diǎn)誘變的試劑盒，進(jìn)一步包含鏈交換反應(yīng)的緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的定點(diǎn)誘變的試劑盒，進(jìn)一步包含都用作對(duì)照的載體和合成的寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的定點(diǎn)誘變的試劑盒，其中所說(shuō)能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)是RecA蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了定點(diǎn)誘變的簡(jiǎn)化方法以及此方法所使用的試劑盒。定點(diǎn)誘變的方法包括步驟(1)在體外用能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)處理含有定點(diǎn)誘變靶DNA的載體以及誘變DNA以制備其中通過(guò)鏈交換反應(yīng)引入了突變的載體；和(2)將其中引入了突變的所得載體引入宿主細(xì)胞。定點(diǎn)誘變的試劑盒包含能催化鏈交換反應(yīng)的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1132790SQ95119768
公開(kāi)日1996年10月9日 申請(qǐng)日期1995年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月22日
發(fā)明者山下裕兄, 友野潤(rùn), 喜多昭彥, 野田晃弘, 中島和男, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社