專利名稱：生產(chǎn)l-賴氨酸的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，并且尤其涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法和在該生產(chǎn)方法中優(yōu)選使用的桿狀菌。
到目前為止，L-賴氨酸是通過用短桿菌屬、棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬的L-賴氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵而生產(chǎn)，從草酰乙酸經(jīng)天冬氨酸、天冬氨酸β-醛等在任一這些微生物的生物合成系統(tǒng)中L-賴氨酸得到合成。許多酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶及二氫吡啶二羧酸鹽合成酶參與這樣的L-賴氨酸生物合成途徑，然而，這些酶中的許多作為終產(chǎn)物L(fēng)-賴氨酸或作為中間產(chǎn)物天冬氨酸的反饋抑制。因此，當(dāng)通過發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸時，為了提高產(chǎn)率，大多使用不受這些抑制的突變株。
例如，已知在如短桿菌屬、棒狀桿菌屬的桿狀菌中，天冬氨酸激酶(下文稱為“AK”)受到L-賴氨酸和在L-賴氨酸合成旁路中合成的L-蘇氨酸的協(xié)同抑制。一種含有不受這種抑制的突變株被應(yīng)用于L-賴氨酸生產(chǎn)中(J.Gen.Appl.Microbiol.，16，373-391(1970))。
一種缺乏被認為是對L-賴氨酸產(chǎn)率具有最大影響的高絲氨酸脫氫酶(下文指“HD”)的突變菌株也被用于通過發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。這可歸因于下面的事實由于缺乏HD去催化天冬氨酸β-半醛產(chǎn)生L-高絲氨酸的反應(yīng)，該反應(yīng)作為L-蘇氨酸固有合成途徑的起始反應(yīng)是來自經(jīng)天冬氨酸β-半醛的L-賴氨酸合成途徑的分枝，因而L-蘇氨酸沒被合成，從而導(dǎo)致L-賴氨酸合成反應(yīng)進程中沒有對AK活性的抑制。這樣的HD缺陷株如一種HD完全缺失的谷氨酸棒狀桿菌株是已知的(Nakayama，K.et al.，J.Gen.Appl.Microbiol.7(3)，145-154(1961))。
除了上述HD完全缺失株之外，一種含有所謂泄漏型(leaky type)HD的突變株也被認為對L-賴氨酸生產(chǎn)是有效的。HD完全缺失株不能合成L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸，因此，如果這些氨基酸在培養(yǎng)基中不存在時該菌株不能夠生長。相反，如果能獲得HD泄漏型菌株，該菌株含有泄漏型HD，該HD基本上不顯示抑制L-賴氨酸生產(chǎn)的活性但具有一點HD活性時，即使不向培養(yǎng)基添加L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸，也可能生長，并且制備培養(yǎng)基變得方便。
此外，泄漏型HD對于作為基底物的天冬氨酸β-半醛的親合力小。因此，HD泄漏型菌株為了合成生長所需的L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸和L-異亮氨酸，而合成大量的天冬氨酸β-半醛。合成相當(dāng)數(shù)量的天冬氨酸β-半醛被轉(zhuǎn)化成L-賴氨酸。
另一方面，HD完全缺失型菌株在完全抑制L-蘇氨酸的生成量上被認為是有用的。然而，由于回復(fù)突變，由突變所致的HD缺陷具有恢復(fù)活性的可能性。因此，一種具有毀壞HD基因且恢復(fù)活性可能性極低的HD缺陷株被認為更加有用。谷氨酸棒狀桿菌的HD基因堿基序列已由Peoples等報導(dǎo)過(Peoples，O.P.et al.，Molecular Microbiology，2(1)，63-72(1988))。
因為HD泄漏型菌株及HD缺陷型菌株不產(chǎn)生L-蘇氨酸，所以AK不受反饋抑制。因此，人們認為AK基因在HD泄漏型菌株和HD缺陷型菌株細胞中擴增，L-賴氨酸合成反應(yīng)繼續(xù)進行，L-賴氨酸產(chǎn)率提高。進而，合并不受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制的AD突變和HD泄漏或缺失導(dǎo)入桿狀菌中L-賴氨酸產(chǎn)率可望進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于以上觀點而作出的為了提高桿狀菌的L-賴氨酸產(chǎn)率，其課題在于獲得HD泄漏型菌株和HD毀壞型菌株，以及提供具有擴增AK基因的HD泄漏型菌株和HD缺陷型菌株，進而含有AK的HD泄漏型菌株和HD基因毀壞型菌株，其中AK不受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制。
為了解決上述的課題，本發(fā)明人獲得了一種HD泄漏型乳發(fā)酵短桿菌突變菌株，分離出野生型HD基因和泄漏型HD基因以闡明它們的結(jié)構(gòu)，將泄漏型HD基因和部分缺失的HD基因?qū)肴榘l(fā)酵短桿菌的野生菌株中因而產(chǎn)生了一種具有提高的L-賴氨酸產(chǎn)率的L-賴氨酸菌生產(chǎn)株。通過在這樣獲得的L-賴氨酸菌生產(chǎn)株細胞中擴增AK基因或通過導(dǎo)入編碼不受L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制的AK基因，進一步提高L-賴氨酸產(chǎn)率上獲得了成功從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了編碼源于桿狀菌從其N-末端數(shù)起的第23個亮氨酸殘基和第104個纈氨酸殘基的至少之一轉(zhuǎn)換為另外一個氨基酸殘基突變型高絲氨酸脫氫酶的DNA片段；源于一種桿狀菌從其N-末端數(shù)起的第23個亮氨酸殘基和第104個纈氨酸殘基的至少之一轉(zhuǎn)換為另外一個氨基酸殘基的突變型高絲氨酸脫氫酶的基因的桿狀菌；以及編碼上述突變型高絲氨酸脫氫酶的基因通過與桿狀細菌的染色體上的高絲氨酸脫氫酶基因的同源重組到染色體DNA上，而轉(zhuǎn)化桿狀細菌。
另一方面，本發(fā)明提供了一種桿狀菌，其特征是編碼來自桿狀細菌染色體上的高絲氨酸脫氫酶一部分的DNA片段通過與桿狀菌染色體上的高絲氨酸脫氫酶基因以同源重組的方式，整合到其染色體DNA上，該菌的高絲氨酸脫氫酶基因被破壞。還有一方面，本發(fā)明提供了一種桿狀菌，其特征是細胞中含有通過連接源于桿狀菌的天冬氨酸激酶基因與能在桿狀菌細胞中自主復(fù)制的載體而構(gòu)建的重組DNA，并且不表達野生型高絲氨酸脫氫酶；本發(fā)明還提供了一種桿狀菌，其特征是編碼來自桿狀的天冬氨酸激酶，而且是由于L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被鈍化的天冬氨酸激酶基因，整合到桿狀染色體上被轉(zhuǎn)化并且不表達野生型高絲氨酸脫氫酶。另外還有一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述桿狀菌的步驟，在其培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累L-賴氨酸以及從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸的方法。
在本專利說明書中，有時，產(chǎn)生野生型HD或野生型AK的菌株被稱為“野生菌株”，幾乎不顯示基本的HD活性，但具有一點HD活性的具有泄漏型突變的HD被稱為“突變型HD”，具有突變的不受L-賴氨酸和L-賴蘇氨酸反饋抑制的AK被稱為“突變型AK”，并且部分缺失的HD基因被稱為“缺失型HD基因”。此外，以宿主染色體DNA上的HD基因或AK基因通過同源重組方式整合包括外源HD基因或外源AK基因及載體到染色體DNA被稱為“基因整合”，通過允許拷貝HD基因或AK基因與載體一起脫落，將重組DNA從整合到染色體DNA狀態(tài)，作成染色體上的HD基因或AK基因由外源HD基因或外源AK基因所替代，該狀態(tài)的完成功被稱為“基因替代”。此外，一種含有突變型HD基因的突變株或用突變型HD基因替代的菌株僅被稱為“HD突變株”，并且用部分缺失HD基因替代的菌株被稱為“HD缺陷型菌株”。
本發(fā)明提及的桿狀菌是在“伯杰氏細菌鑒定手冊”第8版(1974)中599頁定義的一組微生物，它們是位于有氧格蘭氏陽性非抗酸性(non-acid-fast)，無孢子形成能力桿菌，包括屬于棒狀桿菌屬的細菌，及以往屬于短桿菌屬的細菌，但現(xiàn)在又被合并到棒狀桿菌屬，以及與棒狀桿菌屬細菌具有較近親緣關(guān)系屬于短桿菌屬的細菌。
根據(jù)本發(fā)明獲得的HD突變型菌株具有極好的L-賴氨酸產(chǎn)率，并且甚至當(dāng)培養(yǎng)基中沒有L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸或L-高絲氨酸存在時它們?nèi)钥缮L。由于沒有HD基因的表達，本發(fā)明的HD缺陷菌株具有極高的L-賴氨酸產(chǎn)率并可穩(wěn)定地維持該特性。
此外，具有擴增AK基因的HD突變菌株和HD缺陷菌株以及富含突變型AK基因的HD突變菌株和HD缺陷菌株具有更高的L-賴氨酸產(chǎn)率。
發(fā)明詳述以下詳細地說明本發(fā)明。<1>泄漏型HD突變菌株和突變型HD基因的制備通過對產(chǎn)野生型HD桿狀菌的突變處理獲得一種產(chǎn)具有泄漏型突變HD的突變菌株。對于桿狀菌的突變處理是用紫外線照射或常用作人工突變的突變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)而完成的。
從突變處理后的細菌細胞進行單個菌落的分離以從每個菌落中篩選出產(chǎn)泄漏型HD的菌株。泄漏型HD突變菌株能夠在基本培養(yǎng)基上生長，不能在加有過量L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸的基本培養(yǎng)基上生長，但能夠在加有L-高絲氨酸或L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸的基本培養(yǎng)基上生長。這樣，它們就可以用前述的作為標(biāo)準(zhǔn)而加以篩選(shiio，I.&Sano，K.，J.G.A.M.，15，267-287(1969))。為了證實這樣獲得的奕變菌株產(chǎn)泄漏型HD的事實，最好從細菌細胞中提取粗酶溶液將HD比活性與野生型HD進行比較。
HD酶活性可根據(jù)如Kalinowski等的方法Kalinowski，J.et al.，Mol.Gen.Genet.，224，317-324(1990))，使用以Follettie等的方法(Follettie，M.T.et al.，Molecular Microbiology，2，53-62(1988))從細菌細胞中制備的粗酶溶液而被測定。
為了從獲得的泄漏型HD突變菌株分離突變型HD基因，可根據(jù)如Saito和Miura的方法(H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963))從泄漏型HD突變菌株制備染色體DNA，并且通過聚合鏈反應(yīng)方法(PCR；見White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989)擴增HD基因來進行。對于擴增反應(yīng)要使用的DNA引物，使用那些互補于DNA雙鏈DNA兩個3’端、含有HD基因全部或部分區(qū)域的序列。當(dāng)僅僅是HD基因的部分區(qū)域擴增時，用該DNA片段作為引物從染色體DNA文庫中篩選出含有整個區(qū)域的DNA片段是必需的。當(dāng)HD基因整個區(qū)域要被擴增時，含有包括擴增HD基因的DNA片段的PCR反應(yīng)溶液進行瓊脂糖凝膠電泳后，提取目的DNA片段。這樣，含有HD基因的DNA片段可被回收。
DNA引物，基于例如，谷氨酸棒狀桿菌的已知序列(Peoples，O.P.et al，Molecular Micrology，2(1)，63-72(1988))。適當(dāng)?shù)刂苽?。具體地，可擴增編碼HD基因1150堿基構(gòu)成的區(qū)域的引物是優(yōu)選的，以及例如，表示在序列號1及序列號2上的2種引物是適合的。引物DNA的合成可根據(jù)普通方法如磷酰亞胺(phosphoamidite)方法(見Tetrahedron Letters，22，1859(1981))，使用商業(yè)上可得到的DNA合成儀(如Applied Biosystems生產(chǎn)的Model 380 B DNA合成儀)而被合成。此外，PCR可根據(jù)供應(yīng)商指定的方法，使用商業(yè)上可得到的PCR儀(例如，Takara Shuzo公司生產(chǎn)的DNA Thermal Cycler Model P J2000)。Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo公司提供)而完成。
為了利于以后的操作，將通過PCR方法擴增的突變型HD基因連結(jié)到可在大腸埃希氏桿菌(下文被稱為“E.coli”)和/或桿狀菌細胞中自主復(fù)制的載體DNA上，制備重組DNA，將其導(dǎo)入E.coli細胞中。在E.coli細胞中自主復(fù)制的載體優(yōu)選是質(zhì)粒載體，最好是可在宿主細胞中自主復(fù)制的包括，如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398以及RSF1010。
這樣的載體中被插入能使質(zhì)粒在桿狀菌中自主復(fù)制的DNA片段時，可以使用E.coli及桿狀兩方均可自主復(fù)制的所謂穿梭載體。上述片段可以如PAM330(見公開的日本專利58-67699)、PHM1519見公開的日本專利58-77895)、PCG1(見公開的日本專利NO57-134500)、PCG2(見公開的日本專利NO58-35197)、PCG4(見公開的日本專利NO57-183799)和PCG11(見公開的日本專利NO57-183799)中制備。
以下舉例說明這種穿梭載體。含有每種載體的微生物和國際保藏單位的保藏編號以圓括弧表示。
PAJ655大腸埃希氏桿菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒狀桿菌SR8201(ATCC39135)PAJ1844大腸埃希氏桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒狀桿菌SR8202(ATCC39136)PAJ611大腸埃希氏桿菌AJ11884(FERM BP-138)PAJ3148谷氨酸棒狀桿菌SR8203(ATCC39137)PAJ440枯草桿菌AJ11901(FERM BP-140)這些載體按從保藏的微生物按以下方法得到。將對數(shù)生長期收集的細胞使用溶菌酶和SDS溶菌以產(chǎn)生裂解物，用30,000xg離心從中獲取上清液。向上清液中加入聚乙二醇以通過氯化銫-溴化乙錠平衡密度梯度離心手段完成分離純化。
為了向E.coli導(dǎo)入質(zhì)粒以對其轉(zhuǎn)化，使用例如D.M.Morrisn的方法(Method in Enzymology，68，326(1979))或以氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))是可能的。
突變HD基因從泄漏型HD突變菌株分離出來時，也可以通過使用質(zhì)粒載體或類似物制備泄漏型HD突變菌株的染色體DNA文庫，從文庫中篩選出含有突變型HD基因的菌株，并且從篩選出的菌株中回收具有插入突變型HD基因的重組DNA。下面將描述制備染色體文庫和從文庫中篩選含有突變型HD基因方法的實施例。
首先，培養(yǎng)泄漏型HD突變菌株以獲得培養(yǎng)物。備好桿狀菌能在其上生長的任意培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基中含有少量L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸時，優(yōu)選預(yù)先加入L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸或L-高絲氨酸。其次，細菌細胞通過離心培養(yǎng)物而獲得菌體。根據(jù)如Saito和Miura方法(Biochem.Biophys.Acta，72619(1963))或K.S.Kirby方法(Biochem.J.，64，405(1956))從細菌細胞中獲得染色體DNA。
為了從這樣獲得的染色體DNA中分離突變型HD基因，制備染色體DNA文庫。首先，以一種適當(dāng)?shù)南拗泼覆糠纸到馊旧wDNA以獲取各種片段的混和物。通過用控制切割反應(yīng)等的時間長短來控制切割程度，許多種限制酶便可被使用。例如，Sau3AI被允許作用于染色體DNA以在不低于30℃的溫度將其消化，優(yōu)選的是在37℃，酶濃度在1～10單位/毫升，作用時間可變化(1分鐘到2小時)。
然后，切割的染色體DNA片段被連結(jié)能在E.coli細胞中自主復(fù)制的載體DNA上，制備重組DNA。具體的是，將一種與用于切割染色體DNA的限制酶Sau3AI產(chǎn)生相同末端堿基序列的限制酶如BamHI在30℃以上溫度和1～100單位/亳升酶濃度條件下與載體DNA作用1小時以上，最好1～3小時完成切割和裂解。接著，將上述獲得的染色體DNA片段混和物與裂解和切割過的載體DNA混和，使其與DNA連接酶，最好T4DNA連接酶在4-16℃溫度及1～100單位/毫升酶濃度條件下作用1小時以上，最好6～24小時以獲得重組DNA。
使用獲得的重組DNA，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏桿菌K-12菌株以制備染色體DNA文庫。該轉(zhuǎn)化可用如D.M.Morrison方法(Methods inEnzymology，68，326(1979))或以氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性的方法(Mandel.M.and Higa，A，J.Mol.Biol.，53，159(1970))完成。
例如，為了從獲得的染色體DNA文庫中篩選出含有突變型HD基因的轉(zhuǎn)化菌株，可根據(jù)對于谷氨酸棒狀桿菌(Peoples，O.P.et al.，Molecular Microbiology，2(1)，63-72(1988)已知的序列合成寡核苷酸探針以用它完成菌落的雜交。已知存在2種E.coli HD基因(HD-1，HD-2) (Zakin，M.M.et al.J.B.C.258，308-3031(1983))，然而，它們都不具有相應(yīng)于谷氨酸棒狀桿菌HD C-末端一側(cè)的約100個氨基酸殘基的區(qū)域。這樣，當(dāng)要被用作探針的序列選自該區(qū)域時，該探針不與大腸埃希氏桿菌染色體HD基因雜交，這是優(yōu)選的。含有突變型HD基因的重組DNA可根據(jù)如P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116，1064(1973))或D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol，110，667(1972))從這樣篩選出的轉(zhuǎn)化菌株得到分離。
可選擇地，產(chǎn)泄漏HD的菌株可通過用從桿狀菌中克隆的野生型HD基因，按照上述以同樣的方式得以產(chǎn)生。首先，含野生型HD基因或具有別的突變的HD基因DNA在體外進行突變處理，并且經(jīng)突變處理的DNA被連接到適應(yīng)于一宿主的載體DNA以獲取重組DNA。重組DNA被導(dǎo)入宿主微生物以獲取轉(zhuǎn)化子，并從轉(zhuǎn)化子中篩選出表達泄漏型HD的菌株。可選擇地，含有野生HD基因或具有另一突變的HD基因DNA被連接到適應(yīng)于一宿主的載體DNA以獲得重組DNA也是可行的，然后將重組DNA進行體外突變處理，經(jīng)突變處理的重組DNA被導(dǎo)入宿主微生物，以獲得轉(zhuǎn)化子，并且從轉(zhuǎn)化子中篩選出表達泄漏型HD的菌株。
完成體外DNA突變處理的試劑用羥胺為例加以說明。羥胺是一種用于化學(xué)突變的處理劑，它通過將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)镹4-羥胞嘧啶而導(dǎo)致胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變。
用于本發(fā)明的突變型HD基因沒有特別的限制，只要它編碼泄漏型HD，其中有舉例說明的基因，它們編碼具有野生型HD氨基酸序列任何突變的HD，包括(1)N-末端第23個亮氨酸基轉(zhuǎn)換為除亮氨酸殘基以外的氨基酸殘基的突變；(2)N-末端第104個纈氨酸殘基轉(zhuǎn)換為除纈氨酸殘基以外的氨基酸殘基的突變以及(3)N-末端第23個亮氨酸基轉(zhuǎn)換為除亮氨酸殘基以外的氨基酸殘基和N-末端第104個纈氨酸基轉(zhuǎn)換為除纈氨酸殘基以外的氨基酸殘基的突變；在這里，作為野生型HD氨基酸序列具體的可舉出源于序列表序列號3及4所示的野生型乳發(fā)酵短桿菌菌株的HD氨基酸序列。
關(guān)于在前面(1)至(3)描述的突變，可舉出第23個亮氨酸殘基轉(zhuǎn)換為苯丙氨酸殘基的突變例子，第104個纈氨酸殘基轉(zhuǎn)換為異亮氨酸殘基的突變的例子。
任何相應(yīng)于替代氨基酸殘基的密碼子只要可編碼氨基酸殘基，對其類型無任何要求。依據(jù)細菌種類和菌株的不同，所含有的野生型HD氨基酸序列可稍有差異。在與酶活性無關(guān)的位點具有這種氨基酸殘基替代，缺失或插入的HD也可被用于本發(fā)明。
例如，正如將在下面實施例中將要描述的，作為源于乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC13869)HD的氨基酸序列與報導(dǎo)的谷氨酸棒狀桿菌HD氨基酸序列(Peoples，O.P.et al.，Molecular Microbiology 2(1)，63-72(1988))比較的結(jié)果，已闡明N-末端第1 48個氨基酸殘基在谷氨酸棒狀桿菌HD中是甘氨酸殘基而在乳發(fā)酵短桿菌HD中是丙氨酸殘基。可以預(yù)測通過導(dǎo)入前面提及的(1)至(3)突變中任何一個，甚至在上述在谷氨酸棒狀桿菌的HD情況下也可以得到泄漏型HD。
<2>野生型AK基因和突變型AK基因的制備用于本發(fā)明的野生型AK基因可從桿狀菌的野生菌株中制備。
由L-賴氨酸和L-蘇氨酸積累的反饋抑制被基本鈍化的編碼AK的基因可從一種突變菌株中制備，該菌株中由L-賴氨酸和L-蘇氨酸對AK活性的積累反饋抑制基本上被鈍化。這種突變菌株可獲自一組進行過突變處理的細胞，如通過用諸如紫外光照射或以諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)突變劑的普通突變處理方法對野生型桿狀菌的突變處理。對于AK活性的測定，使用Miyjima，R.et al.在TheJournal of Biochemistry(1968)，63(2)，139-148中描述的方法是可能的。
關(guān)于AK基因的供體菌，從乳發(fā)酵短桿菌的野生菌株ATCC 13869和從ATCC 13869株通過突變處理衍生的L-賴氨酸生產(chǎn)菌AJ3463(FERMP-1987)是最優(yōu)選的供體菌。
為了從桿狀菌中分離AK基因，可根據(jù)Saito和Miura的方法(H.Saito and K.Miura，.Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)制備染色體DNA，并且通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(PCR；見White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))擴增AK基因。
對于用于擴增的DNA引物，可以使用那些互補于含有全部或部分AK基因的DNA雙鏈的2個3’端區(qū)域的序列。當(dāng)僅僅是AK基因的部分區(qū)域要擴增時，必需用該區(qū)域的DNA片段為引物從一個基因文庫中擴增含整個區(qū)域的DNA片段進行篩選。當(dāng)整個區(qū)域被擴增時，DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，后經(jīng)目標(biāo)帶的切割。這樣，含有AK基因的DNA片段可被回收。
對于DNA引物，由5’-TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT-3’(序列表中SEQ ID NO5)和5’-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3’(序列表中SEQ ID NO.6)代表的23個和21個堿基的單鏈DNA是最適合的。它是以谷氨酸棒狀桿菌(見Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204；Mol.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)為基礎(chǔ)，擴增編碼AD基因的約1643bp的區(qū)域。DNA的合成可根據(jù)用磷酰亞胺方法(見Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)的常規(guī)方法，用AppliedBiosystems生產(chǎn)的Model 380B DNA合成儀來合成。PCR可根據(jù)供應(yīng)商指定的方法，通過使用Takara Shuzo公司生產(chǎn)的Model PJ2000型DNA熱循環(huán)儀和Tag DNA聚合酶來完成。
用PCR方法擴增的突變型AK基因連接到能在大腸埃希氏桿菌和/或桿狀菌細胞中自主復(fù)制的載體DNA上，以制備重組DNA，為了利于后面的操作，重組DNA被導(dǎo)入大腸埃希氏桿菌細胞。能在E.coli細胞中自主復(fù)制的載體，優(yōu)選的是質(zhì)粒載體，象這些能在宿主細胞中自主復(fù)制的優(yōu)選質(zhì)粒包括如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG399，pHSG398以及RSF1010。
當(dāng)這些載體被插入具有使質(zhì)粒能在桿狀菌中自主復(fù)制能力的DNA片段時，它們便可用在E.coli和桿狀菌中都能自主復(fù)制的所謂穿梭載體。為了向E.coli導(dǎo)入質(zhì)粒以完成轉(zhuǎn)化，使用如D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymoloy，68，326(1979))或從氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Md.Bid.，53，159(1970)是可能的。
野生型AK基因按上述通過從AK野生菌株中分離AK基因而獲得，并且突變型AK基因通過從AK突變菌株分離AK基因而獲得。
用于本發(fā)明的突變型AK基因，只要它編碼由L-賴氨酸和L-蘇氨酸積累的反饋抑制被鈍化的AK就可以，對此沒有特別的限制。然而，可以舉出在野生型AK的氨基酸序列中N-末端的第279個丙氨酸殘基轉(zhuǎn)換為除丙氨酸以外的氨基酸殘基并且為非酸性氨基酸殘基的突變，以及在β-亞基中第30個丙氨酸殘基轉(zhuǎn)換為除丙氨酸以外的氨基酸殘基并且為非酸性氨基酸殘基的突變。作為野生型AK氨基酸序列，可具體地指出在在α-亞基中表示在序列表序列號10的氨基酸序列和在β-亞基中表示在序列表序列號12的氨基酸序列。
前面提及的除丙氨酸以外的非酸性氨基酸可以舉出蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸以及纈氨酸。
任一相應(yīng)于被替代氨基酸殘基的密碼子，只要是可以編碼氨基酸殘基即可，不考慮其類型。另外具有的野生型AK氨基酸序列可依據(jù)菌種和菌株的差異而稍有不同。在與酶活性無關(guān)的位點具有這種氨基酸殘基的替代、缺失或插入的AK也可用于本發(fā)明。
<3>HD突變菌株和HD缺陷菌株的制備HD突變菌株按<1>中描述的通過以紫外光照射或突變劑對產(chǎn)野生型HD的桿狀菌的處理而獲得，并從進行過突變處理的細菌細胞中篩選出產(chǎn)突變型HD的菌株。不表達野生型HD的HD突變菌株也可這樣獲得通過將從這樣獲得的HD突變菌株中分離出的突變型HD基因?qū)氲揭吧蜅U狀菌細胞中，并且用染色體上HD基因的同源重組完成基因替代。
突變型HD基因可按如下方法(見

圖1)被宿主染色體上的HD基因替代。即，將來自乳發(fā)酵短桿菌的溫度敏感復(fù)制起點、突變型HD基因以及對如氯霉素藥物顯示抗性的標(biāo)記基因插入到質(zhì)粒載體以制備重組DNA。重組DNA被用于轉(zhuǎn)化桿狀菌，轉(zhuǎn)化的菌株在溫度敏感的復(fù)制起點不起作用的溫度培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株，然后將其培養(yǎng)于含有藥物的培養(yǎng)基中。這樣便獲得了一種重組DNA被整合到染色體DNA上的轉(zhuǎn)化菌株。
具有整合到染色體重組DNA的菌株導(dǎo)致以最初存在于染色體上HD基因序列的重組，其中染色體HD基因和突變型HD基因的融合基因2個在插入重組DNA(載體部分、溫度敏感的復(fù)制起點、和抗藥標(biāo)記)其它部分的狀態(tài)下被插入到染色體。因此，野生型HD在該狀態(tài)下顯性，這樣，與野生菌株相當(dāng)?shù)纳L在基本培養(yǎng)基中得以顯示。
其次，為了只允許突變型HD基因保留在染色體DNA上，通過兩個HD基因的重組使與載體部分(包括溫度敏感的復(fù)制起點和抗藥標(biāo)記)一齊脫落。例如，培養(yǎng)染色體上具有整合的菌株，培養(yǎng)的細菌細胞經(jīng)擴大并培養(yǎng)于不含藥物的固體平板培養(yǎng)基上。長出的菌落反復(fù)培養(yǎng)于含藥物的固體平板培養(yǎng)基，并且獲得藥物敏感菌株。載體部分從獲得的藥物敏感菌株染色體脫落的事實由Southern雜交證實，進而表達突變型HD的事實得到證實。
當(dāng)用編碼部分HD的HD基因，即使用部分缺失的HD基因，替代上述變異型HD基因，進行基因替代時可以獲得其染色體HD基因以部分缺失HD基因替代的HD缺陷菌株。
正如在下面的實施例1中描述的，預(yù)測到位于HD N-末端側(cè)的區(qū)域參與了活性的表達。因此，在HD基因中，作為被缺失的位點，可舉出N-末端一側(cè)的區(qū)域，如位于距N末端350個氨基酸以內(nèi)的區(qū)域(如從N-末端的第100～200個氨基酸區(qū)域或250～350氨基酸區(qū)域)。既然HD基因與存在于其下游的高絲氨酸激酶基因位于相同的操縱子內(nèi)，那么HD基因的啟動子位點最好不缺失以便不抑制高絲氨酸激酶的表達。
正如報道的用于E.coli，K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol，53，159(1970))，通過使用氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性的方法，或者如報道的用于枯草桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Yong，F(xiàn).E.，G；ene，1，153(1977))，在生長期完成(DNA)的導(dǎo)入以致細胞能整合DNA(所謂的感受態(tài)細胞)的方法，向桿狀菌細胞中導(dǎo)入重組DNA是可能的?？蛇x擇地，在將DNA受體細胞轉(zhuǎn)換為容易整合重組DNA的原生質(zhì)體或球形體之后完成重組DNA向受體細胞的導(dǎo)入也是可能的，正如已知的枯草桿菌、放線菌和酵母(Chang，S.andChoen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J，Ward，J.M.and hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.andFink，G.R.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))。
在原生質(zhì)體方法中，甚至可通過上述的有用于枯草芽孢桿菌的方法來獲得足夠高的頻率。如在公開的日本專利NO57-183799中描述的，在聚乙二醇或聚乙烯醇及二價金屬離子存在的情況下，使用將DNA整合到棒狀桿菌屬或短桿菌屬原生質(zhì)體中的方法當(dāng)然是可能的。甚至可通過添加羧甲基纖維素、葡聚糖、Ficoll，pluronic F68(Serva Co)來代替聚乙二醇或聚乙烯醇以便于DNA整合的方法來獲得相同的結(jié)果。
此外，可通過使用電脈沖方法(Sugimoto et al.，公開的日本專利NO2-2077991)將重組DNA導(dǎo)入屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬的受體中。
導(dǎo)入突變型HD基因或缺失型HD基因的野生型桿狀菌通過下面幾種細菌舉例說明，即棒狀桿菌屬細菌、和到目前為止被劃分為短桿菌屬但現(xiàn)在又被合并到棒狀桿菌屬的短桿菌屬細菌以及與棒狀桿菌屬有較近親緣關(guān)系的短桿菌屬細菌。尤其在本必明中最為優(yōu)選的是屬于棒狀桿菌(短桿菌)屬的產(chǎn)谷氨酸細菌。屬于棒狀桿菌(短桿菌)屬的產(chǎn)谷氨酸野生菌株的實施例包括下面(幾個)。這些野生型菌株以及還具有產(chǎn)L-賴氨酸特性的這類菌株也同樣地用于本發(fā)明。
嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC 13870醋谷棒狀桿菌 ATCC 15806頸棒狀桿菌ATCC 15991谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032ATCC 13060叉開短桿菌ATCC 14020乳發(fā)酵短桿菌 ATCC 13869百合棒狀桿菌 ATCC 15990melassecola 棒狀菌ATCC 17965解糖短桿菌ATCC 14066immariophilum短桿菌 ATCC 14068玫瑰色短桿菌 ATCC 13825黃色短桿菌ATCC 13826生硫短桿菌ATCC 19240ammoniaphilum 微桿菌 ATCC 15354除了如上述的能夠產(chǎn)谷氨酸的野生菌株，可用于本發(fā)明的桿狀菌包括具有谷氨酸生產(chǎn)能力或那些失去谷氨酸生產(chǎn)能力的突變菌株。目前，各種人工的產(chǎn)谷氨酸桿狀菌突變菌株被用作產(chǎn)L-賴氨酸細菌，并且這些菌株也可用于本發(fā)明。這樣的人工突變菌株包括如下抗AEC(S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸)突變菌株，生長時需要如L-高絲氨酸氨基酸的突變菌株(日本專利48-28078及56-6499)；對AEC顯示抗性并需要如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸及L-纈氨酸的突變菌株(美國專利Nos.3708395及3825472)；對DL-α-氨基-ε-已內(nèi)酰胺、α-氨基-正十二烷基內(nèi)酰胺、天冬氨酸類似物、磺酰藥物、醌型、N-十二烷酰亮氨酸顯示抗性的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株；對草酰乙酸脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶抑制劑顯示抗性的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株(公開的日本專利Nos.50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995及56-39778以及特公昭Nos.53-43591和53-1833)；需要肌醇或醋酸的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株(公開的日本專利Nos.55-9784及56-8692)；對氟代丙酮酸或不低于34℃的溫度顯示敏感的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株(公開的日本專利Nos.55-9783和53-86090)以及對乙二醇顯示抗性并產(chǎn)L-賴氨酸的短桿菌或棒狀桿菌突變菌株(見美國專利申請NO333455)。
<4>HD突變菌株或HD缺陷菌株中AK基因的擴增。
在L-賴氨酸和L-蘇氨酸共同存在的情況下AK受到反饋抑制。然而，不表達野生型高絲氨酸脫氫酶的桿狀菌不能產(chǎn)生L-蘇氨酸，因此AK不受反饋抑制。因而，預(yù)期在不表達野生型高絲氨酸脫氫酶的細胞中，如果AK基因被擴增，可提高L-賴氨酸產(chǎn)率。如果抑制鈍化的AK基因被用作擴增的AK基因，由于反饋抑制進一步減少，預(yù)期L-賴氨酸產(chǎn)率會進一步提高。
作為不表達導(dǎo)入AK基因的野生型高絲氨酸脫氫酶的桿狀菌可舉出在按上面<3>中描述而獲得的HD突變菌株或HD缺陷菌株。然而，即使使用通過突變處理而獲得的HD完全缺失型菌株時，同樣地可以得到由于AK基因擴增使L-賴氨酸產(chǎn)率提高的效果。
在不表達野生型高絲氨酸脫氫酶的這種桿狀菌細胞中擴增AK基因或突變AK基因時，桿狀菌可用包含AK基因或突變型AK基因的重組DNA和能在桿狀菌細胞中自主復(fù)制的載體加以轉(zhuǎn)化。
這里使用的載體可以是任意的，只要能在桿狀菌細胞中自主復(fù)制的載體即可，具體地，可以是例如上述的PAJ655、PAJ1844，PAJ611、PAJ3148及PAJ440。
轉(zhuǎn)化桿狀菌的方法通過用于E.coliK-12，即以氯化鈣處理受體細胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))或通過如報道用于枯草桿菌的，即在生長期完成導(dǎo)入以便細胞可整合DNA(所謂感受態(tài)細胞)的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Yorung，F(xiàn).E.Gene，1，153(1977))加以舉例說明?；蛘?，如對于枯草桿菌、放線菌類及酵母所知道的(Chang，S.and Choen，S.N.Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.Ward，J.M.andHopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.Proc.Natl.Acad.Sci USA，75，1929(1978))，在將DNA受體轉(zhuǎn)化為易于整合重組DNA的質(zhì)體或球形體之后再完成向受體中導(dǎo)入重組DNA也是可能的。
此外，重組DNA在宿主中的穩(wěn)定性可通過允許載體含有一個如抗藥的標(biāo)記基因或補充宿主營養(yǎng)缺陷的基因而得到提高。
表達AK基因或突變型AK基因時，可直接地使用AK基因固有的啟動子。但是也可使用在桿狀菌中起作用的別的基因的啟動子將其連接到編碼AK或突變型AK的DNA序列中。
<5>突變型AK基因向HD突變菌株或HD缺陷菌株染色體DNA的導(dǎo)入L-賴氨酸產(chǎn)率可按上面<4>中描述的通過在HD突變菌株或HD缺陷菌株細胞中完成AK基因的擴增而得到提高。然而，為了增加導(dǎo)入到HD突變菌株或HD缺陷菌株中AK基因的穩(wěn)定性，優(yōu)選將AK基因整合進染色體DNA中。在這里，使用突變型AK基因作為待整合進染色體DNA的AK基因是優(yōu)選的。
為了整合突變型AK基因進入到宿主染色體DNA中，基因的整合可以用突變型HD基因或缺陷型HD基因相同的方式來完成。即，將源于乳發(fā)酵短桿菌的溫度敏感型復(fù)制起點、突變型AK基因以及對藥物如氯霉素產(chǎn)生抗性的標(biāo)記基因插入到質(zhì)粒載體以制備重組DNA。重組DNA被用于轉(zhuǎn)化桿狀菌，轉(zhuǎn)化的菌株在溫度敏感復(fù)制起點不起作用的溫度下培養(yǎng)，然后將它們培養(yǎng)于含有藥物的培養(yǎng)基中。這樣，便獲得重組DNA被整合到其染色體DNA上的轉(zhuǎn)化菌株。
具有整合到染色體DNA上的重組DNA的菌株導(dǎo)致最初存在于染色體上的AK基因序列重組，其中染色體AK基因和突變型AK基因兩個的融合基因在插入(interposing)重組DNA(載體部分、溫度敏感型復(fù)制起點及抗藥標(biāo)記)其它部分的狀態(tài)下被插入到染色體上。突變型AK在該狀態(tài)下為顯性，因此表型為突變型。因而，整合有基因的菌株也可直接被使用。然而，當(dāng)相同的序列適當(dāng)?shù)卦谌旧wDNA上平行排列時，重組可能又會發(fā)生，并且AK基因之一易于脫落。因此，最好獲得僅是突變型AK基因保留于染色體DNA的基因替代菌株。即，允許一個拷貝的AK基因通過兩個AK基因的重組與載體部分(包括溫度敏感型復(fù)制起點及抗藥標(biāo)記)一齊脫落。例如，培養(yǎng)染色體上帶有整合的菌株，并且培養(yǎng)的細菌細胞經(jīng)擴大并培養(yǎng)于不含藥物的固體平板培養(yǎng)基。長出的菌落體經(jīng)反復(fù)培養(yǎng)于含藥物的固體平板培養(yǎng)基并獲得藥物敏感型菌株。通過Southern雜交證實載體部分從獲得的藥物敏感菌株染色體脫落的事實，且突變型AK表達的事實也被證實。
此外，當(dāng)野生型AK基因以完整的形式保留于染色體DNA上時也沒有問題出現(xiàn)。這與用突變型HD基因或缺失型HD基因的基因替代情況有所不同。因此，突變型AK基因可被整合到染色體DNA的非AK基因位點上。
<6>L-賴氨酸的生產(chǎn)通過在一種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)HD突變菌株、HD缺陷菌株、AK基因在其中被擴增的這些類型的菌株、或其中整合有突變型AK基因的HD突變菌株或HD缺陷菌株，在培物中可產(chǎn)生和積累L-賴氨酸。
待用的培養(yǎng)基包括常規(guī)培養(yǎng)基，其中含有碳源、氮源、無機離子及任選其它有機成分。
作為碳源，可使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解產(chǎn)物；或者有機酸如延胡索酸、檸檬酸或琥珀酸。
作為氮源，使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨或磷酸銨；有機氮如大豆水解產(chǎn)物；氨氣或氨水是可能的。
允許必需物質(zhì)如維生素B1及L-高絲氨酸或酵母提取物以適當(dāng)?shù)牧看嬖谧鳛橛袡C微量營養(yǎng)物是理想的。除了上面的以外，如果必要，應(yīng)添加少量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
當(dāng)使用HD缺陷菌株時，應(yīng)向培養(yǎng)基中添加適量的L-蘇氨酸及L-甲硫氨酸或L-高絲氨酸。
培養(yǎng)優(yōu)選在有氧條件下用16～72小時得以完成。培養(yǎng)溫度優(yōu)選地控制在25℃～37℃，培養(yǎng)過程的PH優(yōu)選地控制在5～7。無機或有機、酸性或堿性物質(zhì)以及氨等可用作為PH調(diào)節(jié)物。培養(yǎng)液中L-賴氨酸的收集可通過結(jié)合常規(guī)的離子交換樹脂方法、沉淀方法及其它已知方法加以完成。
附圖簡述圖1為基因整合和基因替代的思路圖；圖2為各種微生物HD基因氨基酸序列的比較圖；圖3為各種微生物HD基因氨基酸序列的比較圖(續(xù))；圖4表示p399AK9B和p399AKYB的構(gòu)建過程；圖5表示經(jīng)HD突變菌株和HD缺陷菌株培養(yǎng)后的L-賴氨酸產(chǎn)率和OD值；圖6表示擴增AK基因后的HD突變菌株和HD缺陷菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率以及培養(yǎng)后的OD；圖7表示后突變型AK基因被整合進其染色體的HD突變菌株和HD缺陷菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率和培養(yǎng)后的OD值。
優(yōu)選實施方案描述下文將根據(jù)實施例更為具體地解釋本發(fā)明。實施例1野生型HD基因、泄漏型HD基因及鈍化抑制型HD基因的分析泄漏型HD突變菌株和產(chǎn)生對L-蘇氨酸具有鈍化的反饋抑制的H原突變菌株從野生型乳發(fā)酵短桿菌菌株中獲得。野生型HD基因、泄漏型HD基因及抑制純化型HD基因從野生及突變菌株得到分離并完成對它們結(jié)構(gòu)的分析。乳發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株(FERM BP-734)用作野生菌株。乳發(fā)酵短桿菌AJ12472及AJ12937菌株被用作泄漏型HD突變菌株。乳發(fā)酵短桿菌AI6080菌株被用作鈍化抑制型HD突變菌株。這些突變菌株按如下方法獲得。
AJ12036株是從乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC13869)中脫落最初存在的質(zhì)粒pAM330的菌株，對HD來說是產(chǎn)野生型HD的株。
AJ12472株及AJ12932株是從乳發(fā)酵短桿菌2256菌株中(ATCC13869)以賴氨酸產(chǎn)率作為指標(biāo)通過突變重復(fù)培育結(jié)果而得到的株，是產(chǎn)生泄漏型HD株。另外AI6080株是從乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC 13869)中，以賴氨酸產(chǎn)率作為指標(biāo)，通過突變重復(fù)培育結(jié)果而得到的株，是產(chǎn)生抑制-鈍化型HD株。
(1)通過PCR方法對HD基因的擴增HD基因堿基序列已有報道(Peoples，O.P.et al，MolecularMicrobiology，2(1)，63-72(1988))。據(jù)推測，乳發(fā)酵短桿菌和谷氨酸棒狀桿菌之間每個HD基因序列的類似性高。因此，合成的引物DNA用PCR方法以谷氨酸棒狀桿菌序列為基礎(chǔ)而制備。
染色體DNA根據(jù)常規(guī)方法從乳發(fā)酵短桿菌AJ12036，AJ12472、AJ12937及AI6080菌株中制備。為了從這些染色體DNA中用PCR法擴增含HD基因的約1500bp的DNA片段，使用Model1381A(ABI公司)型DNA合成儀合成2種引物5’端引物H1((841)5’-CTGGGAAGGTGAATCGAATTT-3’(860)，序列表中SEQ ID NO1)及3’端引物H2((2410)5’-TCCGAGGTTTGCAGAAGATC-3’(2391)，序列表中SEQ ID NO2)。圓括弧內(nèi)的數(shù)字表示由People等發(fā)表的在堿基序列中的位置(Peoples，O.P.et al，Molecular Microbiolo gy，2(1)，63-72(1988))。獲得的合成引物用反相HPLC加以純化。
PCR以下面所示的組合物，用PCR擴增儀(Takara Shuzo公司生產(chǎn)的DNA熱循環(huán)儀PJ2000)和PCR試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn)的Takara Gene A mpTM試劑盒)加以完成。
表1成分 濃度 摻入量引物H10.25μM 25pmol引物H20.25μM 25pmoldATP，dGTP，dTTP，dCTP每種200μM 20nmolTaq DNA聚合酶 2.5U/100μL 0.5μl(5U/μL)染色體DNA 1μg10×反應(yīng)緩沖液 10μL水 平衡(總量100μL)PCR中DNA變性、DNA退火及聚合酶反應(yīng)條件分別為94℃ 1分鐘、37℃ 2分鐘及75℃ 3分鐘，并且各個溫度間的轉(zhuǎn)換在1秒完成。DNA通過重復(fù)25個反應(yīng)循環(huán)得到擴增。通過瓊脂糖凝膠電泳對這樣獲得的擴增反應(yīng)產(chǎn)物大小加以證實，確認有約1.4Kbp DNA片段的擴增。
這樣，將從AJ1236、AJ12472、AJ12937及AI6080菌株中每個染色體DNA擴增的DNA片段分別以限制酶K pnI切割后獲得的DNA片段，插入到載體質(zhì)粒pHSG399(見Takeshita，S.et al.)Gene(1987)，61，63-74)的KpnI位點以獲得重組DNA。含有來自AJ12036、AJ12472、AJ12937及AI6080菌株擴增片段的重組DNA質(zhì)粒分別命名為pHDW、pHDMI、pHDMII及pHDMIII。每種質(zhì)粒被導(dǎo)入E，coliJM109菌株以獲得轉(zhuǎn)化子。
<2>HD基因堿基序列的測定及突變位點的分析(1)野生型及突變型HD基因堿基序列的比較按上述獲得的乳發(fā)酵短桿菌_AJ12036、AJ12472、AJ12937及AI6080菌株的HD基因片段堿基序列以雙脫氧法加以測定。
測得的AJ12936菌株野生型HD基因堿基序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列表示在序列表序列號3中。此外，氨基酸序列表示于序列表序列號4中。此序列與Peoples et al報道的(Peoples，O.P.et al，MolecularMicrobiology，2(1)，63-72(1988))谷氨酸棒狀桿菌HD基因序列比較的結(jié)果，堿基有4處不同，其中之一導(dǎo)致氨基酸水平的差異。用谷氨酸棒狀桿菌HD基因序列作為標(biāo)準(zhǔn)，不同的位點顯示如下(1)531G→C(148Gly→148Ala)(2)122G→C(3)1318G→T(4)1324C→G在野生型桿狀菌中各野生株HD基因的序列間可以觀察到的這種差異不影響HD的活性，并且谷氨酸棒狀桿菌HD基因序列可被看作與序列號3所示乳發(fā)酵短桿菌HD基因的相等序列。
AT12036株野生型HD基因的堿基序列和從此序列推導(dǎo)的氨基酸序列與AJ12472株、AJ12937株和AI6080菌株的HD基因的堿基序列和氨基酸序列的比較結(jié)果，對于AJ12472菌株發(fā)現(xiàn)2處突變位點，AJ12937發(fā)現(xiàn)1處對AI6080發(fā)現(xiàn)1處，所有均伴隨有氨基酸替代。此外，還發(fā)現(xiàn)在AJ12472和AJ12937菌株的HD基因中在一處同時存在完全相同的突變。每個突變位點顯示如下。
表2菌株堿基序列上的不同點 氨基酸在殘基突變AJ12472菌株155G→T23Leu→Phe
398G→A104Val→IleAJ12937菌株398G→A104Val→IleAI6080菌株1266G→T393Ser→Phe在下文，155G→T(23Leu→Phe)突變點稱作“突變位點1”，398G→A(104Val→Ile)突變位點稱作“突變位點2”，并且1266G→T(393Ser→Phe)突變位點稱作“突變位點3”。
(2)HD氨基酸序列和乳發(fā)酵短桿菌，枯草桿菌及E.coli突變位點的比較。
已知在E.coli中存在2種HD基因(HD-1、HD-2)，它們中的任何一個與AK構(gòu)成雙功能酶(Zakin，M.M.et al.，J.B.C.，258，3028-3031(1983))。此外，枯草桿菌HD基因的堿基序列已被測定(Parsot，C.and Cohen，G.N.，J.B.C.，263(29)14654-14660(1988))。這些氨基酸序列與乳發(fā)酵短桿菌野生型HD的氨基酸序列比較示于圖2和圖3。
根據(jù)這些結(jié)果，應(yīng)該明白大多數(shù)具有高度同源性的位點位于N-末端區(qū)域，特別是在乳發(fā)酵短桿菌HD的氨基酸序列中，具高度同源性的位點集中于100～230氨基酸區(qū)域。根據(jù)前面提及的事實可推定，是HD活性區(qū)域存在于N-末端一側(cè)，這些事實包括乳發(fā)酵短桿菌HD2個突變位點位于N-末端約100個氨基酸殘基以內(nèi)，尤其突變位點1位于N-末端第23個氨基酸位置，并且這兩個突變位點是與、Ecoli的HD-1及HD-2、枯草桿菌的HD及乳發(fā)酵短桿菌HD之間具有高度的保守性的氨基酸殘基，進而Eoli的HD-1及HD-2沒有相應(yīng)于乳發(fā)酵短桿菌HD N-末端一側(cè)的約100個氨基酸殘基的序列。
另一方面，對L-蘇氨酸具有鈍化抑制的谷氨酸棒狀桿菌HD基因的堿基序列已經(jīng)發(fā)表。即，Sahm等報導(dǎo)由于點突變，C-末端第68個氨基酸發(fā)生了替代(Reinscheid，D.J.et al.，J.Bacteriol.，173(10)，3228-3230(1991))，并且Sinskey等報導(dǎo)由于點突變導(dǎo)致的閱讀框移位，C-末端第17個氨基酸及后面部分發(fā)生改變以及第7個氨基酸及后面部分的缺失(Archer，J.A.C.等，Gene，107，53-59(1991))。此外，氨基酸殘基的突變位于乳發(fā)酵短桿菌AI6080菌株鈍化-抑制HD中C-末端的第53個氨基酸殘基位置。另外，在E.coliHD-1和HD-2中不存在的C-末端一側(cè)區(qū)域存在于枯草桿菌的HD中，它與乳發(fā)酵短桿菌HD以同樣的方式受L-蘇氨酸的反饋抑制。因此，推測關(guān)于L-關(guān)于蘇氨酸反饋抑制的HD區(qū)域存在于C-末端一側(cè)。實施例2野生型AK基因和突變型AK基因的制備和分析<1>野生型和突變型AK基因及含有它們的質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)常規(guī)方法從乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC 13869)中、及由2256株突變處理而得到的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株AJ3463(FERM P-1987)制備的染色體DNA。AK基因根據(jù)PCR方法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；見Wshite，T.J.等，F(xiàn)rends Genet.，5，185(1989)從染色體DNA中得到擴增。用于擴增的DNA引物基于對棒狀桿菌glutamicum已知的序列(見Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204，and Mol Gen.Genet.(1990)，224，317-324)為了擴增編碼AK基因的約1643 bP的區(qū)域具有5’--TCGCGAAGTAGCACCGTGTTCACTT-3’(SEQ ID NO5)序列和5’-ACGGATTCAACTTACGGCC(SEQ ID NO6)的23堿基及21堿基單鏈DNA被合成。根據(jù)常規(guī)的磷酰亞胺方法(見TetrahedronLetters(1981)，22，1859))從Applied Biosystem(1981)，公司生產(chǎn)的Model380B型DNA合成儀加以合成DNA。
在PCR反應(yīng)中，基因擴增根據(jù)供應(yīng)商指定的方法，通過用TakaraShuzo公司生產(chǎn)的Model PJ2000 DNA熱循環(huán)儀和Taq DNA聚合酶加以完成。經(jīng)凝膠電泳確證1643Kb的基因片段被擴增以后，從凝膠中切下的片段根據(jù)常規(guī)方法純化，并以限制酶NruI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))和EcoRI(Takara Shuzp公司生產(chǎn))加以切割。
pHSG399(見Takeshita，S.et al.，Gene(1987)，61，63-74)被用作克隆基因片段的載體。PHSG399以限制酶SamI(由Takara Shuzo Co.，Letd.生產(chǎn))及限制酶EcoRI切割，并被連上擴增的AK基因片段。DNA連接通過用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))以指定方法加以完成。這樣便制備出pHSG399被連到從短桿菌株菌染色體擴增的AK基因產(chǎn)物上的質(zhì)粒。具有來自作為野生菌株的2256菌株(ATCC13869)AK基因的質(zhì)粒被命名為p399AKY，并且具有來自作為產(chǎn)L-賴氨酸細菌的AJ3463AK基因的質(zhì)粒被命名為p399AK9。
具有能使質(zhì)粒在棒狀桿菌屬細菌(下文稱“Coryne.-ori”)中自主復(fù)制能力的DNA片段分別被導(dǎo)入p399AKY用p399AK9以制備出帶有能在棒狀桿菌屬細菌中自主復(fù)制的AK基因的質(zhì)粒Coryne.-ori從能在大腸埃希氏桿菌細胞和棒狀桿菌屬細菌細胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體得到制備。一些這類質(zhì)粒載體已有報道。然而，在本發(fā)明中，使用的是穿梭載體pHK4，它是從能在桿狀菌細胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒pAJ1844中，(見公開的日本專利NO58-216199)和能在Escherichia coli細胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒pHSG298中)見(Takeshita，S.et al.，Gene，61，63-74(1987))制備出。
pHK4的制備方法在公開的日本專利NO5-7491中有詳細描述，然而，可將其簡述如下。pAJ1844以限制酶Sau 3AI部分切割，并與用限制酶Bam HI完全切割的pHSG298連接。連接后的DNA被導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌AJ12036(FERM-p7559)。一種電脈沖方法(見公開的日本專利NO2-207791)被用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子的選擇通過用含25μg/mL卡那霉素的M-CM2G平板(在11純水(pH7.2)中含5g葡萄糖，10g多聚肽(Polypepeone)、10g酵母提取液、5g NaCl，0.2gDL-甲硫氨酸和15g瓊脂)來完成。從轉(zhuǎn)化子中制備質(zhì)粒，并且選擇出最小的質(zhì)粒，命名為pHK4。該質(zhì)?？稍诖竽c埃希氏桿菌及桿狀菌中自主復(fù)制并賦予宿主對卡那霉素的抗性。
按上述獲得的pHK4以限制酶Kpm(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))切割，切點為平末端。平末端的形成是根據(jù)指定方法，以DNA鈍化試劑盒(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))來完成。平末端形成以后，連接上磷酸化Bam HI接頭(由Taraka Shuzo公司生產(chǎn))以產(chǎn)生修飾，從而允許Coryne.-ori部分的DNA片段僅被Bam HI從pHK4切割。該質(zhì)粒以BamHI切割。產(chǎn)生的Coryne.-ori DNA片段同樣地連接到用Bam HI從相同的方式切割的p399AKY或p399AK9上，以制備出能在棒狀桿菌屬細菌中自主復(fù)制且含有AK基因的質(zhì)粒。
含有來自p399AKY野生型AK基因的質(zhì)粒被命名為p399AKYB，并且含有來自p399AK9突變型AK基因的質(zhì)粒被命名為p399AK9B。p399AK9B和p399AKYB的構(gòu)建過程示于圖4。向作為乳發(fā)酵短桿菌野生型菌株的AJ12036菌株(FERM-P7559)導(dǎo)入突變型AK質(zhì)粒p399AK9B而獲得的AJ12691菌株于1992年4月10日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute ofBioscieno and Human Technology of Agency of Industrial Science andTech；nology)，保藏號為FERM P-12918，于1995年2月10日，根據(jù)布達佩斯條約轉(zhuǎn)移到國際保藏，保藏號為FERM BP-4999。
<2>乳發(fā)酵短桿菌野生型及突變型AK基因的堿基序列的測定從每個轉(zhuǎn)化子中制備含有野生型AK基因的質(zhì)粒p399AKY及含有突變型AK基因的質(zhì)粒p399AK9，并且野生型及突變型AK基因的堿基序列被測定。堿基序列的測定根據(jù)Sanger方法(F.Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci..74，5463(1977))等)完成。
由p333AK編碼的野生型AK基因的堿基序列示于序列表的序列號7中。另一方面，由p399AK編碼的突變型AK基因的堿基序列僅具有一個堿基的突變，即與野生型AK相比，在序列號7中第1051個G變?yōu)锳。對于AK基因，已知2個亞基α，β由相同DNA鏈上相同的閱讀框編碼(見Kalinowski，J.et al.Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204)。從同源性判斷，推測該例中的基因，其α、β2個亞基在相同的DNA鏈上以相同的閱讀框編碼。
從DNA堿基序列推導(dǎo)的野生型AK蛋白質(zhì)α-亞基的氨基酸序列與DNA序列一起表示于序列表序列號8中。此氨基酸序列表示于序列號9中。另外，從DNA堿基序列推導(dǎo)的野生型AK蛋白質(zhì)β-亞基的氨基酸序列與DNA序列一起顯示于序列表的序列號10中。單一的氨基酸序列顯示于序列號11中。每個亞單位用GTG作為起始密碼子，其相應(yīng)的氨基酸為甲硫氨酸。然而，這代表著甲硫氨酸，纈氨酸或甲酰甲硫氨酸。
另一方面，在突變型AK基因序列上的突變表明發(fā)生了氨基酸殘基的替代以致相對于野生型AK蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號8、10)，α亞基的第279個丙氨酸殘基以蘇氨酸殘基替代，并且β亞基中第30個丙氨酸殘基以蘇氨酸殘基替代。
<3>突變型AK基因表達產(chǎn)物的AK活性及抑制鈍化的評估制備出野生野生型AK質(zhì)粒p399AKYB和突變型AK質(zhì)粒p399AK9B被分別導(dǎo)入作為(乳發(fā)酵短桿菌谷氨酸棒狀桿菌)野生型菌株的AJ12036菌株(FERM-p7559)而形成的菌株?；蛳虬魻顥U菌的導(dǎo)入根據(jù)電脈沖方法完成。測定作為宿主的乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)AJ12036菌株、具有野生型AK質(zhì)粒的AJ12690菌株及具有突變型AK質(zhì)粒的AJ12691(FERM-P12918)菌株的AK活性?；钚詼y定根據(jù)常規(guī)方法(見Miyajima，R.et al.The Journal ofBiochemistry(1968)，63(2)，139-148)完成。
如表3中所示，已證實，由于AK質(zhì)粒的導(dǎo)入，AK的特異活性增加到約10～15倍，由L-賴氨酸和L-蘇氨酸的積累抑制僅在具有導(dǎo)入突變型AK質(zhì)粒的菌株被鈍化。表3表示了乳發(fā)酵短桿菌野生型AJ12036菌株細菌細胞、及其具有野生型AK質(zhì)粒的AJ12690菌株具有突變型AK質(zhì)粒AJ12691菌株的破碎液的AK比活性由于L-賴氨酸及L-蘇氨酸對其的積累抑制程度。添加作為抑制劑的L-賴氨酸和L-蘇氨酸，其終濃度各自均為1Mm。
表3菌株 AK比活性(mU/mg蛋白)沒有添加+1mM L-賴氨酸+1mM L-蘇氨酸AJ12036 19.0 2.6AJ12690 235.3 34.6AJ12691 210.5 145.3<4>通過位點特異的突變對突變型AK基因AK基因的改進為了進一步改進按上述獲得的突變型AK，試圖通過位點特異的突變手段，以另外的氨基酸殘基替代突變型AK的突變位點(279Ala→Thr)在所需位點導(dǎo)致所需突變的位點特異的突變包括如用PCR方法(Higuchi，R.，61，in PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton Press(1989))，使用噬菌體的方法(Kramer，W.and Frits，H.J.，Meth.in Enzymol，154，350(1987)；Kunkel，T.A et al.，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))。
關(guān)于通過突變要被導(dǎo)入的氨基酸殘基種類，20種氨基酸根據(jù)各自的特性如極性和分子結(jié)構(gòu)加以分類，并且選擇了代表性的8種(Arg，Asp，Cys，Phe，Pro，Ser，Tyr，Val)。在各自突變位點的氨基酸突變和堿基替代列于表4。
表4突變的識別突變位點和氨基酸改變Thr279Ala GCT→Thr A*CTArg279Ala GCT→Arg C*G*TAsp279Ala GCT→Asp GA*TCys279Ala GCT→Cys T*G*TPhe279Ala GCT-→Phe T*T*TPro279Ala GCT→Pro C*CTSer279Ala GCT→Ser T*CTTyr279Ala GCT→Tyr T*A*TVal279Ala GCT→Val GT*T這里使用的導(dǎo)入突變的方法如下。8種合成的23個堿基的DNA(其中將導(dǎo)入突變的第279個丙氨酸殘基的密碼子替代成所需氨基酸殘基密碼子)被命名(作為導(dǎo)入精氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO12；作為導(dǎo)入天冬氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG GAT GCCAAGGTTT-3’SEQID NO13；作為導(dǎo)入半胱氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCG AG TGTGCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO14；作為導(dǎo)入苯丙氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG TTT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO15；作為導(dǎo)入脯氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG CCT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO16；作為導(dǎo)入絲氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAGTCT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO17； 作為導(dǎo)入酪氨酸的合成DNA5’GCCAGGCGAG TAT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO18以及作為導(dǎo)入纈氨酸的合成DNA5’GCCAGGCGAG GTTGCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO19)。16種23個堿基的單鏈DNA。與它們的互補序列一起合成。
例如，當(dāng)要導(dǎo)入精氨酸殘基時，具有序列5’-GCCAGGCGAG CGTGCCAAGGTTT-3’(SEQ ID NO12)的單鏈DNA，作為其互補鏈的單鏈DNA，具有SEQ ID NO5序列的單鏈DNA以及具有SEQ ID NO6的單鏈DNA被用作引物。PCR方法以p399AKY作為模板加以完成。主了避免非特異性突變的導(dǎo)入，含突變點的約280堿基對以限制酶(NaeI-AvalI)從制備的DNA中切割出來，并與p399AKY的相應(yīng)位點點替代后，制備重組質(zhì)粒。對替代區(qū)域進行堿基序列的確認。
在對8種獲得的重組質(zhì)粒中每個所具有的突變型AK酶活性的測定和評估時，一種完全缺失型E.oli菌株Gif106M1被用作宿主(Boy，E.and Patte，J.C.，J.Bacterid.，112，84-92(1972)；Theze，J.et al.，J.Bacteriol.，117，133-143(1974))，因為對于桿狀菌，沒有已知的AK缺失型菌株。另外，認為宿主AK和來自質(zhì)粒AK以混合的方式存在，可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的測定。已知許多桿狀菌基因在E.coli-中表達。因此推測，由于AK基因被連接在pHSG399 lac啟動子下游，故可在大腸埃希氏桿菌中表達。
用野生型及8種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Gif160M1，從每個轉(zhuǎn)化菌株中制備無細胞提取液，且完成酶分析。AK活性以Miyajima，R.et al描述的方法(The Journal of Biochemistry(1968)，63(2)，139-148)加以測定。在添加5mML-賴氨酸、5；mML-蘇氨酸或每個2mM L-賴氨酸及L-蘇氨酸情況下，抑制鈍化程度和特異活性列于表5。
表5特異活性 5mM賴氨 5mM蘇氨 2mM賴氨酸(mU/mg 蛋酸 酸＋蘇氨酸白)(％) (％) (％)AJ12036 5.652.0 87.0 7.0野生型316.4 52.7 86.8 6.2蘇氨酸374.4 58.7 109.1 78.3精氨酸197.4 41.4 106.8 58.6半胱氨酸 267.0 66.5 135.7 60.6苯丙氨酸 447.7 14.6 105.0 32.4脯氨酸125.0 77.5 123.2 85.2絲氨酸406.8 55.0 114.4 37.0酪氨酸425.6 16.1 104.8 32.2纈氨酸448.9 60.5 103.5 75.5結(jié)果，在轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝园被崛缣於彼岬那闆r下，AK被失活，而在轉(zhuǎn)變?yōu)槿我黄渌被岬那闆r下，L-賴氨酸和L-蘇氨酸的抑制被純化。
實施例3HD突變型菌株和HD缺陷菌株L-賴氨酸產(chǎn)率的評估為了比較突變型HD基因和缺陷型HD對L-賴氨酸產(chǎn)率的影響，制作將突變型HD基因或具有部分序列缺失的HD基因整合到同樣宿主的染色體的基因-替代菌株，分別用作HD突變菌株和HD缺陷菌株，并用于L-賴氨酸產(chǎn)率的評估。
<1>替代突變型HD基因質(zhì)粒和替代缺陷型HD基因質(zhì)粒的制備制備基因替代質(zhì)粒，通過突變型HD基因或具有部分序列缺失的HD基因的同源重組，導(dǎo)入到乳發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株(FERM BP-734)(通過缺失乳發(fā)酵短桿菌2256菌株)(ATCC13869)而獲得)的染色體DNA中。
(1)具有突變位點I的HD基因的制備在實施例1中獲得的突變型HD基因有2種，包括具有突變位點1(155C→T(23Leu→Phe)和突變位點2(398G→A(104Val→Ile))的突變型HD基因(來自AJ12472菌株)以及僅具突變位點2的突變型基因(來自AJ12937)。為了研究突變位點1對HD活性和L-賴氨酸產(chǎn)率的影響，制備僅具突變位點1的突變型HD基因。下文中，具有突變位點1的突變型HD稱作HD-M1，具有突變位點2的突變型HD稱作HD-M2，既具有突變點位1又具有突變點2的突變型HD稱作HDM-12。
含有HDM-12基因的質(zhì)粒pHDMI用切斷突變位點1和2之間的限制酶TthIII1，及切割載體和HD基因的連接點的Kpnl切割，從而獲得具有突變位點1的5’一側(cè)HD片段。用相同的方式，具有野生型HD基因的pHDW用TthIII1和Kpnl切割獲得3’一側(cè)HD片段。這樣通過連接5’一側(cè)HD片段和3’一側(cè)HD片段而獲得僅具有突變點1的HD-M1基因。
(2)基因替代用質(zhì)粒的構(gòu)建按上述獲得的僅具有突變點1的HD-M1基因插入到具有氯霉素抗性基因(Cm1)的載體質(zhì)粒pHSG398KpnI位點上。進而將來自乳發(fā)酵短桿菌野生菌株的溫度敏感復(fù)制起點(TSori)插入pHSG398的BamHI位點。這樣便構(gòu)建出替代HD-M1基因的質(zhì)粒pTSHDM1。TSori從質(zhì)粒pHSC4中制備(見公開的日本專利5-7491)，pHSC4質(zhì)粒通過在體外以羥胺處理具有Coryne.-ori的質(zhì)粒pHK4，用處理后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ12036，并從不能在高溫(34℃)生長的轉(zhuǎn)化菌株回收質(zhì)粒而獲得。Coryne.-ori可以用BamHI和KpnI從pHSC4中切割出來，但是僅以Bam HI切割改變了可以切割Coryne.-ori的質(zhì)粒。pHSC4以限制酶KpnI(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))切割且切割面是平末端。平末端的形成是用DNA平切割試劑盒(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))根據(jù)指定的方法加以完成。平末端形成以后，連結(jié)上磷酸化的BamHI接頭(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))以產(chǎn)生修飾，從而允許TSori部分的DNA片段僅以Bam HI從pHSC4切割。具有pHSC4的Escherichia coli AJ12571于1990年10月11日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)科技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號為FERMP-11763，根據(jù)布達佩斯條約于1991年8月26目轉(zhuǎn)移到國際保藏，保藏號為FERM BP-3524。
其次，以同樣的方式，含有僅具突變點2的HD-M2基因的質(zhì)粒pHDII用KpnI切割以獲得HD-M2基因片段，并將其插入到pHSG398的KpnI位點。進而通過將TSori被插入到Bam HI位點，構(gòu)建出替代HD-M2基因用的質(zhì)粒pTSHDM2。
此外，含有既具突變點1又具突變點2的HD-M12基因的質(zhì)粒pHDMI以KpnI切割，從而獲得HD-M12基因片段，并導(dǎo)入PHSG398KpnI位點。進而，通過將TSori插入BamHI位點。構(gòu)建出替代HD-M12基因用的質(zhì)粒pTSHDM12。
此外，具有野生型HD基因的質(zhì)粒pHDW以AatII切割，并且缺失存在于HD基因中兩個AatII位點。(在序列號3，堿基號為716-722和1082-1087)。之間的部分。這樣便制備出含有部分缺失的HD基因(HD-Δ基因)的質(zhì)粒。該質(zhì)粒用KpnI切割以獲得HD-Δ基因片段并被插入pHSG398的KpnI位點。接著將TSori插入BamHI位點。這樣便構(gòu)建出替代HD-Δ基因的質(zhì)粒pTSHΔ。
(3).HD突變菌株和HD缺陷菌株的制備乳發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株的轉(zhuǎn)化根據(jù)電脈沖方法(Sugimoto等，公開的日本專利No.2-207791)，使用上述得到的替代突變型HD基因質(zhì)粒pTSHDMI、pTSHDM2和pTSHDM12以及替代缺失型HD基因質(zhì)粒pTSHDΔ加以完成。
獲得的轉(zhuǎn)化菌株以M-CM2G培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)，直到獲得完全生長(約1-2×109/mL)。培養(yǎng)的細菌細胞被稀釋到每板105個細胞，涂布于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基，并在34℃培養(yǎng)2～7天以獲得菌落。確認獲得的菌落細胞中不含質(zhì)粒。進而，以線形pHSG398作為探針，通過Southern雜交分析手段確認基因替代用質(zhì)粒被整合進染色體。
在按上述獲得的染色體整合菌株中，最初存在于染色體上的HD基因和突變型或與缺失型HD基因融合的基因二個在插入載體(包括TSori)的狀態(tài)下被插入染色體上。
其次，為了只讓突變型HD基因或缺失型HD基因留在染色體上，允許野生型HD基因和載體從染色體DNA上脫落以獲得以突變型HD基因替代的菌株和以缺失型HD基因替代的菌株。野生型HD基因和載體允許按如下方式脫落。
每個整合的菌株在34℃培養(yǎng)于含氯霉素(10μg/ml)的M-CM2G培養(yǎng)基直到獲得完全生長(1-2×109)。培養(yǎng)過的細菌細胞涂布于不含氯霉素的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基以產(chǎn)生每板50～200個菌落并在34℃下培養(yǎng)。長出的菌落按同樣的方式在含氯霉(5μg/mL)的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基上34℃培養(yǎng)，從而獲得氯霉素敏感型菌株。通過Southern雜交來確證載體從獲得的氯霉素敏感型菌株上脫落下來。進一步確證突變型HD或缺失型HD被表達。通過染色體DNA的堿基序列測定來確認突變位點被導(dǎo)入這樣獲得的基因替代菌株。
這樣獲得的HD-M1基因替代菌株被命名為HDM1菌株，HD-M2基因替代菌株被命名為HDM2菌株，并且HD-Δ基因替代菌株被命名為HDΔ菌株。
<2>HD突變菌株和HD缺陷菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率研究作為HD突變菌株的HDM1、HDM2和HDM12菌株以及作為HD缺陷菌株的HDΔ菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率。進行了用單個菌落分離的這些HD突變菌株和HD缺陷菌株以及作為HD野生菌株的AJ12036菌株分別在31.5℃于500mL的加有20mL下述的產(chǎn)L-賴氨酸的培養(yǎng)基燒瓶中，振蕩培養(yǎng)72小時，L-賴氨酸的最終OD(OD562)和積累量被測定。(產(chǎn)L-賴氨酸的培養(yǎng)基)該培養(yǎng)基通過溶解下述的成分(在1L)，用KOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在115℃滅菌15分鐘，然后加入50g/L的通過干燥狀態(tài)下加熱滅菌的CaCO3葡萄糖100g(NH4)SO455gKH2PO41gMgSO4.7H20 1gd-生物素 500μg硫氨素-HCL2000μgFeSO4.7H2O 0.01gMnSO4.7H2O 0.01g尼克酰胺 5mgMamenou(T-N) 1.05gGD113 0.05ml結(jié)果顯示于圖5。任何菌株中未發(fā)現(xiàn)剩余糖。正如從結(jié)果中所闡明的，在AJ12036菌株中很少觀察到L-賴氨酸的積累，而HDM1菌株中約有4g/L，HDM2菌株中約有17g/L，在HDM12菌株中約有7.5g/L且HDΔ菌株中約有30g/L。在后面的任一菌株中觀察到L-賴氨酸的積累。尤其在HDΔ菌株中，L-賴氨酸產(chǎn)率顯著提高。此外，發(fā)現(xiàn)即使僅突變點1向HD的導(dǎo)入，L-賴氨酸也被積累。
HDΔ菌株在或基本培養(yǎng)基只添加L-蘇氨酸或L-甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基上不生長，然而，通過加入L-高絲氨酸或L-蘇氨酸和L-甲硫氨酸，其生長又恢復(fù)。HDM1、HDM2和HDM12菌株的任何一種能夠在既不含L-蘇氨酸也不含L-甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基中生長。
乳發(fā)酵短桿菌HDΔ菌株被命名為乳發(fā)酵短桿菌AJ12846。它于1995年2月2日被保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所，保藏編號為P-14197，并與1994年2月2日根據(jù)布達佩斯條約轉(zhuǎn)移到國際保藏，其保藏號為FERM BP-4995。
實施例4AK基因在HD突變菌株和HD缺陷菌中的擴增效果如在實施例3中所描述的，已闡明L-賴氨酸產(chǎn)率通過向野生菌株中導(dǎo)入突變型HD基因和缺失型HD基因而被提高。進而對通過結(jié)合AK基因因擴增與突變型HD基因和缺失型HD基的預(yù)期效應(yīng)進行了進一步研究。
已知AK受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同抑制，然而，在它們分別單獨存在的情況下抑制程度低。因此，既然HD突變菌株和HD缺陷菌株不產(chǎn)生L-蘇氨酸，預(yù)期L-賴氨酸產(chǎn)率也可通過野生型AK基因的擴增而提高。而且還預(yù)期L-賴氨酸產(chǎn)率可通過導(dǎo)入在實施例2中獲得的不受L-賴氨酸和L-蘇氨酸抑制的編碼突變型AK的基因而進一步提高。
為了研究突變型HD基因或缺失型HD基因與AK基因擴增導(dǎo)入的這種結(jié)合效應(yīng)，含有AK基因的質(zhì)粒被導(dǎo)入在實施例3中獲得的HD突變菌株和HD缺陷菌株中，并且評估L-賴氨酸的產(chǎn)率。
作為野生菌株的AJ12036菌株，作為HD突變菌株的HDM1、HDM2和HDM12以及作為HD缺陷菌株的HDΔ分別被用作各個宿主，并且以具有野生型AK基因和Coryne.-ori的質(zhì)粒(p399AKYB)及具有突變型AK的質(zhì)粒(p399AK9B)轉(zhuǎn)化。即，5種宿主被2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化并一共獲得10種轉(zhuǎn)化菌株。
AJ12036、HDM1、HDM2、HDM12和HDΔ的每個轉(zhuǎn)化菌株的2個菌株用前面提及的產(chǎn)L-賴氨酸培養(yǎng)基加以培養(yǎng)并且測量L-賴氨酸產(chǎn)率。然而，具有p399AKYB質(zhì)粒和p399AK9B質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株在添加有10μg/mL氯霉素的前培養(yǎng)培養(yǎng)基和產(chǎn)L-賴氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)以在添加有20mL培養(yǎng)基的500mL燒瓶中完成。
根據(jù)圖6中顯示的結(jié)果，對于AJ12036菌株即使導(dǎo)入野生型AK質(zhì)粒也沒觀察到L-賴氨酸產(chǎn)率的提高，而在HD突變菌株和HD缺陷菌株，觀察到由于野生型AK質(zhì)粒的導(dǎo)入所致的L-賴氨酸積累量的增加。此外，當(dāng)導(dǎo)入突變型AK質(zhì)粒時，HD突變菌株和HD缺陷菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率與導(dǎo)入野生型AK質(zhì)粒的情況相比有進一步的提高。此外，由于突變型AK質(zhì)粒的導(dǎo)入，甚至在含有野生型HD基因的AJ12036菌株情況下仍觀察到約22g/l的L-賴氨酸積累量。
實施例5在HD突變菌株和HD缺陷菌株中突變型AK基因基因替代的效果<1>.以實變型AK基因和突變型HD基因替代菌株及以突變型AK和缺失型HD基因替代菌株的產(chǎn)生HD突變和HD缺陷與AK基因擴增的結(jié)合效應(yīng)已在實施例4中研究過。本實施例涉及突變型HD基因或缺失型HD基因整合到染色體上的同時，建立突變型AK基因整合到染色體上的株，從而估計L-賴氨酸產(chǎn)率。
用于整合突變型AK基因進入染色體DNA的基因替代質(zhì)粒按如下獲得。
替代突變型AK基因的質(zhì)粒pAK9T通過將乳發(fā)酵短桿菌的溫度敏感復(fù)制起點(TSori)插入存在于在實施例2中獲得的質(zhì)粒p399AK9(以乳發(fā)酵短桿菌AJ3463菌株染色體中擴增的突變型AK基因片段連接到pHSG399而形成的質(zhì)粒)載體部分的BamHI位點而構(gòu)建。
導(dǎo)入有突變型AK基因和HD-M1基因的菌株[(AKFBR＋HDm1菌株]通過用替代突變型AK基因質(zhì)粒pAK97整合實變型AK基因，用在實施例4中獲得的HDM1菌株作母本菌株而獲得。pAK9T通過電脈沖方法(Sugimoto等，公開的日本專利NO2-207791)導(dǎo)入HDM1菌株。并且獲得的轉(zhuǎn)化菌株在25℃，用M-CM2G培養(yǎng)基培養(yǎng)到獲得完全生長(約1-2×109/ml)為止。稀釋培養(yǎng)過的細菌細胞以獲得每個平板105個細胞，涂布于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基，并在34℃培養(yǎng)2-7天以獲得菌落。確證獲得菌落的細胞不含質(zhì)粒。進而，用線性的pHSG399作為探針，通過Souther雜交分析確證pAK9T整合進染色體。
在上述獲得的整合染色體菌株中，最初存在于染色體上的AK基因和突變型AK基因的融合基因在插入載體(包括TSori)的狀態(tài)下被插入染色體中。其次，為了只讓突變型AK基因留在染色體DNA上，使野生型AK基因和載體脫落以獲得突變型AK基因替代的菌株。載體按如下脫落。
整合有突變型AK基因的菌株在34℃于含有氯霉素(10μg/mL)的M-CM2G培養(yǎng)基中培養(yǎng)到獲得完全生長(1-2×109)。培養(yǎng)過的細菌細胞涂布于不含氯霉素的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基，從而使每板具50-200個菌落并在34℃培養(yǎng)。形成菌落的克隆中，篩選出較母本HDM1菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率有提高的菌株。
具有突變型AK基因和HD-M12基因株[AKTBR+HDM12株]用HDM菌株作為母本菌株。
用同樣的方式進行，通過用pAK97基因替代，篩選出與HDM12菌株相比L-賴氨酸產(chǎn)率有提高的菌株。
另一方面，導(dǎo)入有突變型AK基因和HD-M2基因的菌株[(AKFBR＋HDM2菌株]通過在乳發(fā)酵短桿菌AJ12036菌株上導(dǎo)入pAK9T后創(chuàng)建具有導(dǎo)入突變型AK基因的AKFBR菌株作為母本菌株，接著導(dǎo)入HD-M2基因而獲得。即，pAK9T通過電脈沖方法(Sugimoto等，公開的日本專利NO2-207791)導(dǎo)入AJ12036菌株中，并且將獲得的轉(zhuǎn)化菌株在25℃，用M-CM2G培養(yǎng)基培養(yǎng)到獲得完全生長(約1-2×109mL)。培養(yǎng)過的細菌細胞稀釋到每板105個細胞，涂布于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基，并于34℃培養(yǎng)2-7天以獲得菌落。確證獲得的菌落細胞中不含質(zhì)粒。此外，用線性pHSG399作為探針，通過Southern雜交分析來確證pAK9T整合進染色體中。
其次，整合有突變型AK基因的菌株在34℃，培養(yǎng)于含氯霉素(10μg/mL)的M-CM2G培養(yǎng)基中，直到獲得完全生長(1-2×109)。培養(yǎng)過的細菌細胞涂布于不含氯霉素的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基以獲得每板50～200個菌落并于34℃培養(yǎng)。長出的菌落再按相同的方式，在34℃培養(yǎng)于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固體平板培養(yǎng)基以獲得氯霉素敏感型菌株。通過Southern雜交確證載體從獲得的氯霉素敏感菌株染色體上脫落。突變型AD基因的表達也被進一步確證。通過染色體DNA的堿基序列測定來確證這樣獲得的基因替代菌株具有導(dǎo)入的突變位點。
按上述通過電脈沖方法以相同的方式，將替代HD-M2基因的質(zhì)粒pTSHDM2導(dǎo)入這樣獲得的突變型AK基因替代菌株(AKFBR菌株)染色體，并獲得質(zhì)粒脫落的基因替代菌株?；蛱娲甑暮Y選根據(jù)對L-賴氨酸產(chǎn)率的提高和L-蘇氨酸或L-甲硫氨酸的敏感性進行的。
以同樣的方式，導(dǎo)入有突變型AK基因和HDΔ基因的菌株(AKFBR+HDΔ)通過用突變型AK基因替代菌株(AKFBR菌株)作為母本菌株，按上述以同樣的方式用pTSHDΔ完成基因替代，并篩選出由于HD缺陷而對L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷的克隆而獲得。
對于按上述獲得的每個基因替代菌株，突變點的導(dǎo)入最終是通過DNA堿基序列來加以確證。此外，質(zhì)粒脫落是通過Southern雜交證實的。
<2>以突變型AK基因和突變型HD基因替代的菌株和以突變型AK基因和缺失型HD基因替代的菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率的估計進行按上述獲得的4種菌株，即(AKFBR＋HDM1)、(AKFBR＋HDM2)、(AKFBR＋HDM12)和(AKFBR＋HDΔ)菌株的L-賴氨酸產(chǎn)率評估。
這些菌株中每個在31-35℃培養(yǎng)于500mL燒瓶中72小時，其中加有20mL前面提及的L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基，測定培養(yǎng)液的LD和積累的L-賴氨酸量。
結(jié)果如圖7如示。AKFBR菌株的L-賴氨酸產(chǎn)量約19g/L，而(AKFBR＋HDM1)菌株約21g/L，(AKFBR＋HDM2)菌株約22g/L，(AKFBR＋HDM12)菌株約20g/L，(AKFBR＋HDΔ)菌株約35g/L。與單獨導(dǎo)入突變型HD基因或缺失型HD基因時相比，這些基因與突變型AK基因組合導(dǎo)入時，L-賴氨酸產(chǎn)率有進一步提高。
培養(yǎng)完成后，AKFBR菌株與(AKFBR＋HDM1)、(AKFBR＋HDM2)與(AKFBR＋HDM12)菌株的任一種之間的OD只有微小差異。然而，與單獨以缺失型HD基因替代的菌株相比，在(AKFBR＋HDΔ)菌株情況下，OD減少得更多。培養(yǎng)完成以后任何菌株中均未發(fā)現(xiàn)有殘?zhí)恰?br> (AKFBR＋HDM2)、(AKFBR＋HDM12)和(AKFBR＋HDΔ)菌株分別被命名為AJ12848(FERMP-14198)、AJ12849(FERM P-14199)和AJ12850(FERMP-14200)。它們于1994年3月1日分別被保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏編號按上述的圓括號中數(shù)字，于1995年2月9日、根據(jù)布達佩斯條約轉(zhuǎn)移到國際保藏，并且名藏號分別是FERM BP-4996，F(xiàn)ERM BP-4997和FERM BP-4998。實施例6HD完全缺陷菌株回復(fù)突變頻率的測定對于通過在染色體上基因替化而獲得的HD完全缺陷型菌株(HD和AKFBR＋HDΔ菌株〕和通過用作為常規(guī)突變處理劑的N-甲基N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理活細菌細胞而獲得的HDΔ缺陷菌株ATCC13287比較高絲氨酸營養(yǎng)缺陷的回復(fù)突變頻率。
比較方法如下。貯存的菌株在富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，再接種到L-賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基上。經(jīng)72小時振蕩培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋。菌落在M-CM2G固體平板培養(yǎng)基上長出后，再按相同方式培養(yǎng)于既不含L-甲硫氨酸也不含L-蘇氨酸的短桿菌屬菌基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在基本培養(yǎng)基上長出菌落和在營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基上長出的菌落比例被看作為回復(fù)突變比例。當(dāng)用該方法沒能觀察到回復(fù)突變菌株的菌落時，增加涂敷在基本培養(yǎng)基的細菌細胞數(shù)目，另一方培養(yǎng)基涂敷稀釋物，從菌落形成數(shù)推測出涂敷在基本培養(yǎng)基上的菌數(shù)，算出回復(fù)突變率。
通過該方法對前面提及的三種菌株回復(fù)突變的測定結(jié)果列于表6。培養(yǎng)完成時，在ATCC13287菌株中出現(xiàn)較多的回復(fù)突變菌株。相反，在用染色體重組制備的HDΔ和AKFBR＋HDΔ菌株中根本沒有觀察到回復(fù)突變菌株。此外，沒有發(fā)生回復(fù)突變的HDΔ菌株較ATCC13287菌株具有更高的L-賴氨酸產(chǎn)量。
表6菌株回復(fù)突變頻率(％) 積累的L-賴氨酸量(g/L)ATCC13287 40 20.0HDΔ 030.0AKFBR＋HDΔ 035.0
序列表SEQ ID NO.1 信息序列特征長度20類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO.1CTGGGAAGGT GAATCGAATTSEQ ID NO.2信息序列特征長度20類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID No.2TCCGAGGTTT GCAGAAGATC 20SEQ ID No.3信息序列特征長度1478類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性分子類型基因組DNA最初來源有機體乳發(fā)酵短桿菌菌株AJ12036特征名字/關(guān)鍵字CDS位置89…1423鑒定方法S序列描述SEQ ID NO.3GGTACCCTTT TTGTTTTGGA CACATGTAGG GTGGCCGAAA CAAAGTAATA GGACAACAAC 60GCTCGACCGC GATTATTTTT GGAGAATC ATG ACC TCA GCA TCT GCC CCA AGC112Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser1 5TTT AAC CCC GGC AAG GGT CCC GGC TCA GCA GTC GGA ATT GCC CTT TTA 160Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu10 15 20GGA TTC GGA ACA GTC GGC ACT GAG GTG ATG CGT CTG ATG ACC GAG TAC 208Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr25 30 35 40GGT GAT GAA CTT GCG CAC CGC ATT GGT GGC CCA CTG GAG GTT CGT GGC 256Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly45 50 55ATT GCT GTT TCT GAT ATC TCA AAG CCA CGT GAA GGC GTT GCA CCT GAG 304Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu60 65 70CTG CTC ACT GAG GAC GCT TTT GCA CTC ATC GAG CGC GAG GAT GTT GAC 352Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp75 80 85ATC GTC GTT GAG GTT ATC GGC GGC ATT GAG TAC CCA CGT GAG GTA GTT 400Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val90 95 100CTC GCA GCT CTG AAG GCC GGC AAG TCT GTT GTT ACC GCC AAT AAG GCT 448Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala105 110 115 120CTT GTT GCA GCT CAC TCT GCT GAG CTT GCT GAT GCA GCG GAA GCC GCA 496Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala125 130 135AAC GTT GAC CTG TAC TTC GAG GCT GCT GTT GCA GCC GCA ATT CCA GTG 544Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val140 145 150GTT GGC CCA CTG CGT CGC TCC CTG GCT GGC GAT CAG ATC CAG TCT GTG 592Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val155 160 165ATG GGC ATC GTT AAC GGC ACC ACC AAC TTC ATC TTG GAC GCC ATG GAT 640Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp170 175 180TCC ACC GGC GCT GAC TAT GCA GAT TCT TTG GCT GAG GCA ACT CGT TTG 688Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu185 190 195 200GGT TAC GCC GAA GCT GAT CCA ACT GCA GAC GTC GAA GGC CAT GAC GCC 736Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala205 210 215GCA TCC AAG GCT GCA ATT TTG GCA TCC ATC GCT TTC CAC ACC CGT GTT 784Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val220 225 230ACC GCG GAT GAT GTG TAC TGC GAA GGT ATC AGC AAC ATC AGC GCT GCC 832Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala235 240 245GAC ATT GAG GCA GCA CAG CAG GCA GGC CAC ACC ATC AAG TTG TTG GCC 880Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala250 255 260ATC TGT GAG AAG TTC ACC AAC AAG GAA GGA AAG TCG GCT ATT TCT GCT 928Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala265 270 275 280CGC GTG CAC CCG ACT CTA TTA CCT GTG TCC CAC CCA CTG GCG TCG GTA 976Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val285 290 295AAC AAG TCC TTT AAT GCA ATC TTT GTT GAA GCA GAA GCA GCT GGT CGC 1024Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg300 305 310CTG ATG TTC TAC GGA AAC GGT GCA GGT GGC GCG CCA ACC GCG TCT GCT 1072Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala315 320 325GTG CTT GGC GAC GTC GTT GGT GCC GCA CGA AAC AAG GTG CAC GGT GGC 1120Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly330 335 340CGT GCT CCA GGT GAG TCC ACC TAC GCT AAC CTG CCG ATC GCT GAT TTC 1168Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe345 350 355360GGT GAG ACC ACC ACT CGT TAC CAC CTC GAC ATG GAT GTG GAA GAT CGC 1216Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg365 370 375GTG GGC GTT TTG GCT GAA TTG GCT AGC CTG TTC TCT GAG CAA GGA ATC 1264Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile380 385 390TCC CTG CGT ACA ATC CGA CAG GAA GAG CGC GAT GAT GAT GCA CGT CTG 1312Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu395 400 405ATC GTT GTC ACG CAC TCT GCG CTG GAA TCT GAT CTT TCC CGC ACC GTT 1360Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val410 415 420GAA CTG CTG AAG GCT AAG CCT GTT GTT AAG GCA ATC AAC AGT GTG ATC 1408Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile425 430 435 440CGC CTC GAA AGG GAC T AATTTTACTG ACATGGCAAT TGAACTGAAC GTCGGTCGTA 1464Arg Leu Glu Arg Asp445AGGTTACCGT CACG 1478SEQ ID NO.4信息序列特征長度445類型氨基酸拓撲學(xué)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述SEQ ID NO4Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly1 5 10 15Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu20 25 30Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile35 40 45Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys50 55 60Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala65 70 75 80Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly85 90 95Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys100 105 110Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu115 120 125Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala130 135 140Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu145 150 155 160Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr165 170 175Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp180 185 190Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr195 200 205Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala210 215 220Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu225 230 235 240Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala245 250 255Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys260 265 270Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro275 280 285Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe290 295 300Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala305 310 315 320Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala325 330 335Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr340 345 350Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His355 360 365Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala370 375 380Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu385 390 395 400Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu405 410 415Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val420 425 430Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp435 440 445SEQ ID NO5信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述 SEQ ID NO5TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23SEQ ID NO6信息序列特征長度21
類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO6ACG GAATTCA ATCTTACGGC C 21SEQ ID NO7信息序列特征長度1643類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性分子類型基因組DNA最初來源有機體谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC 138698序列描述SEQ ID NO7TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643SEQ ID NO8信息序列特征長度1643類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性分子類型基因組DNA最初來源有機體谷氨酸棒狀桿菌菌株AJ12036特征名字/關(guān)鍵字mat肽位置217…1479鑒定方法S序列描述SEQ ID NO8TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234Met Ala Leu Val Val Gln1 5AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu75 80 85TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val90 95 100CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro105 110 115GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala120 125130GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly135 140 145 150CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn155 160 165GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala170 175 180GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg410 415 420 421AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643SEQ ID NO9信息序列特征長度421類型氨基酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述SEQ ID NO9Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420SEQ ID NO10信息序列特征長度1643類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性分子類型基因組DNA最初來源有機體谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC13869特征名字/關(guān)鍵字mat肽位置964…1479鑒定方法S序列描述SEQ ID NO10TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu1 5 10 15GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala20 25 30AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val35 40 45CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe50 55 60ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys65 70 75CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val80 85 90 95GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val100 105 110ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Ash Val Asn Ile Glu115 120 125TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp130135 140GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly145 150 155GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg160 165 170 172AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643SEQ ID NO11信息序列特征長度172類型氨基酸拓撲學(xué)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述SEQ ID NO11Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu35 40 45Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr50 55 60Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu65 70 75 80Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly85 90 95Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr100 105 110Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu115 120 125Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp130 135 140Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170SEQ ID NO12信息序列特征
長度23類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO12GCCAGGCGAG CGTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO13信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO13GCCAGGCGAG GATGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO14信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO14GCCAGGCGAG TGTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO15信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO15GCCAGGCGAG TTTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO16信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO16GCCAGGCGAG CCTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO17信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO17GCCAGGCGAG TCTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO18信息序列特征長度23類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO18GCCAGGCGAG TATGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO19信息序列特征長度23
類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性分子類型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO19GCCAGGCGAG GTTGCCAAGG TTT 2權(quán)利要求
1.一種編碼源于桿狀菌的高絲氨酸脫氫酶的DNA片段，其中距N-末端第23位亮氨酸殘基和第104位纈氨酸殘基的至少之一被變換為另一種氨基酸殘基。
2.一種具有編碼源于桿狀菌突變型高絲氨酸脫氫酶基因桿狀菌，其中高絲氨酸脫氫酶N-末端的第23位亮氨酸殘基和第104位纈氨酸殘基的至少之一被變換為另一種氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的桿狀菌，其特征是通過與桿狀細菌染色體上的高絲氨酸脫氫酶基因同源重組，將編碼上述突變型高絲氨酸脫氫酶的基因整合進入染色體DNA而將其轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的桿狀菌，其中所述的另一種氨基酸殘基對于第23位亮氨酸殘基來說為苯丙氨酸殘基，并且對第104位纈氨酸殘基來說為異亮氨酸殘基。
5.一種桿狀菌，其中通過與桿狀菌染色體上高絲氨酸脫氫酶基因的同源重組，將源于桿狀菌的編碼部分高絲氨酸脫氫酶的DNA片段整合進染色體DNA，從而破壞該菌的高絲氨酸脫氫酶基因。
6.一種桿狀菌，其細胞中具有重組DNA，該重組DNA是通過連接源于桿狀菌的天冬氨酸激酶基因與能在桿狀菌細胞中自主復(fù)制的載體而構(gòu)建的，并且該菌不表達野生型高絲氨酸脫氫酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的桿狀菌，其中所述的天冬氨酸激酶基因是用于編碼L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制基本被鈍化的天冬氨酸激酶基因的。
8.一種桿狀菌，通過整合編碼源于L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制鈍化的桿狀菌的天冬氨酸激酶基因于桿狀菌染色體DNA中而被轉(zhuǎn)化，并且不表達野生型高絲氨酸脫氫酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的桿狀菌，其中的L-賴氨酸和L-蘇氨酸反饋抑制鈍化的天冬氨酸激酶為突變型天冬氨酸激酶，其N-末端第279位丙氨酸殘基被轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€非丙氨酸的氨基酸殘基，并且在其α-亞基中為非酸性氨基酸，并且第30位丙氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€非丙氨酸的氨基酸殘基且在β-亞基中為非酸性氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求6～9的任一項的桿狀菌，其中通過與桿狀菌染色體上高絲氨酸脫氫酶基因的同源重組，將突變型高絲氨酸脫氫酶基因整合進入其染色體而被轉(zhuǎn)化，該高絲氨酸脫氫酶源于桿狀菌，其N-末端第23位亮氨酸殘基和第104位纈氨酸殘基至少之一被轉(zhuǎn)換為另一種氨基酸殘基，并且因此不表達野生型高絲氨酸脫氫酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求6～9的任一項的桿狀菌，其中通過與桿狀菌染色體上高絲氨酸脫氫酶基因同源重組的方法，將編碼源于桿狀菌酶基因同源重組的方法，將編碼源于桿狀菌的部分高絲氨酸脫氫酶DNA片段整合進其染色體中，從而破壞其高絲氨酸脫氫酶基因，并且不表達野生型高絲氨酸脫氫酶。
12.一種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求2～11中任一項的桿狀菌，在其培養(yǎng)物中積累和生產(chǎn)L-賴氨酸以及從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸的方法。
全文摘要
通過整合編碼天冬氨酸激酶的基因進入具有泄漏型高絲氨酸脫氫酶的桿狀菌染色體DNA或高絲氨酸脫氫酶基因缺陷的桿狀菌染色體DNA而提供一種具高L-賴氨酸產(chǎn)率的桿狀菌，該天冬氨酸激酶源于桿狀菌，其L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制被鈍化。
文檔編號C12N9/02GK1147273SQ9519286
公開日1997年4月9日 申請日期1995年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月4日
發(fā)明者杉本雅一, 臼田佳弘, 鈴木智子, 田中朗子, 松井裕 申請人:味之素株式會社