專利名稱：降解代謝產(chǎn)物無阻遏底物限制性酵母菌株的制作方法
本申請是1993年10月27日申請而未審查的美國申請?zhí)?8/144,236的部分續(xù)申請，而08/144,236申請又是07/829,453提出待審的美國申請?zhí)?7/829,453申請的部分續(xù)申請。本申請也是1993年7月2日申請而未審查的美國申請?zhí)?8/087,616的部分續(xù)申請，此08/087,616申請又是未審查的美國申請?zhí)?8/026,927的部分續(xù)申請。07/829,453和08/026,977兩個申請均是美國申請?zhí)?7/732,081的部分續(xù)申請，現(xiàn)已被放棄。
本發(fā)明的背景技術(shù)本發(fā)明涉及一種酵母細胞，它在葡萄糖存在的情況下只利用半乳糖作為糖源。
常規(guī)的酵母細胞具有能使所述酵母細胞代謝各種糖類的活性酶類。這些糖類包括葡萄糖，麥芽糖和半乳糖。對酶活性的調(diào)節(jié)建立在酶活性的選擇性激活和抑制基礎(chǔ)上進行。當酵母細胞在一種以葡萄糖為其糖源的培養(yǎng)基中生長時，那些輔助代謝除了葡萄糖外的其它糖類的酶的活性都受到抑制。
酶活性的抑制是通過兩種機制中的一種而發(fā)生的。第一種機制是，葡萄糖滅活作用經(jīng)修飾和/或降解蛋白質(zhì)很快地抑制了某些酶類和另一些蛋白質(zhì)的功能。第二種機制是，葡萄糖阻遏作用，在轉(zhuǎn)錄水平上減少了許多產(chǎn)生酶和調(diào)節(jié)酶活性的基因的表達。
酵母細胞中的葡萄糖阻遏作用與大腸桿菌中稱為“降解代謝產(chǎn)物阻遏作用”的代謝過程很相似。“降解代謝產(chǎn)物阻遏作用”這個術(shù)語反映了一種信念，即對基因轉(zhuǎn)錄的阻遏不是由葡萄糖本身所引起的，而是由葡萄糖的降解代謝產(chǎn)物引起的，就象由B.Magasanic在“降解代謝產(chǎn)物阻遏”in Cold Spring Harbor Symp，Quant.Biol.26249(1962)中所描述的那樣。在本申請中，“葡萄糖阻遏”一詞與“降解代謝產(chǎn)物阻遏”一詞是交替使用的。
大量的酵母細胞基因的表達是受葡萄糖阻遏作用支配的。但葡萄糖阻遏作用的程度在基因與基因之間變化很大。例如，有關(guān)半乳糖利用的基因，即半乳糖基因(GAL基因)，它的表達所受的阻遏至少1000倍于葡萄糖的。有關(guān)麥芽糖代謝的基因，麥芽糖基因，它的表達所受到的阻遏15倍于葡萄糖，就如M.Johnston等人描述的The Molecular and CellularBiology of the yeast Saccharomyces(1992)at 226。
葡萄糖在GAL基因的表達上表現(xiàn)出兩種影響。第一種影響是，將葡萄糖加入以半乳糖為基本底物的培養(yǎng)基，會導(dǎo)致在這種富集半乳糖的培養(yǎng)基上長出的酵母培養(yǎng)物表現(xiàn)出對GAL基因表達的幾乎是完全但又是暫時性的阻遏。第二方面影響是，GAL酶的合成在此之后又以一種減低了的速率重新開始，就如Adams在一篇文章中所講的那樣。“Identification of glucokinase in Saccharomyces cerevisiaeKinetics of induction and glucose effects，”J.Bacteriol III308(1972)由于葡萄糖的阻遏作用，在同一批培養(yǎng)中常規(guī)酵母培養(yǎng)物在葡萄糖中的生長分三個時期，正如E.Jones等人所描述于The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces(1992)。在第一生長期或快速生長期內(nèi)，葡萄糖在發(fā)酵的同時還抑制基因表達。僅在葡萄糖在快耗盡之前，培養(yǎng)又進入第二個生長期，受葡萄糖抑制的基因去抑制，使培養(yǎng)物適應(yīng)隨后的對在利用葡萄糖期間積累的乙醇代謝產(chǎn)物的氧化作用。某些酶的合成的去抑制作用遠在葡萄糖耗盡之前便已開始，并在乙醇生長中達到最高水平。生長的第三階段或稱最后時期是緩慢生長的時期，它止于有效乙醇被用盡之時。
通常由于酵母菌株都有很強的適應(yīng)性和多面性，要預(yù)測某一特殊酵母菌株暴露在一種完全營養(yǎng)基質(zhì)中時的行為是很困難的。一方面，某酵母株可能偏好一種如半乳糖的糖類，但當這種酵母菌株置于含有高濃度的葡萄糖的基質(zhì)中時，其對半乳糖的偏愛會逐漸被削弱。培養(yǎng)基中只含有葡萄糖將傾向于抑制半乳糖的代謝。這種酵母菌株有可能拒絕利用任何糖類。另一方面，此酵母菌株也可能轉(zhuǎn)向葡萄糖代謝。
本發(fā)明概要本發(fā)明涉及酵母菌屬啤酒酵母種的酵母細胞，這種啤酒酵母菌能在有葡萄糖存在時只利用半乳糖作為它的糖源。本發(fā)明也涉及能耐受濃度至少在營養(yǎng)基質(zhì)中為6％重量比的乙醇的酵母細胞。本發(fā)明還涉及一種實質(zhì)上不具備蛋白酶A、蛋白酶B和羧肽酶Y的酶活性的酵母細胞。
附圖的描述

圖1圖示了候選的降解代謝產(chǎn)物不阻遏、CAT-，單倍體酵母菌株對面包生面團的耐受時間。
圖2圖示出CAT-，葡萄糖底物限制性(GSL)菌株1、2、3、4號，以及非CAT-對照菌株，通過測它們每種酵母菌株培養(yǎng)物在600納米(nm)處的吸收率而測得的生長速率。
圖3圖示出CAT-GSL菌株6、7、8和9號，及對照菌株，測每個酵母菌株的培養(yǎng)物在600nm處的吸收率，而測得的它們的生長速率。
圖4圖示出CAT-GSL菌株10、12、15和16號，及對照菌株的生長速率，是通過測每種酵母菌株培養(yǎng)物在600nm處的吸收率而得。
圖5圖示出CAT-GSL菌株第17、18、19和20號，及對照菌株的生長速率，是通過測每種酵母菌株培養(yǎng)物在600nm處的吸收率而得的。
圖6圖示出CAT-GSL菌株第24、23、27和35號，及對照組菌株的生長速率，是通過測每種酵母菌株培養(yǎng)物在600nm處的吸收率而得出的。
圖7圖示出CAT-GSL菌株第36、37、40和41號，及對照組菌株的生長速率，是通過測每種酵母菌株的培養(yǎng)物在600nm處的吸收率而得的。
圖8圖示出一種二倍體10×54酵母在三種類型培養(yǎng)基中，通過測每種酵母菌株的培養(yǎng)物的600nm吸收率而測得的生長速率。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明包括二倍體啤酒酵母細胞，它在有葡萄糖存在時只利用半乳糖作為其糖源。本發(fā)明的酵母菌株產(chǎn)生的營養(yǎng)基質(zhì)，如面包生面團，其有控制地醒發(fā)所花時間只有用常規(guī)的以半乳糖作其唯一糖源的一種GAL+酵母菌所需時間的一半。這種針對面團的可控制的醒發(fā)能力很重要，特別是當面團是裝在一個封閉的容器中，如一個紙板箱中時。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的半乳糖的酵母菌株同時還有對乙醇的耐受力，而這種耐受力比任何一種常規(guī)的面包酵母菌或GAL+酵母菌的乙醇耐受力都要強。
能利用半乳糖的酵母細胞被用于發(fā)酵和醒發(fā)面包生面團，特別是可冷凍的面包生面團。酵母菌對乙醇耐受的特征也減少了酵母菌產(chǎn)生面包生面團所需的醒發(fā)時間。
這種利用半乳糖的酵母細胞也用于食物廢品的加工。干酪產(chǎn)物產(chǎn)生大量乳清，實質(zhì)上就是乳糖和水。傳統(tǒng)的加工過程是用酵母將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，而后者再進一步水解為乙醇。常規(guī)的酵母細胞優(yōu)先發(fā)酵葡萄糖，而不是半乳糖。結(jié)果，半乳糖是該過程的二級終產(chǎn)物。本發(fā)明的酵母細胞可用于選擇性地將半乳糖轉(zhuǎn)為乙醇，而不觸動葡萄糖，或用于與常規(guī)的細菌菌株組合在一起，同時轉(zhuǎn)化葡萄糖和半乳糖為乙醇。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的酵母細胞還包括與常規(guī)酵母細胞相比減小了的蛋白酶活性。蛋白酶活性被減小是因為這種酵母細胞實質(zhì)上沒有蛋白酶A、蛋白酶B和羧肽酶Y的活性。與常規(guī)的酵母細胞相比缺少這些酶活性的結(jié)果是其溶解后的蛋白水解活性減少了90％。酵母細胞的這個特點使這種酵母細胞更適合于象發(fā)酵和醒發(fā)可冷凍的生面團這樣的應(yīng)用。
蛋白酶降解面包團結(jié)構(gòu)中的谷膠基質(zhì)，導(dǎo)致生面團徹底裂解成液態(tài)，糖漿狀物質(zhì)。通過降低酵母細胞中的蛋白酶活性，不僅細胞溶解時只有很少的酶類被釋放入生面團，而且與含有GAL+酵母的生面團相比，生面團的醒發(fā)時間被縮減了約50％。可以相信，在正常細胞調(diào)節(jié)中，進行發(fā)酵的蛋白質(zhì)都沒被徹底分解。
“常規(guī)的酵母”是指酵母屬啤酒酵母種的酵母細胞，它能代謝包括葡萄糖，半乳糖，麥芽糖和果糖在內(nèi)的各種糖類。當常規(guī)的酵母在含葡萄糖的基質(zhì)中生長時，參與除葡萄糖以外的其它糖類代謝的酶活性均被減小，其中一種常規(guī)的酵母即是面包酵母。
常規(guī)的半乳糖底物限制性(GSL)酵母指的是一種半乳糖底物限制性酵母，當有葡萄糖存在時，它實質(zhì)上不能發(fā)酵半乳糖。
本發(fā)明的酵母細胞能利用純半乳糖的基質(zhì)，也能利用水解的乳糖的基質(zhì)。正如討論過的，在本發(fā)明的酵母細胞之前，很多酵母，包括半乳糖底物限制性(GSL)酵母菌株，當被置于豐富的葡萄糖時，其代謝均受到削弱。結(jié)果是，酵母菌株均不能有效地代謝存在于乳糖衍生基質(zhì)，如水解的乳糖糖漿中的半乳糖。這種缺陷被確信是由于葡萄糖誘導(dǎo)了降解代謝產(chǎn)物抑制作用。
這種GAL基質(zhì)限制的酵母菌株的代謝損害由幾種因素所致。第一個因素是對分解代謝酶類的合成的阻遏和/或?qū)Ψ纸獯x酶類的蛋白水解作用。第二個使代謝受損的因素是線粒體結(jié)構(gòu)的分解。第三個因素是第一、二個因素的組合。代謝受損的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)是，酵母細胞不能有效地將除葡萄糖以外的糖類轉(zhuǎn)化為二氧化碳，直到足夠多的葡萄糖被代謝掉，而使葡萄糖的濃度降至某種臨界水平。
半乳糖底物限制的酵母菌株都不能代謝葡萄糖。因此，在有葡萄糖及葡萄糖的降解代謝產(chǎn)物存在時，GAL-基質(zhì)——限制性酵母菌株就停止代謝活動。本發(fā)明的GAL基質(zhì)限制性酵母菌株在有葡萄糖時不經(jīng)歷降解代謝產(chǎn)物抑制作用，這一點是對常規(guī)的GAL基質(zhì)限制性酵母的一大改進。
本發(fā)明的二倍體酵母細胞都是通過這樣的過程制備的，該過程包括的步驟有將所選擇的單倍體酵母細胞雜交，提供條件促進酵母細胞菌落上的酵母細胞的孢子形成，分離酵母菌落，從酵母菌落中按所期望的性狀篩選酵母樣本，培養(yǎng)篩選出的菌落以產(chǎn)生酵母菌株，從菌株中產(chǎn)生二倍體酵母細胞，并在營養(yǎng)基質(zhì)，如面包生面團中對二倍體酵母細胞進行評價。典型情況是，在700個單倍體酵母候選菌株中，最終可選擇到兩株酵母株用于在營養(yǎng)基質(zhì)中作評價，在本案中，發(fā)現(xiàn)了三株酵母菌株很好地保留了半乳糖底物限制的特異性，而且沒有回復(fù)突變。
本發(fā)明中二倍體酵母菌株比單倍體菌株更優(yōu)選，因為二倍體菌株由于具有雙倍含量的遺傳物質(zhì)而更強健。二倍體菌株在普通生長中比單倍體酵母菌株釋放出二氧化碳的速度更快。互補作用增強了二倍體菌株中保留遺傳表達的能力，從而使它們強健。二倍體菌株也比單倍體酵母菌株更容易進行商業(yè)化生產(chǎn)，醒發(fā)面包生面團時也更快。
本發(fā)明的二倍體酵母細胞是按下列實施例中的描述來制備的。這些實施例在此是為了舉例說明本發(fā)明的各種具體實施方案，并不是想限制本發(fā)明。
如本文所用，菌株D308.3指一種單倍體的半乳糖底物限制性(GSL)啤酒酵母菌株，因有一個腺嘌呤突變菌落為粉紅色。菌株MSL.1是D308.3的一個腺嘌呤非必需的回復(fù)突變體。這種菌株的菌落都不是粉紅色。a/α GSL#33菌株，是二倍體GSL菌株。菌株GSL#33是GSL的單倍體菌株。GAT-15菌株，是單倍體GSL菌株，是降解代謝產(chǎn)物不阻遏的，而且是能發(fā)酵水解了的乳糖糖漿的菌株。10×54菌株是二倍體GSL菌株，是降解代謝產(chǎn)物不阻遏的。CAT-15菌株和10×54菌株具有醒發(fā)含有水解過的乳糖底物的生面團的能力。MSL.1株和a/αGSL#33株都不能在水解了的乳糖糖漿中有效地發(fā)酵和生長。
D308.3菌株于1993年3月5日保藏于位于Rockville，MD的美國培養(yǎng)物保藏中心(the Ameriean Type CultureCollection)(ATCC)，登記號為74211。該保藏是根據(jù)《國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約》而進行的。
實施例I單倍體酵母菌株MSL.1和GSL#33均在含葡萄糖和半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如上所述，野生型的MSL.1酵母菌株和aGSL#33酵母菌株不能代謝乳糖。降解代謝產(chǎn)物非阻遏的單倍體酵母菌株是從上述菌株中培養(yǎng)出的。
所需的材料包括具有下列相應(yīng)的基因型的酵母菌株酵母菌株基因型MSL.1 h×k1 h×k2 g1k1 trp1 his2 met14aGSL#33h×k1 h×k2 g1k1 met14lys2**基因型是以在各種不同缺陷培養(yǎng)基平板上的生長行為以及親代菌株的基因型為基礎(chǔ)確立的。
50ml的酵母浸出蛋白胨培養(yǎng)基(YEP)和半乳糖被傾注入兩個經(jīng)高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)瓶中。一個瓶接種MSL.1酵母株的分離菌落，而另一個瓶接種“a”GSL#33酵母株的分離菌落，被接種的培養(yǎng)物置于30℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。MSL.1培養(yǎng)物溫育48小時，而不太活潑的“a”GSL#33樣本則溫育72小時。
溫育后緊接著，每份量為100微升(μl)的10-1，10-2，10-3和10-4稀釋的前面提到的母培養(yǎng)物被涂布在含以下瓊脂配方的60％葡萄糖/40％半乳糖的YEP平板上；
60％葡萄糖/40％半乳糖YEP瓊脂細菌酵母浸出物(1％)10克細菌旦白胨(2％)20克葡萄糖(1.2％) 12克半乳糖(0.8％) 8克細菌瓊脂(2％) 20克蒸餾水 1000ml另外，每種培養(yǎng)物的10-5至10-8稀釋分別涂布在YEP培養(yǎng)基和含半乳糖的培養(yǎng)基上。所有的平板均置30℃溫育。計數(shù)酵母菌落。滴度結(jié)果表明，MSL.1培養(yǎng)物細胞密度約1.3×108CFU/ml，而“a”GSL#33的密度約等于6×107CFU/ml。
候選的降解代謝產(chǎn)物不阻遏(CAT-)的回復(fù)突變的菌落在60％葡萄糖/40％半乳糖平板上長勢很好，而代謝受損“野生型”對照菌落表現(xiàn)為難以區(qū)分的薄膜。
30℃溫育了約5天后，60％葡萄糖/40％半乳糖YEP選擇平板上分離出了82個的可能的MSL.1菌落和68個“a”GSL#33CAT-菌落。為了從半乳糖底物限制性但非分解產(chǎn)物抑制性的菌落群中分離不再有半乳糖底物限制性的回復(fù)變異菌落，所有待選的CAT-GSL菌株的分格涂布在含酵母浸出物蛋白胨和葡聚糖的平板(YEPD培養(yǎng)基)以及含60％葡萄糖/40％半乳糖的YEP培基的平板上。平板均于30℃貯存約一周。
68個“a”GSL#33 CAT-候選菌株中，有43個在60％葡萄糖/40％半乳糖YEP平板上生長，但不能在YEPD平板上生長。這些酵母菌落看起來是CAT-GSL酵母株。剩下的24個菌落很容易就在YEPD上生長起來，而且看上去也不再是半乳糖底物限制性的。
沒有一個MSL.1CAT-菌落被證明是CAT-。所有被測試的候選菌在60％葡萄糖/40％半乳糖和在YEPD培基上長得同樣的好。
那43個CAT-GSL候選菌落被測試了液體培養(yǎng)基的糖類利用能力，分離出的推定為CAT-GSL的菌落非抑制作用程度，及這些菌落在不含糖類的液體YEP，YEPD培養(yǎng)基，YEPD和半乳糖培養(yǎng)基，及YEP和50％葡萄糖/50％半乳糖的液體培養(yǎng)基中的生長能力，都可以評估。
包含有10ml YEP和半乳糖的試管樣品，接種了分離出的候選CAT-GSL酵母糊的菌落。此樣品于振蕩培養(yǎng)箱中30℃振蕩溫育約24小時。對照的“GSL#33和GSL#33”α/A樣品也在YEP和半乳糖培養(yǎng)增基中準備好。
緊接著溫育階段之后，含10ml YEP培養(yǎng)基(不含糖)，YEPD培養(yǎng)基，YEP和半乳糖培養(yǎng)基，及YEP和50％葡萄糖/50％半乳糖培養(yǎng)基的各試管樣本中均接種評價過的每種菌株的對數(shù)期起始培養(yǎng)物100微升。接種之后，每份樣品先在一個光學分光光度計上600納米(nm)處測吸光率，然后再置樣本于30℃培養(yǎng)箱。在9天之內(nèi)連續(xù)記錄吸光率的測量值以定量酵母的生長。
43個評估了的CAT-GSL候選菌落中有約24個看來在50％葡萄糖/50％半乳糖液體培養(yǎng)基中比二倍體對照aGSL#33菌株和單倍體MSL.1親代GSL菌株都要長得快且長得好。這24個候選菌株鑒定如下CAT-GSL#1，2，3，4，6，7，8，9，10，12，15，16，17，18，19，20，24，26，27，35，36，37，40和41。另有兩個候選株，23和25也顯示了優(yōu)勢生長行為。這些菌株的生長率均示于圖2-7。其生長率非常接近于每分鐘0.025ml的放氣量。圖示于圖2-7。
以其在面包生面團中的表現(xiàn)篩選這些候選菌落。篩選測驗包括評估每種酵母菌株發(fā)酵和醒發(fā)面包生面團的能力的Risograph排氣量試驗。從被候選酵母菌株發(fā)酵和醒發(fā)面包生面團得到的Risograph排氣量，以及生面團產(chǎn)物醒發(fā)時間實驗，均顯示多數(shù)CAT-GSL酵母菌株以較快的速度放出二氧化碳，且其產(chǎn)生的總二氧化碳比二倍體對照酵母和親代單倍體GSL酵母菌株明顯的多。CAT-GSL酵母菌株在有葡萄糖存在時能有效地代謝半乳糖，這一點在用一種食物分級水解的乳糖糖漿來醒發(fā)GSL酵母發(fā)酵的生面團產(chǎn)物時很重要。
上面鑒定的26個酵母菌落以其在發(fā)酵和醒發(fā)生面團中的表現(xiàn)篩選之。下列表1概括了醒發(fā)鑒定時間的數(shù)據(jù)，放氣速率，總排氣量和候選酵母菌株的生面團的細胞產(chǎn)量。表1顯示了5-7菌株每一欄中，比其它候選株在篩選試驗中表現(xiàn)出色，也比對照a/αGSL#33表現(xiàn)出色。
表1
表2顯示了每種在表1的描述中最優(yōu)選表現(xiàn)者的候選菌株的在表1中出現(xiàn)的頻率。字母分別代表驗收時間(P)，排氣速度(R)，總排氣量(T)，和產(chǎn)量(Y)。
表2
如表1和表2所證實的，好幾種菌株在不止一種評判標準下是優(yōu)越的。CAT-37在四種標準下較優(yōu)，而CAT-2和CAT-15在三種標準下較優(yōu)。在這些評判標準中，醒發(fā)時間在測定在面包生面團的表現(xiàn)中是最重要的。CAT-10只在醒發(fā)時間方面較優(yōu)。此表的幾種菌株后來均用于交配實驗過程，以產(chǎn)生分解代謝物不阻遏的，GSL，二倍體酵母菌株。
圖1是一個條形圖，顯示了所有被測試的菌株的生面團驗收時間。對照菌a/αGSL#33的醒發(fā)時間最長，有6.6小時。所有候選株都比對照菌株表現(xiàn)出色，顯示這些候選株確實是降解代謝產(chǎn)物不阻遏的。醒發(fā)時間最短的候選株是CAT-10，CAT-15，CAT-1，CAT-37，和CAT-40。CAT-10和CAT-15的醒發(fā)時間約只有對照酵母的一半。
還測試了的候選株的二氧化碳的產(chǎn)生。將候選株和水混合來制面包生面團。所有考慮到的菌株中，CAT-15和CAT-37的二氧化碳產(chǎn)生率最高。CAT-25，CAT-24，CAT-23，CAT-2和CAT-12的二氧化碳產(chǎn)生率只稍稍低于菌株CAT-15和CAT-37的速率。
生面團中總排氣量最大的候選株并不總是對應(yīng)那些二氧化碳產(chǎn)生率最高的候選株。在6株總CO2產(chǎn)量最高的候選株中，只有CAT-37，CAT-2，和CAT-15同時有較高的CO2產(chǎn)生率。
CAT-株在面包生面團中的排氣比常規(guī)的面包酵母產(chǎn)生的總排氣量和排氣速率低得多。這正是對用于制造可冷凍的面包生面團的酵母菌株所期望的特征。它允許這種酵母菌株不必打破貯存生面的容器就能在容器中被用于發(fā)酵和醒發(fā)生面。
關(guān)于細胞產(chǎn)量，所有CAT-候選株均比a/αGSL#33對照株要低。相信這是因為a/αGSL#33是二倍體菌株，而所有其它受試菌株是單倍體菌株所致。因為二倍體株有兩套而不是一套遺傳信息，所以a/αGSL#33酵母細胞能生長得更快?；パa作用和營養(yǎng)型標記的存在使二倍體對照株相對于單倍體株，生長受到促進。單倍體菌株中，有幾個菌株的細胞產(chǎn)量均非常接近每升20克。這是較高的產(chǎn)量。
實施例II將蛋白酶缺陷突變引入半乳糖底物限制性(GSL)酵母菌株中。蛋白酶缺陷的酵母菌株，αpep#4-3，與如實施例1中所描述的單倍體GSL酵母菌株，aGSL#33CAT-10，成功地進行了交配。從這種交配中獲得的雜合體菌落在一個孢子形成培養(yǎng)基的平皿上鋪板。分離出產(chǎn)生單倍體孢子的菌落。篩選這些單倍體菌落的半乳糖底物限制型，即，只能在半乳糖中生長不能在葡萄糖中生長，和降解代謝產(chǎn)物不阻遏型，即，在有葡萄糖時也能生長的能力。
共分離73株單倍體GSL降解代謝產(chǎn)物不阻遏(CAT-)的候選菌株。從中篩選PEP#4-3突變。用蛋白酶A活性試驗和另一個蛋白酶B活性試驗來篩選單倍體候選菌株。
單倍體菌株于1994年11月7日保藏在位于Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，該保藏是依照《國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約》進行的，登記號為74306，74307和74309。
實施例III在分離GSL/CAT-單倍體酵母候選株以產(chǎn)生二倍體GSL/CAT-酵母菌株時，使用了有低溫敏感突變的酵母菌株lts#8，來導(dǎo)入α交配基因到GSL單倍體候選菌庫中。共分離到36株單倍體GSL/CAT-候選菌。其中10株似乎還是低溫敏感的。這些菌株已保存在位于Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，是依據(jù)《國際承認的用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約》進行的保藏。這些菌株有如下ATCC登記號和圓括號里的鑒定號74123(cdc 19)，74124(XA6-9C-lts1)，74125(AXC-94B-lts2)，74126(XA98-34B-lts3)，74127(XA99-13C-lts4)，74128(XA77-3D-lts5)，74129(XA88-3A-lts6)，74130(XA89-2A-lts7)，和74131(XA33-5A-lts8)，保藏日為1992年1月31日。
實施例IV常規(guī)的面包酵母培養(yǎng)物產(chǎn)生的面包生面團很典型地需在生面團里加入了至少2％的乙醇，以抑制乳酸細菌的生長，穩(wěn)定面團容器壓力，并減小生面團的流動貯藏期限變化。不幸的是，乙醇還抑制酵母的生長和氣體的產(chǎn)生。一種顯示對乙醇有耐受性適用于可冷凍生面團的GSL菌株已被分離得到。
這種分離是將在有6％乙醇存在的情況下和長至穩(wěn)定期的培養(yǎng)物中獲得的活酵母菌落經(jīng)連續(xù)的分離和再接種步驟而得到的。此分離基于這樣一個前提分離到的菌落對乙醇耐受力越強，它在乙醇存在時的生長將更快。
已分離到兩株有希望的乙醇耐受候選株，并對其在可冷凍的生面團系統(tǒng)中進行了測試。結(jié)果顯示乙醇耐受菌落比親代10×54酵母菌能更快地醒發(fā)生面團樣品，如實施例5所述。醒發(fā)時間減少了一半，為1小時。其中一株乙醇耐受株，E35#1，已被保藏在位于Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏依據(jù)國際承認的用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，是1994年11月7日保藏的，登記號為74310。
實施例V為產(chǎn)生有最強代謝能力的GSL/CAT-二倍體酵母菌株，將分離出的推定的單倍體GSL/CAT-酵母菌株置于YEP(不含糖)培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基，YEP加半乳糖培養(yǎng)基，和一種50/50克分子百分比半乳糖/葡萄糖的YEP液體培養(yǎng)基上生長，以進行篩選。將發(fā)現(xiàn)的最易在50/50半乳糖/葡萄糖培基上生長的單倍體酵母菌株進行交配，以產(chǎn)生二倍體GSL/CAT-酵母菌株。評估這候選的二倍體GSL/CAT-菌株釋放二氧化碳和醒發(fā)可冷凍生面團的能力。對其中最有效的菌株作進一步分析。
有效的單倍體菌株包括以下幾種a GSL33 CAT-(a.k.a.33)#1，2，3，4，6，7，8，9，10，12，15，1-6，17，18，19，20，24，25，27，
29，31，32，33，35，36，39，40，41a GSL33 CAT-15×alts8(a.k.a 15×8)#1，2，3，4，7，8，9，10，12，15，16，17，18，19，22，23a GSL33 CAT-10×pep4-3(a.k.a.10×4-3)#1-74在所評估的酵母菌株中，發(fā)現(xiàn)只有13株保持了GSL/CAT-表型并有適合于經(jīng)互補作用配對的營養(yǎng)缺陷型標記。篩選表型包括這些特征i.該酵母菌易于在YEP加半乳糖的培養(yǎng)基上生長；ii.易于在YEP加50％半乳糖/50％葡萄糖的培養(yǎng)基上生長；iii.不易于在YEP加葡聚糖的培養(yǎng)基上生長。以上結(jié)果均是與在不含糖的YEP對照培養(yǎng)基上觀察到的生長速率相比較而得的。
根據(jù)相容的交配類型和互補的營養(yǎng)缺陷型標記的組合，鑒別了列于表3的下列酵母菌交配對。同時還列出了基于酵母菌的營養(yǎng)缺陷型標記的一種最低限度選擇培基。
表3α配對株 a配對株 人工合成的半乳糖最低限度選擇培養(yǎng)基*15×8#1010×4-3#54 無增補15×8#1010×4-3#58 無增補10×4-3#5 CAT33#15 增補賴氨酸10×4-3#5 CAT33#20 增補賴氨酸10×4-3#5 CAT33#25 增補賴氨酸10×4-3#5 CAT33#27 增補賴氨酸10×4-3#5 10×4-3#52 增補賴氨酸10×4-3#5 10×4-3#54 無增補10×4-3#5 10×4-3#58 無增補10×4-3#5 10×4-3#71 增補賴氨酸10×4-3#57 10×4-3#51 無增補10×4-3#59 CAT33#15 增補賴氨酸10×4-3#59 CAT33#20 增補賴氨酸10×4-3#59 CAT33#25 增補賴氨酸10×4-3#59 CAT33#27 增補賴氨酸10×4-3#59 10×4-3#52 增補賴氨酸10×4-3#59 10×4-3#54 無增補10×4-3#59 10×4-3#58 無增補10×4-3#59 10×4-3#71 增補賴氨酸*所用的選擇培養(yǎng)基是人工合成的半乳糖最低限度的培養(yǎng)基，當兩種親代菌株生長均需要賴氨酸時，加入賴氨酸。
列于表3的單倍體交配酵母菌株對用平板劃線法接種在YEP加半乳糖的培養(yǎng)基上，于30℃溫育24小時。劃線的平板再以垂直方向交叉復(fù)制到另一個YEP加半乳糖的平板上30℃溫育24小時。該交叉復(fù)制平板再用復(fù)制平板培養(yǎng)法傳到人工合成的半乳糖最低限度培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基可增補賴氨酸，也可不增補賴氨酸。這些平板均于30℃培育1-4天。屬于雜交配對組合成的二倍體酵母株的生長是明顯的，表中記為“+”。
表4α交配株 a交配株二倍體酵母菌落生長狀況*15×8#10 10×4-3#54 +15×8#10 10×4-3#58 +10×4-3#5CAT33#15-10×4-3#5CAT33#20-10×4-3#5CAT33#25-10×4-3#5CAT33#27-10×4-3#510×4-3#52 +10×4-3#510×4-3#54 +10×4-3#510×4-3#58 +10×4-3#510×4-3#71 +10×4-3#57 10×4-3#51 +10×4-3#59 CAT33#15-10×4-3#59 CAT33#20-10×4-3#59 CAT33#25-10×4-3#59 CAT33#27-10×4-3#59 10×4-3#52 +10×4-3#59 10×4-3#54 +10×4-3#59 10×4-3#58 +10×4-3#59 10×4-3#71 +*在合成的半乳糖最低限度培養(yǎng)基(有或無賴氨酸)平板上，觀察到那些兩種單倍體菌落重疊生長之處就是二倍體菌落的生長。)表4中列出的推定的二倍體GSL/CAT-菌株在新鮮的含或不含賴氨酸的合成半乳糖最低限度培基上進行平板培養(yǎng)進行進一步分離，再在新鮮的YEP加半乳糖平板上對前面分離到的菌落再培養(yǎng)。
對推定的二倍體GSL/CAT-酵母菌株利用半乳糖和/或葡萄糖的能力的評估，可通過將100微升的一接種環(huán)酵母糊在3毫升(ml)稀釋緩沖液中稀釋后得到的大量的接種物以平板涂布方式涂在YEP加半乳糖培養(yǎng)基平板YEPD培基的平板上，來進行評估。單倍體GSL/CAT-酵母菌株標本，CAT-15，被用作一種對照。平板30℃保存約4天。所有評估的候選二倍體酵母菌株很易在YEP加半乳糖的培基上生長，而在YEPD培基平板上，未顯示出生長的跡象，或是幾乎沒有回復(fù)突變菌落。
根據(jù)上述觀察結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，即分離到的二倍體GSL/CAT-酵母菌株是半乳糖底物限制性的。這些菌株還被置于液態(tài)YEP培養(yǎng)基，YEPD培基，YEP加半乳糖培養(yǎng)基，和YEP加50％葡萄糖/50％半乳糖培養(yǎng)基中進行生長，以它們代謝其它糖類的能力，還篩選了它們在8小時內(nèi)發(fā)酵和醒發(fā)生面團樣本的能力。三種推定的二倍體菌株，5×54，59×58，和10×54，在所有篩選測試中表現(xiàn)合格。10×54菌株的生長用圖示表示在圖8中。
10×54菌株已于1994年11月7日保藏在位于Rockille，MDATCC，依據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩期條約進行保藏，登記號為74308。
通過將酵母菌株接種到Y(jié)EP加半乳糖培養(yǎng)基上，而測試了這三種菌株葡萄糖利用能力的回復(fù)情況。結(jié)果顯示見表5。
表5菌株回復(fù)突變頻率CAT-1510/5.2×107＝1.92×10-7107個細胞中回復(fù)突變體數(shù)為1.925×54 30/2.04×108＝1.47×10-7107個細胞中回復(fù)突變體數(shù)為1.4710×5445/1.65×108＝2.73×10-7107個細胞中回復(fù)突變體數(shù)為2.7359×58470/6.2×107＝7.58×10-6106個細胞中回復(fù)突變體數(shù)為7.58(上文表中所計算出的觀察到的回復(fù)突變頻率代表的是觀察到的點突變回復(fù)突變頻率。)這三種二倍體菌株還被檢查了營養(yǎng)缺陷型的營養(yǎng)要求。菌株在人工合成的半乳糖最低限度培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)。所有菌株都能在最低限度培養(yǎng)基上生長。
我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的酵母菌株，當摻入一面包生面團中時，產(chǎn)生出酵母發(fā)酵的和酵母醒發(fā)的可冷凍生面團。用本發(fā)明的生面團烤出的面包比用常規(guī)的面包酵母制作的面包更受歡迎。
盡管對本發(fā)明的較優(yōu)選實施方案已作描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員仍認識到，在形式和細節(jié)上所做的一些改進不會脫離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種為酵母菌屬啤酒酵母種的酵母細胞，在有葡萄糖存在時只能利用半乳糖作為一種糖源。
2.如權(quán)利要求1的酵母細胞，其中酵母細胞是二倍體。
3.如權(quán)利要求1的酵母細胞，能在含有至少約6％重量比的乙醇濃度的混合物中生長。
4.如權(quán)利要求1的酵母細胞和還包括具有該酵母細胞所需營養(yǎng)的基質(zhì)，該酵母細胞散布在此基質(zhì)中。
5.如權(quán)利要求4的酵母細胞，其中基質(zhì)是面包生面團，且該酵母發(fā)酵并醒發(fā)該面包生面團。
6.如權(quán)利要求5的酵母細胞，其中該酵母醒發(fā)此生面團的時間大約是由常規(guī)的半乳糖底物限制性酵母制作的面包生面團的時間的一半。
7.如權(quán)利要求4的酵母細胞，其中基質(zhì)是乳清。
8.如權(quán)利要求7的酵母細胞，其中基質(zhì)還包括能利用葡萄糖作為糖源的酵母細胞。
9.如權(quán)利要求1的酵母細胞，其中該酵母細胞基本上喪失了蛋白酶A，B和羧肽酶Y的酶活性。
10.如權(quán)利要求1的酵母細胞，而且還能利用水解的乳糖作為一種唯一的碳源。
11.如權(quán)利要求1的酵母細胞，且具有當溫度低于約攝氏10度時就停止生長的生長能力。
12.一種啤酒酵母屬的酵母細胞，能在含至少6％重量比的乙醇濃度的混合物中生長。
13.一種啤酒酵母屬的酵母細胞，基本上不具有蛋白酶A、蛋白酶B和羧肽酶Y的活性。
14.如權(quán)利要求12的酵母細胞，其中混合物是面包生面團。
15.如權(quán)利要求11的酵母細胞，而且包括面包生面團，其中酵母細胞是散布的。
16.一種將乳清轉(zhuǎn)化為葡萄糖和乙醇的方法，包括提供一種啤酒酵母屬的酵母細胞，在有葡萄糖時只能利用半乳糖作為糖源；將該酵母細胞散布于乳清中；提取出由該酵母細胞在乳清中作用所產(chǎn)生的葡萄糖和乙醇。
17.一種將乳清轉(zhuǎn)化為乙醇的方法，包括提供一種只能利用半乳糖作為糖源的啤酒酵母屬的酵母細胞，和一種常規(guī)面包酵母細胞；將酵母細胞散布于乳清中；和提取出由酵母細胞在乳清中作用所產(chǎn)生的乙醇。
18.一種減少面包生面團的醒發(fā)時間的方法，包括提供一種啤酒酵母屬，在有葡萄糖時能利用半乳糖作為唯一糖源，而且能在含有至少約6％重量比的乙醇濃度的混合物中生長的酵母細胞；將這種酵母散布于生面團基質(zhì)中；和將有該酵母的生面團轉(zhuǎn)移到生面團在其中醒發(fā)的容器中。
全文摘要
本發(fā)明包括一種在有葡萄糖時只利用半乳糖作為唯一糖源的酵母細胞。
文檔編號A21D6/00GK1140469SQ95191170
公開日1997年1月15日 申請日期1995年11月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月8日
發(fā)明者戴維·J·多明哥斯 申請人:皮爾斯博瑞公司