專利名稱：：抗cd44v6單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能抗由CD44基因變體外顯子v6編碼的抗原表位的單克隆抗體、由其衍生的抗體分子、以及這種抗體和抗體分子在診斷和治療方面的應(yīng)用。近來已發(fā)現(xiàn)，無論是大鼠未轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞系還是大鼠未轉(zhuǎn)移纖維肉瘤細(xì)胞系，為引發(fā)所謂自發(fā)轉(zhuǎn)移行為，必須對(duì)表面糖蛋白CD44變體進(jìn)行充分表達(dá)(Gunthert等，1991)。最小的CD44同型的標(biāo)準(zhǔn)形式的CD44s(或CD44std)，普遍在包括上皮細(xì)胞的不同組織中表達(dá)，而一些CD44剪切變體(CD44v，CD44var)只在亞上皮細(xì)胞中表達(dá)。由可變剪切而產(chǎn)生CD44變體的方法是使CD44s中10個(gè)外顯子(v1～v10)序列完全剪切掉，但能以不同組合出現(xiàn)在較大變體中(Screaton等，1992；Tolg等，1993；Hofmann等，1991)。這些變體的不同之處在于，不同氨基酸序列被插入蛋白質(zhì)細(xì)胞外部分的某些位點(diǎn)。這樣的變體可在各種人腫瘤細(xì)胞以及人腫瘤組織中檢測(cè)到。因此，近來已詳細(xì)研究了發(fā)生結(jié)腸直腸癌情況下CD44變體的表達(dá)(Heider等，1993a)。CD44變體不在正常人結(jié)腸上皮中表達(dá)，只在腺管增殖細(xì)胞中可檢測(cè)到微弱的表達(dá)。在腫瘤如腺癌的發(fā)展后期，所有惡性腫瘤都表達(dá)CD44變體。在攻擊性非Hodgkin淋巴組織瘤中也已發(fā)現(xiàn)高水平的變體CD44組織表達(dá)(Koopman等，1993)。尤其在轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的情況下，外顯子v6似乎起著特殊作用(Rudy等，1993)。在動(dòng)物模型中，抗v6特異性表位的抗體能防止轉(zhuǎn)移細(xì)胞的滯留和轉(zhuǎn)移病灶的生長(zhǎng)(Seiter等，1993)。在結(jié)腸癌中，v6表達(dá)與腫瘤發(fā)展相互關(guān)聯(lián)(wielenga等，1993)。在胃癌中，v6表達(dá)是區(qū)分腸道類型腫瘤與擴(kuò)散類型腫瘤的重要診斷標(biāo)志(Heider等，1993b)。在后兩篇論文中，v6表達(dá)用抗v6特異性抗原表位抗體來測(cè)定。現(xiàn)有技術(shù)中已知抗外顯子v6所編碼表位的單克隆抗體(Hofmann等，1991；Wielenga等，1993)。由于這樣的抗體在診斷和治療中會(huì)有高潛力的應(yīng)用性，因此非常需要特性改進(jìn)的抗體。本發(fā)明的目的是提供一種與已知v6特異性抗體相比特性好得多的抗體。本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)這一目的。本發(fā)明涉及一種名稱為VFF-18的抗體。本發(fā)明還涉及分泌這種抗體的雜交瘤細(xì)胞系，而且該雜交瘤細(xì)胞系已保藏在德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏股份有限公司(DSM-DeutscheSammlungfurMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，其地址為MascheroderWeg1b，D-38124Braunschweig)，保藏登記號(hào)為DSMACC2174。下文中所用術(shù)語“抗體”或“抗體分子”不僅僅指完全的免疫球蛋白，也指與結(jié)合特異性和親和性有關(guān)的等同物質(zhì)，以及抗體衍生物和重組抗體分子。本發(fā)明的抗體VFF-18按實(shí)施例1中的方法來制備。該抗體還可用所保藏的雜交瘤細(xì)胞系獲得。制備本發(fā)明抗體衍生物，或者從抗體序列分析開始和/或使用雜交瘤細(xì)胞系來生產(chǎn)該抗體，制備具有相同個(gè)體基因型的重組抗體分子，也即在抗原結(jié)合位點(diǎn)區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)，CDR)具有與抗體VFF-18相同氨基酸序列的抗體分子，這些都屬普通專業(yè)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。因此，這樣的衍生物以及重組抗體分子顯然也包括在本發(fā)明中。舉例來說，F(xiàn)ab或F(ab′)2片段或其它片段可從VFF-18抗體的完全免疫球蛋白中產(chǎn)生(Kreitman等，1993)。例如，在診斷過程中，可將VFF-18抗體分子、其片段或者具有相同個(gè)體基因型的重組抗體分子連接到放射性同位素如131I，111In，99mTc或放射性化合物[Larson等，1991；Thomas等，1989；Srivastava，1988]、酶如過氧化物酶或堿性磷酸酶(CattyetRaykundalia，1989)、熒光染料(Johnson，1989)、或生物素分子(Guesdon等，1979)。在治療應(yīng)用中，可將VFF-18或VFF-18衍生的抗體分子與毒素(Vitetta等，1991；VitettaetThorpe，1991；Kreitman等，1993；Theuer等，1993)、細(xì)胞靜止因子(Schrappe等，1992)、前藥(Wang等，1992，Senter等，1989)或放射性物質(zhì)連接。該抗體還可與細(xì)胞因子或免疫調(diào)節(jié)多肽，例如腫瘤壞死因子或白介素-2連接。另外，在對(duì)抗體VFF-18的氨基酸序列進(jìn)行分析后和/或使用能產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤細(xì)胞系，特別是通過分析這些細(xì)胞中所含的基因信息之后，專業(yè)人員還能生產(chǎn)與VFF-18具相同個(gè)體基因型的重組抗體分子。實(shí)現(xiàn)這些目的的方法構(gòu)成本領(lǐng)域技術(shù)的一部分。這樣的重組抗體，譬如可以是人源化抗體(Shin等，1989；GüssowetSeemann，1991)、雙特異抗體(Weiner等，1993；Goodwin，1989)、單鏈抗體(scFv，JohnsonetBird，1991)、完全或片段免疫球蛋白(Coloma等，1992；Nesbit等，1992；Barbas等，1992)，或者經(jīng)鏈改組所生成的抗體(Winter等，1994)。人源化抗體可以通過例如CDR嫁接來制備(EP-0239400)。構(gòu)架區(qū)也可加以修飾(EP-0519596)。目前，對(duì)于抗體的人源化，可以使用如PCR方法(參考例如EP0368684；EP0438310；WO9207075)或計(jì)算機(jī)模擬方法(例如參考WO9222653)。也可制備融合蛋白，例如單鏈抗體/毒素融合蛋白(Chaudhary等，1990；Friedman等，1993)。因此這種抗體分子同樣也包括在本發(fā)明內(nèi)。鑒別VFF-18的確切抗原表位，及利用這一知識(shí)來制備具相同結(jié)合特異性的等價(jià)抗體，也屬本領(lǐng)域普通專業(yè)人員的技能范圍之內(nèi)的事。準(zhǔn)確的抗原表位可以通過實(shí)施例2中肽結(jié)合試驗(yàn)來鑒別，例如通過改變肽Hul的序列。因此，這樣的抗體同樣也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的另一方面是VFF-18或VFF-18衍生的或等價(jià)的抗體分子在診斷和治療中的應(yīng)用。診斷方法可以是本身已知的方法，其中使用本發(fā)明抗體分子，例如酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISACatty及Raykundalia，1989)、放射免疫測(cè)定法(Catty及Murphy，1989)，免疫組織化學(xué)法(Heider等，1993b)，或western氏印漬法。較為適宜的是這些方法可以用從機(jī)體采得的組織樣品或例如從活組織中采得的液體來進(jìn)行。進(jìn)行這些試驗(yàn)可以是定性的，半定量的或定量的。本發(fā)明中，所述抗體或抗體分子可以如現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)其它v6特異抗體所說明的那樣來使用(WO9500851)，而且本發(fā)明抗體或抗體分子的優(yōu)越性質(zhì)意味著這些方法大有改進(jìn)。除體外診斷外，本發(fā)明抗體分子也適于體內(nèi)診斷，特別是腫瘤診斷。如果該抗體分子攜載可檢測(cè)標(biāo)記，則可為診斷目的，例如體內(nèi)給腫瘤成象，或者譬如為放射輔助治療目的(放射指導(dǎo)的外科手術(shù))而檢測(cè)該標(biāo)記。舉例來說，對(duì)于為進(jìn)行免疫閃爍照相而使用與放射同位素結(jié)合的抗體，有許多可供專業(yè)人員實(shí)施本發(fā)明的方法(Siccardi等，1989；Keenan等，1987；Perkins和Pimm，1992；Colcher等，1987；Thopson等，1984)。治療應(yīng)用可以例如類似于使用抗體1.1ASML(Seiter等，1993)的方法來進(jìn)行。應(yīng)用時(shí)抗體分子可以全身或局部施藥，例如經(jīng)靜脈(藥團(tuán)或長(zhǎng)時(shí)間輸注)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射或輸注。也可以灌流單個(gè)器官或肢體。綴合或未綴合抗體(完全免疫球蛋白、片段、重組嵌合分子、等等)的給藥方法屬現(xiàn)有技術(shù)(Mulshine等，1991；Larson等，1991；Vitetta及Thorpe，1991；Vitetta等，1991；Broitz等，1992；Press等，1989；Weiner等，1989；Chatal等，1989；Sears等，1982)。實(shí)施例2至4證明了VFF-18的性質(zhì)比其它抗CD44v6抗體優(yōu)越。圖1GST-CD44(v3-v10)融合蛋白的示意圖。GST＝日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。v3-v10＝角質(zhì)形成細(xì)胞CD44的變體插入片段。箭頭標(biāo)明凝血酶切割位點(diǎn)。圖2人和鼠CD44基因外顯子v6的序列對(duì)照?？贵w1.1ASML(抗鼠CD44v6)或VFF-18(抗人CD44v6)分別與之結(jié)合的肽Ral和Hul的序列用粗體字母標(biāo)出，使之醒目。全同的氨基酸以星號(hào)標(biāo)出。圖3CD44v6特異性抗體與合成肽的結(jié)合?？贵w與肽的結(jié)合用ELISA測(cè)定，測(cè)定時(shí)將肽固定，然后同抗體溶液一起溫育。經(jīng)合適的沖洗步驟后，以過氧化物酶綴合的抗鼠IgG抗體來測(cè)定所結(jié)合的抗體。(A)在第一次實(shí)驗(yàn)中，證明了大鼠特異性CD44v6抗體1.1ASML結(jié)合在肽Ral(KWFENEWQGKNPPT)上。(B)在另一次實(shí)驗(yàn)中，合成了由CD44v6序列衍生的RAL同源肽。不同的抗人CD44v6雜交瘤上清液與此種肽Hul(QWFGNRWHEGYRQT)結(jié)合。此實(shí)驗(yàn)表明，VFF-18與肽結(jié)合得比其它常用抗體好得多。(C)為進(jìn)行定量評(píng)定起見，以不同濃度的純化抗體重復(fù)進(jìn)行了此實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)也證明，VFF-18具有比其它抗體更高的結(jié)合親和性。圖4放射標(biāo)記抗體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。三種抗體VFF-7(抗v6)、VFF-8(抗v5)，和VFF-18(抗v6)用N-琥珀酰亞胺基[2，3-3H]丙酸酯進(jìn)行放射標(biāo)記，并用于不同腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合測(cè)定。測(cè)定時(shí)，使用下列細(xì)胞系CHO-CD44var在細(xì)胞表面表達(dá)人變體CD44(外顯子v3-v10)的重組倉鼠細(xì)胞系(中國倉鼠卵巢)；HCT-116、CX-1、HT-29、CaCo、COLO205人結(jié)腸癌細(xì)胞系；A431人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系。表明了抗體與不同細(xì)胞系有著特異性結(jié)合。v6特異抗體VFF-7和VFF-18對(duì)重組體細(xì)胞系的結(jié)合具有相同的數(shù)量級(jí)，而抗體對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系顯示了非常不同的結(jié)合行為。在一些情況下，只可見VFF-18的結(jié)合和VFF-8的較小程度結(jié)合(HT-29，CaCo，COLO205)，而在其它細(xì)胞系的情況下，VFF-18的結(jié)合比VFF-7好得多。圖5測(cè)定正常人血清中含外顯子v6的可溶性CD44變體。將3種v6特異抗體VFF-4、VFF-7、和VFF-18在夾心ELISA中用作包被抗體。在所有三種情況下，均使用過氧化物酶連接的CD44std特異抗體(BU-52，std＝標(biāo)準(zhǔn))作為檢測(cè)抗體。在這些試驗(yàn)((A)及(B))中，顯示出兩種不同正常人血清在不同稀釋度時(shí)的信號(hào)。在這兩種情況下，用VFF-18觀察到比用另兩種抗體強(qiáng)得多的信號(hào)。圖6含v6的CD44變體的血清水平。用兩種不同ELISAs測(cè)定6名健康供者血清中可溶解CD44var的含量。在一次試驗(yàn)中使用VFF-7作為包被抗體，而在另一次試驗(yàn)中使用VFF-18作為包被抗體；兩種抗體均識(shí)別外顯子v6。在兩種情況下，將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組可溶性CD44變體(外顯子v3-v10)作為對(duì)照制劑。在平均情況下，VFF-18ELISA顯示出比VFF-7ELISA高3.5倍的值。這意味著，VFF-18比VFF-7能更好地識(shí)別血清中出現(xiàn)的可溶性CD44var。實(shí)施例實(shí)施例1單克隆抗體VFF-18的制備pGEX融合蛋白的克隆將CD44v的HPKII型(Hofmann等，1991)整個(gè)可變區(qū)經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)由人角質(zhì)形成細(xì)胞CDNA加以放大。正如Hofmann等所述，LCLC97可變區(qū)的(5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′，位置25-52，和5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′，位置1013-984，這兩個(gè)PCR引物包含EeoRI識(shí)別位點(diǎn)用來將PCR產(chǎn)物直接克隆到載體pGEX-2T中(Smith等，1988)。所得結(jié)構(gòu)(pGEXCD44vHPKIL，v3-v10)編碼了大約70千道爾頓的融合蛋白，由日本血吸蟲(Schistosomaiaponicum的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和人CD44外顯子v3-v10組成(圖1；Heider等，1993a)。融合蛋白在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)，然后在谷胱甘肽瓊脂糖上進(jìn)行親和層析純化(Smith等，1988)。免疫和篩選根據(jù)下面方法，用親和純化后的融合蛋白對(duì)雌性Balb/C小鼠腹膜內(nèi)免疫接種1.免疫接種佛氏完全佐劑中90μg融合蛋白2.和3.免疫接種佛氏不完全佐劑中50μg融合蛋白。諸免疫接種各隔四星期進(jìn)行。最后一次接種后14天，動(dòng)物另外在三天連續(xù)時(shí)間內(nèi)用溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的10μg融合蛋白免疫接種。繼后一天，用聚乙二醇4000使具有高抗體效價(jià)的動(dòng)物脾細(xì)胞與P3.X63-Ag8.653鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。繼而在微量滴定平板上在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤細(xì)胞(Khler及Milstein，1975；Keamey等，1979)。用ELISA分別進(jìn)行血清中抗體效價(jià)的測(cè)定和雜交瘤上清液的篩選。在該試驗(yàn)中，首先用融合蛋白(GST-CD44v3-10)或只用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶涂覆微量滴定平板。然后，用血清樣品或雜交瘤上清液的系列稀釋物進(jìn)行溫育，用抗鼠免疫球蛋白過氧化物酶偶聯(lián)的抗體來檢證特異性抗體。棄除只與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的雜交瘤。然后用結(jié)構(gòu)域特異性融合蛋白(外顯子v3，外顯子v5+v6，外顯子v6+v7，外顯子v8-v10)鑒定保留的抗體(Koopman等，1993)，然后在人皮膚切片上測(cè)試這些抗體免疫組織的化學(xué)反應(yīng)性。然后通過與合成肽Hul(QWFGNRWHEGYRQT)的結(jié)合來鑒別抗體VFF-18。Hul序列是人CD44外顯子v6的一個(gè)片段。實(shí)施例2CD44v6特異抗體與合成肽的結(jié)合應(yīng)用ELISA測(cè)定CD44v6特異抗體與合成肽的結(jié)合。溶液包被緩沖液0.05M碳酸鈉，pH9.6測(cè)定緩沖液PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)0.5％BSA(牛血清白蛋白)0.05％Tween20底物溶液Kierkegaard&amp;PerryLaboratories公司，GaithersburgMD，USA；TMB過氧化物酶底物過氧化物酶溶液B(H2O2)1∶1。在4℃下，將肽(50μg/ml，溶于包被緩沖液中)在購自BioProducts公司的NUNCMaxisorp免疫平板(1.1ASML)或ActiA平板上(VFF抗體)固定過夜。在ActiA平板情況下，肽與平板共價(jià)結(jié)合。接著，用PBS/0.05％Tween20沖洗平板，平板表面空出來的吸附位點(diǎn)用測(cè)定緩沖液封阻(室溫，1小時(shí))，然后再次用PBS/0.05％Tween20沖洗。經(jīng)封阻后，用溶于20mM碳酸氫鈉(pH9.0)的10mM硼氫化鈉還原ActiA平板(室溫下?lián)u蕩1小時(shí))，再用PBS/0.05％Tween20沖洗三次。然后，將溶于濃度在0.02和10.0μg/ml之間的測(cè)定緩沖液中的雜交瘤上清液或抗體溶液加到小孔中并在滴定板振蕩器中室溫溫育2小時(shí)。隨后，用PBS/0.05％Tween20沖洗平板三次。然后，加入以合適稀釋度溶于測(cè)定緩沖液的辣根過氧化物酶綴合抗鼠IgG抗體100μI/孔。在滴定板振蕩器上室溫溫育2小時(shí)后，用PBS/0.05％Tween20沖洗三次，并以底物溶液染色。10-15分鐘后，用2M硫酸停止發(fā)育，用光度計(jì)在450nm(參考690nm)測(cè)定吸收值。在第一次實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了鼠CD44v6特異性抗體1.1ASML對(duì)肽Ral(KWFENEWQGKNPPT)的結(jié)合(表1，圖3(A))。表1在另一組實(shí)驗(yàn)中，合成了與Ral(同源、從人CD44v6序列衍生的肽(Hul，QWFGNRWHEGYRQT)。使不同抗人CD44v6抗體與Hul結(jié)合。該試驗(yàn)表明，與所用的其它抗體相比，VFF-18與這種肽的結(jié)合親和性高得出乎預(yù)料(表2，圖3(B))。表2此外，為進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，還以不同濃度使純化的抗人CD44v6抗體與肽Hul結(jié)合。這里也可以看到，與其它抗體相比，VFF-18顯然具有更好的結(jié)合親和性(表3，圖3(C表3實(shí)施例3放射標(biāo)記CD44v6特異性抗體與腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合抗體的放射標(biāo)記將1mCiN-琥珀酰亞胺基-[2，3-3H]丙酸酯([3H]-NSP，Amersham，1mCi/ml)在硅氧烷化樣品細(xì)管中，在0℃噴水抽真空下蒸發(fā)幾乎至干。加入15μg抗體(1mg/ml，溶于PBS，pH7.4)，并在4℃溫育48小時(shí)。接著過量的[3H]-NSP通過與PBS中的30μl1M甘氨酸在室溫下反應(yīng)20分鐘而猝滅。用SephadexG-25-M柱(柱容積15ml)并以PBS/0.5％BSA為洗脫緩沖液，將標(biāo)記的抗體與[3H]-甘氨酸分離。[3H]-標(biāo)記的抗體出現(xiàn)在外水體積中。在檢測(cè)鼠免疫球蛋白用的ELISA中測(cè)定抗體的量，并計(jì)算特異活性。放射標(biāo)記抗體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合用N-琥珀酰亞胺基-[2，3-3H]丙酸酯對(duì)3種抗體VFF-7(抗v6)、VFF-8(抗v5)和VFF-18(抗v6)進(jìn)行放射性標(biāo)記，并用于對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合檢測(cè)中。檢測(cè)時(shí)，使用了下面的細(xì)胞系CHO-CD44var在細(xì)胞表面表達(dá)人變體CD44(外顯子v3-v10)的重組倉鼠細(xì)胞系(中國倉鼠卵巢)；HCT-116，CX-1，HT-29，CaCo，COLO205人結(jié)腸癌細(xì)胞系；A431人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系。細(xì)胞在12孔的組織培養(yǎng)平板上接種，在CO2溫育箱中在37℃保溫過夜，接著用PBS沖洗一次，并用乙醇固定(室溫下1分鐘)。然后，用培養(yǎng)基(RPMI1640/10％牛胎血清)沖洗一次并與放射性抗體(250000dpm/井，培養(yǎng)基中)結(jié)合。在培養(yǎng)平板振蕩器中室溫溫育25小時(shí)后，將平板用PBS/0.5％BSA沖洗三次，細(xì)胞用0.1MNaOH/1％TritonX-100增溶，并以閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定放射性。在過量100倍的未標(biāo)記抗體存在下測(cè)定非特異性結(jié)合。結(jié)合以單位化的細(xì)胞數(shù)(400000個(gè)細(xì)胞)為準(zhǔn)計(jì)。測(cè)定抗體的特異活性后，以fmol表示被結(jié)合抗體的量。表4和圖4示出抗體對(duì)不同細(xì)胞系的特異性結(jié)合。v6特異性抗體VFF-7和VFF-18與重組細(xì)胞系CHO-CD44var的結(jié)合數(shù)值大致相同，但這些抗體對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞系顯示出極其不同的結(jié)合行為。在一些情況下，只可見VFF-18結(jié)合，和較小程度的VFF-8結(jié)(HT-29，CaCo，COLO205)，而在其它細(xì)胞系的情況下，VFF-18結(jié)合顯然比VFF-7更好。</tables>表4實(shí)施例4測(cè)定血清中可溶性CD44v6用的ELISA溶液包被緩沖液0.05M碳酸鈉，pH9.6測(cè)定緩沖液PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)0.5％BSA(牛血清白蛋白)0.05％Tween20樣品稀釋劑BenderMedSystems公司，維也納(Vienna)，奧地利(Austria)底物溶液Kierkegaard&amp;PerryLaboratories公司，GaithersburgMD，美國；TMB過氧化物酶底物過氧化物酶溶液B(H2O2)1∶1。用5μg/mlCD44v6特異性抗體包被微量滴定平板(Nunc-ImmunoplateMaxiSorpF96)(4℃下保溫過夜)。然后，用PBS/0.05％Tween20沖洗平板，平板表面上空的吸附位點(diǎn)用測(cè)定緩沖液封阻(室溫，1小時(shí))，再?zèng)_洗平板一次。用樣品稀釋劑將血清樣品至少以1∶5的比例預(yù)稀釋，再在平板中用樣品稀釋劑逐次以1∶2的比例進(jìn)行稀釋。緊接著，在測(cè)定緩沖液中以合宜的稀釋度(1∶3000-1∶10000)加入50μl/孔辣根過氧化物酶綴合的抗CD44std抗體(克隆BU-52，TheBindingSite，Birmingham)。在振蕩器上室溫溫育3小時(shí)后，用PBS/0.05％Tween20沖洗三次，并用底物溶液染色。10至15分鐘后，用2M硫酸停止發(fā)育，用光度計(jì)在450nm(參考690nm)處測(cè)定吸收值。為定量測(cè)定，與血清樣品平行制備了可溶性CD44標(biāo)準(zhǔn)樣品溶于測(cè)定緩沖液的系列稀釋樣品。此制劑在表達(dá)可溶性Cd44v3-v10的重組倉鼠細(xì)胞(CHO)上清液中純化。CD44v3-v10是一種含有外顯子v3至v10編碼肽序列的人CD44變體。表5和圖5表明正常人血清中含有外顯子v6的可溶性CD44變體。三種v6特異性抗體VFF-4、VFF-7和VFF-18分別用作夾心ELISA中的包被抗體。在所有三種情況下，均以過氧化物綴合的CD44std特異性抗體(BU-52，std＝標(biāo)準(zhǔn))作檢證抗體。在這些測(cè)試中，顯現(xiàn)出兩種不同正常人血清在不同稀釋度時(shí)的信號(hào)。在(A)和(B)的兩種情況下，可觀察到VFF-18的信號(hào)比其它兩種抗體強(qiáng)得多表5A血清1表5B血清2表6和圖6顯示了含v6的CD44變體血清水平。用兩種不同的ELISA測(cè)定了6個(gè)健康供者血清中可溶性CD44var的含量。在一次試驗(yàn)中，用VFF-7-作包被抗體，而在另一次試驗(yàn)中用VFF-18作包被抗體；兩種抗體均能識(shí)別外顯子v6。在兩種情況下，都用CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的重組可溶性CD44變體(外顯子v3-v10)作為對(duì)照制劑。VFF-18-ELISA顯示出平均比VFF-7-ELISA高3.5倍的數(shù)值。這意味著，與重組體蛋白質(zhì)相比，VFF-18比VFF-7能更好地識(shí)別血清中產(chǎn)生的可溶性CD44var。</tables>表6參考文獻(xiàn)BarbasCF，BjorlingE，ChioiF，DunlopN，CababaD，JonesTM，ZebedeeSL，PerssonMAA，NaraPL，NorrbyE，BurtonDR.“重組的人Fab片段體外中和人的1型免疫缺陷病毒”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.899339-9343(1992)。BreitzHB，WeidenPL，VanderheydenJ-L，AppelbaumJW，BjornMJ，F(xiàn)erMF，WolfSB，RatcliffBA，SeilerCA，F(xiàn)oisieDC，F(xiàn)isherDR，SchroffRW，F(xiàn)ritzbergAR，AbramsPG.錸-186標(biāo)記的單克隆抗體用于進(jìn)行放射免疫治療的臨床實(shí)驗(yàn)I期試驗(yàn)結(jié)果。J.Nucl.Med.331099-1112(1992)。Catty，D.，Raykundalia，C.ELISA和相關(guān)免疫測(cè)。InCatty，D(Hrsg).AntibodiesVol.II.IRLPress0xford(1989)，97-152，ppl05-109。Catty，D.，Murphy，G.應(yīng)用放射標(biāo)記的免疫測(cè)定。InCatty，D(Hrsg).AntibodiesVol.II.IRLPressOxford(1989)，pp77-96。ChatalJ-F，SaccaviniJ-C，GestinJ-F，ThedrezP，CutetC，KremerM，GuerreauD，NolibeD，F(xiàn)umoleauP，GuillardY.為治療卵巢癌對(duì)患者腹膜內(nèi)注射的銦111標(biāo)記的OC125單克隆抗體生物分布。CancerRes.493087-3094(1989)。ChaudharyVK，BatraJK，GaldoMG，WillinghamMC，F(xiàn)itzgeraldDJ，PastanI.將大腸桿菌中功能可變區(qū)的抗體基因克隆為單鏈免疫毒素的快速方法。Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.871066(1990)。ColcherD，EstebanJ，CarrasquilloJA，SugarbakerP，ReynoldsJC，BryantG，LarsonSM，SchlomJ.單克隆抗體(B72.3)在癌癥患者腔內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥的互補(bǔ)作用。CancerRes.474218-4224(1987)。ColomaMJ，HastingsA，WimsLA，MorrisonSL.用聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的可變區(qū)表達(dá)抗體分子的新運(yùn)載體。J.Immunol.Methods15289-104(1992)。FriedmannPN，McAndrewSJ，GawlakSL，ChaceD，TrailPA，BrownJP，SiegallCB.BR96sFv-PF40，選擇性殺死癌細(xì)胞的有效單鏈免疫毒素CancerRes.53334-339(1993)。GoodwinDA.關(guān)于用抗肝素嵌合的抗體來對(duì)人腫瘤進(jìn)行標(biāo)靶特異單克隆抗體問題的新探索。J.Nucl.Med.Biol.16645(1989)。Gunthert，U.，Hofmann，M.，Rudy，W.，Reber，S.，Zoller，M.，HauBmann，I.，Matzku，S.，Wenzel，A.，Ponta，H.，和Herrlich，P，糖蛋白CD44的新變體使大鼠癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移成為可能。Cell6513-24(1991)。Guesdon，J.I.，Ternynck，T.，Avrameas，S.J.Histochem.Cytochem.271131(1979)。GussowD，SeemannG.單克隆抗體的人源化作用。MethodsEnzymol.20399-121(1991)Heider，K.-H.，Hofmann，M.，Horst，E.，vandenBerg，F(xiàn)，Ponta，H.，Herrlich，P，和Pals，S.T.大鼠轉(zhuǎn)移相關(guān)的CD44變體的人同系物在結(jié)腸直腸癌和腺瘤性息肉中被表達(dá)。J.CellBiol.120227-233(1993a)。Heider，K-H.，Dammrich，J.，Skroch-Angel，P，Muller-Hermelink，H-K.，Vollmers，H-P，Herrlich，P，和Ponta，H.CD44剪切變體在腸和擴(kuò)散型人胃癌和正常胃粘膜中的分化表達(dá)。CancerRes.534197-4203(1993b)。Hofmann，M.，Rudy，W.，Zoller，M.，Tolg，C.，Ponta，H.，HerrlichP，和Gunthert，U.大鼠體內(nèi)CD44剪切變體具有新陳代射行為同源序列在人腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)。CancerRes.515292-5297(1991)。Johnson，G.D.免疫熒光。InCatty，D(Hrsg).AntibodiesVol.II.IRLPressOxford(1989)，179-200，ppl80-189。JohnsonS，BirdRE.單克隆抗體單鏈衍生物的構(gòu)建和其在大腸桿菌中的產(chǎn)生。MethodsEnzymol.20388-98(1991)。Kearney，J.F.，RadbruchA.，LiesegangB.，RajewskiK.新的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系喪失了免疫球蛋白表達(dá)但可構(gòu)建分泌抗體的雜交細(xì)胞系。J.Immunol.1231548(1979)。KeenanAM，WeinsteinJN，CarrasquilloJA，BunnPA，ReynoldsJC，F(xiàn)oonKAetal.免疫淋巴閃爍法和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤患者對(duì)111In-標(biāo)記的T101單克隆抗體的劑量依賴性。CancerRes.476093-6099(1987)。Kohler，G.，Milstein，C.預(yù)先測(cè)定的特異性分泌抗體及融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)。Nature265495(1975)Koopman，G.，Heider，K.-H.，Horts，E.，Adolf，G.R.，vandenBerg，F(xiàn)，Ponta，H.，Herrlich，P，Pals，S.T.活化的人淋巴細(xì)胞和凝集、Non-Hodgkin’s淋巴瘤表達(dá)大鼠轉(zhuǎn)移相關(guān)CD44變體的同系物。J.Exp.Med.177897-904(1993)。KreitmanRJHansenHJ，JonesAL，F(xiàn)itzGeraldDJP，GoldenbergDM，PastanI.含有抗體LL2或LL2-Fab’的以假單孢菌外毒素為基礎(chǔ)的免疫毒素誘導(dǎo)小鼠中皮下人B-細(xì)胞淋巴瘤的退化。CancerRes.53819-825(1993)。LarsonSM，CheungN-KV，LeibelSA.放射同位素綴合物。InDeVitaVT，Hell-manS，RosenbergSA(Eds.).癌癥的生物治療。J.B.LippincottComp.，Phila-delphia，496-511(1991)。MulshineJL，MagnaniJL，LinnoilaRI單克隆抗體在治療固體癌中的應(yīng)用。InDeVitaVT，HellmanS，RosenbergSA(Eds.).癌癥的生物治療。J.B.LippincottComp.，Philadelphia，pp563-588(1991)。NesbitM，F(xiàn)uZF，McDonald-SmithJ，SteplewskiZ，CurtisPJ.從桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)一種能識(shí)別人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的功能單克隆抗體。J.Immunol.Methods151201-208(1992)。PerkinsAC，PimmMV.癌免疫和免疫治療中γ閃爍照相法的作用。Eur.J.Nucl.Med.191054-1063(1992)。PressOW，EaryJF，BadgerCC，MartinPJ，AppelbaumFR，LevyR，MillerR，BrownS，NelpWB，KrohnKA，F(xiàn)isherD，DeSantesK，PorterB，KiddP，ThomasED，BemsteinID.用放射標(biāo)記的MB-1(抗-CD37)抗體治療頑固的Non-Hodgkin’s淋巴癌。J.Clin.Oncol.71027-1038(1989).Rudy，W，Hofnann，M.，Schwartz-Albiez，R.，Zoller，M.，Heider，K.-H.，Ponta，H.，Herr-lich，P.在轉(zhuǎn)移性的大鼠腫瘤細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