專利名稱：Dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼人體因子IX(fIX)的DNA序列。該序列可用于包括轉(zhuǎn)基因動物在內(nèi)的因子IX表達(dá)系統(tǒng)，并具有潛在的基因治療用途。
要想在異源系統(tǒng)，尤其是轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中獲得因子IX的高表達(dá)產(chǎn)率是困難的。例如，盡管由β-乳球蛋白驅(qū)動的人體因子IX在轉(zhuǎn)基因動物，如羊的乳里的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(如WO-A-8800239所公開的)基本方法是有效的，但所得到的產(chǎn)率很低。這似乎是由兩個主要原因造成的錯誤的表達(dá)。因子IXcDNAs的使用通常會遇到這樣一個問題，即難于獲得理想水平的適當(dāng)?shù)膄IX轉(zhuǎn)錄物。這一問題可通過轉(zhuǎn)基因拯救方法(見WO-A-9211358，“Increased Expression by a SecondTransferred Sequence in Transgenic Organisms”)得以部分地解決。在該現(xiàn)有公開文件中，β-乳球蛋白(BLG)與編碼人體因子IX的構(gòu)建物FIXD的共整合，會導(dǎo)致能表達(dá)高水平FIXD mRNA的鼠系的產(chǎn)生。但在這些動物的乳中只含有極少的fIX。
異常剪接。通過嚴(yán)格檢查BLG+FIXD鼠中的FIXD mRNA轉(zhuǎn)錄物證明，它比預(yù)計的長度短了大約450bp。據(jù)推測，這些堿基很可能是由于mRNA的異常剪接而從內(nèi)部缺失的(Clark等，Bio/Technology10，1450～1454，(1992))。
在J.Biol.Chem.270，5276-5281(1994)(Kurachi等)中對人體因子IX mRNA在肝細(xì)胞中的剪接進(jìn)行了討論。這篇文章指出，剪接信號序列的存在能導(dǎo)致因子IX表達(dá)的增加，因為剪接復(fù)合體在前體mRNAs從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移出來之前起著保護(hù)其免受隨機(jī)降解的作用。
業(yè)已證實，異常剪接確實是因子IX在異源或轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)率低的一個原因。而且，最明顯的是弄清了隱敝剪接位點(diǎn)在編碼因子IX的人體基因上的位置。這一發(fā)現(xiàn)使得我們能夠制造出編碼因子IX的DNA序列，以避免所觀察到的異常剪接。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種帶有編碼一種具有人體因子IX活性的蛋白質(zhì)的序列的DNA，其中，對該DNA進(jìn)行修飾，以便影響至少下列隱敝剪接位點(diǎn)之一的功能(a)包括mRNA核苷酸1086的供體位點(diǎn)；和(b)包括mRNA核苷酸1547的受體位點(diǎn)；采用的是附圖的圖2中的mRNA核苷酸編號。
本發(fā)明的DNA能使fIX的表達(dá)水平比迄今所公開的通過修正fIX序列的異常剪接所能達(dá)到的水平高。
核前體mRNA(即在剪接產(chǎn)生輸送到細(xì)胞質(zhì)中的mRNA之前短暫地存在于細(xì)胞核中的初級基因轉(zhuǎn)錄物)上的供體位點(diǎn)帶有核苷酸GU，剪接之后它成為切除的內(nèi)含子的5’末端核苷酸。核前體mRNA上的受體位點(diǎn)帶有核苷酸AG，剪接之后它成為切除的內(nèi)含子的3’末端核苷酸。在前一段落中給出的核苷酸編號是分別針對(5’)供體位點(diǎn)的G殘基和(3’)受體位點(diǎn)的G殘基的。
本發(fā)明的優(yōu)選DNA能編碼野生型人體因子IX。不過，編碼變體(特別是來自共有序列的等位變體)、保守突變或其它蛋白質(zhì)的DNA也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要該蛋白質(zhì)與人體因子IX基本上同源。正如在本領(lǐng)域中普遍理解的，“基本上同源”既可在蛋白質(zhì)水平上評價也可在核酸水平上評價。例如，在蛋白質(zhì)水平上，如果候選蛋白質(zhì)與人體因子IX的氨基酸同源性至少為40、60、80、90、95或99％，而且越高越好，就可以說是基本上同源。在核酸水平上，如果候選DNA序列與人體因子IX的DNA序列至少有80、90、95或99％同源性，而且越高越好，就可以說是基本上同源。
應(yīng)該知道，本發(fā)明可應(yīng)用于編碼因子IX(或具有因子IX活性的其它蛋白質(zhì))的各種DNA序列。具體地講，本發(fā)明可應(yīng)用于cDNA序列、具有天然內(nèi)含子的完整補(bǔ)體的基因組序列和帶有存在于編碼因子IX的基因組DNA上的某些而不是所有內(nèi)含子的“小基因”序列。
為了避免或至少是顯著降低異常剪接，有多種修飾本發(fā)明的DNA以便影響隱敝供體/受體位點(diǎn)的功能的方法。
首先，在附加的內(nèi)含子5’或3’與隱敝剪接以某種方式“競爭”的基礎(chǔ)上，該構(gòu)建物的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)可以改變。不過，這種方法比較復(fù)雜，而且僅能部分抑制異常剪接。
其次，可以用工程法除去隱敝供體位點(diǎn)。mRNA供體位點(diǎn)上的G或U可被其它堿基取代，或者兩者都被取代，只要這種變化不產(chǎn)生終止密碼即可。該方法在技術(shù)上比上述的競爭內(nèi)含子法簡單，但必需改變因子IX的氨基酸序列，因為供體位點(diǎn)上的GU殘基構(gòu)成了纈氨酸密碼子的前兩個核苷酸，而且所有的纈氨酸密碼子都是由GU開始。這可能不是缺點(diǎn)，而且，如果要制造次級或下一代因子IX的變體的話可能還是優(yōu)點(diǎn)。然而，如果必須至少在供體位點(diǎn)范圍內(nèi)保留野生型因子IX序列的話，它就不合適了。
再者，而且在多數(shù)情況下理想的是，可用工程法除去隱敝受體位點(diǎn)。該位點(diǎn)位于因子IX DNA的3’非翻譯區(qū)，所以與氨基酸序列無關(guān)。mRNA受體位點(diǎn)的A或G可以缺失或是被其它堿基所取代，或者這兩個堿基同時缺失或被取代。事實上，在本發(fā)明的一些最簡單的實施方案中，該受體位點(diǎn)的缺失，僅要求產(chǎn)生在3’末端被截短的因子IX cDNA片段(或者，當(dāng)然也可以是被相應(yīng)地截短了的DNA而不是cDNA)。在其它實施方案中，可將定點(diǎn)誘變技術(shù)專門用于改變受體位點(diǎn)(或當(dāng)然也可以是供體位點(diǎn))。
本發(fā)明的DNA可用于用來表達(dá)因子IX(或類似蛋白質(zhì))的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種表達(dá)宿主，它包括與一個表達(dá)控制序列可操作地連接的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的DNA。表達(dá)控制序列通常包括一個啟動子，并且還可以有其它調(diào)節(jié)序列。
盡管本發(fā)明可普遍用于各種不同的細(xì)胞類型和培養(yǎng)的細(xì)胞，但它特別適用于轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)系統(tǒng)，因為原則上講可由該技術(shù)獲得高產(chǎn)率。因此，在某些優(yōu)選實施方案中，表達(dá)宿主是動物，如哺乳動物。
用于產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的優(yōu)選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)涉及轉(zhuǎn)基因的有胎盤非人哺乳動物，特別是羊和其它產(chǎn)乳動物，這些動物可以在乳蛋白啟動子，特別是乳清蛋白β-乳球蛋白的控制下，在(成年雌性的)乳腺中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，參見WO-A-8800239、WO-A-9005188和WO-A-9211385。
不過，本發(fā)明并不局限于這些優(yōu)選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的應(yīng)用。預(yù)計編碼因子IX的序列可用于血友病的基因治療方法，例如，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或直接轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入干細(xì)胞。不會發(fā)生異常剪接的改善的fIX序列的優(yōu)點(diǎn)是不言而喻的。
可以對本發(fā)明每一方面的特征做必要的變化。
將通過以下的實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。實施例與附圖相應(yīng)，其中

圖1與例1相應(yīng)，它是用于證實FIXD構(gòu)建物的異常剪接的示意圖；圖2也與例1相應(yīng)，引自Anson等，The EMBO Journal3(5)1053-1060(1984)，它表示因子IX mRNA中隱敝供體和受體位點(diǎn)的位置；圖3與例1相應(yīng)，更詳細(xì)地表示供體和受體位點(diǎn)如何相互作用；該圖還表示用于供體和受體位點(diǎn)的通用共有序列；圖4表示人體因子IX基因的總體結(jié)構(gòu)，包括隱敝剪接位點(diǎn)的位置；圖5與例2相應(yīng)，表示用于區(qū)分不同表達(dá)系統(tǒng)中不同構(gòu)建物的未剪接和異常剪接的mRNA的以PCR為基礎(chǔ)的示意圖；圖6與例3相應(yīng)，表示被稱為FIXD Δ3’剪接體的構(gòu)建物的構(gòu)建；圖7與例4相應(yīng)，表示的是對來自能高產(chǎn)率表達(dá)人體因子IX的轉(zhuǎn)基因鼠的乳的Western印跡分析結(jié)果。在非還原條件下對來自FIXD Δ3’剪接體系(313 1.2和31.3)的兩種動物的乳樣進(jìn)行電泳。乳樣被稀釋1/200，分別加樣5μl或10μl。fIX，10ng fIX；CM，對照乳；CM+fIX，對照乳+10ng fIX；和圖8也與例4相應(yīng)，它表示以因子IX-特異性探針進(jìn)行檢測的來自FIXD-Δ3’剪接體鼠的典型RNA樣品的Northern印跡。將來自高度和中度表達(dá)BIX鼠(BIX33.1和BIX34.1)的乳腺RNAs與來自FIXDΔ3’剪接體轉(zhuǎn)基因鼠(標(biāo)記的BIXΔ3’3.10-BIXΔ3’44.2)的乳腺樣品進(jìn)行比較。用標(biāo)記過的來自p5G3’CVII(一種帶有人體fIX cDNA序列的質(zhì)粒)的插入片段對印跡進(jìn)行檢測，并用GAPDH進(jìn)行再檢測，以控制加樣量。轉(zhuǎn)錄物的大小得到確認(rèn)。FIXDΔ3’-剪接體轉(zhuǎn)錄物明顯大于來自BIX鼠的轉(zhuǎn)錄物。例1構(gòu)建物FIXD的異常剪接通過用RT-PCR對來自鼠表達(dá)系之一的乳腺RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行克隆，證實FIXD mRNA的異常剪接。FIXD披露于WO-A-9005188的例3和WO-A-9211385的比較例6中，它包括與β-乳球蛋白(BLG)5’和3’序列(包括外顯子6和7)融合的人體因子IX(fIX)cDNA；FIXD不含天然的內(nèi)含子。設(shè)計并構(gòu)建了對fIXcDNA的5’末端和BLG的3’末端具有專一性的引物(模式1圖1)。該引物具有以下序列模式1-5’fIX(編碼號292343)5’CAC CAA GCT TCA TCACCA TCT GCC3’★模式1-3’BLG(編碼號290646)5’GGG TGA CTG CAG TCCTGG TCC C3’★含有引入的HindIII位點(diǎn)，以便能夠克隆。
上述引物擴(kuò)增來自BLG+FIXD鼠的較短的FIXD轉(zhuǎn)錄物(稱作BIX)，并將其克隆在質(zhì)粒載體pBLUESCRIPT中，稱作pRT-FIX，然后對其測序。pRT-FIX的序列表明，在fIX序列中有一個462nt的內(nèi)缺失。因此，與預(yù)計的FIXD mRNA的大小為1813nt不同，BIX轉(zhuǎn)錄物為1351個核苷酸(圖1)。
用Sanger的雙脫氧法測定的pRT-FIX序列，確認(rèn)了在BIXmRNA上所觀察到的缺失的精確位置。通過檢查fIXcDNA序列(Anson等，The EMBO Journal 3(5)1053-1060(1984))并與由pRT-FIX所推斷的5’和3’斷裂點(diǎn)進(jìn)行比較，證實該缺失幾乎可以肯定是由于異常剪接造成的。因此，該缺失包括堿基對1085～1547(含端點(diǎn))(采用的是Anson論文和本說明書圖2中的編號)。5’末端的序列為5’GUAAGUGG，而3’末端的序列為UUUCUCUUUACAG3’(圖3)。它們是內(nèi)含子的供體(5’)和受體(3’)位點(diǎn)的‘極好’的共有序列。(一個內(nèi)含子的5’和3’末端必須分別有GU和AG這對剪接來說是絕對必要的；這里的其它堿基也接近供體和受體位點(diǎn)的共有區(qū)。)應(yīng)當(dāng)指出的是，供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的存在并不意味著基因必須以這種方式剪接人們不能由該序列預(yù)測是否會發(fā)生剪接。實際上，在天然因子IX基因中，這些位點(diǎn)存在于被與FIXD上相同的序列分開的最后一個外顯子(外顯子8)中(圖4)。然而，這些位點(diǎn)并不用于人體肝臟里的正常表達(dá)因子IX前體mRNA。因此，由于某種原因，產(chǎn)生于乳腺里的FIX轉(zhuǎn)錄物利用這些剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致內(nèi)缺失BIX mRNA的產(chǎn)生。這種內(nèi)缺失的mRNA不能編碼有功能的fIX蛋白質(zhì)，因為它導(dǎo)致了編碼fIX的最后109個氨基酸的片段的去除。例2其它fIX構(gòu)建物上發(fā)生的異常剪接fIXcDNA序列異常剪接的驗證是用表達(dá)FIXD構(gòu)建物(與BLG共整合)的小鼠來做的。以前已用由fIXcDNA序列轉(zhuǎn)基因的羊做過實驗，但在這些羊中，該fIXcDNA序列被整合到完整BLG基因的第一個外顯子上，形成一種被稱為FIXA的構(gòu)建物(如在WO-A-8800239中的例3中所述)。該構(gòu)建物看上去表現(xiàn)相當(dāng)差，并在乳中產(chǎn)生相當(dāng)?shù)退降膄IX。因此，看一看這種異常剪接是否發(fā)生在帶有該fIX構(gòu)建物的乳腺中也是很有意義的。羊的乳腺RNA樣品帶有另一種較差的表達(dá)構(gòu)建物JFIXA1(在WO-A-9005188的例4中的E部分被鑒定為JFIX A1)，該樣品也是由按照在WO-A-9005188中建立者所披露的轉(zhuǎn)基因方法制備的轉(zhuǎn)基因羊所產(chǎn)生的。設(shè)計一套PCR引物(模式2圖5)，當(dāng)RT-PCR擴(kuò)增RNA時它可以分辨未剪接的fIX序列和在BIX mRNA上觀察到的異常剪接的mRNA。在野生型(非異常剪接的mRNA)中，這種引物可產(chǎn)生一個689p的片段，而在異常剪接的mRNA中它會產(chǎn)生一個227bp的片段。這些引物具有以下序列模式2-5’fIX(編碼號795X)5’GAG GAG ACA GAA CATACA GAG C3’模式2-3’fIX(編碼號794X)5’CAG GTA AAA TAT GAAATT CTC CC3’它被用于由表達(dá)fIX的組織制備的多種RNA。其結(jié)果如表1所示。
表1
羊乳腺中的FIXA和JFIXA1確實表現(xiàn)出與BIX相同的異常剪接，因此，它并不是嚴(yán)格取決于構(gòu)建物。不過，鼠體內(nèi)的FIXA顯示出一種相當(dāng)混亂的情況。僅有1/12的鼠表達(dá)該構(gòu)建物，但表達(dá)水平較高(30μg/ml)。很明顯，這只鼠不會在乳腺中發(fā)生這種異常剪接，因此，在乳中可觀察到很高水平的fIX。但還不清楚這種現(xiàn)象為什么會發(fā)生在這只鼠中。不過，它表明，缺乏異常剪接可提高fIX在乳中的含量。例3 FIX-Δ3’剪接體的構(gòu)建構(gòu)建過程如圖6所示。一套PCR引物(模式4)模式45’BLG(976G)5’GCT TCT GGG GTC TAC CAGGAA C3’模式4 3’fIX(2212)5’TAT AAC CCG GGA AAT CCA TCT TTCATT AAG T3’★★帶有附加的5’序列，該序列包括用于克隆的新的SmaI位點(diǎn)被用于擴(kuò)增從5’BLG序列到fIX的終止密碼的3’端即隱性受體剪接位點(diǎn)5’端的一段FIXD。因此，這一段DNA帶有fIX編碼序列，但在3’非翻譯區(qū)缺少隱性受體位點(diǎn)。將該片段與BLG序列融合，以制成一種非常類似于FIXD的構(gòu)建物，但它缺少存在于FIXD上的fIX的141bp的3’側(cè)翼序列，包括隱性受體位點(diǎn)。例4 FIX-Δ3’剪接體的表達(dá)為了試驗FIX-Δ3’剪接體是否會在轉(zhuǎn)基因動物中導(dǎo)致fIX表達(dá)的改善，將其同BLG一起共同注射到鼠卵子中(見WO-A-9211385)，并建立起若干轉(zhuǎn)基因系。在RNA水平和蛋白質(zhì)水平上分析乳腺中FIX-Δ3’剪接體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。蛋白質(zhì)分析迄今已對9個系的轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行了分析，9個系在乳中均表現(xiàn)出可檢測量的fIX。其中之一(系31)表現(xiàn)出極高的含量(平均60.9μg/ml)，某些個體表現(xiàn)出＞100μg/ml(表2)這是迄今在乳中所能達(dá)到的最高fIX水平。
因子IX乳樣的ELISA分析這些乳來自帶有修飾過的因子IXcDNA(去掉了受體剪接位點(diǎn))的轉(zhuǎn)基因鼠。該ELISA基于兔多克隆的捕捉，而檢測是由被生物素化過的同一多克隆進(jìn)行的。表達(dá)結(jié)果如下表2在FIXΔ3’系中RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)
★通過對拖尾DNA的Southern印跡的PhosphorImager分析而測定的；這些值是近似值(“nd”表示未做)。
@在某些樣品中，F(xiàn)IXDΔ3’mRNA的含量是相對于體外轉(zhuǎn)錄的fIX轉(zhuǎn)錄物測定的
+由ELISA測定；由括號中所示的G1(第一代)或G2(第2代)樣品數(shù)平均得到$該系的某些個體的fIX含量超過100μg/ml此外，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在還原性和非還原性凝膠上具有極類似于由正常血漿產(chǎn)生的人體fIX的遷移率(圖7)，并具有生物活性(表3)。這種fIX產(chǎn)生水平可在羊上實現(xiàn)商業(yè)化。
來自轉(zhuǎn)基因鼠乳的人體fIX的提純及生物活性通過免疫親和層析從所收集的來自系31的鼠乳中提純fIX。與Ca+結(jié)合fIX Gla結(jié)構(gòu)域結(jié)合的MabA7由Charles Lutsch贈送。該抗體與溴化氰活化的Sepharose聯(lián)結(jié)。將稀釋的乳液與被抗體結(jié)合的Sepharose一起在50mM Tris，150mM NaCl pH7.5(TBS)+50mM CaCl2中在4℃溫度下培養(yǎng)過夜。用TBS，25mM EDTA，pH7.5將結(jié)合的蛋白質(zhì)等度洗脫下來。通過添加fIX缺乏型血漿(診斷試劑，Oxon，UK)和APTT試劑(Sigma)測定fIX凝固活性，在加入Ca+5分鐘后使反應(yīng)開始。凝固作用是用一臺ST4分析儀(Diagnostica Stago)進(jìn)行滾珠振蕩而測定的。將正常人體血漿(ELISA測得fIX為4μg/ml)用作標(biāo)準(zhǔn)。
結(jié)果如下面的表3所示表3
★收集來自FIXΔ3’31系的若干乳樣@通過ELISA測定+通過凝固試驗測定RNA分析用fIX專一性探針對來自FIX-Δ3’剪接體鼠的典型RNA樣品的Northern印跡進(jìn)行檢測。觀察到預(yù)計大小的轉(zhuǎn)錄物(～1680nt)(圖8)，而且，穩(wěn)態(tài)mRNA含量與在乳中測出的fIX的含量相關(guān)(例如系31具有最高的mRNA含量(見表2))。將這些FIX-Δ3’剪接體RNAs與某些BIX RNAs一起跑帶。應(yīng)當(dāng)指出，它們的分子量比BIXmRNA(1351nt)的高，盡管構(gòu)建物較小。導(dǎo)致BIX mRNA變短的異常剪接現(xiàn)在已被消除。這是由對FIX-Δ3’剪接體RNA的RT-PCR分析而得到證實的，它表明轉(zhuǎn)錄物的3’片段是完整的(未示出)。
權(quán)利要求
1.具有編碼一種有人體因子IX活性的蛋白質(zhì)的序列的DNA，其中，對該DNA進(jìn)行修飾，以便影響至少下列隱敝剪接位點(diǎn)之一的功能(a)包括mRNA核苷酸1086的供體位點(diǎn)；和(b)包括mRNA核苷酸1547的受體位點(diǎn)；采用的是附圖的圖2中的mRNA核苷酸編號。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA，它編碼野生型人體因子IX。
3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA，它含有至少一個存在于編碼因子IX的基因組DNA中的內(nèi)含子。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的DNA，其中的隱敝供體位點(diǎn)是用工程方法除去的。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的DNA，其中的隱敝受體位點(diǎn)是用工程方法除去的。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA，它是編碼因子IX的DNA片段，該DNA片段的3’末端被截短以排除所述受體位點(diǎn)。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA，它是cDNA。
8.一種表達(dá)宿主，它包括與一個表達(dá)控制序列可操作地連接的如權(quán)利要求1～7中任一項所述的DNA。
9.如權(quán)利要求8所述的表達(dá)宿主，它是一種轉(zhuǎn)基因的非人動物。
10.如權(quán)利要求9所述的表達(dá)宿主，其中，所述動物是一種胎盤哺乳動物，而所述表達(dá)控制序列控制在乳腺里的表達(dá)，以使因子IX存在于哺乳動物的乳中。
11.如權(quán)利要求9所述的表達(dá)宿主，其中，所述的表達(dá)控制序列包括β-乳球蛋白啟動子。
全文摘要
重組人體因子IX的較差的表達(dá)產(chǎn)率歸因于在異源表達(dá)系統(tǒng)如轉(zhuǎn)基因宿主中的異常剪接。異常剪接位點(diǎn)已被確認(rèn)為(a)包括mRNA核苷酸1085的供體位點(diǎn)；和(b)包括mRNA核苷酸1547的受體位點(diǎn)；采用的是附圖的圖2中的mRNA核苷酸編號。改進(jìn)的因子IX表達(dá)序列至少用工程方法除去上述位點(diǎn)之一，以便避免或減少異常剪接的影響并由此提高產(chǎn)率。這種改進(jìn)的DNA序列還可用于基因治療。
文檔編號C12P21/04GK1149317SQ9519289
公開日1997年5月7日 申請日期1995年5月2日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月3日
發(fā)明者A·J·克拉克 申請人:Ppl治療(蘇格蘭)有限公司