專利名稱：人細(xì)胞色素p450系列轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)范疇。
適用于藥品、化妝品、食品添加劑、農(nóng)藥、化工產(chǎn)品、毒素等環(huán)境致癌物的代謝和遺傳毒理學(xué)檢測及研究。
目前國內(nèi)外主要應(yīng)用遺傳毒理短期試驗技術(shù)檢測化學(xué)物質(zhì)的致突變性、致癌性，由于大多數(shù)化學(xué)致突變物/致癌物需經(jīng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450(簡稱CYP)代謝活化才能產(chǎn)生遺傳毒理作用，而傳統(tǒng)所用的建株細(xì)胞絕大多數(shù)不能表達(dá)CYP，因此必需在細(xì)胞外添加嚙齒動物或其它來源的肝微粒體酶系或輔助細(xì)胞以達(dá)到理想的活化。這種設(shè)計與體內(nèi)前致癌物在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行活化的過程正好相反，由于終致癌物在進(jìn)入細(xì)胞時遭遇胞漿膜屏障且終致癌物半壽期一般都很短，此外，由于所用的嚙齒動物的CYP與人類CYP有著較大的不同，因而影響了研究結(jié)果的可信度。
當(dāng)前國外主要采用DNA重組技術(shù)，建立cDNA文庫，在獲得人CYP基因的表達(dá)克隆后，導(dǎo)入建株細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)用于藥理學(xué)、遺傳毒理學(xué)的檢測和研究，但存在著實驗周期長，工作量大，細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)不穩(wěn)定、所用的靶細(xì)胞不適合于我國的藥理學(xué)、毒理學(xué)檢測規(guī)定等缺點，且國外已商品化的產(chǎn)品價格也較高，難于在國內(nèi)推廣應(yīng)用。
本發(fā)明建立的一系列穩(wěn)定表達(dá)人CYP的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，應(yīng)用于遺傳毒理短期試驗，可使有關(guān)致癌物的代謝活化和毒理終點測定在同一細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，進(jìn)一步提高了實驗的靈敏度和可信度；而且使選用較低劑量、較長時間暴露、檢測化學(xué)致癌物的遺傳毒性成為可能；建立一系列人CYP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，可為不同CYP同功酶的代謝功能研究提供非常有用的工具。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)人CYP cDNA的克隆和鑒定以手術(shù)切除的人肝細(xì)胞標(biāo)本及人羊膜FL細(xì)胞為起始材料，抽提總RNA，經(jīng)設(shè)計的特定引物RT-PCR獲得cDNA后，SouthernBlot雜交，初步對該cDNA片段進(jìn)行分析和鑒定，將該cDNA片段克隆至質(zhì)粒pGEM-3Z中進(jìn)行序列分析和酶切圖譜分析，以證實獲得的基因無誤。
(2)真核細(xì)胞表達(dá)重組體的構(gòu)建和鑒定將克隆入重組質(zhì)粒中的CYP cDNA片段用限制性內(nèi)切酶切下，在電泳膠上分離回收，亞克隆入真核細(xì)胞表達(dá)載體pREP-9中，必要時酶切鑒定重組表達(dá)體上克隆片段的取向。
(3)真核細(xì)胞表達(dá)重組體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)和建株利用電穿孔轉(zhuǎn)移技術(shù)將重組真核細(xì)胞表達(dá)載體導(dǎo)入合適的培養(yǎng)細(xì)胞中，用G418篩選出抗性細(xì)胞后，采用Northern Blot和CYP同功酶的活性測定技術(shù)鑒定，以獲得長期穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
(4)將該細(xì)胞系與遺傳毒理學(xué)短期試驗技術(shù)結(jié)合，建立新的檢測前致突變物/致癌物的方法，用于遺傳毒理學(xué)研究。
克隆表達(dá)的人CYP基因選擇存在于肝臟且在藥物和前致突變物/致癌物代謝中發(fā)揮重要作用的三大家族中的個體基因CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4。基因表達(dá)的哺乳類靶細(xì)胞選用國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的細(xì)胞如中國倉鼠CHL、V79細(xì)胞，人羊膜FL細(xì)胞以及適合于該基因系列表達(dá)的其他一切細(xì)胞。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明進(jìn)一步提高了研究結(jié)果的可信度和靈敏度，為人CYP個體同功酶的代謝功能研究提供非常有用的工具，促進(jìn)和提高我國環(huán)境致癌物的監(jiān)測及研究水平。本系列人CYP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，可應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)，監(jiān)測、醫(yī)藥、化妝品、食品添加劑，日用化工產(chǎn)品和農(nóng)藥等方面的生產(chǎn)監(jiān)測和管理，因而具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。
在技術(shù)上，本發(fā)明首先采用RT-PCR技術(shù)克隆人CYP基因，克服了構(gòu)建cDNA文庫過程中的困難，大大減輕了工作量，節(jié)約了成本，縮短了實驗周期，且應(yīng)用國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的幾株細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞。實驗結(jié)果表明導(dǎo)入的基因能穩(wěn)定表達(dá)半年以上。
本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步說明實施例1人CYP cDNA的克隆和鑒定根據(jù)已發(fā)表的CYP cDNA序列，選擇其5′端和編碼區(qū)序列的3′端分別為兩側(cè)引物的起始端，兩個PCR引物的5′末端分別含有限制性內(nèi)切酶識別位點。
人肝組織取自手術(shù)切除的癌旁組織，總RNA按AGPC方法提取，經(jīng)紫外分光光度計測定和甲醛變性膠電泳確定所獲得的RNA純度，濃度和完整性。
RT-PCR擴(kuò)增CYP cDNAlug總RNA經(jīng)65℃變性5min，置冰上依次加入4ul 5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，2ul 10mM dNTP，0.5ulRNA酶抑制物(RNAsin，40u/ul)，lul 100mM隨機(jī)引物，2ul逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV，7.5u/ul)，加雙蒸水至終體積20ul，室溫10min，42℃溫青1.5h，然后加入兩側(cè)引物各30pmoles，lul Taq酶(2u/ul)，加雙蒸水至終體積100ul，循環(huán)參數(shù)94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 1min共35個循環(huán)后72℃ 7min。PCR擴(kuò)增完畢后，取10ul反應(yīng)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳檢測。
用原設(shè)計的相應(yīng)內(nèi)切酶分別酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pGEM-3Z質(zhì)粒(2.74kb)。1％瓊脂糖凝膠電泳分離，在透析袋中電泳回收，按文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化受體菌JM 109和陽性克隆的篩選。
克隆片段的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和部分序列分析鑒定，通過計算機(jī)上Gen Bank軟件分析比較，選擇一合適的限制性內(nèi)切酶，作限制性酶切圖譜分析，區(qū)別基因的多態(tài)性及假基因，應(yīng)用于此目的序列分析按試劑盒操作說明書進(jìn)行。
實施例2 真核細(xì)胞表達(dá)重組體的構(gòu)建和鑒定自擴(kuò)增的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、電泳膠上分離回收CYP cDNA片段，與經(jīng)酶切、小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理的真核細(xì)胞表達(dá)載體pREP-9直接連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10，提取質(zhì)粒，進(jìn)行長度分析和酶切圖譜分析，篩選出陽性克隆。對單酶切位點克隆的片段，尚需進(jìn)行插入片段方向的鑒定。
實施例3 真核細(xì)胞表達(dá)重組體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)和建株擴(kuò)增正向真核細(xì)胞表達(dá)體，利用電穿孔技術(shù)將重組表達(dá)體導(dǎo)入合適的培養(yǎng)細(xì)胞中，電穿孔的方法和程序按Bio-Rad說明書進(jìn)行，電穿孔后，將細(xì)胞重懸于20ml DMEM培養(yǎng)液中，移入2只10cm培養(yǎng)平皿，置37℃ 5％CO2培養(yǎng)48h，然后加入G418至終濃度500mg/ml，每隔3天換液一次，共篩選二周，10天出現(xiàn)細(xì)胞克隆生長，將克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，及時凍存。按文獻(xiàn)所述的方法，從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其母系細(xì)胞中提取總RNA，以32P-CYP cDNA相應(yīng)片段為探針，作Northern Blot分析，并以β-actin作為內(nèi)對照，檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的CYP RNA表達(dá)水平。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的CYP同功酶活性測定，在培養(yǎng)細(xì)胞中提取S9或微粒體后，取各自的特異性酶反應(yīng)底物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果以熒光分光光度計測定經(jīng)計算酶的比活性表示。
實施例4 遺傳毒理學(xué)短期試驗上的應(yīng)用采用雙核微核法試驗。5×105細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中過夜(每種受試濃度接種2瓶)，換用5ml加有受試致突變物的無血清MEM培養(yǎng)基，4h后，用PBS洗滌貼壁細(xì)胞2次，加入含10％小牛血清及3ug/ml CYB(細(xì)胞松馳素)的MEM 5ml，經(jīng)36.5℃培養(yǎng)16h，胰酶消化收集細(xì)胞，懸浮于2ml PBS中，緩慢加入1/5Vol的固定液(1∶3的冰乙酸∶甲醇)，預(yù)固定30min，1000rpm×10min離心，沉淀的細(xì)胞再用4ml固定液固定2次，每次30min，固定后的細(xì)胞用氣干法滴片，10％Giemsa染色15min，在高倍顯微鏡下計算1000個雙核細(xì)胞的微核細(xì)胞頻率，微核細(xì)胞的判斷按Ciaravino的修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，實驗結(jié)果用Kastenbaum-Bowman法進(jìn)行統(tǒng)計分析。
本研究應(yīng)用我們建立的穩(wěn)定表達(dá)CYP的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株對一組前致突變物/致癌物進(jìn)行雙核微核試驗，同時以母細(xì)胞系為對照。


圖1.重組質(zhì)粒和真核細(xì)胞重組表達(dá)體的構(gòu)建2.Northern Blot結(jié)果上圖Lane 1，3，5為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞總RNA與32P-CYP cDNA雜交結(jié)果Lane 2，4，6為相應(yīng)母細(xì)胞系總RNA與32P-CYP cDNA雜交結(jié)果下圖洗脫后膜與32P-β-actin雜交的結(jié)果圖3.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(CHL-1A1)及對照細(xì)胞EROD酶活性圖4.、圖5.所示應(yīng)用我們建立的分別穩(wěn)定表達(dá)CYP2B6與CYP 1A1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株CHL-2B6、CHL-1A1對一組前致突物/致癌物進(jìn)行雙核微核試驗，同時以母細(xì)胞系CHL為對照，結(jié)果表明，五種前致突變物NNK、DEN、NM、AFBl和CP均能誘導(dǎo)CHL-2B6細(xì)胞的微核率顯著增加，其中NNK，CP和AFBl具有劑量反應(yīng)關(guān)系，在最高受試濃度微核率約增加3～8倍。五種前致突變物，苯并[α]芘、3-甲基膽蒽、苯并蒽、二甲苯蒽和蒽均能誘導(dǎo)CHL-1A1細(xì)胞的微核率顯著增高，并具有劑量反應(yīng)關(guān)系。上述結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株在化學(xué)致癌物的遺傳毒理學(xué)研究方面具有重要的應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.一種人細(xì)胞色素P450(簡稱CYP)系列轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，包括人CYP cDNA的克隆和鑒定、真核細(xì)胞表達(dá)重組體的構(gòu)建和鑒定、真核細(xì)胞表達(dá)重組體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)和建株等，其特征在于(1)人CYP cDNA的克隆和鑒定以手術(shù)切除的人肝細(xì)胞標(biāo)本及人羊膜FL細(xì)胞為起始材料，抽提總RNA，經(jīng)設(shè)計的特定引物RT-PCR獲得cDNA后，SouthernBlot雜交，初步對該cDNA片段進(jìn)行分析和鑒定，將該cDNA片段克隆至質(zhì)粒pGEM-3Z中進(jìn)行序列分析和酶切圖譜分析，以證實獲得的基因無誤。(2)真核細(xì)胞表達(dá)重組體的構(gòu)建和鑒定將克隆入重組質(zhì)粒中的CYP cDNA片段用限制性內(nèi)切酶切下，在電泳膠上分離回收，亞克隆入真核細(xì)胞表達(dá)載體pREP-9中，必要時酶切鑒定重組表達(dá)體上克隆片段的取向。(3)真核細(xì)胞表達(dá)重組體導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)和建株利用電穿孔轉(zhuǎn)移技術(shù)將重組真核細(xì)胞表達(dá)載體導(dǎo)入合適的培養(yǎng)細(xì)胞中，用G418篩選出抗性細(xì)胞后，采用Northern Blot和CYP同功酶的活性測定技術(shù)鑒定，以獲得長期穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。
2.如權(quán)利要求1所述的人細(xì)胞色素P450系列轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，其特征在于克隆表達(dá)的人CYP基因選擇CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP 2B6、CYP2E1和CYP3A4等。
3.如權(quán)利要求1所述的人細(xì)胞色素P450系列轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，其特征在于基因表達(dá)的哺乳類靶細(xì)胞選用，中國倉鼠CHL、V79細(xì)胞、人羊膜FL細(xì)胞及適合于該基因系列表達(dá)的其他一切細(xì)胞。
全文摘要
采用DNA重組技術(shù)，通過RT-PCR從人肝組織中擴(kuò)增CYP1A1、1A2、2A6、2B6、2E1和3A4 cDNA，與真核表達(dá)載體pREP9重組，導(dǎo)入哺乳類細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，建立CYP系列轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)研究，使有關(guān)致癌物的代謝活化和毒理終點測定在同一細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，進(jìn)一步提高了實驗的靈敏度，而且為不同CYP同功酶的代謝功能研究提供非常有用的工具。
文檔編號C12N5/10GK1152029SQ9512060
公開日1997年6月18日 申請日期1995年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月11日
發(fā)明者余應(yīng)年, 董海濤, 吳健敏, 蔡朱男 申請人:浙江醫(yī)科大學(xué)