專利名稱：生產(chǎn)核酸的拷貝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生至少是部分核酸鏈的拷貝的方法。
在遺傳工程領(lǐng)域，經(jīng)常有這樣的情況樣品中僅存在非常少量的核酸，而以研究或診斷測(cè)試為目的，則需要大量的全序列或部分序列核酸。也就是說(shuō)，可能需要知道某種特定的核酸是否存在于樣品中(比如確定一個(gè)人是否被一種特定的病毒感染，可以是DNA，也可以是RNA，或者確定在他們的核酸中存在或不存在有特定的序列)。如果存在于樣品中的話，由于核酸的量是低于可檢測(cè)限度的，所以需要對(duì)樣品做擴(kuò)增反應(yīng)，這樣即可產(chǎn)生更多量的核酸(如果存在的話)。然后，可通過(guò)檢測(cè)來(lái)確定核酸的存在與否。如果檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的，則證明核酸存在于原始樣品中。相反地，若結(jié)果為陰性的，那么可以證明核酸不存在于原始樣品中。
本發(fā)明涉及不同的技術(shù)，用這些技術(shù)，可以使存在于或潛在存在于樣品中的核酸得到擴(kuò)增，產(chǎn)生大量核酸。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種方法，用該方法可以產(chǎn)生至少是部分核酸鏈(“靶鏈”)的拷貝，靶鏈?zhǔn)谴嬖谟诨驖撛诖嬖谟跇悠分械模痉椒ò铝胁襟E(i)提供了一種固相支持系統(tǒng)，其上固著有大量的單鏈寡核苷酸，這些平鏈寡核苷酸能同靶鏈雜交。(ii)(a)清洗支持系統(tǒng)以除去未雜交物質(zhì)。(iii)產(chǎn)生靶1鏈的拷貝，該鏈摻入了固相的寡核苷酸及包含同至少是部分靶鏈互補(bǔ)的核苷酸序列，也就是說(shuō)生成的靶1鏈拷貝中至少有一部分是以靶鏈為模板而生成的，并且，如果需要，可以是靶1序列拷貝的全部。(iv)使同靶1鏈拷貝相雜交的靶鏈變性，然后可選擇使至少是部分的靶鏈同支持系統(tǒng)上的尚未轉(zhuǎn)變?yōu)榘?鏈拷貝的寡核苷酸再雜交。(v)同時(shí)，(a)用固定于固相支持物上的靶1鏈拷貝作為模板來(lái)生成(從雜交干靶1鏈上的引物來(lái)生成)靶2鏈拷貝，該鏈包括了感興趣的核酸序列，并且(b)用靶鏈為模板，如果他們已經(jīng)同固定的寡核苷酸雜交了的話，再次產(chǎn)生至少是部分的靶1鏈拷貝，并且(如果需要)，可完成靶1鏈的形成，并且(vi)按所需要的次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，在每次重復(fù)步驟(iv)和(v)時(shí)，用靶2鏈拷貝來(lái)進(jìn)一步生成靶1鏈拷貝。
如前所述，本發(fā)明的方法對(duì)于含有或不含感興趣的核酸的樣品均有效。如果核酸不存在，那么上面列出的步驟(iii)-(vi)將不會(huì)導(dǎo)致靶1鏈拷貝和靶2鏈拷貝的產(chǎn)生。此外，不能生成靶2鏈拷貝提供了有價(jià)值的信息，因?yàn)樵趯?shí)行的檢測(cè)步驟中，將確定靶2鏈拷貝的存在，若結(jié)果為陰性，則證明靶鏈不存在于原樣品中。
清洗步驟(ii)(a)使得未雜交物質(zhì)從支持系統(tǒng)上被移去，這樣使得用于步驟(iii)中的靶鏈樣品將是無(wú)污染的。因而，在原樣品中存在的污染物將不會(huì)參與本發(fā)明方法的其后的反應(yīng)。
在步驟(iv)中，靶鏈可同支持物上的未延伸寡核苷酸再雜交。或者在步驟(v)之前，可將原始的靶鏈從固相支持系統(tǒng)上移去。
按以下所述操作也是可取的在整個(gè)的從步驟(iii)-(vi)的順序操作中，在每次雜交反應(yīng)后和/或在每次鏈合成反應(yīng)后和/或連接反應(yīng)后，洗滌固相支持系統(tǒng)和/或移去反應(yīng)試劑。這樣，比如，在步驟v(b)中引入的過(guò)量的引物就可在(至少是部分的另外的)靶1鏈拷貝產(chǎn)生前被去除。
寡核苷酸優(yōu)選地共價(jià)同固相支持物相聯(lián)。優(yōu)選地，固相支持系統(tǒng)是是一種顆粒組成的系統(tǒng)并且寡核苷酸是固定于顆粒之上的。顆粒組成的支持系統(tǒng)的應(yīng)用是其自聲權(quán)利的一個(gè)重要特征。并且因此根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，用該方法可以產(chǎn)生至少是部分的核酸鏈(靶鏈)的拷貝，其中靶鏈?zhǔn)谴嬖谟诨驖撛诖嬖谟跇悠分?，本方法包括以下步驟(i)提供了一種顆粒組成的固相支持系統(tǒng)，其上固定有大量的單鏈寡核苷酸，這些寡核苷酸可同靶鏈雜交。(ii)提供了單鏈形式的靶鏈并且可使靶鏈同支持物上的寡核苷酸鏈雜交，寡核苷酸鏈的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于靶鏈的數(shù)量。(iii)產(chǎn)生靶1鏈拷貝，其摻入了固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶鏈互補(bǔ)的核酸序列，也就是說(shuō)生成的靶1鏈拷貝至少有一部分是以靶鏈為模板而生成的，并且，如果需要，可以完成靶1序列拷貝的形成。(iv)變性同靶1鏈拷貝相雜交的鏈并且可任選將至少是部分的先前的靶鏈同支持物上的尚未轉(zhuǎn)化為靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交。(v)同時(shí)，(a)用固定于固相支持物上的靶1鏈拷貝作為模板來(lái)生成靶2鏈(從同靶1鏈拷貝雜交的引物上生成)，該鏈包括感興趣的核酸序列，并且，(b)用靶鏈作為模板，如果靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，來(lái)進(jìn)一步生成至少是部分的靶1鏈拷貝，并且(如果需要)可完成靶1鏈拷貝，而且(vi)按所需次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，在步驟(iv)和(v)的每次重復(fù)中，用靶2鏈拷貝來(lái)進(jìn)一步生成靶1鏈拷貝。
本發(fā)明的第二個(gè)方面的一個(gè)優(yōu)選的特性是，步驟(ii)之后，在執(zhí)行步驟(iii)之前，可以洗滌顆粒固相支持物以移去未雜交的物質(zhì)。
優(yōu)選的顆粒是非多孔型硅石，并且優(yōu)選大小在50到200微米間的顆粒(更優(yōu)選的是大小在100到200微米間)。這些顆?？梢院薪宦?lián)的硅氧烷基質(zhì)，其中含有能同寡核苷酸反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)(比如環(huán)氧基團(tuán))，這樣，通過(guò)硅氧烷基質(zhì)就可將寡核苷酸固定于支持物上。合適的顆粒在WO-A-93/13220(Tepnd)中有敘述。
更優(yōu)選的是這些固相支持物上應(yīng)被裝入一個(gè)柱中，這樣液體就可以容易地加入或移出。這樣的柱子的應(yīng)用可以使得反應(yīng)物(比如雜交緩沖液，核苷酸)能被容易地加入到反應(yīng)體系中。再者，在任意一步完成后，可以簡(jiǎn)便地對(duì)柱進(jìn)行洗滌以移去過(guò)剩的反應(yīng)物等，以便留下潔凈的樣品用來(lái)進(jìn)行下一步反應(yīng)。
在WO-A-93/13220中揭示了一種合適的柱子的制備法。
在上面的方案中，靶1鏈拷貝可通過(guò)許多途徑產(chǎn)生。首先，支持物上的寡核苷酸的定向可以使其作為引物(用雜交于其上的靶鏈或靶2鏈拷貝作為模板)在步驟(v)(b)中延伸從而直接產(chǎn)生靶1鏈拷貝。其次，定向的寡核苷酸也可能不能按前項(xiàng)所述的方式延伸。在這種情況下，需要加入游離的引物，這些引物同已經(jīng)與固定的寡核苷酸雜交的靶鏈或靶2鏈拷貝進(jìn)行雜交，然后向寡核苷酸方向延伸，結(jié)果最后同寡核苷酸會(huì)合并共同完成靶1鏈拷貝的制備。
本發(fā)明方法的一個(gè)特征是，在步驟(ii)中，固相支持系統(tǒng)上的寡核苷酸的數(shù)量要大大多于將與之雜交的靶鏈的量。此處所說(shuō)的大大多于指的是支持物上的寡核苷酸的總量要比徑步聚(ii)中引入的靶鏈的量多10倍，更優(yōu)選的是多至少100倍，并且多至少1000倍則更佳。
步驟(v)(a)導(dǎo)致了靶2鏈拷貝的生成，該鏈包括有感興趣的核酸序列，在步驟(v)的最后(包括除了用固定于支持物上的寡核苷酸外還用液相的引物)，靶2鏈拷貝同靶1鏈拷貝雜交，在先執(zhí)行步驟(v)之后，靶2鏈拷貝數(shù)較未延伸的寡核苷酸要低。因此，在第一次重復(fù)步驟(iv)時(shí)，靶2鏈拷貝(已經(jīng)經(jīng)變性從靶1鏈拷貝上解離下來(lái))將趨向于同未延伸的寡核苷酸雜交，而同靶1鏈拷貝進(jìn)行再雜交的趨勢(shì)則較前者小。這樣，在重復(fù)步驟(v)(b)時(shí)，靶2鏈拷貝同寡核苷酸的雜交將導(dǎo)致產(chǎn)生更多的靶1鏈拷貝，同時(shí)在步驟(v)(a)中更多的靶2鏈拷貝也將產(chǎn)生(通過(guò)先前生成的靶1鏈拷貝產(chǎn)生)。
步驟(iv)和(v)可按需要不斷重復(fù)。至少在此過(guò)程的前幾個(gè)循環(huán)中，每次生產(chǎn)步驟(v)都將生成更多量的靶2鏈拷貝，同時(shí)，當(dāng)然也將會(huì)使未經(jīng)延伸的寡核苷酸的量減少。這樣的早期階段將會(huì)使靶2鏈拷貝的數(shù)目呈幾何增長(zhǎng)。在每次重復(fù)后續(xù)步驟(iv)后，靶2鏈拷貝同靶1鏈拷貝進(jìn)行再雜交的可能性均將增長(zhǎng)，這樣的結(jié)合不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生更多的靶1鏈拷貝或靶2鏈拷貝。假若步驟(iv)和(v)重復(fù)得足夠地多，那么將有這樣一點(diǎn)，在此點(diǎn)所有的或基本上所有的支持物上的原始的寡核苷酸都被延伸并產(chǎn)生了靶1鏈拷貝。若反應(yīng)的進(jìn)行能夠達(dá)到此點(diǎn)，則是理想的。
步驟(f)的產(chǎn)物包括其上固著有雙鏈核酸的固相支持系統(tǒng)。更確切地說(shuō)，雙鏈包括一條鏈?zhǔn)前?鏈拷貝，該鏈摻入有固定于支持物上的原始寡核苷酸，另一條鏈?zhǔn)桥c靶1鏈拷貝雜交的靶2鏈拷貝，該鏈摻入有感興趣的原始靶鏈的順序的拷貝。原始順序被復(fù)制的真實(shí)程度將依賴于諸如(i)在步驟(ii)中同寡核苷酸雜交的靶鏈的區(qū)域，和(ii)有步驟e(i)中同引物相雜交的靶1鏈拷貝的區(qū)域。
步驟(f)的產(chǎn)物可用于多種用途。首先，靶2鏈拷貝可從固定的靶1鏈拷貝上經(jīng)變性解離下來(lái)。經(jīng)收集，就可得到增量的感興趣的序列(增量是指同原始靶鏈的量相比)。一旦靶2鏈拷貝經(jīng)變性并被從系統(tǒng)中移去，就可得到一固相支持系統(tǒng)，該系統(tǒng)可至少再用一次，以產(chǎn)生更多量的感興趣的序列，這一流程包括(vii)將引物同位點(diǎn)上的靶1鏈拷貝雜交，這樣，引物延伸后的產(chǎn)物是以靶1鏈拷貝為模板并包含有感興趣的序列。(viii)以靶1鏈拷貝作為模板延伸引物，并且(ix)產(chǎn)物鏈經(jīng)變性從靶1鏈拷貝上解離并收集產(chǎn)物鏈。
步驟(vii)-(ix)優(yōu)選重復(fù)至少一次，優(yōu)選地是重復(fù)多次。每次重復(fù)步驟(vii)-(ix)產(chǎn)生的產(chǎn)物鏈的量基本相同。因此，以這種累加為基礎(chǔ)，重復(fù)步驟(vii)-(ix)導(dǎo)致的產(chǎn)物鏈的量的增加是線性的。為了最大限度地得到產(chǎn)物鏈，很明顯希望所有的或基本上所有的原始寡核苷酸均轉(zhuǎn)化為靶1鏈拷貝。
步驟(vi)或步驟(viii)中得到的產(chǎn)物的另一種用途是可用限性內(nèi)切酶酶切雙鏈，使之從支持物上脫落，這種雙鏈產(chǎn)物可以克隆入一種載體或用作其它任意的用途。
應(yīng)該清楚，本發(fā)明方法所產(chǎn)生的核酸能通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)，比如用酶標(biāo)的可同核酸雜交的寡核苷酸檢測(cè)。
本發(fā)明的方法可通過(guò)多種途徑實(shí)施。
在第一種實(shí)施方案中，固定于固相支持系統(tǒng)上的寡核苷酸的方向是，當(dāng)靶鏈雜交于其上并運(yùn)用合適的酶系統(tǒng)時(shí)，寡核苷酸本身可延伸產(chǎn)生靶1鏈拷貝。這通常意味著寡核苷酸是通過(guò)它們的5′末端同固相支持系統(tǒng)相連，從而使延伸過(guò)程從5′向3′延伸。
在這個(gè)實(shí)施方案中，用于步驟(v)(a)中，生成靶2鏈拷貝的引物為液相引物，該引物可同靶1鏈拷貝的遠(yuǎn)離支持物的一端的位點(diǎn)雜交，并向支持物端延伸以生成靶2鏈拷貝。應(yīng)當(dāng)理解在生成靶2鏈拷貝時(shí)，通過(guò)延伸固定的寡核苷酸可產(chǎn)生更多的靶1鏈拷貝(固定于支持物上)。
在最簡(jiǎn)單的實(shí)施方法中，本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案用了一種固相支持系統(tǒng)，其上摻入有一種固定的寡核苷酸(用于同二條核酸鏈的一條靶鏈雜交)。在對(duì)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案的改進(jìn)方案中，固相支持系統(tǒng)上包含有二種不同的固定的寡核苷酸，一種寡核苷酸可同雙鏈核酸中的一條鏈雜交，而第二種寡核苷酸可同雙鏈核酸的另一條鏈雜交。應(yīng)當(dāng)理解伴隨這種改進(jìn)，就可以生成兩類的靶2鏈拷貝，這二類拷貝是互補(bǔ)的并且(當(dāng)雜交在一起時(shí))可以生成至少是部分的原始雙鏈序列。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，固定于固相支持系統(tǒng)上的寡核苷酸的方向是，當(dāng)靶鏈同其雜交后，需引物再同靶鏈雜交并且(用合適的酶系)向著寡核苷酸延伸引物。在此種情況下，要完成靶1鏈拷貝的制備，需將引物延伸產(chǎn)物同寡核苷酸相連。本發(fā)明的這一實(shí)施方案通常意味著寡核苷酸足以其3′末端同固相支持系統(tǒng)相聯(lián)，引物(雜交于靶鏈上)的延伸是按5′到3′的方向向著支持物端進(jìn)行延伸的。
對(duì)于本發(fā)明中的第二種實(shí)施方案，固相支持系統(tǒng)可以包括一種類型的固定的寡核苷酸或包括二種類型的固定的寡核苷酸，以產(chǎn)生互補(bǔ)的靶2鏈拷貝。
也可以將本發(fā)明實(shí)施方案1和實(shí)施方案2相結(jié)合以便使固相支持系統(tǒng)摻入有二種固定的寡核苷酸(同本發(fā)明的實(shí)施方案3相一致)，即(i)第一種本身可延伸以產(chǎn)生靶1鏈拷貝(正如本發(fā)明實(shí)施例1)的寡核苷酸，和(ii)第二種需要同引物延伸得到的產(chǎn)物連接的寡核苷酸(為了生成靶1鏈拷貝)，該引物是同靶鏈雜交的。
正如上面所述，固相支持系統(tǒng)可以摻入二種不同的固定的寡核苷酸，一種可同雙鏈核酸的一條鏈雜交，而另一種則可同雙鏈核酸的另一條鏈雜交。就本發(fā)明自身權(quán)利而言，這是一個(gè)重要的特性，因而根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種方法，用該方法可生成至少是部分的核酸鏈的拷貝，這些核酸存在于或潛在存在于樣品中，該方法包括以下步驟(i)提供了一種固相支持系統(tǒng)，其上固定有大量的二種不同的單鏈寡核苷酸0和0′，此二種寡核苷酸可以分別同雙鏈核酸的二條互補(bǔ)鏈中的一條雜交，也就是說(shuō)互補(bǔ)雙鏈提供了靶1鏈和靶1′鏈，(ii)提供了單鏈形式的靶1和靶1′鏈并且使靶鏈同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數(shù)量基本超過(guò)靶鏈的數(shù)量，(iii)生成靶1和1′鏈的拷貝，每個(gè)拷貝均摻入有寡核苷酸0或0′中的一種，以及包含有同至少是部分靶1或靶1′鏈互補(bǔ)的一段核酸序列，即靶1或1′鏈的拷貝的合成至少在部分上是以各自的靶鏈為模板而分別進(jìn)行的，從而產(chǎn)生了至少是部分的靶1或靶2鏈的拷貝。并且，如果需要，可生成全部的靶1和/或靶2的序列的拷貝，(iv)變性同靶1鏈拷貝相雜交的鏈并且可任選使至少是一部分前述的鏈同支持物上的有未轉(zhuǎn)化為靶1鏈的寡核苷酸再雜交，(v)同時(shí)(a)以固定于固相支持物上的靶1鏈拷貝為模板來(lái)生成靶2鏈拷貝(通過(guò)延伸同靶1鏈拷貝相雜交的引物實(shí)現(xiàn))，后者含有感興趣的核酸序列，并且(b)如果該靶鏈已雜交于固定的寡核苷酸上的話，則用該靶鏈作為模板來(lái)進(jìn)一步產(chǎn)生至少含部分靶1鏈的拷貝，并且(如果需要)可生成全部的靶1鏈拷貝，并且(vi)按所需次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，以靶2鏈拷貝為模板，每次重復(fù)步驟(iv)和(v)都將進(jìn)一步生成靶1鏈的拷貝。
本發(fā)明將用與附圖有關(guān)的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，其中

圖1描述了裝置的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法可通過(guò)此種裝置實(shí)施；圖2簡(jiǎn)要描述了本發(fā)明實(shí)施方案1中的各步的過(guò)程；圖3簡(jiǎn)要描述了本發(fā)明實(shí)施方案1中的一個(gè)另外的流程；圖4簡(jiǎn)要描述了本發(fā)明實(shí)施方案2的流程；圖5簡(jiǎn)要描述了本發(fā)明第二種實(shí)施方案中的一個(gè)另外的流程；圖6簡(jiǎn)要描述了本發(fā)明的第三種實(shí)施方案的一個(gè)的流程；圖7簡(jiǎn)要描述了本發(fā)明第三種實(shí)施方案的一個(gè)另外的流程；圖8和圖9圖示實(shí)施例1的結(jié)果；并且圖10和圖11圖示實(shí)施例2的結(jié)果。
首先參看圖1，圖中所示的裝置包括一個(gè)可流動(dòng)通過(guò)的柱子1，柱中間是一個(gè)橫放的隔板，隔板上有顆粒支持物PA，隔板下是顆粒支持物PB。PA和PB分別含有固定于其上的寡核苷酸3和4，詳情見(jiàn)下。隔板2可允許液體流過(guò)但顆粒PA和PY不能通過(guò)。但是也可以不要隔板2而將支持物PA和PB混合在一起，這樣亦可行。
同柱2相連的是進(jìn)流裝置，如圖所示?？杉尤腚s交緩沖液，酶，核苷酸及清洗液。此外同柱2相連的還有貯存器5，從柱中流出的產(chǎn)物可注入其中并且也可將其中的產(chǎn)物再重新上柱。提供的加熱器6是在需要時(shí)加熱柱1的。最后，圖示的多個(gè)閥門的使用是用來(lái)將試劑加入或移出柱中。將液體加入或移出柱子可用注射器實(shí)現(xiàn)，比如正排量(positivedisplacement)注射器。
支持物PA和PB可以是如WO-A-93/13220中所述那樣。這樣，支持物是固相二氧化硅，其外表有硅氧烷基質(zhì)，寡核苷酸3和4可(分別)結(jié)合于該基質(zhì)上。寡核苷酸同支持物結(jié)合的方式在WO-A-93/13200中有記述。
支持物PA和PB僅在結(jié)合的寡核苷酸上有區(qū)別。考慮到DNA分子包含互補(bǔ)可雜交的鏈A和鏈B。固定于支持物PA上的寡核苷酸可同鏈A(當(dāng)從鏈B上變性解離)雜交，同時(shí)，支持物PB上的寡核苷酸可以同鏈B雜交。
現(xiàn)在來(lái)參看圖2，該圖顯示了本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施例的運(yùn)用，可用來(lái)生產(chǎn)令人感興趣的雙鏈序列的拷貝，雙鏈序列分別含有X、Y序列。柱子包括兩類顆粒，圖2中稱為P1和P2。為了圖解，鏈X和Y在其末端區(qū)假定含有任意的堿基序列。
所包括的步驟如下1.含靶序列的DNA或者是柱外變性后然后加入柱中，或者是雙鏈DNA先加入柱中再原位變性。這二種情況中，DNA的變性是通過(guò)升高溫度或同化學(xué)物質(zhì)接觸實(shí)現(xiàn)，這在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。任意一種情況下，變性DNA在柱中同支持物混合。然后將柱子降溫，以使得靶物同顆粒上的寡核苷酸是可進(jìn)行雜交。雜交反應(yīng)在一很精確的溫度下發(fā)生，該溫度對(duì)于支持物上的核酸順序同靶物順序的結(jié)合是特異的(稱為反應(yīng)的Tm(熔解溫度))。Tm由靶序列中堿基的組成比率決定。含高的AT比值的DNA在均低的溫度下熔解，而含高的GC比值的DNA的熔解溫度則較高(在任意給定鹽濃度下)。
如圖所示，序列X(靶)的3′末端具有序列AAAA。(通過(guò)5′末端)固定于顆粒P1上的寡核苷酸含有序列TTTT，即該序列可同序列X的3′末端雜交，因而該鏈可被捕獲(步驟(b))。
Z鏈(靶)，如圖所示，在其3′末端有序列GGGG。(通過(guò)5′末端)固定于顆粒P2上的寡核苷酸有序列CCCC，其可同Y鏈3′末端區(qū)雜交，因此此鏈也可被捕獲(步驟(b))。2.在清洗柱子移去雜質(zhì)(包括非靶物質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)均有抑制作用)，脂類及鹽后，柱子繼續(xù)使用一種緩沖液清洗，該緩沖液對(duì)于方案中下一步的進(jìn)行是有益的。然后加入聚合酶及核苷酸來(lái)延伸柱上結(jié)合的寡核苷酸，這些寡核苷酸可作為引物，因而可從引物復(fù)制被捕獲的鏈(步驟(c))從而生成固定于支持物上的靶1鏈拷貝。3.一旦反應(yīng)完成，可清洗柱子以除去不想要的(未用的)試劑。4.其后，可將靶鏈從固定的靶1鏈拷貝上經(jīng)變性解離(步驟(d))并且可同未經(jīng)延伸的寡核苷酸再雜交，因?yàn)槲唇?jīng)延伸的寡核苷酸的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原始的雙鏈分子的最初的量。5.在下一步(步驟(f))中，如圖所示，具有序列TTTT和CCCC的游離引物(溶相)被加入并同共價(jià)聯(lián)結(jié)顆粒P1和P2的那些鏈雜交。通過(guò)清洗步驟將過(guò)量的游離引物洗出柱子。6.現(xiàn)在加入酶和核苷酸(步驟(g))，以便使對(duì)于每個(gè)P1和P2顆粒，兩個(gè)延伸反應(yīng)都同時(shí)發(fā)生，即(i)延伸那些同核酸鏈雜交，并被共價(jià)固定于支持物上的寡核苷酸(比如P1上的)TTTT(這一反應(yīng)的方向是遠(yuǎn)離支持物P1和P2的)以生成靶1鏈拷貝，并且(ii)延伸那些同共價(jià)固定于支持物上的鏈相雜交的游離引物(比如對(duì)于P1是CCCC)(這一么應(yīng)發(fā)生的方向是朝向支持物P1和P2)，這樣生成靶2鏈拷貝。
步驟(i)可使在顆粒P1上合成共價(jià)固定于支持物上的序列Z，另外該步可使在顆粒P2上合成共價(jià)固定于支持物上的序列X。步驟(ii)可導(dǎo)致顆粒P1上的序列X及顆粒P2上的序列Z的合成。這是以幾何級(jí)數(shù)復(fù)制靶DNA的開(kāi)始。7.然后可以清洗柱以移去不需要的試劑。8.步驟(d)-(g)可按照所需次數(shù)重復(fù)。
在支持物上有大量過(guò)量的原始的固定寡核苷酸。因而，本過(guò)程起初的循環(huán)將按下進(jìn)行(只考慮顆粒P1)。假定在步驟(g)結(jié)束時(shí)，顆粒P1有二條共價(jià)固定的鏈Z及二條同鏈Z雜交的鏈X。在第一次重復(fù)步驟(d)-(n)時(shí)，隨之的結(jié)果將是4條鏈X和鏈Z。在下一次重復(fù)后將每鏈有8條，等等。然而這種指數(shù)增長(zhǎng)將受到固定于支持物上的寡核苷酸數(shù)目的限制。這樣，步驟(g)中合成的雜交鏈的量將漸漸增至這樣的水平在隨后的變性和再雜交步驟中(步驟(d)和(e))，一些鏈X將同未延伸的寡核苷酸雜交。而另外一些將同鏈Z雜交，而鏈Z是通過(guò)延伸固定的引物得到的。最后，所有固定引物都將被延伸并且顆粒P1上的雙鏈核酸將會(huì)飽和。(該結(jié)論對(duì)于P2同樣有效)。
雙鏈核酸可以從支持物上切下來(lái)(用合適的限性酶)。另一辦法是將步驟(g)中得到的靶2鏈拷貝產(chǎn)物經(jīng)變性從支持物上解離下來(lái)。然后重復(fù)下列步驟，用其來(lái)產(chǎn)生按線性增長(zhǎng)的靶2鏈拷貝。(i)將引物CCCC和TTTT同固定的靶1鏈拷貝雜交，(ii)延伸引物，并且(iii)變性并收集延伸產(chǎn)物(即靶2鏈拷貝)。
現(xiàn)在來(lái)談圖3，該圖顯示了圖2所示方案的一個(gè)改進(jìn)方案。圖3中的方案以一雙鏈核酸開(kāi)始，其中其X鏈有任意序列，正如圖示。在5′端為A，3′端為B，而另一條鏈則有任意末端序列C、D(A同C互補(bǔ)，B同D互補(bǔ))。在A和B之間，部分的X鏈為序列L，同Y鏈上的序列M互補(bǔ)。
提供兩類顆粒P1和P2。顆粒P1上帶有大量的序列為M的寡核苷酸，后者通過(guò)5″末端固定于(顆粒支持物P1)上。顆粒P2上帶有大量的序列為L(zhǎng)的寡核苷酸，后者通過(guò)5′末端固定于(顆粒支持物P2)上。
圖3中的方案同圖2中的一樣，也包括方案的各個(gè)步驟，因此不再贅述。但下列幾點(diǎn)需要指出在圖2的方法中，兩個(gè)固定的寡核苷酸(TTTT和CCCC)使得合成出的靶1鏈拷貝有互補(bǔ)的堿基序列。這是由于一條寡核苷酸(CCCC)同序列X的末端相對(duì)應(yīng)，而另一寡核苷酸(TTTT)同序列Z鏈的另一末端相對(duì)應(yīng)。
與之相比，在圖3的方法中，鏈X是通過(guò)其中間區(qū)L同顆粒P1上的寡核苷酸M相雜交并且鏈Z是通過(guò)其中間區(qū)M同顆粒P2上的寡核苷酸L相雜交。在下面的延伸步驟中(步驟(c))，顆粒P1上產(chǎn)生的靶1鏈拷貝有如下序列5′M……………………………C3′同時(shí)顆粒P2上產(chǎn)生的則有如下序列5′L……………………………B3′這樣，這二種靶1鏈拷貝是不互補(bǔ)的。
在步驟(e)中，顆粒P1上靶2鏈拷貝產(chǎn)物的序列為3′L……………………………A5′這代表了部分的原始鏈X的拷貝，同樣，顆粒P2產(chǎn)生的靶2鏈拷貝產(chǎn)物的序列為3′M……………………………D5′也只代表了部分的原臺(tái)鏈Z的拷貝。
現(xiàn)在來(lái)說(shuō)明圖4，圖4顯示了本發(fā)明的第二種實(shí)施方案。
本方法以雙鏈DNA開(kāi)始，DNA含二鏈X、Y。在柱中用了二種顆粒P3和P4。
第一種顆粒P3上，寡核苷酸GGGG(通過(guò)其3′末端)固定于P3上，其可同鏈X的5′末端雜交。
寡核苷酸AAAA(也通過(guò)其3′末端)固定于另一種顆粒P4上，其將與鏈Z的5′末端區(qū)雜交。
變性靶DNA并同顆粒P3和P4雜交后，清洗顆粒去除污染物(同前)。雜交反應(yīng)捕獲感興趣的序列。
加入兩種游離產(chǎn)物(CCCC和TTTT)并同顆粒結(jié)合的DNA雜交。引物(TTTT)將同鏈X3′末端區(qū)雜交。另一引物(CCCC)將同鏈Z的3′末端雜交(步驟c)。
然后清洗顆粒來(lái)除去多余的試劑。
向柱中加入酶的核苷酸(也有這樣的可能，即此步中同時(shí)加入引物)并且進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸反應(yīng)將引物向支持物的方向延伸，但不連接到固定的寡核苷酸上(步驟d)?！?*”在步驟(d)產(chǎn)物中代表延伸產(chǎn)物不同固定的寡核苷酸連接。
加入DNA連接酶使延伸(引物所得的)產(chǎn)物同固定的寡核苷酸連接，這樣就產(chǎn)生了固定于支持物上的靶1鏈拷貝(步驟e)。
在變性和再雜交后(步驟f)，再加入二種引物TTTT和CCCC。引物TTTT，同P4顆粒上的靶1鏈拷貝的3′末端雜交，并且也同顆粒P3上的已雜交的核酸雜交。同樣，引物CCCC也同固定于顆粒P3上的靶1鏈拷貝3′末端雜交，并且亦同顆粒P4上的已雜交的核酸雜交。
清洗柱子以除去過(guò)剩試劑。加入聚合酶及核苷酸并進(jìn)行延伸反應(yīng)(步驟g和h)。引物照?qǐng)D所示延伸(產(chǎn)生靶2鏈拷貝)，然后(在清洗柱后)來(lái)進(jìn)行連接反應(yīng)，來(lái)完成在支持物P3和P4上的靶1鏈拷貝的制備。
步驟(f)-(i)可按所需次數(shù)重復(fù)以生成大量的靶1拷貝鏈和靶2拷貝鏈。后者最終被作為產(chǎn)物收集而前者(固定于其支持物上)可用來(lái)按前述的辦法生產(chǎn)更多的靶2鏈拷貝。
現(xiàn)在來(lái)談圖5，該圖顯示了圖4中方案的一個(gè)改進(jìn)方案。
同圖3中相同，圖5中方案也以同樣的雙鏈DNA開(kāi)始。此外，圖5中的方法用二種類型的顆粒，稱為顆粒P3，序列為M的寡核苷酸通過(guò)其3′末端固定于P3上，顆粒P4，序列為L(zhǎng)的寡核苷酸通過(guò)其3′末端轉(zhuǎn)化于P4上。
圖5中的方法的各步反應(yīng)次序同圖4中的一樣。圖5中的方法的產(chǎn)物包括固定有靶1鏈拷貝序列的支持物3′M…………………………D5′和3′L…………………………A5′這些支持物可用來(lái)產(chǎn)生更多的這些序列5′L…………………………B3′和5′M…………………………C3′這些序列存在于原雙鏈核酸中。
現(xiàn)在來(lái)說(shuō)明圖6，該圖敘述了一種方法，該方法同本發(fā)明的第三種實(shí)施方案一致，是圖2和圖4中方法的結(jié)合。在圖6的方法中，第一種類型的顆粒通過(guò)3′末端(參看圖2中的P1顆粒)P5捕獲序列X(原始雙鏈核酸中的X序列)。第二種類型的顆粒P6則通過(guò)5′末端(參看圖4中的顆粒P4)來(lái)捕獲序列Y。
總的反應(yīng)流程在圖6中描述。顆粒P5上進(jìn)行的反應(yīng)順序同顆粒P1上進(jìn)行的很相似。P6上進(jìn)行的各反應(yīng)步驟則同顆粒P4上進(jìn)行的一致。盡管顆粒P5和P6在一個(gè)柱中，但P6上發(fā)生的直接反應(yīng)對(duì)P5無(wú)影響。
圖6的方法中產(chǎn)生的支持物可用來(lái)產(chǎn)生增量的X和Y序列，X和Y序列是存在于原始核酸中的。
圖6中的方法可以經(jīng)改進(jìn)而按圖7所示進(jìn)行操作，它也是從圖3中所示的核酸類型開(kāi)始。在圖7中，顆粒P5上具有序列為M的并通過(guò)5′末端固定于P5上的寡核苷酸(參見(jiàn)圖3中的P1顆粒)，同樣，P6顆粒上具有序列為L(zhǎng)的并通過(guò)其3′末端固定于P6上的寡核苷酸(參看圖5中的P4顆粒)。圖7中的反應(yīng)的順序同圖5或圖6中的相同。在這些步驟中，顆粒P5的功能同圖3中的顆粒P1相同，而顆粒P6的功能同圖5中的顆粒P4的目同。
圖7中的方法產(chǎn)生的支持物可用來(lái)生成增量的下列序列3′M…………………………C5′和3′L…………………………A5′這些序列存在于原始核酸樣品中。
參考下面非限定性的實(shí)施例，該發(fā)明通過(guò)實(shí)施例來(lái)闡述。實(shí)施例1在本實(shí)施例中，“緩沖液”指包括10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl和1.5mM MgCl2的組合物。
24聚體寡核苷酸序列如下(I)(I)5′GGC GTC ATC ATG GTC ATA GCT GTT 3′將(I)通過(guò)其5′末端固定于顆粒支持物上(大小為105μm)，該顆粒以M-相的名子在3M有售，固定是用WO-A-93/13220(Tepnel)中描述的方法通過(guò)硅氧烷基質(zhì)的實(shí)現(xiàn)的。每克顆粒支持物中含50μmol的過(guò)量的序列(I)。
在5個(gè)流過(guò)柱(flow through)裝置中每個(gè)裝入2mg的支持物，柱子內(nèi)徑為2mm。支持物通過(guò)相距10mm的二塊過(guò)濾器板(frits)保持其位置。
向每個(gè)柱中加入25fmol的溶于緩沖液中的48聚體寡核苷酸，其序列(II)為(II)5′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC TATGAC CAT GAT TAC GCC 3′然后將柱子在95℃保溫10分鐘。將溫度減至72℃。這一流程將使序列(II)同固定的序列(I)雜交。
用緩沖液清洗柱子，并將溫度降至57℃，再向柱中加入緩沖液，其中含有4種dNTP，每種0.2mM，以及1.25單位的聚合酶(棲熱水生菌)。
將柱子保溫于57℃2分鐘以與之雜交的48聚體寡核苷酸作模板延伸固定的24聚體寡核苷酸(序列(I))。
然后將柱子的溫度增至95℃，保溫2分鐘使48聚體序列(II)同延伸序列(I)變性解離。
將柱溫冷卻至72℃，向其中加入緩沖液，該緩沖液含有4種dNTP，每種0.2mM，以及1.25單位聚合酶(棲熱水生菌)和25pmol的生物素化的24聚體寡核苷酸，其序列(ii)為(III)5′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′在72℃下保溫2分鐘以使序列II同未經(jīng)延伸的序列(I)雜交，并使序列(III)同已延伸的序列(I)雜交。然后將柱子冷卻至57℃，保溫2分鐘以延伸序列(I)和(III)。
收集一個(gè)柱子中的支持物作下面敘述的檢測(cè)步驟之用。
剩下的柱子用上面詳述的方案再作以下的循環(huán)95℃變性(2分鐘)，加入序列(II)并在72℃再雜交(2分鐘)，57℃延伸(2分鐘)(盡管可用更短的時(shí)間)。在4個(gè)、9個(gè)、19個(gè)和29個(gè)循環(huán)后，收集支持物。(因此這些樣品分別經(jīng)過(guò)了5次、10次、20次和30次的延伸反應(yīng))。
空白的實(shí)驗(yàn)按下面所述進(jìn)行。(a)一個(gè)柱子中含有其上固定有序列(I)的支持物及緩沖液。該柱用上面所述的方案來(lái)進(jìn)行循環(huán)，但不向其中補(bǔ)加核酸或反應(yīng)試劑。
所有收集到的樣品均用于下面的檢測(cè)方案。
收集的顆粒同鏈霉親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)。過(guò)量的復(fù)合物經(jīng)洗滌移去，然后用商業(yè)出售的堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)(Ampak exDako)來(lái)處理顆粒。處理能使樣品隨時(shí)間而顯色并可在490nm下觀測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖8，該圖為吸收值對(duì)擴(kuò)增溫育時(shí)間作圖。圖9是吸收值變化率對(duì)樣品經(jīng)歷的延伸循環(huán)數(shù)作用。
從這些數(shù)據(jù)可清楚地看出擴(kuò)增是指數(shù)擴(kuò)增。實(shí)施例2除了序列(I)、(II)和(III)用下列序列(Ia)，(Iia)和(IIIa)分別代替之外，實(shí)施例1中的方案被重復(fù)應(yīng)用。(Ia)5′ AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′(IIa)5′ GGC GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTGAAA TTG TTA TCC GCT 3′(IIIa)5′GGC GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT 3′此外，對(duì)照實(shí)驗(yàn)照下面的進(jìn)行(b)用非互補(bǔ)(同序列(I))的生物素化的24聚體寡核苷酸作探針檢測(cè)一個(gè)含有已延伸的序列(I)的柱，該探針序列為5′CGC CAT TCA GGC TGC CGA ACT GTT 3′(c)一個(gè)柱子，其上含有固定有已延伸的序列(I)的支持物，保溫于4℃中作為循環(huán)為0的對(duì)照。
結(jié)果分別作圖，即圖10和圖11?？稍俅慰闯鰯U(kuò)增是按指數(shù)進(jìn)行的。
應(yīng)該理解序列(II)和(Iia)是互補(bǔ)的。因?yàn)檫@樣就可通過(guò)用固定有序列(I)的顆粒同固定有序列(Ia)的顆粒的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)序列(II)和(IIa)的擴(kuò)增。
權(quán)利要求
1.一種生成至少是部分存在或潛在存在于樣品中的核酸鏈(靶鏈)拷貝的方法，該方法包括以下步驟(i)提供一種固相支持系統(tǒng)，其上固定有大量的能同靶鏈雜交的單鏈寡核苷酸。(ii)提供了靶鏈的單鏈形式并將其同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數(shù)量要大大超出靶鏈的數(shù)量，(ii)(a)清洗支持系統(tǒng)以除去未雜交的物質(zhì)，(iii)生成靶1鏈的拷貝，該拷貝摻入有固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶鏈互補(bǔ)的核苷酸序列，也就是說(shuō)生成的靶1鏈拷貝至少有一部分是以靶鏈為模板而生成的，并且，如果需要，可完成靶1鏈拷貝序列形成。(iv)變性同靶1鏈拷貝雜交的核酸鏈并且可選擇使至少是部分的前述鏈同支持物上的未轉(zhuǎn)變成靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交。(v)同時(shí)，(a)用固定于固相支持物上的靶1鏈拷貝為模板來(lái)合成(從雜交于靶1鏈拷貝的引物上合成)靶2鏈拷貝，靶2鏈拷貝含有感興趣的核酸序列，且(b)若靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，則可用其作為模板來(lái)合成更多的至少是部分的靶1鏈拷貝，并且(若需要)完成靶1鏈的形成，并且(vi)按所需次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，每次重復(fù)步驟(iv)和(v)均用靶2鏈拷貝來(lái)生成更多的靶1鏈拷貝。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的固相支持系統(tǒng)是一種顆粒系統(tǒng)，寡核苷酸被固定于顆粒上，
3.生成至少是部分核酸鏈(靶鏈)的拷貝的方法，靶鏈存在或潛在存在于樣品中，本方法包括步驟(i)提供一種顆粒固相支持系統(tǒng)，其上固定有大量的能同靶鏈雜交的單鏈寡核苷酸，(ii)提供了靶鏈的單鏈形式并且使靶鏈同固定于支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數(shù)量要大大超過(guò)靶鏈的數(shù)量，(iii)生成靶1鏈拷貝，該拷貝包括固定的寡核苷酸及同至少是部分靶鏈互補(bǔ)的核酸序列，即生成的靶1鏈拷貝至少有一部分是以靶鏈為模板而合成的，并且，如果需要，可完成靶1鏈拷貝序列的形成，(iv)變性同靶1鏈拷貝雜交的核酸鏈并且可選擇使至少部分的前述的鏈同支持物上的尚未轉(zhuǎn)變成靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交，(v)同時(shí)，(a)用固定于固相支持物上的靶1鏈拷貝為模板來(lái)生成(從雜交于靶1鏈拷貝的引物上合成)靶2鏈拷貝，靶2鏈拷貝含有感興趣的核酸序列，且(b)若靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，則可用其作為模板來(lái)進(jìn)一步合成更多的至少是部分的靶1鏈拷貝，并且(若需要)完成靶1鏈拷貝的形成，并且(vi)按所需次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，每次重復(fù)步驟(iv)和(v)均用靶2鏈拷貝來(lái)生成更多的靶1鏈拷貝。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在步驟(ii)后，在執(zhí)行步驟(iii)前清洗支持系統(tǒng)以移去未雜交的物質(zhì)。
5.權(quán)利要求2到4的任一項(xiàng)的方法，其中顆粒是非多孔性二氧化硅
6.權(quán)利要求2到5任一項(xiàng)的方法，其中顆粒的大小在50到200微米。
7.權(quán)利要求2到6任一項(xiàng)的方法，其中寡核苷酸是通過(guò)硅氧烷基質(zhì)固定于支持物上的。
8.權(quán)利要求2到7的任一項(xiàng)的方法，其中顆粒是在柱子中，液體可方便地加入或移出柱子。
9.權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的方法，其中所有的或基本上所有的固定于支持物上的原始寡核苷酸都轉(zhuǎn)變成靶1鏈拷貝。
10.權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的方法，其中支持物上的寡核苷酸的方向使得它們可以用靶鏈作為模板進(jìn)行延伸或者是用雜交于其上的靶2鏈拷貝作為模板進(jìn)行延伸，以產(chǎn)生靶1鏈拷貝。
11.權(quán)利要求2的方法，其中固相支持系統(tǒng)上包含兩種不同的固定的寡核苷酸，其方向如權(quán)利要求10中所述，一種的方向是使其能同雙鏈核酸的一條鏈雜交，另一種的方向是使其同雙鏈核酸的另一條鏈雜交。
12.權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的方法，其中靶1鏈拷貝是這樣產(chǎn)生的，使引物同已經(jīng)與固定的寡核苷酸雜交的靶拷貝或靶2鏈拷貝雜交，然后在步驟(v)(b)中向著寡核苷酸方向延伸引物，最后通過(guò)與寡核苷酸的連接來(lái)完成靶1鏈拷貝的制備。
13.權(quán)利要求11的方法，其中固相支持物上包含兩種不同的固定的寡核苷酸，其方向和權(quán)利要求12中所述，一種的方向是使其能同雙鏈核酸的一條鏈雜交，另一種的方向是使其能同核酸的另一條鏈雜交。
14.權(quán)利要求1到13的任一項(xiàng)的方法，其中固相支持系統(tǒng)包含兩種固定的寡核苷酸，包括(i)第一種可通過(guò)延伸其自身來(lái)生成靶1鏈拷貝的寡核苷酸，(ii)第二種(為了生成靶1鏈拷貝)需要同引物延伸生成的產(chǎn)物連接的寡核苷酸，引物同靶鏈雜交。
15.產(chǎn)生至少是部分存在于或潛在存在于樣品中的核酸鏈拷貝的方法，該方法包括下列步驟(i)提供了一種固相支持系統(tǒng)，其上固定有大量的兩種單鏈寡核苷酸0和0′中的每一種，每種寡核苷酸可同雙鏈核酸互補(bǔ)鏈中的一條雜交，互補(bǔ)的核酸二條鏈稱為靶1鏈和靶1′鏈，(ii)提供單鏈形式的靶1和靶1′鏈并使之同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數(shù)量要基本超過(guò)靶鏈的數(shù)量，(iii)生成靶1和1′鏈拷貝，每個(gè)拷貝均包含各自的寡核苷酸0或0′且核酸序列至少有一部分同靶1或靶1′鏈分別互補(bǔ)，即生成的靶1和靶1′鏈拷貝至少有一部分是以各自的靶鏈作為模板而合成的，并且，若需要，完成靶1序列和/或靶1′序列的拷貝的形成，(iv)變性同靶1和靶1′鏈拷貝雜交的靶1和靶1′鏈并且可任選將至少是部分的靶1和靶1′鏈同支持物上的尚未轉(zhuǎn)化成靶1鏈或靶1′鏈拷貝的寡核苷酸再雜交，(v)同時(shí)(a)用固定于固相支持物上的靶1和靶1′鏈拷貝作為模板來(lái)分別生成(從與靶1和靶1′鏈拷貝雜交的引物上生成)靶2和靶2′鏈拷貝并且(b)如果靶1和靶1′鏈拷貝已同固定的寡核苷酸雜交，則可以將其作為模板來(lái)進(jìn)一步生成更多的至少是部分的靶1和靶1′鏈拷貝，并且(如果需要)可完成靶1鏈拷貝的形成，并且(vi)按所需次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，每次重復(fù)步驟(iv)和(v)均用靶2和靶2′鏈拷貝來(lái)生成更多的靶1和靶1′鏈拷貝。
16.此前任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法還包括以下步驟(vii)將引物同靶1鏈拷貝在特定位點(diǎn)雜交以使用靶1鏈拷貝作為模板來(lái)延伸引物得到的產(chǎn)物含有感興趣的序列，(viii)用靶1鏈拷貝作為模板延伸引物，并且(ix)將產(chǎn)物鏈從靶1鏈拷貝上變性解離。收集產(chǎn)物鏈。
17.生產(chǎn)至少是部分核酸鏈(“靶鏈”)拷貝的方法，把鏈存在于或潛在存在于樣品中，該方法包括的步驟有(i)提供了一種固相支持系統(tǒng)，其上固定有大量的單鏈寡核苷酸，寡核苷酸能同靶鏈雜交，(ii)提供了靶鏈的單鏈形式，并使之同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數(shù)量大大超過(guò)靶鏈的數(shù)量，(iii)產(chǎn)生靶1鏈拷貝，其包括固定的寡核苷酸以及含有至少有一部分同靶鏈互補(bǔ)的核酸序列，即生成的靶1鏈拷貝其序列至少有一部分是以靶鏈作為模板而生成的，并且，如果需要，可完成靶1序列拷貝的形成，(iv)將同靶1鏈拷貝雜交的鏈變性并且可任選將至少是部分的前述鏈同支持物上的尚未轉(zhuǎn)化成靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交，(v)同時(shí)(a)用固定于固相支持物上的靶1鏈拷貝作為模板來(lái)生成(從同靶1鏈拷貝雜交的引物上)靶2鏈拷貝，靶2鏈拷貝中含有感興趣的核酸序列，并且(b)若靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，則可以其作為模板來(lái)進(jìn)一步合成更多的至少是部分靶1鏈的拷貝，并且(如果需要)可完成靶1鏈拷貝的形成，且(vi)按所需次數(shù)重復(fù)步驟(iv)和(v)，每次重復(fù)均可用靶2鏈拷貝來(lái)進(jìn)一步生成更多的靶1鏈拷貝。(vii)將引物同靶1鏈拷貝在特定位點(diǎn)雜交以使用靶1鏈拷貝為模板延伸的延伸產(chǎn)物包含有感興趣的序列(viii)用靶1鏈拷貝作為模板來(lái)延伸引物，并且(ix)將產(chǎn)物鏈從靶1鏈拷貝上變性解離并收集該產(chǎn)物鏈。
全文摘要
公開(kāi)了一種方法，該方法用固定在固相支持物上的寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增核酸。靶核酸鏈(樣品中待分析)同寡核苷酸雜交并且用靶鏈作為模板來(lái)生產(chǎn)靶鏈拷貝(包含固定的寡核苷酸)。將靶鏈從靶鏈拷貝上變性解離并同未延伸的寡核苷酸再雜交。在下一步中，從與靶鏈雜交的寡核苷酸上合成出新的靶(1)鏈拷貝，并且用前面生成的靶(1)鏈拷貝可同時(shí)合成出靶(2)鏈拷貝。按所需的次數(shù)不斷重復(fù)下列步驟變性，再雜交，生成靶(1)和靶(2)鏈拷貝，就可以得到理想的擴(kuò)增度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1152946SQ9519420
公開(kāi)日1997年6月25日 申請(qǐng)日期1995年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月28日
發(fā)明者S·J·明特 申請(qǐng)人:特普尼爾醫(yī)學(xué)有限公司