專利名稱：：4-甲硫基丁腈的酶水解的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及腈水解酶作為由腈基水解生成羧基的催化劑的應用。更確切地說，本發(fā)明涉及選自產堿菌、紅球菌或Gordona菌菌種微生物的，更確切地說選自于寄存號為ATCC8750的糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)、寄存號為FERMBP-3857的紅球菌Rhodo-coccussp.HT29-7、寄存號為FERMBP-4535的GordonaterraeMA-1微生物的腈水解酶的應用。例如，糞產堿桿菌腈水解酶在以其專利號分別是EP348901和JP03224496公告的ASAHI公司的歐洲和日本專利中描述過。在這些專利中，尤其是歐洲專利中，這種腈水解酶用來由外消旋腈生產旋光性酸。優(yōu)選的原料腈是α取代的腈，并且這些腈含有優(yōu)選的是有1-3個碳原子的烷基鏈或芳基。上述歐洲專利中的第11個實施例描述了用糞產堿桿菌水解外消旋扁桃腈，得到R-(-)扁桃酸，對映體過量為91％。NITTOCHEMICAL公司的歐洲專利486289與其美國等效專利US5326702，都描述了在亞硫酸鹽存在下用產堿桿菌sp.BC35-2(FERMNo11265或FERM-BP-3318)水解扁桃腈，在這種情況下得到扁桃酸，對映體過量約98％。ASAHI公司的專利JP04341185還描述了糞產堿桿菌ATCC8750腈水解酶的制備和應用，以解決由其外消旋腈制備光學純化合物的問題。更優(yōu)選地，在上面引用的日本專利中描述的對映選擇的腈水解酶能夠將具有下述通式(I)的2-羥基腈水解成具有下述化學式(II)的2-羥基羧酸式中R表示或許取代的芳基或可能取代的雜環(huán)基。該專利指出，用所述腈水解酶水解扁桃酸的腈能夠達到R-(-)扁桃酸對映體過量100％。在其實施例5中指出，可以使用所述的腈水解酶水解如戊腈、丙烯腈、2-鹵代丙腈、氯乙腈之類的脂族腈。但沒有明確指出有關有非對稱中心的脂族腈的這種水解對映選擇性。這份說明書還明確說明了糞產堿桿菌腈水解酶在pH6.5-8.0，所述酶的使用溫度(根據(jù)這份參考文獻)總是低于45℃的條件下活性最高。非常驚奇地看到，所述糞產堿桿菌ATCC8750的酶用于水解4-甲硫基-2-羥基丁腈時進行這種水解，從光學純度來看沒有任何選擇性。這種酶水解所述的腈，得到兩種酸的外消旋混合物，其中任何一種異構體都沒有優(yōu)勢。寄存號為FERMBP-3857的紅球菌sp.HT29-7的腈水解酶，例如在公告號分別為EP610049和US5296373的歐洲專利和美國專利中描述過，這兩份專利都是NITTO公司的。在這些專利中，尤其在這份美國專利中，使用這種腈水解酶由帶苯基的外消旋腈生產旋光性酸。這些原料腈都含有芳基，主要涉及扁桃腈或其芳環(huán)取代衍生物的水解。上述這份美國專利的實施例1描述了用紅球菌sp.HT29-7水解外消旋扁桃腈，得到R-(-)扁桃酸，對映體過量100％。實施例2描述了在其環(huán)上取代的扁桃腈衍生物的水解，扁桃酸衍生物對映體過量也是100％。用苯醛的腈進行水解時同樣是如此。NITTOCHEMICAL公司的歐洲專利610049描述了紅球菌sp.HT29-7(FERMBP-3857)、產堿桿菌sp.BC35-2(FERMBP-3318)或Breuibacte-riumacetylicum乙酰短桿菌IAM1790，在γ位被芳環(huán)取代的α羥基腈水解生成被旋光性苯基取代的α羥基羧酸這一過程中的用途。用紅球菌sp.HT29-7得到的酸，因原料腈的情況，和因是否有磷酸的存在(pH固定在約8.2)，其對映體過量總是不相同。非常驚奇地看到，紅球菌sp.HT29-7(FERMBP-3318)的這種腈水解酶在其用于水解4-甲硫基-2-羥基丁腈時，從對映體來看沒有任何選擇性。這種酶水解所述的腈，得到兩種酸的外消旋混合物，其中任何異構體都沒有優(yōu)勢。歐洲專利0610048描述了寄存號為FERMBP-4535的GordonaterraeMA-1的腈水解酶，用于將γ位為苯基和α位為羥基的腈水解成相應的旋光性酸。在所有這些實施例中，對映體過量是92-100％。非常驚奇地發(fā)現(xiàn)，寄存號為FERMBP-4535的GordonaterraeMA-1的腈水解酶在其用于水解4-甲硫基-2-羥基丁腈時，從對映體來看沒有任何選擇性。這種酶水解所述的腈，得到兩種酸的外消旋混合物，其中任何一種異構體都沒有優(yōu)勢。因此，本發(fā)明涉及一種通過用下述微生物的腈水解酶水解外消旋的α取代的4-甲硫基丁腈，制備外消旋的α取代的4-甲硫基丁酸的方法寄存號為ATCC8750的糞產堿桿菌、寄存號為FERMBP-3857的紅球菌sp.HT29-7、寄存號為FERMBP-4535的GordonaterraeMA-1。根據(jù)本發(fā)明的方法，這種微生物可以原樣使用或固定在本領域技術人員熟知的載體上使用。另外，這種酶編碼的遺傳信息可以從母體微生物(如糞產堿桿菌ATCC8750等)轉移到如枯草桿菌之類的微生物上。本發(fā)明方法的一種實施方式是使用相應量的自由的或固定的酶代替微生物，這種酶完全地或部分地已被純化。在α取代的4-甲硫基丁腈中，使用4-甲硫基-2-羥基丁腈更可取，所述的4-甲硫基-2-羥基丁腈能夠制備外消旋的蛋氨酸羥基類似物。這種蛋氨酸衍生物的制備技術能夠避免生成大量的無機副產物，由于涉及到環(huán)境保護的限制，排放這些副產物越來越成問題。在本發(fā)明的范圍內，這些酶在pH為4-11時具有腈水解酶的活性，pH為5-9時其活性最大。最佳使用溫度是30-60℃，不過在30-50℃使用這些酶更好。在原料溶液中，腈的可取濃度為每升10-400毫摩爾，優(yōu)選的是每升50-200毫摩爾。得到的酸的銨鹽濃度在其濃度低于每升2摩爾時，優(yōu)選的是每升0.1-1.5摩爾時不太影響這種酶的活性?？赏ㄟ^下述的實施例更完整地說明本發(fā)明，這些實施例不應看作是對本發(fā)明的限制。實施例1在下述的介質中培養(yǎng)糞產堿桿菌ATCC8750微生物乙酸銨10克/升酵母提取物5克/升胨5克/升K2HPO45克/升MgSO4·7H2O0.2克/升FeSO4·7H2O30毫克/升NaCl1克/升苯基氰0.5克/升pH7.2在2升裝600毫升這種介質的錐瓶中于30℃進行所述的培養(yǎng)。整個溶液以每分鐘150轉攪拌30小時。回收細胞沉淀物，用9克/升氯化鈉溶液洗滌，然后冷凍。丁腈水解的操作條件如下4-甲硫基-2-羥基丁腈50mM細胞5毫克/毫升磷酸鹽緩沖液200mM溫度30℃時間4小時4-甲硫基-2-羥基丁腈水解動力學研究表明，線性生成每小時每毫克干細胞2.8微摩爾蛋氨酸羥基類似物。生成的酸的對映體過量是用液相色譜測定的，酸的產率為80％時，其對映體過量是0％。實施例2根據(jù)用自由的細胞在180小時生成蛋氨酸羥基類似物的動力學評價酶的穩(wěn)定性。這些操作條件如下4-甲硫基-2-羥基丁腈100mM細胞10毫克/毫升磷酸鹽緩沖液300mM5毫升溫度25℃在排干后接著加100mM腈。生成相應的酸列于表1</tables>起始活性是每小時每毫克干細胞2微摩爾。盡管酸的濃度很高(0.9M蛋氨酸羥基類似物)，但這個實施例仍證明了酶的穩(wěn)定性。實施例3在下述條件下還測定了酶的穩(wěn)定性隨底物量和生成的酸量的變化酶的穩(wěn)定性隨底物量的變化腈表中的結果細胞10毫克/毫升磷酸鹽緩沖液300mMpH7.05毫升溫度25℃時間1小時酶的穩(wěn)定性隨生成酸量的變化關系操作條件如下腈50mM細胞2.5毫克/毫升磷酸鹽緩沖液100mMpH7.01毫升溫度30時間2小時</tables>實施例4腈水解酶的純化在實施例1描述的介質中于30℃培養(yǎng)糞產堿桿菌細胞24小時。在離心分離培養(yǎng)物后，將沉淀物溶于所述的pH7.5緩沖液[25mMtrisHCl，10％(重量/體積)甘油]中。這種細胞懸浮液用超聲波處理，然后離心得到粗提取物。再用最高為30％飽和度的硫酸銨處理這種粗提取物。得到的沉淀在pH7.5緩沖液中再制成懸浮液，然后對2升同樣的緩沖液透析一夜。然后，將得到的溶液放到預先用所述的pH7.5緩沖溶液平衡的QSepharoseFastFlowHR26/10陰離子交換柱中。再用0-1摩爾梯度氯化鈉溶液淋洗其活性物。然后，將這些活性餾分放到預先用所述的pH7.5緩沖溶液平衡的MonoQHR5/5陰離子交換柱中。再用0-1摩爾梯度氯化鈉溶液淋洗其腈水解酶。為了完成其純化，合并含有活性物的餾分，然后加1摩爾硫酸銨。將這種溶液放到預先用被加入1摩爾(NH4)2SO4的所述pH7.5緩沖溶液平衡的PhenylSepharoseHR5/5疏水相互作用柱中。再用1-0摩爾梯度硫酸銨溶液淋洗其活性物。用凝膠過濾法測定其蛋白質的分子量。其分子量是約260kDa。在SDS-PAGE柱上，觀察到唯一的43kDa帶(純度為95％)。用糞產堿桿菌的腈水解酶將4-甲硫基-2-羥基丁腈水解成蛋氨酸羥基類似物的動力學是線性的。實施例5pH的影響操作條件如下腈50mM蛋白質50微克/毫升pH4-5、100mM乙酸鹽緩沖液pH6-7、100mM磷酸鹽緩沖液1毫升pH8-9、100mMTRIS-HCl緩沖液pH10-11、100mM硼酸鹽緩沖液溫度30℃時間1-2小時</tables>實施例6溫度的影響操作條件如下腈50mM蛋白質50微克/毫升pH7.0、100mM磷酸鹽緩沖液溫度4-60℃時間1小時這種酶最佳的作用溫度是50℃</tables></tables>扁桃腈的對比實施例操作條件如下扁桃腈7mM蛋白質5微克/毫升磷酸鹽緩沖液100mMpH7.01毫升溫度30℃</tables>因此，純化的腈水解酶對這種扁桃腈是對映選擇性的，而對4-甲硫基-2-羥基丁腈沒有對映選擇性。實施例7用紅球菌sp.HT29-7FERMBP-3857水解4-甲硫基-2-羥基丁腈在下述介質中培養(yǎng)紅球菌sp.HT-29-7FERMBP-3857微生物甘油20克/升酵母提取物(DIFCO)3克/升KH2PO41克/升Na2HPO4·12H2O4.4克/升Na2SO42.8克/升MgCl2·6H2O0.85克/升CaCl2·2H2O0.05克/升MnSO4·H2O0.033克/升FeSO4·7H2O0.013克/升ZnSO4·7H2O0.005克/升苯基氰0.5克/升pH7.5在2升裝600毫升這種介質的錐瓶中于30℃進行培養(yǎng)。所有溶液均以每分鐘150轉攪拌140小時?；厥占毎恋?，用9克/升氯化鈉溶液洗滌，然后冷凍。水解時pH的影響操作條件如下4-甲硫基-2-羥基丁腈100mM660nm處光密度15pH4-5、100mM乙酸鹽緩沖液pH6.0-7.0、100mM磷酸鹽緩沖液1毫升pH8.0-9.0、100mMTRIS-HCl緩沖液pH10.0-11.0、100mM硼酸鹽緩沖液溫度30℃時間10小時實施例8底物濃度的影響在下述條件下還測定了這種酶的穩(wěn)定性隨底物量的變化4-甲硫基-2-羥基丁腈見表中的結果660nm處光密度20pH7.0、300mM磷酸鹽緩沖液5毫升溫度30℃時間2小時<p>實施例9這種酶的穩(wěn)定性隨生成的酸量的變化操作條件如下4-甲硫基-2-羥基丁腈100mM660nm處光密度15pH7.0、300mM磷酸鹽緩沖液1毫升溫度30℃時間6小時<p>實施例10對映體過量4-甲硫基-2-羥基丁腈140mM660nm處光密度14pH7.0、100mM磷酸鹽緩沖液1毫升溫度20℃4-甲硫基-2-羥基丁腈水解動力學研究表明，每小時每毫克干細胞線性生成蛋氨酸羥基類似物。生成的酸的對映體過量是用液相色譜法測定的，酸的產率為15-100％時，其對映體過量為0％。實施例11溫度的影響操作條件如下4-甲硫基-2-羥基丁腈100mM660nm處光密度15pH7.0、100mM磷酸鹽緩沖液1毫升溫度見表時間6小時實施例124-甲硫基-2-氨基丁腈的水解操作條件如下4-甲硫基-2-羥基丁腈23mM660nm處光密度15pH7.0、100mM磷酸鹽緩沖液1毫升溫度30℃實施例13GordonaterraeMA-1(FERMBP-4535)使用的培養(yǎng)條件如下甘油10克/升酵母提取物0.4克/升KH2PO46.8克/升Na2HPO4·12H2O7.1克/升Na2SO42.8克/升MgCl2·6H2O0.4克/升CaCl2·2H2O40毫克/升MnSO4·H2O4毫克/升FeCl30.6毫克/升ZnSO40.3毫克/升苯基氰0.5克/升pH7.2酶的活性然后，洗滌培養(yǎng)的細胞，在羥基甲硫基丁腈存在下進行活性物數(shù)量測定。操作條件如下[腈]＝23mM；[細胞]＝6.8克/升；100mM磷酸鹽緩沖液pH7.0；35℃圖3用GordonaterraeMA-1水解AMTP的氰醇羥基甲硫基丁腈水解動力學是線性的。起始速度估計為13mM/小時?？烁杉毎?。實施例14AMTP氰醇濃度對腈水解酶的影響測定了羥基甲硫基丁腈起始濃度對腈水解酶活性的影響，這些結果列于下表中。操作條件如下[細胞]＝5.1克/升100mM磷酸鹽緩沖液pH7.0；35℃測定了在0.5、1、2和3小時的動力學</tables>直到200mM，其活性不太隨底物的濃度改變。實施例15蛋氨酸羥基類似物濃度對腈水解酶的影響在這個試驗中，我們研究了4-羥基-2-甲硫基丁酸銨濃度對腈水解酶活性的影響。其操作條件如下[細胞]＝5克/升；[腈]＝100mM；100mM磷酸鹽緩沖液；pH7.0；35℃羧酸銨的濃度為0-1.5M。</tables>4-羥基-2-甲硫基丁酸銨濃度根本不改變GordonaterraeHT29-7菌株腈水解酶的起始活性。實施例16pH和溫度的影響操作條件如下[腈]＝100mM；[細胞]＝7.5克/升；pH4-5、100mM乙酸鹽緩沖液pH6-7、100mM磷酸鹽緩沖液pH8-9、100mMTRIS-HCl緩沖液pH10-11、100mM硼酸鹽緩沖液30℃；測定了在1、2、4和6小時的動力學。</tables>最佳pH在我們的操作條件下處在8-9附近。溫度對GordonaterraeMA-1的腈水解酶活性的影響。操作條件如下[腈]＝100mM；[細胞]＝7.5克/升；100mM磷酸鹽緩沖液；pH7.0；測定在1小時的動力學。</tables>最佳溫度在40-50℃。權利要求1.外消旋的α取代4-甲硫基丁酸的制備方法，其特征在于用選自糞產堿桿菌、紅球菌sp.HT-29-7或Gordonaterrae的腈水解酶水解外消旋的α取代4-甲硫基丁腈。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于外消旋的取代4-甲硫基丁腈是4-甲硫基-2-羥基丁腈。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于其介質的pH是4-11，優(yōu)選的是5-9。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于水解溫度是30-60℃，優(yōu)選的是30-50℃。5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在起始溶液中α取代4-甲硫基丁腈的濃度是每升10-400mM，優(yōu)選的是每升50-200mM。6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于溶液中α取代4-甲硫基丁酸的濃度是每升10-2000mM，優(yōu)選的是每升100-1500mM。7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于使用產堿桿菌屬微生物腈水解酶。8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于使用紅球菌屬微生物腈水解酶。9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于使用Gordona菌屬微生物腈水解酶。全文摘要本發(fā)明涉及一種用糞產堿桿菌、紅球菌sp.HT-29-7或Gordonaterrae腈水解酶，將α取代4-甲硫基丁腈酶水解成外消旋的α取代4-甲硫基丁酸的新方法。文檔編號C12N9/78GK1158640SQ95195224公開日1997年9月3日申請日期1995年9月19日優(yōu)先權日1994年9月22日發(fā)明者O·法威-布勒,M-C·伯朵,D·拉格,A·阿里阿格諾申請人:羅納-普朗克動物營養(yǎng)素公司