專利名稱：一種修飾的超抗原和一種尋找靶物化合物的綴合物和該綴合物的用途的制作方法
超抗原主要是病毒或細(xì)菌來源蛋白質(zhì)，能同時與哺乳動物細(xì)胞MHCII類抗原和T細(xì)胞受體Vβ鏈結(jié)合。這種結(jié)合引起T-淋巴細(xì)胞的激活和荷載MHC II類抗原細(xì)胞的溶胞。當(dāng)與超抗原接觸時，Vβ鏈結(jié)合部分適當(dāng)程度的多態(tài)性引起相對大部分的T-淋巴細(xì)胞被激活(與通過正?？乖庸ね緩降募せ钭饔孟啾?。
最初超抗原的定義是與各種葡萄球菌腸毒素(SEA，SEB，SEC1，SEC2，SED，和SEE)相關(guān)的。近來發(fā)現(xiàn)新的命名為SEH的葡萄球菌腸毒素(Kegong等，J.Exp.Med.180(1994)1675-1683)。引起興趣后，又發(fā)現(xiàn)了超抗原。例子其中包括中毒性休克綜合癥毒素1(TSST-1)，與皮癬皮膚(scalded skin)綜合癥有關(guān)的表皮脫落毒素(Exft)，鏈球菌熱源外毒素A，B和C(SPE A，B和C)，鼠乳腺腫瘤病毒蛋白質(zhì)(MMTV)，鏈球菌M蛋白質(zhì)，梭狀芽苞產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridial perfringens)腸毒素(CPET)。超抗原及其性質(zhì)的綜述參見Kotzin等(Adv.Immunol.54(1993)99-166)。
假單孢桿菌外毒素A被看好為功能性超抗原，因為有結(jié)果表明這種毒素可以在細(xì)胞內(nèi)通過使細(xì)胞生產(chǎn)生成在細(xì)胞表面表達(dá)的片段，所述片段具有結(jié)合Vβ鏈的能力并接著激活T細(xì)胞。(假單孢桿菌外毒素A，Legaard等，Cell.Immunol.135(1991)372-382)。
已經(jīng)建議通過常規(guī)免疫系統(tǒng)激活而實現(xiàn)的治療效果，將超抗原用于多種疾病的治療(Kalland等，WO 9104053；Terman等，WO9110680；Terman等，WO 9324136；Newell等，Proc.Matl.Acad.Sci.USA 88(1991)1074-1078)。
與疫苗相關(guān)，已建議使用突變過的從而排除它們TCR結(jié)合能力的超抗原(Kappler & Marrack，WO 9314634)。
先前已經(jīng)說明了超抗原的突變(Kappler & Marrack，WO9314634；Kappler等，J.Exp.Med.175(1992)387-396；Grossman等，J.Immunol.147(1991)3274-3281；Hufnagle等，Infect.Immun.59(1991)2126-2134)。
我們自己以前曾建議為了溶胞表達(dá)抗體定向結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，而將超抗原和抗體的綴合物用于治療(Dohlsten等，WO 9201470；Lando等，Cancer Immunol.Immunother.36(1993)223-228；Kalland等，Med.Oncol.Tumor Pharmacother.10(1993)37-47；Lando等，J.Immunol.150(8，第二部分)(1993)114A(Joint Meeting of theAmerican Association of Immunologists and Clinical ImmunologySociety，Denver，Colorado，USA，May21-25(1993))；Lando等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.Annu.Meet.33(0)(1992)339(Annual meeting of the American Associationfor Cancer Research，San Piego，California，USA，May20-23(1992))；Dohlster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)9287-9291)。建議接受治療的疾病是癌癥，病毒感染，寄生蟲寄生，自身免疫疾病和其它與表達(dá)疾病特異表面結(jié)構(gòu)細(xì)胞相關(guān)的疾病。至今進(jìn)行的實驗工作重點在于包含重組SEA和各種抗癌抗體的綴合物上。與未結(jié)合形式的超抗原相比，這種綴合物具有一定程度降低的結(jié)合MHC II類抗原的能力。沒有確定降低的MHC II類抗原結(jié)合能力對實現(xiàn)最佳溶胞和最佳治療效果是否是有利的。
Ochi等人先前已描述了用與腫瘤特異抗獨特型抗體化學(xué)綴合的SEB的免疫治療實驗(J.Immunol.151(1993)3180-3186)。
在優(yōu)先申請實行期間，瑞士專利局另外引用了Buelow等人的文獻(xiàn)(J.Immunol.148(1992)1-6)，其中描述了蛋白質(zhì)A和SEB片段的融合，但沒有強調(diào)MHC II類抗原結(jié)合，或者將這種融合產(chǎn)物用于細(xì)胞殺傷；和Hartwig等人的文獻(xiàn)(Int.Immunol.5(1993)869-875)，其中說明了突變影響超抗原鏈球菌紅斑(erthrogenic)毒素A的未融合形式的MHC II類抗原結(jié)合。發(fā)明目的本發(fā)明的第一個目的是在抗定向細(xì)胞毒性全身免疫刺激方面改善現(xiàn)有技術(shù)已知的超抗原-抗體綴合物。刺激產(chǎn)生活化的T-淋巴細(xì)胞，該刺激決定于超抗原與T細(xì)胞受體和MHC II類抗原兩者的結(jié)合能力。
本發(fā)明的第二目的是提供生物特異性親和配對物(例如抗體)和具有經(jīng)修飾的對MHC II類抗原的親和的超抗原之間的綴合物?，F(xiàn)已證明暴露抗原(抗綴合物的抗體/生物特異性親和配對物所定向的抗原)細(xì)胞的超抗原抗體依賴細(xì)胞溶胞(SADCC)的選擇性較之其它暴露MHC II類抗原的細(xì)胞得到提高。
本發(fā)明的第三個目的是提供綴合物，其可以用作患癌癥，自身免疫疾病，寄生蟲寄生，病毒感染或其它與在細(xì)胞表面表達(dá)特異于各種疾病的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞相關(guān)的疾病的哺乳動物的治療中的活性成份。發(fā)明說明本發(fā)明的主要方面是一種綴合物，包含a.定向于一結(jié)構(gòu)的生物特異性親和配對物，所述結(jié)構(gòu)是人們欲與綴合物結(jié)合的，b.一種肽，其i.自超抗原衍生，ii.具有結(jié)合T細(xì)胞受體Vβ鏈的能力，且iii.具有與該肽自其中衍生的超抗原相比經(jīng)修飾的結(jié)合MHC II類抗原的能力(野生型超抗原＝SA(wt))。
所述肽與所述親和配對物通過橋(B)互相共價連接。
優(yōu)選綴合物具有活化T-淋巴細(xì)胞的能力并指導(dǎo)T-淋巴細(xì)胞選擇地溶胞細(xì)胞，在這些其選擇溶胞的細(xì)胞表面上暴露有親和配對物定向的結(jié)構(gòu)。這意謂著在SADCC介導(dǎo)方法中(超抗原抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性)，該綴合物將引起細(xì)胞溶胞。參見下文中的實驗部分和我們先前關(guān)于超抗原和抗體之間綴合物的公開文獻(xiàn)(例如，Dohlsten等，WO9201470)。
本發(fā)明綴合物具有類似于現(xiàn)有技術(shù)中公開的超抗原-抗體綴合物的結(jié)構(gòu)(Dohlsten等，WO 9201470，本文中引作參考)，即本發(fā)明綴合物具有下面通式T-B-SA(m)其中T代表生物特異性親和配對物，SA(m)是經(jīng)修飾的超抗原(上文提到的肽)，且B是將T和SA(m)連接在一起的共價橋。
原則上T可以是任何通過生物特異性親和結(jié)合的結(jié)構(gòu)。最重要的情況下，T能結(jié)合細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，優(yōu)選如上文給出的疾病特異結(jié)構(gòu)。這種T定向結(jié)構(gòu)一般不同于(a)超抗原衍生肽(SA(m))結(jié)合的Vβ鏈表位和(b)未經(jīng)修飾的超抗原結(jié)合的MHC II類抗原表位。生物特異性親和配對物T可以主要從白細(xì)胞介素(例如白細(xì)胞介素-2)，激素，抗體和抗體的抗原結(jié)合片段，生長因子等中間選擇。參見例如參加會議“癌癥治療的分子研究”，Ashville，North Carolina，November7-11，1993，的Woodworth的文章，細(xì)胞因子毒素的臨床前及臨床進(jìn)展。與免疫球蛋白(例如蛋白質(zhì)A和G和L)的恒定區(qū)，凝集素，鏈霉親和素，生物素等結(jié)合的多肽在優(yōu)先權(quán)日被認(rèn)為有較小重要性。
在優(yōu)先權(quán)日，優(yōu)選T是抗體或抗體抗原結(jié)合片段(包括Fab，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)V，單鏈抗體等)，特別強調(diào)定向抗所謂C242的表位(Lindholm等，WO 9301303)或抗其它癌特異表位抗體的抗體活性片段(如Fab)。
在T是抗體的情況下，其主要是單克隆或一定數(shù)目的單克隆(例如2，3，4，5或更多)的混合物。在非治療用途情況下，T可以是多克隆抗體。
T不一定必須具有多肽結(jié)構(gòu)。
修飾的超抗原SA(m)主要是突變超抗原，但可能也可以是化學(xué)修飾超抗原，包括保持T細(xì)胞受體Vβ鏈結(jié)合能力的超抗原片段。
術(shù)語“突變的超抗原”指通過取代，插入或去除天然超抗原中的一個或幾個氨基酸而在基因組水平上修飾超抗原結(jié)合MHC II類抗原的天然能力。
在本發(fā)明化學(xué)綴合物中可以等同使用通過突變?nèi)コ麄€氨基酸序列的部分氨基酸而得到的超抗原片段和通過超抗原的酶解或化學(xué)分解而得到的片段。
經(jīng)修飾的超抗原SA(m)可以包括自不同超抗原衍生的并且可能已經(jīng)突變的一個或幾個氨基酸序列，例如下文將提到的優(yōu)選超抗原的結(jié)合物。
如此得到的修飾的超抗原SA(m)與天然超抗原相比具有降低的免疫原性和毒性。
能與T細(xì)胞受體Vβ-鏈交叉反應(yīng)的其它基團/物質(zhì)可能也可以與上文給出的突變超抗原(SA(m))等同使用。這樣的基團/物質(zhì)可以是非多肽結(jié)構(gòu)。
在優(yōu)先權(quán)年未，本發(fā)明最令人感興趣的產(chǎn)物候選者包括突變形式的具有多MHC II類抗原結(jié)合位點和/或與Zn2+配位能力的超抗原，例如SEA，SED，SEE和SEH。
T以及SA(m)可以通過重組技術(shù)制備。
橋B可以選擇現(xiàn)有技術(shù)公開的(Pohlsten等，WO 9201470)，即優(yōu)選是親水性的并具有一個或幾個選自酰胺，硫醚，醚，二硫化物等的結(jié)構(gòu)。在橋具有未取代未斷裂烴鏈的情況下，優(yōu)選不具有芳香環(huán)如苯基。最重要的橋是以重組技術(shù)獲得的橋，即綴合作用以基因組水平發(fā)生。在這種情況下，寡肽橋包含親水性氨基酸殘基，優(yōu)選如Gln，Ser，Gly，Glu，和Arg。也包括Pro和His。在優(yōu)先權(quán)年期間已決定出優(yōu)選的橋是包括三個氨基酸殘基的肽(GlyGlyPro)。
本發(fā)明綴合物中每個生物特異性親和配對物可以包括一個或幾個修飾的超抗原，反之亦然。這意謂著上式中的T除生物特異配對物之外可以包含一個或幾個修飾的超抗原。類似地，SA(m)可以包含一個或幾個生物特異性親和配對物T。親和配對物T和SA(m)也可以包括其它結(jié)構(gòu)。每個親和配對物的修飾的超抗原數(shù)優(yōu)選是一個或兩個。
合成本發(fā)明新的綴合物主要根據(jù)兩條主要途徑進(jìn)行1.通過重組技術(shù)，2.T對SA(m)的化學(xué)連接。這些方法對本領(lǐng)域普通熟練技術(shù)人員來說是非常熟悉的并包括很多變化?？梢姳景l(fā)明主要涉及人工綴合物，即自然界中未發(fā)現(xiàn)的綴合物。
修飾的超抗原與生物特異性親和配對物T的化學(xué)物連接經(jīng)常使用存在于每個化合物中許多位置上的功能基團(例如伯氨基或羧基)。因此終產(chǎn)物會含有綴合物分子的混合物，這些綴合物分子就發(fā)生連接的位置來說是不同的。
對于重組綴合物(融合蛋白)，就連接位置來說，所得綴合物質(zhì)將是均一的。經(jīng)修飾的超抗原的氨基末端與生物特異性親和配對物的羧基末端連接，或者反過來生物特異性親和配對物的氨基末端與修飾超抗原的羧基末端連接均有此結(jié)果。對于抗體，如完整抗體和抗原結(jié)合片段(Fab，F(xiàn)v等)，無論輕鏈或者重鏈可以用于這種融合?，F(xiàn)在優(yōu)選重組綴合物，優(yōu)選Fab片段以及經(jīng)修飾的超抗原氨基酸末端與抗體重鏈(CH1)的第一恒定區(qū)連接，不排除也可以給出很好結(jié)果的與輕鏈或與VH和有兩種不同的在大腸桿菌中獲得大量超抗原(包括修飾和融合形式)的方法細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)或分泌。對于本發(fā)明綴合物優(yōu)選后一方法，因為它提供了正確折疊蛋白質(zhì)從外周胞質(zhì)和從培養(yǎng)基中純化的純化作用。細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)導(dǎo)致復(fù)雜的純化過程，且經(jīng)常需要蛋白質(zhì)體外再折疊(為使蛋白質(zhì)獲得正確的三級結(jié)構(gòu))。上文不排除也可以在其它宿主細(xì)胞中生產(chǎn)活性綴合物，例如真核細(xì)胞，如酵母或哺乳動物細(xì)胞。
突變超抗原的制備和具有經(jīng)修飾的結(jié)合(親和)MHC II類抗原能力的突變體的選擇也可以根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行(參見，例如，Kappler等，J.Exp.Med.165(1992)387-396)。也可以參見我們的實驗部分。
綴合物結(jié)合T細(xì)胞受體Vβ鏈，結(jié)合靶結(jié)構(gòu)的能力，以及引起靶細(xì)胞溶胞的能力決定于i.a.自超抗原衍生的肽(SA(m))，生物特異性親和配對物(T)和橋(B)的結(jié)構(gòu)和長度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過研究構(gòu)效關(guān)系并借助于已公開的與現(xiàn)有技術(shù)已知超抗原抗體綴合物的那些模型(參見上文指出的公開文獻(xiàn))，能夠在結(jié)合能力和引起胞溶能力方面優(yōu)化本發(fā)明綴合物。也可以見下文的實驗部分。
經(jīng)修飾的結(jié)合MHC II類抗原能力指比值IC50(SA(wt))IC50(SA(m))＜0.9(90％)，如＜0.5(＜50％)和也可能＜0.01(＜1％)?；蛘吡硪粋€方法，本發(fā)明綴合物經(jīng)修飾的結(jié)合能力可以以相關(guān)常數(shù)比，Kd(SA(wt))Kd(SA(m))來測定，Kd以nM測定，且具有與比值IC50(SA(wt))IC50(SA(m))相同的限制條件。IC50(SA(wt))，IC50(SA(m))，Kd(SA(mt))和Kd(SA(m))的測定見下文實驗部分。
現(xiàn)有技術(shù)已知一些超抗原可以有兩個或多個結(jié)合MHC II類抗原的位點(Fraser等，InSuperantigensA Pathogens view on theimmune system.Eds.Huber & Palmer，Current Communicationsin Cell Molecular Biology7(1993)7-29)。對于這種類型超抗原，應(yīng)該至少在一個結(jié)合位點修飾結(jié)合能力，例如減小上文提到的大小。用超抗原修飾可能足以產(chǎn)生兩個MHC II類抗原結(jié)合位點親和的變化差異，嘗試地＞10％且優(yōu)選通過在至少一個位點減小親和而產(chǎn)生這種變化差異。
超抗原以不同親和結(jié)合不同亞基的TCR Vβ鏈。在本發(fā)明融合蛋白/綴合物中，所用的超抗原可以是被修飾的，從而使一個或幾個亞基具有改變的亞基特異性或改變的親和。有充分理由相信TCR Vβ親和和通過TCR的刺激作用之間存在拋物線型關(guān)系，即中等程度的親和將給出最大刺激作用。因此，一旦包括修飾超抗原的融合蛋白質(zhì)/綴合物能明顯刺激基本上呈遞所有人Vβ亞基分布的靜息T細(xì)胞群而使其增殖時，就已取得修飾超抗原對TCR Vβ的合適的親和。所述T細(xì)胞群可以是從隨機選擇人個體中集中的T細(xì)胞?！懊黠@”是指刺激作用可以測出。實驗部分表II(右欄)的結(jié)果表明引起本發(fā)明綴合物/融合蛋白SADCC的能力經(jīng)?；旧鲜桥c包括野生型超抗原融合物相同。本發(fā)明綴合物/融合蛋白的主要用途本發(fā)明綴合物主要為了治療和正常超抗原和抗體之間綴合物治療的疾病一樣的疾病。參見上文提到的公開文獻(xiàn)。因此本發(fā)明綴合物可以作為主要治療或者作為與外科或其它藥物相關(guān)的輔助治療給藥。
本發(fā)明藥物組合物包括本領(lǐng)域已知的、但現(xiàn)在包含本發(fā)明新綴合物的制劑。因此組合物可以是凍干的顆粒材料，無菌或消毒制備的溶液，片劑，安瓿等形式。載體可以存在，如水(優(yōu)選用例如PBS緩沖至生理pH值)或其它惰性固體或液體材料。常規(guī)情況下通過使綴合物混合、溶于、結(jié)合到，或者與一和或幾種水溶性或水不溶性含水或無水載體化合來制備組合物，如果需要，可以一同加入合適的添加劑和佐劑。載體和條件不反作用地影響綴合物活性是絕對必要的。象水這樣的包括在表達(dá)的載體中。
本發(fā)明綴合物一般以配制前劑量出售或給藥，每劑含有有效量綴合物，以現(xiàn)在的結(jié)果為基礎(chǔ)，相信在10μg-50mg范圍內(nèi)。準(zhǔn)確劑量具體情況各不相同，取決于患者的體重和年齡，給藥途徑，疾病類型，抗體，超抗原，鍵聯(lián)形式(-B-)等。
給藥途徑是本領(lǐng)域一般已知的那些途徑，即靶細(xì)胞溶胞有效量或治療有效量的本發(fā)明綴合物與靶細(xì)胞接觸。上文具體指明的大部分是指腸胃外給藥，如給哺乳動物如人注射或輸液(皮下，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，肌內(nèi))。本發(fā)明綴合物可以局部或全身給藥。
“靶細(xì)胞溶胞有效量”是指有效激活和定向并使T-淋巴細(xì)胞破壞靶細(xì)胞的量。
優(yōu)先權(quán)年末已決定包括未修飾超抗原的綴合物/融合蛋白優(yōu)選給藥途徑是每天3小時靜脈內(nèi)輸注，并結(jié)合使用退燒藥(撲熱息痛)。在4天間重復(fù)給藥，在患者體內(nèi)產(chǎn)生抗融合蛋白/綴合物的第二抗體之前停止給藥。這種劑量方案可能也適用于本發(fā)明綴合物/融合蛋白。應(yīng)用的其它領(lǐng)域本發(fā)明綴合物也可以用在定性或定量測定尋找靶物基團(T)定向的結(jié)構(gòu)。這些方法一般是本領(lǐng)域人員公知的。因此修飾的超抗原可以用作免疫測定包括免疫組織化學(xué)中的標(biāo)記基團，意謂著該標(biāo)記基團接著被例如一種抗體檢測，該抗體定向于肽(SA(m))，并用酶，同位素，熒光團或一些現(xiàn)有技術(shù)已知的其它標(biāo)記基團標(biāo)記。另一種免疫測定方法是在細(xì)胞群中測定在細(xì)胞表面表達(dá)能結(jié)合尋找靶物基團(T)的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。這種用途是指在SADCC測定中來自細(xì)胞群的樣品與T-淋巴細(xì)胞與本發(fā)明綴合物一起在溫孵。如果溫孵產(chǎn)生細(xì)胞溶胞表明細(xì)胞群包含在細(xì)胞表面表達(dá)所述結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。
實驗部分生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)抗體主要用單克隆抗體C215作為模型物質(zhì)進(jìn)行與本發(fā)明相關(guān)的實驗工作。該抗體定向抗GA-733家族(參見例如EP 376 746)參見其中引用的參考文獻(xiàn)和Larsson等，Int.J.Canc.32(1988)877-82)。已斷明C215表位對人癌癥治療沒有足夠的特異性。在優(yōu)先權(quán)日從用野生型SEA的融合產(chǎn)物的實驗判斷，相信mab C242(Lindholm等，WO 9301303)是一個較好的候選者。細(xì)菌菌株和質(zhì)粒大腸桿菌菌株UL 635(xyl-7，ara-14，T4R，ΔompT)和HB 101(Boyer and Roulland-Dessoix，J.Mol.Biol.41(1969)459-472)被分別用于表達(dá)和克隆。載體pKP889被用來表達(dá)Fab-SEA融合蛋白(自鼠抗體C215衍生)，載體pKP943和pKP1055用來分泌SEA(

圖1)。Fab-SEA表達(dá)載體pKP889與pKP865相同(Dohlsten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)，印刷中)，只不過CH1和SEA之間的間隔區(qū)是GlyGlyAlaAlaHisTyrGly。pKP943的表達(dá)產(chǎn)生具有天然氨基末端的SEA。使用pKP1055產(chǎn)生在氨基末端加一個Gly殘基的SEA。在兩個載體中，來自葡萄球菌蛋白A(Uhlén等，J.Biol.Chem.259(1984)1695-1702)的信號用于轉(zhuǎn)錄和翻譯，一種合成信號肽用于分泌(L.Abrahmsén，未發(fā)表)。體外誘變在Perkin Elmer Thermocycler上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)來進(jìn)行突變。反應(yīng)混合物(100μl)含有購自Perkin Elmer Cetus的1×PCR緩沖液(10mM Tris/HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.001％(w/v)明膠)，另外的2mM MgCl2，0.4mM dNTPs(Perkin ElmerCetus)，2.5單位Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，USA)和100ng DNA模板。加入引物，使其終濃度為0.8μm。原來的模板是包含與Betley等(J.Bacteriol.170(1988)34-41)公開的相同的金黃色葡萄球菌腸毒素A基因的質(zhì)粒，只不過所述基因的第一個密碼子(編碼Ser)變成TCC以在該基因的5’終端提供一個Bam HI位點。然后使用包含通過沉默突變引入的更多單一限制性酶切位點的衍生物。用一套引物進(jìn)行緊接著限制性酶切位點的突變引入。其中一個引物跨越突變和限制性酶切位點。對于大多數(shù)突變得用兩套引物，在兩個連續(xù)步驟中進(jìn)行PCR。新的限制性酶切位點與每個突變一起引入以使易于鑒別。在Gene Assembler(Pharmacia Biotech AB，Sweden)上合成用作引物的寡核苷酸。為證實每一突變，在Applied Biosystem DNA-序列測定儀上使用其Taq DyeDeoxy Termination Cycle Sequencing藥盒測定核苷酸序列的相關(guān)部分。蛋白質(zhì)制備和分析進(jìn)行不同基因構(gòu)建物的大腸桿菌細(xì)胞在室溫(Fab-SEA載體)和在24-34℃(分泌載體，最佳溫度取決于突變)下生長過夜。肉湯是補加有卡那霉素(50mg/l)的2×YT(16g/l細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨，10g/l細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物，5g/l NaCl)。通過加入異丙基-β-D-硫半乳糖苷達(dá)終濃度為100μM來誘導(dǎo)融合蛋白。(用于非融合SEA表達(dá)中的蛋白質(zhì)A啟動子是組成型的)。以5000×g離心使細(xì)胞成片狀沉淀物，通過一小時振蕩期間在冰上使事先冷凍的細(xì)胞片狀物在10mMTris-HCl(pH7.5)中小心融化而釋放外周胞質(zhì)內(nèi)含物。以9500×g離心15分鐘澄清外周質(zhì)提取物。不用進(jìn)一步純化而使用Fab-SEA蛋白質(zhì)。通過在抗SEA抗體柱上的親和層析進(jìn)一步純化SEA和Gly-SEA。自用SEA預(yù)免疫的兔身上事先采集多克隆兔抗-SEA抗體，并在蛋白質(zhì)G Sepharose(Pharmacia Biotech)上親和層析進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)分析在預(yù)制的聚丙烯酰胺SDS Tris-Glycine Novex凝膠(4-20％梯度或均勻12％，Novex新實驗技術(shù))上分離蛋白質(zhì)，用考馬斯藍(lán)染色或者用于Western印跡法。在Western印跡法分析中用多克隆兔抗SEA抗體(上文)檢測SEA，接著用豬抗兔Ig抗體，和兔抗辣根過氧化物酶抗體和過氧化物酶。對于Fab-SEA融合蛋白也使用了過氧化物酶綴合的識別k鏈的鼠抗體(AAC 08P，Serotech LTD，England)。3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(Sigma)用于過氧化物酶顯色。
在室溫(22-25℃)，在含有0.02mM ZnSO4和0.005％(v/v)Tween20的10mM磷酸鹽緩沖液(pH8.2)中，在J-720分光偏振計中(JASCO，Japan)得到圓二色(CD)譜。掃描速度是10nm/min，且每個譜是五次連續(xù)掃描的平均結(jié)果。池徑長度是1mm，蛋白質(zhì)濃度為0.2至0.5mg/ml。平衡時鹽酸胍(Gdn-HCl)變性在23℃通過222nm處的CD而測定，其中蛋白質(zhì)濃度為0.3mg/ml，池徑長度是1mm。這些數(shù)據(jù)用來計算未折疊蛋白質(zhì)的表觀組分(Fapp)。將這個數(shù)據(jù)套入兩位點折疊方法(Hurle等，Biochemistry 29(1990)4410-4419)得到未折疊平衡參數(shù)。體外結(jié)合和功能測定原料試劑使用自英國Gibco，Middlesex購得的RPMI1640培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基pH7.4，并含有2mM L-谷氨酰胺(Gibco，Middlesex，英國)，0.01M HEPES(Biological Industnes，以色列)，1mM NaHCO3(Biochrom AG，德國)，0.1mg/ml硫酸慶大霉素(BiologicalIndustries，以色列)，1mM丙酮酸鈉(JRH Biosciences Industries，USA)，0.05mM巰基乙醇(Sigma Co.，USA)，100倍濃的非基本氨基酸(Flow Laboratories，蘇格蘭)，并補充有10％胎牛血清(Gibco，Middesex，英國)。如上所述獲得重組SEA(wt)，SEA(m)和融合產(chǎn)物C215Fab-SEA(wt)和C215Fab-SEA(m)。自美國Cetus公司購得人重組IL-2。自美國Sigma公司購得絲裂霉素C。自德國Merek公司購得Na251CrO4。自英國Imperial公司購得不含鎂和鈣的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。細(xì)胞自美國典型細(xì)胞培養(yǎng)物中心(American Type Cell CultureCollection)(Rockville，MD，USA)得到人結(jié)腸癌細(xì)胞系Colo 205和B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji(表達(dá)HLA-DR3/W10，-DP7，-DQ w1/w2)。EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞樣B細(xì)胞系BSM是自Van DeGriend博士，Dept of Immunology，Dr Daniel den HoedCancer Center，Leiden，荷蘭，得到的慷慨贈送的禮物。細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行用Gen-Probe Mycoplasma T.C.試驗，Gen-Probe Inc.SanDiego，USA的支原體污染試驗。
SEA激活的細(xì)胞系是通過激活外周血中單核細(xì)胞而制備的。自University Hospitol of Lund的血液供者身上得到血沉棕黃層血樣。在2×106個細(xì)胞/ml濃度時用含10％FCS培養(yǎng)基中絲裂霉素C處理的SEA包被BSM細(xì)胞(與100ng/ml SEA預(yù)溫)刺激PBMs。T細(xì)胞系用20U/ml人重組IL-2兩星期再刺激一次并用絲裂霉素C處理的SEA包被BSM細(xì)胞一星期刺激一次。用在測定之前將細(xì)胞系培養(yǎng)4-12星期。
按照臺盼藍(lán)排斥測定的，效應(yīng)細(xì)胞的生存力超過50％。測定野生型和突變體SEA的MHC II類抗原結(jié)合特性放射性碘化方法。使用乳過氧化物酶技術(shù)的酶珠(NEN，Boston，MA)用10至25mCi Na125I標(biāo)記合適量的野生型或突變體SEA。用疊氮化鈉猝滅以終止反應(yīng)，并且通過PD-10柱(Pharmacia BiotechAB，瑞典)，用R10培養(yǎng)基作為洗脫緩沖液，從游離碘中分離蛋白質(zhì)結(jié)合放射活性。選擇條件，使I-125和蛋白質(zhì)之間的計量比≤2∶1。通過在TSK SW 3000 HPLC柱上進(jìn)行大小排阻層析來校準(zhǔn)放射化學(xué)純度。只對野生型SEA檢測放射碘化學(xué)對結(jié)合活性的作用，發(fā)現(xiàn)沒有影響(數(shù)據(jù)未給出)。
定向結(jié)合測定。預(yù)先在R10培養(yǎng)基中培養(yǎng)的6×104/100μl Raji細(xì)胞一式三份被加入到圓錐形聚丙烯試管中，100μl/試管連續(xù)稀釋的125I-標(biāo)記野生型或突變體SEA。細(xì)胞用2ml 1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的10mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH7.4，沖洗，以300×g離心5分鐘，并抽吸。這一過程重復(fù)兩次。最后，在γ計數(shù)器(PackardInstruments Co，Downers Grove，IL，USA)中分析細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合放射活性?？鄢翘禺惤Y(jié)合后(即只是與R10培養(yǎng)基保溫后的結(jié)合)，根據(jù)Scatchard(Ann.N.Y.Acad.Sci.51(1949)660-72)計算飽和時的表觀相關(guān)常數(shù)，Kd，結(jié)合位點數(shù)，N。
抑制測定(突變體SEAs對125I-標(biāo)記野生型SEA結(jié)合的抑制)。這些抑制實驗按照定向結(jié)合測定說明的那樣進(jìn)行，稍加改進(jìn)。簡言之，使50μl125I-標(biāo)記的野生型SEA與過量未標(biāo)記野生型或突變體SEA(50μl/試管)競爭結(jié)合6×104/100μl Raji細(xì)胞。定向測定中使用≈40％結(jié)合放射活性的示蹤物濃度產(chǎn)生，獲得抑制測定中的最大靈敏度。競爭者替代能力以達(dá)到結(jié)合放射活性的50％抑制的濃度(IC50)來表示。用下式計算突變體相對于野生型SEA的結(jié)合親和IC50(SEA(wt))∶IC50(SEA(m))為了分析突變體是否象野生型SEA一樣競爭結(jié)合Raji細(xì)胞上相同的位點，用SEA突變體獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)以對數(shù)-分對數(shù)函數(shù)作圖，并用野生型SEA相應(yīng)數(shù)據(jù)做平行試驗。
抑制測定(未標(biāo)記野生型SEA和SEA突變體對熒光標(biāo)記野生型SEA結(jié)合的抑制)。Raji細(xì)胞(2.5×105)與抑制劑在37℃保溫30分鐘，所述抑制劑(野生型或突變體SEA；0-6000 0nM)在50μl CO2-獨立的補充有10％FCS，谷氨酰胺和慶大霉素的培養(yǎng)基(Gibco)中稀釋。加入熒光素綴合的野生型SEA，達(dá)到30nM終濃度，樣品在37℃溫育另外半小時。樣品用補充有1％BSA的冰冷凍PBS(PBS-BSA)沖洗三次，最后在冰上在0.4ml PBS-BSA中保存直到其被用于分析。在FACStar(Becton Dickinson)流式細(xì)胞儀上自每一樣品中用10000個活細(xì)胞分析綠色熒光并用LYSIS II程序計算平均熒光值。SEA(wt)，SEA(m)和它們與C215Fab融合蛋白的SDCC和SADCC測定。
SDCC測定。用體外激發(fā)SEA特異T細(xì)胞系作為效應(yīng)物細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)4小時51Cr3+釋放測定中分析SEA(wt)，SEA(m)和它們與C215Fab的融合蛋白抗MHC II+類Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性。簡言之，在存在或不存在(對照)添加劑情況下，以確定的效應(yīng)子對靶細(xì)胞比例，在微量滴定井中以每0.2ml培養(yǎng)基(RPMI，10％FCS)2.5×103個細(xì)胞培養(yǎng)51Cr標(biāo)記Raji細(xì)胞。以100×([cpm實驗釋放-cpm背景釋放]/[cpm總釋放-cpm背景釋放])計算特異性細(xì)胞毒性百分率。對于未融合蛋白，效應(yīng)子與靶細(xì)胞比是30∶1，對于融合蛋白，該比例是40∶1。
抗人結(jié)腸癌細(xì)胞SADCC。使用體外激發(fā)SEA特異T細(xì)胞系作為效應(yīng)子細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)4小時51Cr3+釋放測定中分析C215Fab-SEA(wt)，C215Fab-SEA(m)，SEA(wt)和SEA突變體抗C215+MHC II-類結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的細(xì)胞毒性。主要地，在有或沒有(對照)添加劑情況下以效應(yīng)子對靶細(xì)胞之間30∶1的比例在微量滴定井中以每0.2ml培養(yǎng)基(RPMI，10％FCS)2.5×103個細(xì)胞培養(yǎng)51Cr3+標(biāo)記的SW620細(xì)胞。象SDCC測定一樣計算特異性細(xì)胞毒性百分率。體內(nèi)功能實驗?zāi)[瘤細(xì)胞。cDNA編碼人腫瘤相關(guān)抗原C215(B16-C215)(Dohlsten等，Monoclonal antibody-superantigen fusion proteinsTumor specific agents for T cell based tumor therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，In press，1994)轉(zhuǎn)染的B16-F10黑素瘤細(xì)胞象貼壁細(xì)胞一樣生長至幾至鋪滿。培養(yǎng)基由補加有5×10-5β-巰基乙醇(Sigma，St Louis，MO，USA)的RPMI 1640(GIBCO，Middlesex，UK)，2mM L-谷氨酰胺(GIBCO)，0.01M Hepes(Biological Industries，以色列)和10％胎牛血清(GIBCO)組成。細(xì)胞通過在0.02％EDTA中短暫培養(yǎng)而解吸，并懸浮于冰冷卻1％同系鼠血清(載體)的磷酸鹽緩沖鹽水中，濃度為4×105個細(xì)胞/ml。
動物和動物治療。進(jìn)行了T細(xì)胞受體Vβ3鏈轉(zhuǎn)基因的12-19周大的C57B1/6鼠(Dohlsten等，Immunology 79(1993)520-527)。尾靜脈靜脈內(nèi)注入0.2ml載體中十萬個B16-C215腫瘤細(xì)胞。在第1，2和3天，以圖5a和5b中指明的劑量給小鼠靜脈內(nèi)注射0.2ml載體中的C215Fab-SEA(wt)或C215Fab-SEA(D227A)。根據(jù)相同的程序，對照鼠只注射載體。腫瘤細(xì)胞注射后第21天，頸脫位殺死小鼠，取出肺，置于Bouin’s溶液中，并計數(shù)肺轉(zhuǎn)移數(shù)。結(jié)果葡萄球菌腸毒素A的“丙氨酸掃描”。
最初不知道SEA的結(jié)構(gòu)，只能推斷什么支鏈?zhǔn)潜砻婵山咏摹Ｒ虼舜蟛糠滞蛔凅w從同源超抗原排列中選擇(Marrack和Kappler，Science248(1990)705-711)。保守的(主要是極性的)殘基按照下面推理選擇，即保留形式中這些超抗原中的一些超抗原期望與HLA-DR結(jié)合(Chitagumpala等，J.Immunol.147(1991)3876-3881)。根據(jù)公開文獻(xiàn)(Cunnningham和Wells，Science244(1988)1081-1085)使用丙氨酸取代。在這一工作過程中可得到的情報是i)已證明Zn2+離子對于SEA和MHC II類抗原(HLA-DR)之間的相互作用是重要的(Fraser等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA89(1991)5507-5511)，ii)已公開葡萄球菌腸毒素B(SEB)的突變分析(Kappler等，J.Exp.Med.175(1992)387-396)，和iii)公開了SEB結(jié)構(gòu)(Swaminathan等，Nature 359(1992)801-806)。
發(fā)現(xiàn)具有嚴(yán)重降低的HLA-DR，D227A親和的第一種突變體與Zn2+離子配位非常差(沒給出數(shù)據(jù))。假設(shè)SEA和SEB是一般折疊，新的數(shù)據(jù)表明有兩個MHC II類抗原結(jié)合區(qū)；一個包含Zn2+離子，而一個相當(dāng)于SEB中確定的位點。在這一假設(shè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次突變。這第二批突變體以在氨基末端攜帶一個甘氨酸的SEA形式中表達(dá)。首先該延伸表明對野生型SEA的結(jié)合性質(zhì)無影響(下一節(jié))。
從單克隆抗體結(jié)合分析(表I)判斷，在一個功能形式中，多數(shù)突變體被大腸桿菌表達(dá)和分泌。得到非常低數(shù)量的突變體E154A/D156A和R160A。自然從本研究中排除這些突變體。在殘基128，187，225或227有Ala取代的突變體不被單克隆抗體1E識別。后兩個突變體顯現(xiàn)降低水平的表達(dá)(在34℃比在24℃更明顯)，且在變性但不還原的條件下，在SDS-PAGE中遷移較快(所有其它突變體象野生型SEA一樣遷移，數(shù)據(jù)未給出)。從CD譜分析判斷，D227A的結(jié)構(gòu)與天然SEA稍有不同(圖2)，但其穩(wěn)定性非常接近野生型SEA(如對鹽酸胍變性的抗性所測定的)。突變體和天然SEA(SEA(wt))之間計算的ΔΔG值是0.16kcal/mol，并且只是大約ΔG°值的4％(數(shù)據(jù)未給出)。CD分析中所有信號都低，可能是β-折疊片結(jié)構(gòu)。最近報導(dǎo)了His225配位Zn2+(未公開數(shù)據(jù)，F(xiàn)raser等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1991)5507-5511))。因為ASP227包括在Zn2+配位作用中(上文)并可假定和His225位于相同的β-折疊片中，這表明這兩個殘基參與構(gòu)成鋅配位蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的鋅結(jié)合核(Vallee和Auld，Biochemistry29(1990)5647-5659)。與MHC II類抗原和T細(xì)胞受體結(jié)合從與熒光標(biāo)記野生型SEA競爭暴露大量MHC II類抗原的Raji細(xì)胞所需要的量計算MHC II類抗原親和。通過比較結(jié)合熒光達(dá)到50％抑制的濃度(IC50)和作為競爭劑的野生型SEA所需的濃度來計算突變體替代能力。對于野生型SEA和一些突變體，將這一分析結(jié)果與其中以125I標(biāo)記野生型SEA被用作示蹤劑的分析的結(jié)果相比較。從表II可以看出從這兩個抑制分析得到的數(shù)值很好地相互關(guān)聯(lián)。
對于六種選擇的突變體，直接用125I標(biāo)記突變體SEA測定與MHC II類抗原的結(jié)合(表II)。對于突變體H50A，從定向結(jié)合測定和抑制測定得到的值很好地相互關(guān)聯(lián)，但對于突變體F47A，發(fā)現(xiàn)很大差異定向結(jié)合表明只有比野生型SEA弱7倍的結(jié)合，但兩者競爭分析證明70倍左右減少的結(jié)合。另外兩種突變體的數(shù)據(jù)表明兩種不同的相互作用。對于突變體H225A和D227A，也是在這種分析中，親和低于檢測限。
先前我們已證明由癌活性抗體Fab片段和SEA組成的融合蛋白被用來使細(xì)胞毒性T細(xì)胞定向特異性溶胞癌細(xì)胞，而SEA和T細(xì)胞受體(TCR)之間的相互作用太弱，其自身不能檢測到(Dohlsten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，印刷中)。因此，與涉及分離超抗原的分析相反，用Fab融合前后序列進(jìn)行SEA和TCR之間相互作用的功能測定，結(jié)果不受MHC II類抗原結(jié)合支配。所以，在鉻釋放測定中監(jiān)測不同綴合物使T細(xì)胞溶胞被Fab部分識別的細(xì)胞的效率。該分析證明影向MHCII類抗原結(jié)合的突變不影響TCR結(jié)合(表II)。突變的生物學(xué)效應(yīng)以刺激外周淋巴細(xì)胞分裂的能力測量增殖效應(yīng)。與MHC II類抗原競爭非常不強的所有三種突變體誘導(dǎo)極少或不誘導(dǎo)增殖，中間突變體H187A具有某些增殖能力，而其它被研究的突變體不能從野生型中明顯區(qū)別開來(表III)。Harris等人(Infect.Immun.61(1993)3175-3183)最近報導(dǎo)了SEA突變體F47G和L48G具有相似的T細(xì)胞刺激活性的嚴(yán)重減少。很明顯任何兩個建議的結(jié)合區(qū)強的降低作用會產(chǎn)生對誘導(dǎo)增殖的能力的嚴(yán)重影響。這表明SEA交聯(lián)兩個引起TCR二聚化作用的MHC II類抗原分子，這需要產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
相反，不同突變體體外指導(dǎo)受激SEA T細(xì)胞溶胞具有靶細(xì)胞的MHCII類抗原的效率與結(jié)合能力相互關(guān)聯(lián)，而不是與競爭能力相互關(guān)聯(lián)(表III)。例如，F(xiàn)47A和D227A的效率只分別降低2.5倍和300倍。因此，顯而易見，對于二價也沒有一成不變的要求?；罨疶細(xì)胞表面明顯較大數(shù)目的TCRs導(dǎo)致多價態(tài)的價態(tài)增高可能部分屏蔽SEA/MHC II類抗原相互作用中較低親合力的效應(yīng)。先前通過使用包含一個抗-CD3部分和一個抗癌部分的癌特異性雙功能抗體已證明不需要二聚化作用來控制T細(xì)胞細(xì)胞毒性(Renner等，Science264(1994)833-35)。體內(nèi)功能性實驗結(jié)果見圖6a和6b。用C215Fab-SEA(wt)和C215Fab-SEA(D227A)對鼠進(jìn)行治療，兩者在減少B16-C215黑素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移數(shù)方面都是高度有效的。標(biāo)靶的超抗原的兩種變體治療效果基本上是相同的。以5μg/注射劑量用C215Fab-SEA(wt)治療導(dǎo)致70％的致死率。相反，用同劑量的C215Fab-SEA(D227A)治療時，沒有鼠死亡?？傊琒EA(D227A)是具有降低的毒性并且當(dāng)參入Fab-SEA融合蛋白質(zhì)時保持治療效果的突變體的一個例子。討論最近已報導(dǎo)了SEB和HLA-DR之間復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Jardetzky等，Nature368(1994)711-718)。鑒定包括在這一相互作用之中的大多數(shù)SEB殘基也保守于SEA中。我們關(guān)于突變體D277A的數(shù)據(jù)表明SEA的這一位點(氨基近側(cè)位點)和MHC II類抗原之間相互作用的弱親和，Kd值比8μM高。最近報導(dǎo)SEB和HLA-DR之間相互作用的Kd是1.7μM(Seth等，Nature369(1994)324-27)。研究SEB，TCR和HLA-DR之間不同的相互作用，表明不存在TCR時SEB和HLA-DR之間的復(fù)合物不能穩(wěn)定存在。細(xì)胞質(zhì)基因組共振實驗表明這是因為非?？斓牟徽顟B(tài)(off-rate)。如果SEA交聯(lián)兩個MHC II類抗原分子，接著進(jìn)行TCR的二聚化作用獲得的親合力效應(yīng)可以解釋SEA怎么可以在遠(yuǎn)低于Kd的濃度下誘導(dǎo)增殖效應(yīng)。假設(shè)突變F47A降低氨基近側(cè)位點的親和低于顯著性，Zn2+位點的Kd是大約95nM。這一假設(shè)最近被一個發(fā)現(xiàn)增加了其可信性，即突變體F47R，F(xiàn)47R/H50A和F47R/L48A/H50D表明和F47A具有相同的MHC II類抗原親和(未公開)。
以SEB結(jié)構(gòu)(Kappler等，J.Exp.Med.175(1992)387-396)和同源性序列排列(Marrack和Kappler，Science 248(1990)705-711)為基礎(chǔ)，肯定表明His225和Asp227位于相同的β-平面上，因此支鏈可能是鄰側(cè)的。因此，很可能這兩個殘基構(gòu)成鋅配位蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的鋅結(jié)合核(Vallee和Auld，Biochemistry29(1990)5647-5659)。與這些突變體相似，在殘基128或187處取代的突變體也被除1E之外的所有單克隆識別。Fraser等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1991)5507-5511)證明Zn2+結(jié)合SEA，并且是與MHCII類抗原高親和相互作用所需要的。對于鋅的親和不受加入HLA-DR的影響。以該發(fā)現(xiàn)和對Zn2+的高親和為基礎(chǔ)(Kd大約為1μM)，SEA排他性地提供了配位作用，并建議包括四重折疊配位。我們的數(shù)據(jù)表明，包括四個殘基N128，H187，H225和D227。前兩個殘基的功能還不清楚；代替提供配體，N128可以幫助D227的去質(zhì)子化作用。關(guān)于這點的理由是取代D227的效應(yīng)比取代H225的效應(yīng)更嚴(yán)重。
先前已報導(dǎo)MHC II類不同超抗原親和和刺激T細(xì)胞增殖的能力之間無相關(guān)關(guān)系(Chintagumpala等，J.Immunol.147(1991)3876-3881)。超抗原對不同TCR Vβ-鏈的不同親和可能會部分地解釋這些結(jié)果。這里我們發(fā)現(xiàn)相同缺少的相關(guān)關(guān)系，但與各超抗原相反，突變體具有如Fab-SEA前后序列所示相同的TCR親和(如SADCC所測定的)。缺少相關(guān)關(guān)系最可能的解釋是在該項分析中鑒別的兩個結(jié)合區(qū)代表兩個不同的結(jié)合位點不僅得到共同有效結(jié)合，并且也導(dǎo)致MHC II類抗原的兩個分子的交聯(lián)，接著產(chǎn)生T細(xì)胞受體的兩個分子二聚化作用。這將表明兩個位點的親和對獲得增殖效應(yīng)是重要的。高親合力產(chǎn)生于包括兩分子的SEA，TCR和MHC II類抗原的六聚復(fù)合物內(nèi)的相互作用。因此盡管有低的定向親和，SEA對MHC II類抗原的強親和/親合力使SEA與TCR相互作用。其它生物特異性親和配對物用重組技術(shù)制備出SEA(D227A)和葡萄球菌蛋白質(zhì)A IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，并在大腸桿菌中表達(dá)。這一試劑已成功地用來使T-淋巴細(xì)胞靶向于CD7和CD38陽性而HLA-DP，-DQ和-DR陰性的Mot4和CCRF-CEM細(xì)胞(自ATCC獲得)。Mot4和CCRF-CEM細(xì)胞與抗-CD7或抗CD38鼠單克隆(Dianova，Hamburg，Germany)一起預(yù)溫孵。為了加強鼠單克隆和融合蛋白IgG-結(jié)合部分之間的結(jié)合，也加入了兔抗鼠Ig抗體。
與蛋白質(zhì)A-SEA(wt)相比較，蛋白質(zhì)A-SEA(D227A)具有降低的結(jié)合表達(dá)MHC II類抗原Daudi細(xì)胞的能力。表I證明突變體結(jié)構(gòu)完整性。監(jiān)測六個單克隆抗體的結(jié)合。突變 單克隆抗體1A 2A 3A 1E 4E EC-Al野生型 ++++++D11A/K14A ++++++D45A ++++++F47A ++++++H50A (+) + (+) +++K55A ++++++H114A ++++++K123A/D132G++++++N128A +++-++K147A/K148A++++-+E154A/D156AND ND ND +ND NDR160A ND ND ND +ND NDH187A +++-++E191A/N195A++++++D197A ++++++H225A +++-++D227A +++-++腳注“+”表示結(jié)合，“-”表示與野生型SEA相比50至90％結(jié)合。ND表示沒有測定。表IISEA突變體與MHC II類抗原和T細(xì)胞受體的結(jié)合。后者監(jiān)測其用不同突變體Fab-SEA融合蛋白定向激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞以特異地溶胞癌細(xì)胞的能力(SADCC)。突變 IC50(nM) IC50(nM)Kd(nM) SADCCSEA-FITC1125I-SEA1125I標(biāo)記1(野生型1的％)野生型 50 38 13 1002Gly-SEA 50 ND ND 1002D11A/K14A50 ND ND NDD45A 53 ND ND NDF47A 3150 2943 95 100H50A150 132 32 100K55A 44 ND ND NDH114A48 ND ND NDK123A/D132G 188 75 12/237 100N128A .1150 ND 2.9/76 100K147A/K148A 58 ND ND NDH187A 1030 602 97 100E191A/N195A 51 ND ND NDD197A78 ND ND NDH225A＞9000 9600 ND NDD227A＞9000 ＞10000 ＞8000 100腳注1)ND表示沒測定。2)在Fab-SEA前后序列中，CH1和SEA終端的間隔是Gly。表III突變的生物效應(yīng)。監(jiān)測刺激靜息T細(xì)胞增殖的能力和指導(dǎo)細(xì)胞毒素細(xì)胞溶胞暴露靶細(xì)胞的MHC II類抗原的能力(SDCC＝超抗原依賴介導(dǎo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性)。突變 增殖 SDCC％ EC50(相對)野生型 100 1Gly-SEAND 1D11A/K14A ND 0.8D45A 50 1.3F47A＜0.2 2.5H50A 20 1.4K55A 100 1.3H114A ND 1K123A/D132G40 2.1N128A 40 1.2K147A/K148AND 0.7E154A/D156AND NDR160A ND NDH187A 15 4E191A/N195A 100 1.1D197A ND 1.3H225A ＜0.2 3×102D227A ＜0.013×102腳注ND表示未測定。圖的說明概述∷突變體SEA(D227A)(＝SEA(m9)或突變體m9)是優(yōu)先權(quán)日最推崇的SEA變體。因此選擇該突變體代表體外和體內(nèi)結(jié)果(圖3-6)。圖1用來表達(dá)SEA和C215Fab-SEA的質(zhì)粒的示意圖。產(chǎn)物基因后的編碼區(qū)和兩個轉(zhuǎn)錄終止區(qū)用框表示。編碼卡那霉素抗性蛋白的基因標(biāo)記為Km。lacI是乳糖阻抑物基因。VH和CH1表示編碼鼠抗體C215重鏈Fd片段的基因。類似地VK和CK表示編碼k鏈的基因。Rop是編碼來自pBR322的復(fù)制調(diào)控蛋白的基因。指導(dǎo)產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄的啟動子如箭頭所示，在pKP889中是trc啟動子，在另外兩個載體中，啟動子來自葡萄球菌蛋白A(spa)。包含復(fù)制源的區(qū)以ori表示。pKP943和pKP1055編碼的SEA之間的唯一差別是后者在N末端加了一個甘氨酸殘基。包含在后者載體中的SEA基因也含有更多單一的，由沉默突變引入的限制性酶切位點。圖2野生型SEA和突變體F47A和D227A的圓二色性譜，指出每個MHCII類抗原結(jié)合區(qū)最嚴(yán)重的減少的突變。實線是野生型SEA曲線，突變體曲線是虛線或中間打點線，分別是F47A和D227A。圖3表示SEA(wt)和SEA(D227A)的超抗原依賴性介導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性(SDCC)的濃度依賴性。圖4表示C215Fab-SEA(wt)和C215Fab-SEA(D227A)的超抗原依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(SDCC)的濃度依賴性。圖5表明C215Fab-SEA(wt)和C215Fab-SEA(D227A)與自由的SEA(wt)相比，其超抗原mAb依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(SADCC)的濃度依賴性。圖6a比較用C215Fab-SEA(wt)和C215Fab-SEA(D227A)治療B16-C215黑素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移C57B1/6鼠獲得的治療效果。圖6b表明圖6a中表示的治療中C215-SEA(wt)和C215-SEA(D227A)的毒性。
權(quán)利要求
1.綴合物，包括a.一種能結(jié)合至預(yù)先確定的結(jié)構(gòu)的生物特異性親和配對物(尋找靶物基團)，和b.一種肽，其i.包含自一超抗原衍生的氨基酸序列，ii.具有結(jié)合T細(xì)胞受體Vβ鏈的能力，和iii.與肽自其中衍生的超抗原相比，具有經(jīng)修飾的結(jié)合MHC II類抗原的能力，各部分共價連接在一起。
2.權(quán)利要求1的綴合物，其特征在于a.生物特異性親和配對物定向朝向一種細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，和b.綴合物具有激活T-淋巴細(xì)胞以溶胞在細(xì)胞表面具有所述細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1-2之任一的綴合物，其特征在于生物特異性親和配對物是抗體或者抗體的抗原結(jié)合片段。
4.權(quán)利要求1-3之任一的綴合物，其特征在于其是融合蛋白。
5.權(quán)利要求1-4之任一的綴合物，其特征在于所述肽是突變的超抗原。
6.權(quán)利要求1-5之任一的綴合物，特征在于所述肽自超抗原衍生，而且其結(jié)合MHC II類抗原的能力至少改變10％。
7.權(quán)利要求1-6之任一的綴合物，特征在于超抗原是葡萄球菌腸毒素A，B，C1，C2，D，或E。
8.權(quán)利要求7的綴合物，特征在于所述超抗原另外可以從葡萄球菌腸毒素H衍生。
9.權(quán)利要求1-8之任一的綴合物，特征在于生物特異性親和配對物所定向的結(jié)構(gòu)是在患病期間，例如癌癥，病毒感染，自身免疫疾病或寄生蟲寄生期間，在細(xì)胞表面上表達(dá)的結(jié)構(gòu)。
10.一種溶胞哺乳動物細(xì)胞的方法，特征在于使細(xì)胞與T-淋巴細(xì)胞和權(quán)利要求2-9之任一的綴合物接觸，其中生物特異性親和配對物定向于要被溶胞的細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，所述溫孵在允許所述細(xì)胞溶胞的條件下進(jìn)行。
11.一種用于選擇性溶胞細(xì)胞(I)的方法，細(xì)胞(I)和其它細(xì)胞(II)一起存在，并且表達(dá)優(yōu)選存在于要被溶胞的這些細(xì)胞(I)上的結(jié)構(gòu)，特征在于細(xì)胞(I和II)同時與權(quán)利要求2-9之任一的綴合物接觸，其中生物特異性親和配對物定向于要被溶胞的細(xì)胞(I)上的表面結(jié)構(gòu)，所述接觸在允許溶胞的條件下進(jìn)行。
12.權(quán)利要求11的方法，特征在于細(xì)胞(I)與疾病癥狀相關(guān)，如癌癥，病毒感染，寄生蟲寄生，自身免疫疾病等。
13.一種治療哺乳動物疾病癥狀的方法，癥狀是指通過表達(dá)疾病特異表面結(jié)構(gòu)而與癥狀相關(guān)的特異細(xì)胞的出現(xiàn)，特征在于給予哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求2-9之任一的綴合物，綴合物中生物特異性親和配對物定向抗疾病特異結(jié)構(gòu)。
全文摘要
一種綴合物，包括(a)一種結(jié)合預(yù)測定結(jié)構(gòu)的生物特異性親和配對物(尋找靶物基團)和(b)一種肽，其(i)包含自超抗原衍生的氨基酸序列，和(ii)具有結(jié)合T細(xì)胞受體Vβ鏈的能力，和(iii)與所述肽從其中衍生的超抗原相比，具有修飾的結(jié)合MHC II類抗原的能力，各部分共價連接在一起。
文檔編號C12N15/01GK1152877SQ9519407
公開日1997年6月25日 申請日期1995年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月11日
發(fā)明者L·亞伯拉罕森, P·比約克, M·德爾斯藤, T·卡蘭 申請人:法馬西亞及厄普約翰公司