專利名稱：：嗜熱真菌表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。具體地說，本發(fā)明涉及能用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)(特別是酶)的嗜熱真菌宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：近年來重組宿主細(xì)胞在表達(dá)異源蛋白質(zhì)上的使用已極大地簡(jiǎn)化了大量有商業(yè)價(jià)值的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，所述的蛋白質(zhì)過去只能從其天然來源分離純化獲得?，F(xiàn)在，有可供選擇的不同的表達(dá)系統(tǒng)用來產(chǎn)生任何給定的蛋白質(zhì)，包括原核和真核宿主。合適的表達(dá)系統(tǒng)的選擇不僅常常取決于宿主細(xì)胞產(chǎn)生足夠量的活性狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力，也可以在很大程度上受所述蛋白質(zhì)預(yù)期的最終用途的制約。盡管哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞已十分普遍地用作真核宿主，但絲狀真菌已開始被認(rèn)為作為重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生之宿主細(xì)胞非常有用。曲霉屬的某些種已有效地用作重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生之宿主細(xì)胞。不過常常有形成太濃密的菌絲體聚集體和非均勻分布的問題，這也會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)不足和不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的情形。已報(bào)道用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉(Ballance，etal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.112284-289，1983)，但發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化以很低的頻率發(fā)生。也已報(bào)道黑曲霉和米曲霉兩者在重組產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)上有用。雖然這些物種目前通常用于重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生，但它們不是沒有其不利之處。具體地說，它們?cè)诎l(fā)酵罐中的生長(zhǎng)形態(tài)不最適宜發(fā)酵，因?yàn)檎扯入S生物量的增加容易變得相當(dāng)高。增加的粘度限制了混合發(fā)酵培養(yǎng)物和向其通氣的能力，導(dǎo)致菌絲體的氧和營養(yǎng)物供應(yīng)不足，由此引起菌絲體不能存活和不產(chǎn)生蛋白質(zhì)。而且，常常有形成太濃密的菌絲體聚集體和非均勻分布的問題，這也會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)不足。由此，從商業(yè)目的出發(fā)，仍然需要真菌宿主，這種宿主能夠用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)而且表現(xiàn)出令人滿意的生長(zhǎng)特征(例如快速生長(zhǎng)和低粘度)，從而提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的重組蛋白質(zhì)真菌宿主細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)出非常適用于在發(fā)酵罐中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的生長(zhǎng)特征。本發(fā)明的宿主細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)，在給定的生物量濃度下表現(xiàn)出低的粘度，形成均勻分布的菌絲體，具有允許營養(yǎng)物向菌絲體各部分充分?jǐn)U散的足夠疏松的結(jié)構(gòu)。具體地說，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是嗜熱真菌，該真菌產(chǎn)生的粘度值(如以帕斯卡表示的)低于在相同的發(fā)酵條件(例如，在鹽、含有100g/l葡萄糖的酵母膏培養(yǎng)基中pH5下的間歇發(fā)酵)和相同的生物量下米曲霉產(chǎn)生的粘度值的80％，優(yōu)選的是低于50％，最優(yōu)選的是低于30％。優(yōu)選的所述真菌宿主產(chǎn)生同源的疏松結(jié)構(gòu)的菌絲體。最優(yōu)選的所述真菌宿主細(xì)胞選自梭孢殼屬、嗜熱子囊菌、屬毀絲霉屬和孢子絲菌屬的各種。因此，本發(fā)明提供了如上所限定的重組宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包含編碼異源蛋白質(zhì)(本文中也理解為包括肽)的核酸片段，所說的蛋白質(zhì)可以由所說宿主細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在有益于表達(dá)所說的目標(biāo)異源蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)液中回收所說的蛋白質(zhì)。附圖簡(jiǎn)要描述圖1說明幾種嗜熱真菌與米曲霉比較的在間歇發(fā)酵中推斷到30g/l時(shí)的粘度(以帕斯卡表示)。圖2顯示從未轉(zhuǎn)化的嗜熱菌株和其木聚糖酶轉(zhuǎn)化體分離的總DNA的southern雜交分析結(jié)果。Humicolainsolens的1.2kbHindlII-XhoI片段用作模板。1道未轉(zhuǎn)化的Myceliophthorathermophila；2道Myceliophthorathermophila轉(zhuǎn)化體#5；3道Myceliophthorathermophila轉(zhuǎn)化體#11；4道未轉(zhuǎn)化的Acremoniumalabamense；5道Acremoniumalabamense轉(zhuǎn)化體#5；6道Acremoniumalabamense轉(zhuǎn)化體#8；7道未轉(zhuǎn)化的Sporotrichumcellulophilum；8道Sporotrichumcellulophilum轉(zhuǎn)化體#6；9道Sporotrichumcellulophilum轉(zhuǎn)化體#7。圖3說明Thielaviaterrestris373和其無芽孢形成突變體在一段時(shí)間內(nèi)生物量的增加。箭頭表示所說373菌株開始形成芽孢時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。發(fā)明詳述任何重組蛋白質(zhì)的商業(yè)用途極大地取決于在大規(guī)模發(fā)酵中獲得有效產(chǎn)生的能力。在真菌工業(yè)發(fā)酵中，生產(chǎn)力受許多因素的限制。最常見的問題與以下因素有關(guān)與單細(xì)胞生物體(例如釀酒酵母和芽孢桿菌的種)相比的相對(duì)高的粘度，和濃密聚集體狀菌絲體通常的很不均勻的分布。由于氧氣和/或營養(yǎng)物不能擴(kuò)散到所有細(xì)胞，這便導(dǎo)致大多數(shù)菌絲體缺乏氧氣和/或營養(yǎng)物。高粘度降低可到達(dá)發(fā)酵罐的氧氣的轉(zhuǎn)運(yùn)率，依次對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的總能量發(fā)生不利的影響，從而引起可獲得的生物量的較低濃度和較低的終產(chǎn)率或者較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間。因此可以看出，沒有導(dǎo)致低粘度的合適的形態(tài)，簡(jiǎn)單地增加生物量不足以在發(fā)酵中增加產(chǎn)率。為獲得任何優(yōu)點(diǎn)，必須增加產(chǎn)生性生物量。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多嗜熱真菌意想不到地表現(xiàn)出使其適于在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的生長(zhǎng)特征。鑒別具有有用的生長(zhǎng)特征的真菌的嘗試始于在各種條件下的分類學(xué)上的異源組的隨機(jī)篩選。搖瓶評(píng)價(jià)主要集中在確定候選菌株是否產(chǎn)生胞外蛋白和/或蛋白酶(產(chǎn)生其中每一種對(duì)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生來說都不是所用細(xì)胞的所需特征)。然而也觀察各菌株的生長(zhǎng)和形態(tài)。首先，快速生長(zhǎng)并且具有疏松均勻的菌絲體分布，而在培養(yǎng)中既無大的沉淀又無聚集體形成被認(rèn)為是用于發(fā)酵罐中的好的候選菌株的標(biāo)志?；谶@一初步篩選，選擇下列物種在發(fā)酵罐中試驗(yàn)Thermoascusthermophilus、Mucorpusilus、Myceliophthorathermophila、Thielaviaterrestris、Acremoniumalabamense(Thielaviaterrestris的不完全形式)、Talaromycesemersonii和Sporotrichumcellulophilum。將候選菌株在100g/l葡萄糖中進(jìn)行間歇發(fā)酵并分析粘度，以米曲霉為對(duì)照。Mucorpusilus產(chǎn)生大塊菌絲體，踝節(jié)菌屬菌株產(chǎn)生高水平的蛋白酶(因而不進(jìn)行進(jìn)一步的研究)，表1給出的其它菌株的數(shù)據(jù)說明被試嗜熱菌株的粘度水平實(shí)質(zhì)上(即至少約50％)低于在相等生物量下由米曲霉所觀察到的水平。這些數(shù)據(jù)的推斷值(包含30g/l菌株生物量)示于圖1中。Thermoascusthermophilus表現(xiàn)出最有利的輪廓這一物種的菌絲體是均勻分散的，形成緊靠的高度分支菌絲體的松散結(jié)構(gòu)。毀絲霉屬類似于梭孢殼屬，但具有伸長(zhǎng)的較少分支的生長(zhǎng)形式，形成比用梭孢殼屬所見的高一些的粘度。踝節(jié)菌屬和孢子絲菌屬兩者都都表現(xiàn)出有用的形態(tài)和非常低的粘度。除了表現(xiàn)出有用的形態(tài)外，候選宿主菌株當(dāng)然還必須是可轉(zhuǎn)化的并且能夠表達(dá)異源蛋白質(zhì)。盡管嗜熱真菌(例如灰腐質(zhì)霉thermoidea變種)過去已被轉(zhuǎn)化(Allisonetal.，Curr.Genet.21225-229，1992)，但異源蛋白質(zhì)在重組真菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)還未見報(bào)道。因此，開始還不清楚這些嗜熱菌株最終是否能完全用于重組異源蛋白質(zhì)產(chǎn)生中。然而，令人驚奇的是如以下實(shí)施例所示，標(biāo)準(zhǔn)的曲霉屬轉(zhuǎn)化方案(如例如Christiansenetal.，Bio/Technol.61419-1422所描述的)可以用于轉(zhuǎn)化大多數(shù)被試菌株。因此，就可轉(zhuǎn)化性和有利的形態(tài)兩者而言，本發(fā)明的嗜熱真菌具有用作發(fā)酵罐中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生之宿主細(xì)胞所必需的性質(zhì)。用嗜熱真菌作為宿主細(xì)胞也具有其它優(yōu)點(diǎn)。除了在培養(yǎng)這些真菌中觀察到的較低的粘度外，它們生長(zhǎng)的較高溫度有益于某些物種比非嗜熱菌株更快速的生長(zhǎng)。這依次導(dǎo)致生物量更快速的積累，帶來相對(duì)較短的發(fā)酵周期。在連續(xù)發(fā)酵中，這些真菌所喜愛的較高溫度與較低pH的組合提供了污染危險(xiǎn)性明顯降低的條件。本發(fā)明包含在發(fā)酵期間滿足以上所述的粘度要求的任何嗜熱真菌。“嗜熱真菌”意指在至少約40℃(優(yōu)選的在40-50℃之間)的溫度下表現(xiàn)出最佳生長(zhǎng)的任何真菌。它包括但不限于支頂孢屬、Corynascus、梭孢殼屬、毀絲霉屬、嗜熱子囊菌屬、孢子絲菌屬、毛殼菌屬、櫛霉屬、Scytalidium和踝節(jié)菌屬的嗜熱成員。在優(yōu)選的實(shí)施方案中所說的嗜熱菌株選自Thermoascusthermophilus、Myceliophthorathermophila、Sporotrichumcellulophilum和Thielaviaterrestris的菌株。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)以上所述的物種，本發(fā)明包含完全和不完全狀態(tài)兩者以及其它分類學(xué)等同物(例如，增節(jié)變態(tài)體(anamorphs))，而不論其被稱的物種名稱。例如Thielaviaterrestris的不完全形式稱為Acremoniumalabamense。可以從例如下列文獻(xiàn)中找到分類學(xué)等同物和其它有用物種的別的例子Cannon，Mycopathologica11175-83，1990；Moustafaetal.，Persoonia14173-175，1990；Stalpers，Stud.Mycol.24，1984；Upadhyayetal.，Mycopathologia8771-80，1984；Subramanianetal.，Cryptog.Mycol.1175-185，1980；Guarroetal.，Mycotaxon23419-427，1985；Awaoetal.，Mycotaxon16436-440，1983；vouKlopotek，Arch.Microbiol.98365-369，1974；和Longetal.，1994，ATCCNamesofIndustrialFungi，ATCC，Rockville，Maryland。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地識(shí)別合適的等同物。實(shí)施例中給出的結(jié)果表明各物種的幾種分離物具有使其在發(fā)酵中有用所需的形態(tài)。所說結(jié)果也說明被轉(zhuǎn)化的能力不限于單個(gè)嗜熱種。有用的不限于單個(gè)分離物或菌株，而是種的有特征的一組。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這些種的其它菌株或分離物也能用于異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。各個(gè)種的許多菌株是公眾可從下列保藏單位獲得的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)12301ParklawnDrive，RockvilleMaryland20852；農(nóng)業(yè)研究服務(wù)培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)1815NorthUniversityStreet，Peoria，Illinois61604；真菌遺傳材料保藏中心(FGSC)，Kansas；DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSM)，MascheroderWeg1B，D-3300Braunschweig，Germany；應(yīng)用微生物學(xué)研究所(IAM)，TokyoUniversity1-1，1-Chome，Yayoi，Bunkyo-ku，Tokyo113，Japan；發(fā)酵研究所(IFO)，17-85Juso-honmachi2-chome，Yodogawa-ku，Osaka532，Japan；和真菌菌種保藏中心(CBS)，Oosterstraat1，3740AGBaarn，Netherlands。也是可以從NovoNordiskBiotech，Davis，California培養(yǎng)物保藏中心獲得的?？梢杂靡韵聦?shí)施例描述的方法容易地確定其它嗜熱真菌宿主用于發(fā)酵罐中的適合性。簡(jiǎn)言之，在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如鹽/酵母膏、大豆、馬鈴薯蛋白質(zhì)或補(bǔ)加有葡萄糖或其它合適碳源的任何培養(yǎng)基)上培養(yǎng)候選真菌。在約37-50℃(優(yōu)選的約42-46℃)溫度和約4-7的pH下進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)然地會(huì)認(rèn)識(shí)到對(duì)照發(fā)酵的溫度應(yīng)是對(duì)對(duì)照菌株(例如米曲霉)最佳的溫度，約為32-36℃。通過目測(cè)搖瓶中菌絲體形態(tài)定性識(shí)別那些對(duì)發(fā)酵有用的菌株是可能的。有用的菌株會(huì)顯示出有許多分支點(diǎn)的松散均勻排列的菌絲體。通過評(píng)價(jià)發(fā)酵罐中各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基的實(shí)際粘度在發(fā)酵罐中很好地證實(shí)有用性?？梢杂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的方法測(cè)定粘度，所說的方法例如，Brookfield轉(zhuǎn)動(dòng)粘度測(cè)定法(限定的或非限定的剪切距離和任何類型的紡錘構(gòu)型)、動(dòng)力學(xué)粘度管(流過管子)、落球粘度計(jì)或杯式粘度計(jì)。優(yōu)選地，評(píng)價(jià)中包含米曲霉菌株作為對(duì)照，將候選菌株的粘度值與其值比較。優(yōu)選的宿主細(xì)胞表現(xiàn)出的粘度水平為相同發(fā)酵條件下米曲霉菌株產(chǎn)生的粘度的約80％或更低，優(yōu)選的約50％或更低，最優(yōu)選的約為30％或更低。本領(lǐng)域技術(shù)人員也會(huì)認(rèn)識(shí)到本文描述的宿主物種的成功的轉(zhuǎn)化不限于特別說明的載體、啟動(dòng)子和選擇標(biāo)記。一般來說，用于轉(zhuǎn)化米曲霉、黑曲霉和構(gòu)巢曲霉的那些技術(shù)也適于本發(fā)明的宿主細(xì)胞。例如，雖然amdS選擇標(biāo)記是優(yōu)選的，但其它有用的選擇標(biāo)記包括但不限于argB(構(gòu)巢曲霉或黑曲霉)、trpC(黑曲霉或構(gòu)巢曲霉)、pyrG(黑曲霉或構(gòu)巢曲霉)、sC(硒酸鹽抗性)或glufosinate抗性(米曲霉)標(biāo)記，或它們的來源于其它種的等同物。所說的啟動(dòng)子可以是在這些種中表現(xiàn)出強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以是來源于編碼胞外和胞內(nèi)蛋白質(zhì)(例如淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纖維素酶和糖酵解酶)兩者的基因的。這類合適的啟動(dòng)子可以是來源于米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶和Rhizomucormiehei脂肪酶基因的。來源于糖酵解酶基因啟動(dòng)子的例子是TPI、ADH和PGK。所說的啟動(dòng)子也可以是同源啟動(dòng)子，即，使用的宿主菌株天然的基因啟動(dòng)子。按照本發(fā)明的有用的啟動(dòng)子是米曲霉TAKA淀粉酶啟動(dòng)子。TAKA淀粉酶是公知的α-淀粉酶(Todaetal.，Proc.JapanAcad.58Ser.B.208-212，1982)。為了引入特定的限制位點(diǎn)有利于啟動(dòng)子序列與選擇的基因或者選擇的信號(hào)肽或前區(qū)(preregion)連接，啟動(dòng)子序列可以提供有接頭。終止子和聚腺苷酸化序列也可以來源于與啟動(dòng)子相同的來源。增強(qiáng)子序列也可以插入進(jìn)構(gòu)建體。為了避免需要破碎細(xì)胞獲得表達(dá)產(chǎn)物，減小細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物可能降解的量，產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外是優(yōu)選的。為此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將目標(biāo)基因連接到可以引導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物到細(xì)胞分泌途徑的前區(qū)(例如，信號(hào)肽和前導(dǎo)肽)上。所說的前區(qū)可以來源于任何生物體的任何分泌蛋白質(zhì)基因，或者可以是天然前區(qū)。這種前區(qū)有用的可用源是曲霉屬的葡糖苷酶或淀粉酶基因；芽孢桿菌的淀粉酶基因；RM的脂酶或蛋白酶基因；釀酒酵母α-因子的基因或小牛前凝乳酶基因。大多數(shù)優(yōu)選的前區(qū)來源于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶、芽孢桿菌NCIB11837的麥芽淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因。有效的信號(hào)序列是米曲霉TAKA淀粉酶信號(hào)，RM天冬氨酸蛋白酶信號(hào)和RM脂酶信號(hào)。另外，也可以使用被表達(dá)基因的天然前區(qū)。功能性連接到啟動(dòng)子和終止子序列上的所需產(chǎn)物的基因可以摻入包含選擇標(biāo)記的載體，或者置于能夠整合進(jìn)宿主菌株基因組的不同載體或質(zhì)粒上。載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體或質(zhì)?；蛘呤枪餐线M(jìn)基因組的總DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒。載體或質(zhì)?？梢允蔷€型的或封閉環(huán)狀的分子。按照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化宿主，一個(gè)包含選擇標(biāo)記，包括剩下的待引入的異源DNA的另一個(gè)包含啟動(dòng)子、所需蛋白質(zhì)的基因和轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷酸化序列。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可用于表達(dá)任何目標(biāo)原核或真核異源肽或蛋白質(zhì)，優(yōu)選地是用于表達(dá)真核肽或蛋白質(zhì)。Thielaviaterrestris特別有用是由于認(rèn)識(shí)到其具有安全性歷史，對(duì)這些種的特別的興趣是用它們表達(dá)異源蛋白質(zhì)，特別是真菌酶。所述的新表達(dá)系統(tǒng)可用于表達(dá)酶，例如過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、蛋白酶和其它蛋白分解酶、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、果膠酶和其它溶果膠酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、殼質(zhì)酶、mutanase和脫氧核糖核酸酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，術(shù)語“真菌酶”不僅包括天然真菌酶，而且包括經(jīng)氨基酸取代、缺失、添加或其它可以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等的修飾方法修飾的那些真菌酶。本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可以用于重組產(chǎn)生宿主細(xì)胞天然的蛋白質(zhì)。這種使用的例子包括但不限于，把嗜熱菌株的天然蛋白質(zhì)置于不同啟動(dòng)子控制下，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過采用信號(hào)序列加快目標(biāo)天然蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，或者增加主體宿主細(xì)胞通常產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)。因此，在術(shù)語“異源蛋白質(zhì)”的范圍內(nèi)，本發(fā)明也包括達(dá)到以下程度的同源蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)生，所說的程度是這種表達(dá)包括使用宿主細(xì)胞非天然的遺傳元件或者使用經(jīng)操作以宿主細(xì)胞中正常情況下見不到的方式起作用的天然元件。如上所述，由于其良好的形態(tài)，Thielaviaterrestris屬于用于重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的優(yōu)選的種。然而，在浸沒培養(yǎng)中，該種在生長(zhǎng)限制(葡萄糖或水)條件下由于孢子形成也喪失生物量。具體地說，發(fā)酵早期產(chǎn)生的大量菌絲體快速消失，大量孢子出現(xiàn)。由于菌絲體是產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的來源，因此在培養(yǎng)中避免孢子形成是合乎需要的。為此，分離了不形成孢子的梭孢殼屬突變體。將孢子置于紫外光下并培養(yǎng)5天。然后將菌絲體散布到平板上培養(yǎng)24小時(shí)。選擇8個(gè)最大的菌落，假定菌絲體片段生長(zhǎng)快于首先必須發(fā)育的孢子，在搖瓶中試驗(yàn)。在浸沒培養(yǎng)中，8個(gè)菌落中的2個(gè)表現(xiàn)出不形成孢子，說明如果有需要，這一方法是產(chǎn)生不形成孢子的菌株的有活力的方法。進(jìn)一步用下列非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明。I.嗜熱菌的搖瓶評(píng)價(jià)搖瓶中使用具有下列組份的ASPO4培養(yǎng)基(含有可變碳源)酵母膏2g/lMgSO47H2O1g/lCaCl21g/lKH2PO45g/l檸檬酸2g/l微量金屬*0.5ml/l尿素2g/l(NH4)2SO42g/l*含有14.3g/l七水硫酸鋅，五水硫酸銅，0.5g/l六水氯化鎳，13.8g/l七水硫酸亞鐵，8.5g/l一水硫酸錳和3g/l檸檬酸。使用無擋板丙烯搖瓶(100或500ml)，于42-44℃溫度和4.5pH在200rpm振蕩。在搖瓶中根據(jù)下列特征篩選大量的嗜熱菌株(1)生長(zhǎng)活躍；(2)蛋白酶產(chǎn)生；(3)分泌蛋白質(zhì)；(4)菌絲體形態(tài)。為確定蛋白酶活性，將各培養(yǎng)液上清液在2500rpm下離心5分鐘，用于酪蛋白透明平板試驗(yàn)中，這一試驗(yàn)測(cè)定由作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)活性者被評(píng)價(jià)的各真菌物種所產(chǎn)生的蛋白酶水平。按如下進(jìn)行酪蛋白透明平板試驗(yàn)。平板培養(yǎng)基的組成為20g/l脫脂乳，20g/l瓊脂糖，供pH5和pH7下試驗(yàn)的0.2M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，和供pH9下試驗(yàn)的甘油氫氧化鈉緩沖液。將奶粉與100ml緩沖液混合并保存在60℃下。將瓊脂糖與400ml緩沖液混合并高壓滅菌5分鐘。稍微冷卻后，加入溫?zé)岬哪袒旌衔铮瑢⒒旌衔镙p輕倒轉(zhuǎn)2-3次進(jìn)行混合。以每塊平板50-70ml的量將培養(yǎng)基倒在150mm平板上，貯存直至使用。臨用之前，在每塊平板的瓊脂上制12個(gè)孔。將25μl各菌株發(fā)酵上清液加到各種pH值的一塊平板上，在37℃培養(yǎng)過夜。向pH9的平板加入0.5M冰乙酸沉淀酪蛋白，使任何澄清帶可見。根據(jù)澄清帶的大小(即，從無帶到直徑大于2cm)帶型(即，透明，不透明或兩種類型)評(píng)價(jià)平板。各培養(yǎng)物的上清液也用于評(píng)價(jià)菌株的胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)生。按制造者的說明制備Novex8-16％SDS聚丙烯酰胺凝膠用于評(píng)定蛋白質(zhì)輪廓。將40μl(48小時(shí))培養(yǎng)上清液樣品與10μl5×離解緩沖液(離解緩沖液＝4mlTris-HCl，pH6.8；1gSDS；617mg二硫蘇糖醇，加無菌蒸餾水至10ml)和甘油/溴酚藍(lán)(10-20mg加到約10ml80-90％甘油中，置于沸水中2小時(shí)以溶解)混合。煮沸5分鐘，冷卻，上樣并在120V下電泳，直到溴酚藍(lán)跟蹤染料到達(dá)凝膠底部。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。顯示大量帶的那些分離物被認(rèn)為是作為潛在的新宿主不太合適的。用+到+++等級(jí)定量評(píng)價(jià)生長(zhǎng)。形態(tài)分成以下幾類1-具有很少支鏈的長(zhǎng)的緊密相互作用的菌絲；2-許多分生孢子，具有非常長(zhǎng)的支鏈；3-具有某些支鏈的稀長(zhǎng)線型菌絲；4-厚短無規(guī)則菌絲，有許多支鏈；5-具有非常長(zhǎng)的支鏈的松散菌絲；6-具有非常均勻菌絲分布松散菌絲；7-具有某些支鏈的長(zhǎng)的緊密相互作用的菌絲。形態(tài)5和6被認(rèn)為最合乎需要。在搖瓶中進(jìn)行5個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中按以下改變碳源的種類和數(shù)量(1)麥芽糖糊精10g/l；(2)葡萄糖10g/l；(3)麥芽糖糊精20g/l；(4)10g/lAvicell+1g/l葡萄糖〔為纖維素酶誘導(dǎo)作用〕；(5)30g/l麥芽糖糊精+10g/l葡萄糖。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)中待試物種的分離物是Talaromycesemersonii、Talaromycesbyssochlamydoides、Thielaviaterrestris、Thermoascusthermophilus、嗜熱子囊菌、Malbrancheasulfurea、Melanocarpusalbomyces、Sporotrichumcellulophilum、Acremoniumalabamense、灰腐質(zhì)霉thermoidea變種、Mucorpusilus、Myceliophthorathermophila和Scytalidiumthermophilum。在以上所述的一種或多種實(shí)驗(yàn)條件下，這些菌株中的幾個(gè)表現(xiàn)出有用的形態(tài)，并且活躍生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)條件下，無被試菌株表現(xiàn)出分泌高水平(大于1g/l)的任何蛋白質(zhì)，被認(rèn)為具有干凈的蛋白質(zhì)基底。幾個(gè)菌株(例Talaromycesemersonii、Talaromycesbyssochlamydoides)顯示出高蛋白酶活性，在試驗(yàn)生長(zhǎng)條件下某些菌株(例如Malbrancheasulfurea)生長(zhǎng)非常緩慢。沒有進(jìn)行其它試驗(yàn)。在這一評(píng)價(jià)過程中，測(cè)定浸沒培養(yǎng)中在平板上孢子形成的程度。平板上孢子形成的能力對(duì)有用的宿主細(xì)胞是事實(shí)上自發(fā)的。在普通真菌瓊脂平板上Thielaviaterrestris和Myceliophthorathermophila兩者都不顯示出任何孢子。對(duì)毀絲霉屬，使菌絲體首先在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(FDA；Difco)平板上于37℃生長(zhǎng)48小時(shí)，然后在50℃生長(zhǎng)過夜，接著于37℃生長(zhǎng)另外的24-48小時(shí)。在這一物種中溫度逆境(stress)明顯地觸發(fā)孢子形成。對(duì)梭孢殼屬，可以經(jīng)首先于37℃培養(yǎng)室的普通氛圍中在PDA平板上培養(yǎng)菌絲體誘導(dǎo)平板上的孢子形成。然后將培養(yǎng)物置于用氮?dú)庋蜎]的1升Pyrex燒杯中，用塑料包裹物密封，再回送到37℃室中48小時(shí)。在培養(yǎng)室普通氛圍下從燒杯除去平板，在室中培養(yǎng)1周。在氮?dú)馓幚碇昂椭蟮纳L(zhǎng)之間，平板發(fā)育出一圈白色的孢子。這一孢子形成明顯地由氧逆境觸發(fā)。在浸沒培養(yǎng)中，氧有限和葡萄糖有限也引發(fā)梭孢殼屬的孢子形成。事實(shí)上，在具有20g/l葡萄糖的ASPO4培養(yǎng)基中3-4天后，這種孢子形成自發(fā)發(fā)生。然而，在發(fā)酵條件下，這種孢子形成是不合乎需要的，因?yàn)榫z體生物量迅速消失并被孢子取代，由此降低生產(chǎn)力。為了解決這一問題，從ThielaviaterrestrisE373產(chǎn)生不形成孢子的菌株，將具有106UV暴露過的(30秒暴露導(dǎo)致40％殺滅)孢子/ml培養(yǎng)基(具有2g/l葡萄糖的ASPO4)的搖瓶于42℃培養(yǎng)5天。選擇8個(gè)最大的菌落，假定菌絲體片段生長(zhǎng)快于首先必須發(fā)育的孢子。將選擇的菌落轉(zhuǎn)移到搖瓶中。在這些浸沒培養(yǎng)物中，8個(gè)菌落中的2個(gè)表現(xiàn)出一點(diǎn)也不形成孢子，而其它6個(gè)表現(xiàn)出某些程度的孢子形成。首先選擇來在罐發(fā)酵中研究的是Thielaviaterrestris(菌株E373和ATCC20627)、Myceliophthorathermophila(菌株A421)、Sporotrichumcellulophilum(菌株ATCC20493)和Thermoascusthermophilus(菌株2050和CBS759.71)、Mucorpusilus(菌株A209)、Acremoniumalabamense(A2082)、Talaromycesemersonii(菌株A577)。指定為“A”的菌株可以從NovoNordiskA/S，Bagsvrd，Denmark培養(yǎng)物保藏中心獲得；指定為“E”的菌株可以從NovoNordiskEntotech，Davis，Calitornia培養(yǎng)物保藏中心獲得。II.發(fā)酵罐評(píng)價(jià)用于發(fā)酵罐的培養(yǎng)基如下MgSO47H2O2g/lKH2PO45g/l一水檸檬酸4g/l酵母膏10g/l(NH4)2SO410g/lCaCl22g/lAMG微量金屬*0.5ml/lPluronic1ml/l*含有14.3g/l七水硫酸鋅，2.5g/l五水硫酸銅，0.5g/l六水氯化鎳，13.8g/l七水硫酸亞鐵，8.5g/l一水硫酸錳和3g/l檸檬酸。使用自來水，高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH至6。碳源基于起始體積(21)按100g/l加入50％葡萄糖。在pH5.0+/-0.1(用磷酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié))下于42-46℃進(jìn)行發(fā)酵。使用具有增大的葉輪的Applicon發(fā)酵罐。溶解氧的濃度(DOT)保持在大于20％飽和濃度，通氣速率為每分鐘每體積1體積，攪拌速率在800-1400rpm之間。以干細(xì)胞重量估計(jì)生物量濃度。經(jīng)事先過秤的20μm薄膜過濾20ml培養(yǎng)液。用水洗滌濾餅2次，于96℃干燥48小時(shí)并稱重。用裝有“C14”杯和圓筒系統(tǒng)的BohlinReologi，Inc.“Visco88”測(cè)定粘度。系統(tǒng)開關(guān)設(shè)置為“1”，速度設(shè)置為“8”。以1000rpm轉(zhuǎn)動(dòng)杯內(nèi)圓筒，傳遞1222/s剪切率。從發(fā)酵罐移去全部培養(yǎng)樣品，在室溫裝置上于2分鐘內(nèi)測(cè)定。將約10毫升樣品放入杯(依次連接到Visco88上)中，完全浸沒圓筒。記錄圓筒旋轉(zhuǎn)開始幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生的起始粘度讀數(shù)。分析ThielaviaterrestrisE373和ATCC20627、MyceliophthorathermophilaA421、SporotrichumcellulophilumATCC20493)、Thermoascusthermophilus2050和米曲霉A1560(對(duì)照)的6種發(fā)酵物的粘度。每個(gè)發(fā)酵都是pH5和1100rpm下的100g/l葡萄糖間歇發(fā)酵。使嗜熱菌株在42℃生長(zhǎng)，使米曲霉在37℃生長(zhǎng)。表1給出了顯示以帕斯卡表示的粘度值的數(shù)據(jù)。帕斯卡值越低，培養(yǎng)物的粘性越小。測(cè)定的粘度數(shù)據(jù)是在電流計(jì)中試驗(yàn)的開始幾秒中測(cè)定的新鮮樣品的。比較在30g/l生物量時(shí)菌株的推斷的的粘度數(shù)據(jù)示于圖1中。表1.嗜熱菌比較的粘度如數(shù)據(jù)所示，粘性高得多的菌株是對(duì)照米曲霉菌株。粘性最低的菌株是兩種梭孢殼屬菌株。這些菌株被觀察到在發(fā)酵罐中易于混合和通氣，并且顯示出非常均勻分散的菌絲體，菌絲體形成密切相關(guān)的松散結(jié)構(gòu)高度分支的菌絲體在生長(zhǎng)期間連續(xù)被折斷，既不形成大塊也不形成聚集體。毀絲霉屬菌株非常類似梭孢殼屬菌株，但給出伸長(zhǎng)的較少分支的生長(zhǎng)形式，產(chǎn)生稍微大一些的粘度。沒有獲得支頂孢屬的測(cè)定值，但肉眼觀察表明它表現(xiàn)出類似于梭孢殼屬的形態(tài)和粘度。嗜熱子囊菌屬也顯示出類似于梭孢殼屬的好的形態(tài)。孢子絲菌屬在形態(tài)學(xué)上也是好的，但產(chǎn)生大量的綠色色素，并且在這些發(fā)酵條件下開始裂解。Mucorpusilus不出現(xiàn)最優(yōu)形態(tài)，具有大塊菌絲體，未進(jìn)行進(jìn)一步分析。踝節(jié)菌屬也未被進(jìn)一步分析，因?yàn)槠洚a(chǎn)生比其它菌株更高量的蛋白酶活性。表2說明在生物量的濃度為2-15g/l時(shí)測(cè)定的生長(zhǎng)率和被試菌株在發(fā)酵罐中對(duì)蛋白酶的產(chǎn)生情況。從生長(zhǎng)曲線估測(cè)生長(zhǎng)率，其中從2-15g/l干生物量濃度(由過濾、干燥和稱量濾器上剩下的重量測(cè)定生物量)觀察到幾乎線型生物量增加。表2.在pH542℃下葡萄糖間歇發(fā)酵中的生長(zhǎng)速率和蛋白酶形成<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="757">菌株相對(duì)于米曲霉的生長(zhǎng)率蛋白酶產(chǎn)生ThermoascusthermophilusMucorpusilusMyceliophthorathermophilaThielaviaterrestrisAcremoniumalabamenseTalaromycesemersoniiSporotrichumcellulophilum1x2.5x1x3x3x1x2x低蛋白酶非常高蛋白酶(全部)非常高堿性蛋白酶高酸性蛋白酶高酸性蛋白酶非常高蛋白酶(主要是酸性)某些蛋白酶(主要是酸性)</table></tables>估計(jì)真菌形態(tài)和確定其是否適于浸沒罐發(fā)酵的另一種方法是嘗試獲得非常高的生物量濃度。對(duì)單細(xì)胞生物體(例如大腸桿菌和釀酒酵母)，達(dá)到近100g/l的生物量濃度是可能的，而對(duì)真菌達(dá)到大于75g/l的水平非常困難。米曲霉和黑曲霉的上限(由于高粘度和缺乏氧轉(zhuǎn)移引起)是約50-60g/l。在浸沒培養(yǎng)中試驗(yàn)以上所述的ThielaviaterrestrisE373和不形成芽孢的突變體。于pH5，42℃下在與以上所述的比較為雙倍強(qiáng)度的間歇培養(yǎng)基(200g/l)中進(jìn)行發(fā)酵。140小時(shí)后，不形成芽孢的突變體達(dá)到約90g/l的生物量(圖3)。這是真菌發(fā)酵中異常高的生物量濃度，明顯說明具有這一類型形態(tài)的菌株的優(yōu)越性。II.異源基因在嗜熱菌中的表達(dá)A.選擇標(biāo)記載體具有潮霉素B抗性標(biāo)記的載體pJaL77用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。這一標(biāo)記基于大腸桿菌潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其在TAKA啟動(dòng)子控制下。簡(jiǎn)言之，按如下所述構(gòu)建載體。從BoehringerMannheim以質(zhì)粒pHph-1購得賦予潮霉素B抗性的基因。經(jīng)PCR使這一基因裝配ATG密碼子以及氨基和羧基末端的合適的限制位點(diǎn)，PCR采用的引物是5’-GCTCAGAAGCTTCCATCCTACACCTCAGCAATGTCGCCTGAACTCACCGCGACGTCT-3’(N-末端)和3’-CGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCTCCAGAGATCTCAGGCT-5’(C-末端)。用限制酶BamHI和XhoI切割PCR片段，克隆進(jìn)曲霉屬表達(dá)載體pToC68(如WO91/17243描述的)的相應(yīng)位點(diǎn)，產(chǎn)生pJaL77。通過將p3SR2(Hynesetal.，Mol.Cell.Biol.3(8)1430-1439，1983)的2.7kbXbaI片段克隆進(jìn)XbaI切割的脫磷酸化的pUC19質(zhì)粒構(gòu)建包含amdS標(biāo)記的質(zhì)粒pToC90。B.表達(dá)載體載體pHD414是質(zhì)粒p775(EP238023)的衍生物。與這一質(zhì)粒相反，pHD414具有TAKA啟動(dòng)子和AMG終止子之間的一串單一限制位點(diǎn)。通過除去終止子3’末端的約200bp長(zhǎng)片段(包含不需要的RE位點(diǎn))，接著除去啟動(dòng)子5’末端的約250bp長(zhǎng)片段(其也包含不需要的位點(diǎn))構(gòu)建該質(zhì)粒。用NarI(位于pUC載體中)和XbaI(就在終止子3’)切割除去200bp區(qū)，接著用克列諾DNA聚合酶+dNTP填補(bǔ)產(chǎn)生末端，在凝膠上純化載體片段并再連接載體片段。這一質(zhì)粒稱為pHD413。用StuI(位于啟動(dòng)子的5’末端)和PvuII(在pUC載體中)切割pHD413，在凝膠上分級(jí)分離并再連接，形成pHD414。包含pYES中約1100bp木聚糖酶HindII/XbaIcDNA片段的大腸桿菌菌株以DSM6995在DSM保藏。經(jīng)用HindII/XbaI切割從一個(gè)克隆分離木聚糖酶cDNA片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫純化該片段，為連接反應(yīng)準(zhǔn)備好。將所說的cDNA片段連接進(jìn)pHD414產(chǎn)生pAXX40-1-1，其以NRRLB-21164保藏。所說的木聚糖酶基因以DSM(DeutscheSammlungvonMikrooganismenundZellkulturenGmbH)6995保藏。III.嗜熱宿主的轉(zhuǎn)化除了指明的以外，下列一般性方案用于轉(zhuǎn)化所有被試菌株用待轉(zhuǎn)化菌株的菌絲體塊(2cm直徑)接種100mlMY51培養(yǎng)基(麥芽糖糊精，30g/l；七水硫酸鎂，2g/l；K2PO4，10g/l；硫酸鉀，2g/l；檸檬酸，2g/l；酵母膏，10g/l；AMG微量金屬，0.5ml；尿素，1g/l；硫酸銨，2g/l；pH6.0)，于42℃振蕩培養(yǎng)14小時(shí)。經(jīng)米拉合金布(miracloth)過濾收獲菌絲體，用200ml0.6M硫酸鎂洗滌。將菌絲體懸浮在15毫升1.2M硫酸鎂和10mM磷酸二氫鈉(pH5.8)中。使懸液在冰上冷卻，加入1ml包含120mgNovozyme234的緩沖液。5分鐘后，加入1ml12mg/mlBSA(SigmaH25型)，在輕輕攪拌下于30℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3小時(shí)(依據(jù)菌株而定)，直到在顯微鏡下觀察時(shí)，樣品中可見大量的原生質(zhì)體。對(duì)支頂孢屬和梭孢殼屬，原生質(zhì)體出現(xiàn)的效率(protoplastingefficiency)相對(duì)較低，這些菌株需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間(2-3小時(shí))，直到獲得轉(zhuǎn)化的足夠的原生質(zhì)體。懸液經(jīng)米拉合金布過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到無菌管中，用5ml0.6M山梨糖醇和100mMTris-HCl(pH＝7.0)覆蓋。在2500rpm下離心15分鐘，從硫酸鎂軟墊頂部收集原生質(zhì)體。將2體積STC(1.2M山梨糖醇，10mMTris-HClpH＝7.5，10mM氯化鈣)加到原生質(zhì)體懸液中，在2500rpm下離心混合物5分鐘。將原生質(zhì)體懸液再懸浮到STC并再沉淀。重復(fù)這一操作，然后將原生質(zhì)體再懸浮進(jìn)0.1-1mlSTC中。將100微升原生質(zhì)體懸液與在10微升STC中的5-25微克合適的DNA混合。用pAXX40-1-1和含有選擇標(biāo)記的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化各菌株。質(zhì)粒pToC90含有構(gòu)巢曲霉amdS基因，用于轉(zhuǎn)化和以乙酰胺為唯一氮源的生長(zhǎng)選擇。質(zhì)粒pJaL77用于轉(zhuǎn)化和潮霉素B(150微克/毫升)抗性選擇。將混合物置于室溫下25分鐘。加入0.2ml60％PEG4000(BDH29576)，10mM氯化鈣和10mMTris-HCl(pH7.5)，小心混合兩次，最后加入0.85ml相同的溶液并小心混合。將混合物置于室溫下25分鐘，在2500×g下離心15分鐘，將沉淀再懸浮進(jìn)2毫升1.2M山梨糖醇。在沉降一次以上后，將原生質(zhì)體散布到合適的平板上。將原生質(zhì)體散布到基本平板(Cove，Biochem.Biophys.Acta11351-56，1966)上，該平板包含1.0M蔗糖(pH＝7.0)，作為氮源的10mM乙酰胺(當(dāng)amdS為選擇標(biāo)記時(shí))和抑制基底生長(zhǎng)的20mMCsCl。當(dāng)hygB為選擇標(biāo)記時(shí)，培養(yǎng)基不同之點(diǎn)在于用10mM硝酸鈉為氮源，并存在150微克/毫升潮霉素B。于42℃下培養(yǎng)選擇平板5天。將所有在COVE選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到COVII(無氯化鈣且蔗糖濃度為30g/l的COVE培養(yǎng)基)平板上，該平板含有AZCL-木聚糖(0.2％)和各自的選擇試劑。由在真菌菌落中和其周圍快速形成藍(lán)色暈圈識(shí)別共轉(zhuǎn)化體。表3給出了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和識(shí)別的共轉(zhuǎn)化體的數(shù)量。表3.嗜熱菌轉(zhuǎn)化的結(jié)果在所研究的任何嗜熱真菌中潮霉素選擇都不成功，可能是由于所說的啟動(dòng)子在這些菌株中無效。然而，用amdS選擇，除了嗜熱子囊菌屬外在所有菌株中獲得了轉(zhuǎn)化體。共轉(zhuǎn)化頻率在20-40％之間。D.木聚糖酶在轉(zhuǎn)化體中表達(dá)的估價(jià)將由木聚糖酶平板試驗(yàn)識(shí)別的所有共轉(zhuǎn)化體進(jìn)行測(cè)定木聚糖酶產(chǎn)率的搖瓶振蕩發(fā)酵估價(jià)。使用下列組成的M401培養(yǎng)基麥芽糖糊精，50.0；七水硫酸鎂，2.0；磷酸二氫鉀，2.0；檸檬酸，4.0；酵母膏，8.0；AMG微量金屬溶液，0.5ml；硫酸銨，2.0；尿素，1.0。于42℃振蕩培養(yǎng)，從24小時(shí)開始每天測(cè)定木聚糖酶活性。用補(bǔ)充有檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH6.5)的0.2％-AZCL木聚糖(MegazymeCo.Australia)測(cè)定發(fā)酵液中的木聚糖酶活性。稀釋培養(yǎng)液(通常是100倍)，將10微升稀釋的培養(yǎng)液與1毫升0.2％-AZCL木聚糖底物混合。在42℃培養(yǎng)溫育混合物30分鐘。每5分鐘充分混合反應(yīng)混合物一次。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，經(jīng)在10000rpm下離心5分鐘沉淀未消化的底物。通過在595nm的吸收定量從這一底物釋放的藍(lán)色染料，從用已知活性的酶制劑制得的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算培養(yǎng)液的酶活性量。確定相對(duì)于在相同條件下制得的標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)木聚糖酶單位(EXU)。也在相同的條件下培養(yǎng)未轉(zhuǎn)化的菌株并與其轉(zhuǎn)化體比較。圖2所示的數(shù)據(jù)(基于活性峰)說明所有未轉(zhuǎn)化的菌株產(chǎn)生非常低水平的木聚糖酶活性，而某些轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生比未轉(zhuǎn)化的菌株高達(dá)5-10倍的活性。用過的培養(yǎng)基的SDS-PAGE分析揭示出僅在轉(zhuǎn)化體中存在22kd腐質(zhì)霉屬木聚糖酶蛋白質(zhì)帶(盡管水平很低)。這說明嗜熱真菌中表達(dá)異源基因的潛能。木聚糖酶產(chǎn)產(chǎn)生能力順序是以下順序毀絲霉屬-孢子絲菌屬-支頂孢屬-梭孢殼屬。E.表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和整合證實(shí)為了明確地說明表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和整合，用從未轉(zhuǎn)化的各菌株和其選擇轉(zhuǎn)化體分離的總DNA進(jìn)行southern雜交。選擇各菌株的兩個(gè)最好的轉(zhuǎn)化體用于southern雜交分析。用EcoRI消化從這些菌株分離的總基因組DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠分離DNA片段并進(jìn)行印跡。因?yàn)樗箧邭俸椭ы旀邔俅硐嗤甑挠行院蜔o性階段，所以僅支頂孢屬DNA用于雜交實(shí)驗(yàn)。首先用構(gòu)巢曲霉amdS基因(用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記)探查印跡。結(jié)果表明僅在轉(zhuǎn)化體中存在amdS基因，而在未轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照中沒有。在去掉amdS探針后，用Humicolainsolens木聚糖酶cDNAD1.2kbHindIII和XhoI片段再探查相同的印跡，結(jié)果為僅支頂孢屬轉(zhuǎn)化體(而不是未轉(zhuǎn)化菌株)顯示出存在HumicolainsolenscDNAD雜交帶。未轉(zhuǎn)化的毀絲霉屬和孢子絲菌屬以及它們的轉(zhuǎn)化體顯示出存在雜交到探針上的約2kb帶(可能表示這些菌株中存在與Humicolainsolens木聚糖酶基因有同源性的DNA序列)，而轉(zhuǎn)化體還顯示出另外的雜交到這一探針上的高分子量帶。權(quán)利要求1.一種包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的重組嗜熱真菌宿主細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所說的序列是可操作連接到啟動(dòng)子上的。3.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所說的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所說的啟動(dòng)子是真菌啟動(dòng)子。5.權(quán)利要求4的細(xì)胞，其中所說的啟動(dòng)子選自米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶和Rhizomucormiehei脂肪酶啟動(dòng)子。5.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所說的蛋白質(zhì)是真菌酶。6.權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所說的酶選自過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、蛋白酶和其它蛋白分解酶、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、果膠酶和其它溶果膠酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、殼質(zhì)酶、mutanase和脫氧核糖核酸酶。7.權(quán)利要求1的細(xì)胞，該細(xì)胞還包含選擇標(biāo)記。8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所說的標(biāo)記選自argB、trpC、pyrG、amdS、hygB、sC和glufosinate抗性。9.權(quán)利要求1的細(xì)胞，該細(xì)胞是從頂孢霉屬、Corynascus、梭孢殼屬、毀絲霉屬、嗜熱子囊菌屬、孢子絲菌屬、毛殼屬、櫛霉屬、Scytalidium或踝節(jié)菌屬成員獲得的。10.權(quán)利要求1的細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中產(chǎn)生的粘度約為相同的條件下培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)生的粘度的80％或更低。11.權(quán)利要求1的細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中產(chǎn)生的粘度約為相同的條件下培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)生的粘度的50％或更低。12.權(quán)利要求1的細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中產(chǎn)生的粘度約為相同的條件下培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)生的粘度的30％或更低。13.一種產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括在允許表達(dá)所述的蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)重組嗜熱宿主細(xì)胞，并且從培養(yǎng)液中回收所說的蛋白質(zhì)，其中所說的細(xì)胞包含可操作連接到啟動(dòng)子上之編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列。14.權(quán)利要求13的方法，其中所說的蛋白質(zhì)是真菌蛋白質(zhì)。15.權(quán)利要求13的方法，其中所說的啟動(dòng)子是真菌啟動(dòng)子。16.權(quán)利要求13的方法，其中所說的蛋白質(zhì)是真菌酶。17.權(quán)利要求16的方法，其中所說的酶選自過氧化氫酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化物酶、脂酶、水解酶、酯酶、角質(zhì)酶、蛋白酶和其它蛋白分解酶、氨肽酶、羧肽酶、植酸酶、裂合酶、果膠酶和其它溶果膠酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、甘露糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、轉(zhuǎn)移酶、核糖核酸酶、殼質(zhì)酶、mutanase和脫氧核糖核酸酶。18.權(quán)利要求13的方法，其中所說的細(xì)胞還包含選擇標(biāo)記。19.權(quán)利要求18的方法，其中所說的標(biāo)記選自argB、trpC、pyrG、amdS、hygB、sC和glufosinate抗性。20.權(quán)利要求13的方法，其中所說的啟動(dòng)子選自米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α-淀粉酶和Rhizomucormiehei脂肪酶啟動(dòng)子。21.權(quán)利要求13的方法，其中所說的宿主細(xì)胞是從頂孢霉屬、Corynascus、梭孢殼屬、毀絲霉屬、嗜熱子囊菌屬、孢子絲菌屬、毛殼屬、櫛霉屬、Scytalidium或踝節(jié)菌屬成員獲得的。22.一種重組真菌宿主細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中產(chǎn)生的粘度約為相同的條件下培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)生的粘度的80％或更低。23.權(quán)利要求22的細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中產(chǎn)生的粘度約為相同的條件下培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)生的粘度的50％或更低。24.權(quán)利要求22的細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中產(chǎn)生的粘度約為相同的條件下培養(yǎng)的米曲霉產(chǎn)生的粘度的30％或更低。25.權(quán)利要求22的細(xì)胞，該細(xì)胞是從嗜熱真菌獲得的。26.權(quán)利要求25的細(xì)胞，該細(xì)胞是從頂孢霉屬、Corynascus、梭孢殼屬、毀絲霉屬、嗜熱子囊菌屬、孢子絲菌屬、毛殼屬、櫛霉屬、Scytalidium或踝節(jié)菌屬成員獲得的。27.權(quán)利要求26的細(xì)胞，該細(xì)胞是從Thielaviaterrestris、Acremoniumalabamense、Myceliophthorathermophilum或Sporotrichumcellulophilum獲得的。28.權(quán)利要求22的細(xì)胞，該細(xì)胞是從Thielaviaterrestris獲得的。29.權(quán)利要求22的細(xì)胞，該細(xì)胞是從Thielaviaterrestris的不形成孢子的突變體獲得的。30.一種重組真菌宿主細(xì)胞，該細(xì)胞在罐發(fā)酵中能產(chǎn)生濃度至少為75g/l(干重)的生物量。31.權(quán)利要求30的細(xì)胞，該細(xì)胞是從Thielaviaterrestris、Acremoniumalabamense、Myceliophthorathermophilum或Sporotrichumcellulophilum獲得的。33.權(quán)利要求30的細(xì)胞，該細(xì)胞是從梭孢殼屬的不形成孢子的突變體獲得的。全文摘要本發(fā)明涉及包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸序列的重組嗜熱宿主細(xì)胞，以及利用該細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的重組宿主在罐發(fā)酵中表現(xiàn)出比許多已知的真菌宿主細(xì)胞(例如曲霉屬微生物)更好的形態(tài)，這一形態(tài)引起較低的粘度水平，從而提高產(chǎn)率。文檔編號(hào)C12R1/645GK1156482SQ95194219公開日1997年8月6日申請(qǐng)日期1995年7月12日優(yōu)先權(quán)日1994年7月20日發(fā)明者E·B·杰森,K·C·伯明納塞申請(qǐng)人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司