專利名稱：通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)l-賴氨酸及l(fā)-谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸及L-谷氨酸的方法。L-賴氨酸廣泛用來(lái)作為食品添加劑等，并且L-谷氨酸廣泛用來(lái)作為調(diào)味品等。
背景技術(shù)：
迄今為止工業(yè)生產(chǎn)的L-賴氨酸及L-谷氨酸是利用棒桿狀細(xì)菌通過(guò)發(fā)酵方法來(lái)獲得，這些細(xì)菌包括短頸細(xì)菌屬及棒狀桿菌屬，它們具備產(chǎn)生這些氨基酸的能力。這些方法中，已知棒狀細(xì)菌的生長(zhǎng)需要生物素，但同時(shí)如果培養(yǎng)基中有過(guò)量生物素存在則L-谷氨酸不積累。因此，在常規(guī)生產(chǎn)L-谷氨酸方法中常采取下列方法之一。即在培養(yǎng)過(guò)程中限制培養(yǎng)基中生物素的濃度，或者在含有足夠量的生物素的培養(yǎng)基中加入諸如表面活性劑或內(nèi)酰胺抗生素作為生物素活性抑制劑使它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程的起始及中期階段發(fā)揮作用。
然而，當(dāng)使用諸如廢糖漿這種廉價(jià)但含有過(guò)量生物素的原料在培養(yǎng)基中作為碳源，需要在培養(yǎng)基中加入生物素活性抑制劑，因而會(huì)增加產(chǎn)品費(fèi)用。
另一方面，已知下列發(fā)酵方法可以用來(lái)同時(shí)生產(chǎn)L-賴氨酸及L-谷氨酸。即，在生產(chǎn)L-谷氨酸的條件下培養(yǎng)產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌，或者將產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌及產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌混合后共同培養(yǎng)(日本專利公開(kāi)號(hào)5-3793)。
然而，在通過(guò)發(fā)酵由生產(chǎn)L-谷氨酸的條件下培養(yǎng)產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌，從而同時(shí)獲L-賴氨酸及L-谷氨酸的方法之中，產(chǎn)生L-谷氨酸的條件是在含有低濃度生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)短頸細(xì)菌屬或棒狀桿菌屬生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，或是在含有足夠量生物素的培養(yǎng)基中在培養(yǎng)過(guò)程起始期及中期加入表面活性劑或內(nèi)酰胺抗生素。尤其是使用諸如廢糖漿這種廉價(jià)但富含過(guò)量生物素的原料作為培養(yǎng)基的碳源時(shí)，需要在培養(yǎng)基中加入表面活性劑或內(nèi)酰胺類抗生素作為生物素活性抑制劑，這是增加產(chǎn)品費(fèi)用的原因之一。
而且，在把產(chǎn)生L-賴氨酸細(xì)菌及產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌混合后共同培養(yǎng)的方法中，其存在的問(wèn)題是培養(yǎng)過(guò)程控制有困難，發(fā)酵結(jié)果也不穩(wěn)定。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供通過(guò)發(fā)酵方法廉價(jià)且穩(wěn)定地生產(chǎn)L-谷氨酸，即使在使用廢糖漿這種富含過(guò)量生物素的原料作為培養(yǎng)基的碳源時(shí)也無(wú)需加入生物素活性抑制劑。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供通過(guò)發(fā)酵方法廉價(jià)且穩(wěn)定地同時(shí)生產(chǎn)L-賴氨酸、L-谷氨酸，即使在使廢糖漿這種富含過(guò)量生物素的原料作為培養(yǎng)基的碳源時(shí)也無(wú)需加入生物素活性制劑。
作為對(duì)上述目標(biāo)的研究結(jié)果，本項(xiàng)發(fā)明的的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種常規(guī)用來(lái)產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，它對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感突變而產(chǎn)生變異菌株，即使無(wú)任何表面活性劑及內(nèi)酰胺抗生素添加，變異菌株也能在富含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累相當(dāng)數(shù)量的L-谷氨酸。另外，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了通過(guò)賦于源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌以生物活性抑劑溫度敏感特性的菌株，它即使在無(wú)任何表面活性劑或內(nèi)酰胺抗生素添加也能由富含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累相當(dāng)數(shù)量的L-谷氨酸及L-賴氨酸。這樣本發(fā)明就已完全實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)。
也即，本發(fā)明在于通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生L-谷氨酸的方法，它包括如下步驟由液體培養(yǎng)基培養(yǎng)突變株，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累L-谷氨酸，由培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸，由產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌獲得突變株，這種菌株對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感突變，以及由無(wú)生物素活性抑制劑的富含過(guò)量生物素的任何培養(yǎng)基生產(chǎn)L-谷氨酸。
另一方面，本發(fā)明在于通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸及L-谷氨酸的方法，它包括如下的步驟由液體培養(yǎng)基培養(yǎng)突變株，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累L-賴氨酸及L-谷氨酸，由培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸及L-谷氨酸，由產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌獲得突變株，這種菌株有對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感突變，以及由無(wú)生物素活性抑制劑的富含生物素的培養(yǎng)基生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它提供了源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌的突變株，這種菌株有對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感突變，并具備由無(wú)生物素活性抑制劑的富含生物素培養(yǎng)基生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。該突變株有時(shí)在此后稱為“本發(fā)明的第一突變株”。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它提供了源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌的突變株，該菌株有生物素活性抑制劑溫度敏感突變，具備由無(wú)生物素活性抑制劑的富含生物素的培養(yǎng)基生產(chǎn)L-谷氨酸和L-賴氨酸的能力。該突變株有時(shí)在此后稱為“本發(fā)明的第二突變株”。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它提供了繁殖突變株的方法，該突變株具備由無(wú)生物素活性抑制劑的富含生物素的培養(yǎng)基生產(chǎn)L-谷氨酸的能力，本發(fā)明還賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感的特點(diǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它提供了繁殖突變株的方法，該突變株具備由無(wú)生物素活性抑制劑的富含生物素的培養(yǎng)基生產(chǎn)L-谷氨酸，L-賴氨酸的能力，本發(fā)明還賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感的特點(diǎn)及其生產(chǎn)L-賴氨酸的能力。
本發(fā)明將于下面詳細(xì)介紹其細(xì)節(jié)。
<1>源自產(chǎn)生L-谷氧酸細(xì)菌并具有生物素活性抑制劑溫度敏感突變株的制備，以及L-谷氨酸的生產(chǎn)〔1〕源自產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌并具有生物素活性抑制劑溫度敏感突變株的制備常規(guī)已知的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌是源自棒狀中產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌，當(dāng)它們?cè)诤胁簧儆?0μg/L濃度過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，實(shí)際上并不能在液體培養(yǎng)基里產(chǎn)生L-谷氨酸，除非在培養(yǎng)過(guò)程起始階段及中期的培養(yǎng)基內(nèi)加入諸如表面活性劑或抗生素等生物素活性抑制劑。本發(fā)明的第一突變株即使在含有過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也無(wú)需加入任何生物素活性抑制劑至培養(yǎng)基中就有產(chǎn)生L-谷氨酸的能力。即，本發(fā)明的第一突變株源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，它帶有生物素活性抑制劑的溫度敏感突變，在無(wú)生物素活性抑制劑添加時(shí)可在富含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中產(chǎn)生L-谷氨酸。
上述突變株可通過(guò)賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌以生物素活性抑制劑溫度敏感特點(diǎn)誘導(dǎo)得到。生物素活性抑制劑包括表面活性劑及抗生素。
表面活性劑包括，飽和脂肪酸類如月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、棕櫚酸；脂肪酸酯型非離子類表面活性劑如脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨聚糖酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇聚丙二醇酯、脂肪酸聚氧乙烯山梨聚糖酯；以及N-乙酰氨基酸類如N-棕櫚酰甘氨酸、N-棕櫚酰丙氨酸、N-棕櫚酰纈氨酸、N-棕櫚酰亮氨酸、N-棕櫚酰蘇氨酸、N-棕櫚酰甲硫氨酸、N-棕櫚酰天冬氨酸、N-棕櫚酰谷氨酸、N-肉豆蔻酰谷氨酸、N-硬脂酰谷氨酸、N，N’-二棕櫚酰烏氨酸、N，N’-二棕櫚酰賴氨酸。
抗生素包括，內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素及頭孢賴氨酸(cephalolysine)。
通常，產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到某個(gè)或更高濃度的生物素活性抑制劑的抑劑。在本發(fā)明中，對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感的菌株具有一個(gè)特性，即當(dāng)培養(yǎng)溫度為33-37℃(最好不低于34℃)時(shí)，與不添加生物素活性抑制劑的培養(yǎng)過(guò)程相比，其生長(zhǎng)受到明顯抑制；而在培養(yǎng)溫度為31.5℃(最適生長(zhǎng)溫度)、生物素活性抑制劑濃度最大時(shí)，我們可以看到，與無(wú)生物素活性抑制劑的培養(yǎng)過(guò)程相比，其生長(zhǎng)狀況相同。確切地說(shuō)，下面定義的特性是所期望的。即當(dāng)研究31.5℃及33-37℃時(shí)生物素活性抑制劑所施加的影響時(shí)，假定無(wú)生物素活性抑制劑時(shí)每個(gè)溫度的生長(zhǎng)程度均視為100，再由此計(jì)算每一個(gè)生物素活性抑制劑濃度下的相對(duì)生長(zhǎng)程度，從而決定31.5℃時(shí)不少于80相對(duì)生長(zhǎng)程度的最高濃度，以及33-37℃具有最高濃度生物素活性抑制劑時(shí)不多于50相對(duì)生長(zhǎng)程度。
本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌包括迄今分類屬于短頸細(xì)菌屬但目前則劃分屬于棒狀桿菌屬的細(xì)菌(國(guó)標(biāo)系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，41卷，255頁(yè)，1981年)，還包括屬短桿細(xì)菌屬但與棒狀桿菌屬較近的細(xì)菌。因此，本發(fā)明中所運(yùn)用的突變菌株可以對(duì)下列屬于短頸細(xì)菌屬或棒狀桿菌屬的產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌誘導(dǎo)得到。在此項(xiàng)說(shuō)明中，如不涉及L-谷氨酸產(chǎn)量，屬于棒狀桿菌屬或短桿細(xì)菌屬的細(xì)菌均統(tǒng)稱為“棒狀細(xì)菌”。嗜乙酰乙酸棒狀桿菌 ATCC 13870醋谷棒狀桿菌 ATCC 15806頸棒狀桿菌(callunae) ATCC 15991谷氨酸棒狀桿菌 ATCC 13032(擴(kuò)展短桿菌) ATCC 14020(乳發(fā)酵短桿菌) ATCC 13869(百合棒狀桿菌) ATCC 15990(黃色短桿菌) ATCC 14067corynebacterium melassecolaATCC 17965解糖短桿菌 ATCC 14066Brevibacterium immariophilum ATCC 14068玫瑰色短桿菌 ATCC 13825生硫短桿菌 ATCC 19240嗜氨微桿菌 ATCC 15354嗜熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(corynebacterium AJ12340(FERM BP-1539)thermoaminogenes)對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感的細(xì)菌突變株可以通過(guò)下列突變處理的方法而得到紫外線輻射、X-光輻射、放射性輻射以及突變劑等處理上述細(xì)菌菌株，繼而在含有生物素活性抑制劑的瓊脂牛培養(yǎng)基上進(jìn)行影印。即在33-37℃時(shí)觀察生物素活性抑制劑在幾個(gè)濃度時(shí)父代菌株的生長(zhǎng)狀況，較優(yōu)選擇是不低于34℃時(shí)決定最大濃度生物素活性抑制劑時(shí)仍有可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)。分離得到的突變株，此株在上述同樣溫度及最大濃度生物素活性抑制劑中可能會(huì)不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)速度顯著下降。
通過(guò)上述方法已經(jīng)賦予產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌生物素活性抑制劑溫度敏感特點(diǎn)。該突變株作為能夠在無(wú)生物素活性抑制劑的富含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中生產(chǎn)L-谷氨酸的細(xì)菌加以繁殖。
〔2〕通過(guò)基團(tuán)重組方法制備源自產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的生物素活性抑制劑溫度敏感突變株除了上述基于突變處理的方法以后，生物素活性抑制劑溫度的敏感突變的突變菌株也可通過(guò)其它方法獲得。例如，由產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌中獲得生物素活性抑制劑相關(guān)抗性基因，該基因在體外進(jìn)行突變處理以獲得溫度敏感性的生物素活性抑制劑抗性的突變表型基因。隨后利用目前已經(jīng)建立的同源重組方法將染色體上相應(yīng)的野生型基因置換為突變型基因。這樣即可獲得生物素活性抑制劑溫度敏感突變菌株。
下面所要描述的表面活性劑抗性相關(guān)基因也認(rèn)為是生物素活性抑制劑相關(guān)抗性基因。源自棒狀細(xì)菌的表面活性劑抗性相關(guān)基因可按如下方法分離(1)獲取屬于棒狀細(xì)菌且表面活性劑敏感性增強(qiáng)的表面活性劑敏感突變株；(2)將野生型棒狀細(xì)菌的各種染色體DNA片段與在棒狀細(xì)菌中有效的載體連接以制備各種重組DNA；(3)將各種重組DNA導(dǎo)入棒狀桿菌屬表面活性劑敏感突變菌株完成轉(zhuǎn)化；(4)由轉(zhuǎn)化菌株篩選喪失表面活性劑敏感的菌株，即該菌株具增強(qiáng)的表面活性劑抗性；(5)由喪失表面活性劑敏感性的轉(zhuǎn)化菌株中回收重組DNA；(6)分析與載體相連的野生型棒狀細(xì)菌中染色體DNA片段的結(jié)構(gòu)；由此所得的野生型棒狀細(xì)菌的染色體DNA片段帶有源自棒狀細(xì)菌的表面活性劑抗性相關(guān)基因。該基因至少與棒狀細(xì)菌在含有表面活性劑的培養(yǎng)基中產(chǎn)生L-谷氨酸的某一機(jī)制相關(guān)。同時(shí)，該基因還可能與添加青霉素或其它生物素限制物等方法產(chǎn)生L-谷氨酸有共同相關(guān)性。
在上述條目(1)中，“屬于棒狀細(xì)菌且表面活性劑敏感性增強(qiáng)的表面活性劑敏感突變株”指的是屬于棒狀細(xì)菌的突變株，它在含有對(duì)正常野生型棒狀細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)影響濃度的表面活性劑的培養(yǎng)基中嚴(yán)重生長(zhǎng)不良。例如，當(dāng)使用聚氧乙烯山梨聚糖甘油-棕櫚酸酯作為表面活性劑時(shí)，在培養(yǎng)基中其濃度為0.1-1mg/dl時(shí)，與正常野生型菌株相比，屬于棒狀細(xì)菌的表面活性劑敏感突變株生長(zhǎng)不良。相反，即使在培養(yǎng)基中表面活性劑濃度加至0.1-1mg/dl時(shí)，野生型棒狀細(xì)菌生長(zhǎng)卻未見(jiàn)任何變化。顯然與通常情況相比，在培養(yǎng)表面活性劑敏感突變株時(shí)，添加表面活性劑以產(chǎn)生L-谷氨酸，為產(chǎn)生L-谷氨酸所需表面活性劑的量明顯減少。據(jù)估測(cè)表面活性劑敏感細(xì)菌菌株的狀態(tài)大致與野生型菌株接觸表面活性劑之后狀態(tài)相當(dāng)。
制備表面活性劑敏感性相關(guān)基因?yàn)楂@得屬于棒狀細(xì)菌的表面活性劑敏感突變菌株，可利用日本專利出版號(hào)52-24593中描述的方法。即對(duì)產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌施以諸如紫外線照射，X光照射，輻射照射以及突變劑處理等誘導(dǎo)突變方法，以獲得在含有父系菌株能夠生長(zhǎng)劑量表面活性劑的瓊脂培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)的突變菌株。
屬于棒狀細(xì)菌的表面活性劑敏感突變株的特例為乳發(fā)酵短桿菌AJ11060，它在日本專利公開(kāi)號(hào)59-10797中已予公開(kāi)。
制備野生型棒狀細(xì)菌的各種染色體DNA片段的方法如下。即在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)野生型棒狀細(xì)菌，采用Saito等相同的方法由收集的細(xì)胞中回收染色體DNA(H.Saito和K.Miura，生物化學(xué)及生物物理Acta，72卷，619頁(yè)(1963))。用限制性酶消化回收的染色體DNA。用一種識(shí)別四個(gè)核苷酸的酶對(duì)DNA進(jìn)行不完全降解可制備多種DNA片段。
在棒狀細(xì)菌中可操縱的載體有能在棒狀細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制的質(zhì)粒。其具體例子如下。
(1)PAM330(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)No.58-67699)(2)PHM1519(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)No.58-77895)(3)PAJ655(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)No.58-192900)(4)PAJ611(同上)(5)PAJ1844(同上)(6)PCG1(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)No.57-134500)(7)PCG2(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)No.58-35197)(8)PCG4(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)No.57-183799)(9)PCG11(同上)為將棒狀細(xì)菌內(nèi)可操縱的載體與野生型棒狀細(xì)菌的各種染色體DNA片段連接。制備各種重組DNA，該載體應(yīng)以消化染色體DNA的同一限制性酶加以消化，或以能產(chǎn)生與多種染色體DNA片段末端互補(bǔ)順序的限制酶加以切割。消化的載體與染色體DNA片段相連時(shí)通常使用T4DNA連接酶。
為將各種重組DNA導(dǎo)入屬于棒狀細(xì)菌的表面活性劑敏感的突變株系，可采取常規(guī)報(bào)道的轉(zhuǎn)化方法。例如，可采用的方法有大腸桿菌K-12作為受體菌株時(shí)用CaCl2(氯化鈣)處理，從而提高DNA的透性(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學(xué)雜志，53卷，159頁(yè)(1970))，或由處于增殖階段的枯草桿菌作感受態(tài)細(xì)胞來(lái)導(dǎo)入DNA(Puncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yound，F(xiàn).E，基因雜志，1卷，153頁(yè)，(1977))。也可采用如下方法，已知枯草桿菌，放線菌及酵母等的DNA受體細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體、原生質(zhì)球狀態(tài)，這種狀態(tài)的DNA受體細(xì)胞易整合重組DNA以將重組DNA導(dǎo)入DNA受體。(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168卷，111頁(yè)(1979)；Bibb，M.J.，Wand，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274卷，398頁(yè)(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，75卷，1929頁(yè)(1978))。
至于原生質(zhì)體方法，即使是使用上述枯草桿菌方法也能獲得足夠高的轉(zhuǎn)化率。但是正如日本專利公開(kāi)號(hào)57-183799中所述那樣，也能夠運(yùn)用將棒狀細(xì)菌細(xì)胞的原生質(zhì)體與二價(jià)金屬離子及聚乙二醇或聚乙烯醇之一相接觸的狀態(tài)下將DAN導(dǎo)入的方法。當(dāng)然，使DNA導(dǎo)入易化的方法還可使用羧甲基纖維素，葡聚糖，菲可(Ficoll)及Pluronic F68(Serva公司)等類代替聚乙二醇或聚乙烯醇。本發(fā)明中采用電脈沖法(見(jiàn)日本專利公開(kāi)號(hào)2-207791)作為轉(zhuǎn)化方法的實(shí)施例。
下面將要描述由轉(zhuǎn)化菌株中篩選喪失對(duì)表面活性劑敏感性的方法。
由限制酶Sau 3AI部分消化得到的長(zhǎng)度為4-6Kbp的野生型棒狀細(xì)菌染色體DNA片段與能在大腸桿菌及棒狀細(xì)菌體內(nèi)增殖的質(zhì)粒載體相連接后得到重組DNA，這些重組體進(jìn)一步導(dǎo)入大腸桿菌DH5菌株的感受細(xì)胞中(Takara Shuzo有限公司生產(chǎn))或其類似物中。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株可建立一個(gè)野生型棒狀細(xì)菌基因文庫(kù)。
表面活性劑敏感的變異菌株AJ11060與在上述基因文庫(kù)中的重組DNA一起被轉(zhuǎn)化。將獲得的轉(zhuǎn)化物？次涂布在不含表面活性劑的M-CM2G瓊脂片上(每1升純水中含有葡萄糖5g，多聚胨10g，酵母浸出物10g，氯化鈉5g，DL-甲硫氨酸0.2g，瓊脂15g及氯霉素4mg，pH7.2)而形成大約40,000個(gè)菌群，將這些菌群在含30mg/L表面活性劑(聚山梨醇酯40)的M-CM2G片上復(fù)制以便獲得呈良好生長(zhǎng)狀態(tài)的菌株，這樣就得到了對(duì)表面活性劑不敏感的菌株。
制備野生型棒狀細(xì)菌染色體DNA的方法也可以同樣用于從失去表面活性劑敏感性的轉(zhuǎn)化菌株中回收重組DNA。即在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株，用Saito等(H.Saito，K.Miura，生物化學(xué)及生物物理進(jìn)展，72卷，619頁(yè)(1963年))的方法從收集的細(xì)胞中回收重組DNA。
與載體相連接的野生型棒狀細(xì)菌染色體DNA片段的結(jié)構(gòu)按如下方法分析。染色體DNA片段的全部核苷酸序列由常規(guī)的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列分析。對(duì)DNA序列進(jìn)行分析以確定增強(qiáng)子，啟動(dòng)子，操縱子，SD序列，引導(dǎo)肽，衰減子，起始密碼子，終止密碼子以及開(kāi)放閱讀框架等的位置。按照上面描述所得的源自棒狀細(xì)菌的表面活性劑抗性相關(guān)基因在下述實(shí)施例3中稱為“dts R基因”。該dts R基因至少包括序列表中SEQ ID No1中所示的由467-469位ATG至1985-1987位CTG之間的序列。由此序列所編碼的氨基酸序列在序列表中SEQ IDNOS1及2示出。在上述467-469位ATG同一框架的上游位置存在另一個(gè)ATG(核苷酸序列號(hào)359-361)。不可否認(rèn)這個(gè)多余的ATG可能是啟動(dòng)子。然而，根據(jù)對(duì)該基因上游共感序列的分析可推測(cè)上述467-469位ATG是起始密碼子。即由此推測(cè)dts R基因編碼的肽所具有的氨基酸序列包括SEQ ID No2中示出的氨基酸序列37-543位。這個(gè)肽稱為“DTSR蛋白”。凡在本發(fā)明的設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)中及權(quán)利要求涉及DTSR蛋白的氨基酸和dtsR基因的核苷酸序列時(shí)，它們的描述通常以467-469位ATG作為起始密碼子。當(dāng)然，359-361位ATG作為起始密碼子的可能性也需要考慮。例如，當(dāng)將dts R基因引入屬于短桿菌屬的細(xì)菌中以擴(kuò)大表達(dá)，可以設(shè)想包括SEQ ID No1中示出的核苷酸號(hào)467-1987序列將會(huì)表達(dá)。當(dāng)然也很容易為本專業(yè)技術(shù)熟練人員所理解，如果SEQ ID No1中示出的編碼區(qū)域和其上游區(qū)域中包括核苷酸號(hào)359-466也導(dǎo)入短桿細(xì)菌屬的細(xì)菌內(nèi)，DTSR蛋白以任何ATG作為起始密碼子均能正確表達(dá)。dtsR基因在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，N末端由起始密碼子編碼的甲硫氨基有時(shí)會(huì)為氨肽酶切除。
正如下述實(shí)施例3中所述，DTSR蛋白的氨基酸序列表明它與已報(bào)道的蛋白質(zhì)有同源性。該蛋白質(zhì)在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，83卷(1986年)，8049-8053頁(yè)；美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，83卷(1986年)，4864-4868頁(yè)；及基因，122卷(1992年)，199-202頁(yè)等文章稱為丙酮酸輔酶A羧化酶(PPC)蛋白的β-亞基。所有這些文章均未描述能表明該蛋白質(zhì)涉及谷氨酸的生產(chǎn)。
丙酰輔酶A羧化酶是一種催化反應(yīng)，其代謝途徑是通過(guò)2-羥基戊二酸，丙酰輔酶A，D-甲基丙二酰輔酶A及L-甲基丙二酰輔A酶等將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。這條代謝途徑可能是三羧酸循環(huán)中α-酮戊乙酸脫氫酶催化的反應(yīng)的旁路。另外丙酰輔酶A羧化酶需要生物素作為輔酶。根據(jù)這些證據(jù)，顯示丙酰輔酶A羧化酶催化的反應(yīng)，上述代謝途徑或其部分包含的某些反應(yīng)涉及表面活性劑抗性。因此與表面活性劑抗性相關(guān)的基因極可能包括丙酰輔酶A羧化酶差的α-亞基，或者其它能催化上述代謝途徑的其它酶或其部分亞基的編碼基因，除本身的dtsR基因之外，另外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)DTSR蛋白缺陷株的培養(yǎng)需要油酸。乙酰輔酶A羧化酶也需生物素為輔酶并與丙酰輔酶A羧化酶有相同的結(jié)構(gòu)。因此編碼脂肪酸代謝途徑中催化每一步反應(yīng)的酶或其部分亞基的基因可能也都與表面活性劑抗性相關(guān)。本發(fā)明中“表現(xiàn)生物素活性抑制劑溫度敏感突變”可能也包括這些基因的突變。
由基因替換法制備導(dǎo)入突變型dtsR基因的菌株表面活性劑溫度敏感突變也可以由以上述所得到的dtsR基因?yàn)榇淼模c表面活性劑抗性相關(guān)基因產(chǎn)生突變而得到。即可通過(guò)這樣的步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括將所得基因通過(guò)體外引入突變使之能制備具有產(chǎn)生溫度敏感功能的基因產(chǎn)物-突變型基因，并通過(guò)同源重組方法將染色體上已有的野生型基因替換。同源重組的基因替換方法已經(jīng)建立。例如它可通過(guò)使用線性DNA方法，或溫度敏感質(zhì)粒的方法加以利用。
具體地說(shuō)，將dtsR基因修飾為突變型基因包括在編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列中一或多個(gè)核苷酸位點(diǎn)上引起置換，缺失，插入，增加或倒位，使用的方法有定點(diǎn)突變法(Kramer，W.和Frits，H.J.，酶學(xué)方法，154卷，350頁(yè)，(1987年))，或次氯酸鈉及羥胺等化學(xué)誘變劑處理(Shortle，D.和Nathans，D.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，75卷，270頁(yè)(1978年))。
定點(diǎn)突變方法中使用人工合成的寡聚核苷酸，它能夠在可選及特定的堿基對(duì)中引入可選的置換，缺失，插入，增加及倒位。使用該方法時(shí)，首先將含有確切核苷酸序列并克隆的dtsR基因的質(zhì)粒變性以制備單鏈DNA。然后使用欲改變其部分的寡聚核苷酸人工合成的互補(bǔ)片段。當(dāng)然，該人工合成的寡聚核苷酸并非要完全互補(bǔ)，它應(yīng)該允許可選的堿基置換，缺失，插入，增加及倒位。單鏈DNA與帶有可選的堿基置換，缺失，插入，增加及倒位的人工合成的寡聚核苷酸共同退火。由T4連接酶及DNA聚合酶I的Klenow片段制備完整的雙鏈質(zhì)粒，將其導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。由此而得到的轉(zhuǎn)化體中，其質(zhì)粒攜帶的基因內(nèi)可選的堿基置換，缺失，插入，增加或倒位將會(huì)固定。引入基因突變的類似方法包括PCR重組方法(PCR技術(shù)，Stockton出版社(1989))。
化學(xué)試劑處理方法是以次氯酸及羥胺等直接處理含有目標(biāo)基因的DNA片段，它能在DNA片段中隨機(jī)地引入堿基置換，缺失，插入，增加或倒位。
由導(dǎo)入突變的基因替換產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌染色體上正?；虻姆椒橥粗亟M(分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，細(xì)菌學(xué)雜志，162卷，1196頁(yè)(1985年))。在同源重組中，與染色體上某些序列有同源性的質(zhì)粒等被引入細(xì)菌細(xì)胞，在有同源性序列的位置上發(fā)生一定頻率的重組，這樣整個(gè)質(zhì)粒即可整合進(jìn)入染色體。如在染色體同源序列處又發(fā)生新的重組，則該質(zhì)粒會(huì)從染色體下脫落。此時(shí)，根據(jù)重組在染色體上產(chǎn)生位置的不同有時(shí)會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)入突變的基因更加固定，而原來(lái)染色體上正常的基因則會(huì)隨質(zhì)粒從染色體上脫落。對(duì)這些細(xì)菌菌株進(jìn)行篩選，可能會(huì)篩選到染色體上正?；?yàn)榫哂袎A基置換，缺失，插入，增加或倒位的導(dǎo)入突變的基因所替換的菌株。
增強(qiáng)谷氨酸生物合成系統(tǒng)基因以改進(jìn)表面活性劑溫度敏感突變株的L-谷氨酸生產(chǎn)能力產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的表面活性劑溫度敏感突變株的L-谷氨酸生產(chǎn)能力可通過(guò)增強(qiáng)谷氨酸生物合成系統(tǒng)的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)谷氨酸生物合成系統(tǒng)的基因得到增強(qiáng)的實(shí)施例有糖酵解途徑中的磷酸果糖激酶(PFK，日本專利公開(kāi)號(hào)63-102692)，糖回補(bǔ)途徑中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，日本專利公開(kāi)號(hào)60-87788和62-55089)，三羧酸循環(huán)中的檸檬酸合成酶(CS，日本專利公開(kāi)號(hào)62-201585和63-119688)，烏頭酸水化酶(ACO，日本專利公開(kāi)號(hào)62-294086)，異檸檬酸脫氫酶(ICDH，日本專利公開(kāi)號(hào)62-166890和63-214189)及催化氨化反應(yīng)的谷氨酸脫氫酶(GDH，日本專利公開(kāi)號(hào)61-268185)。
下面敘述的幾種方法可能獲得上述基因。
(1)一個(gè)突變菌株的獲得有如下表現(xiàn)，即目的基因發(fā)生突變后表現(xiàn)出可鑒別的特征，而再引入目的基因時(shí)則特征消失。與突變菌株特征互補(bǔ)的基因可由棒狀細(xì)菌染色體上獲得。
(2)如果已從其它生物中獲得目的基因，并確證了它的核苷酸序列，可以高度同源區(qū)DNA序作探針以雜交的方法獲得目的基因。
(3)如果目的基因的核苷酸序列已完全清楚，則可以棒狀細(xì)菌染色體為模板通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR法)獲得帶目的基因的基因片段。
此處所用染色體可以按前面所述Saito等方法(H.Saito和K.Miura生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，72卷，619頁(yè)，(1963年))獲得。任何可行的棒狀細(xì)菌宿主-載體系統(tǒng)都可運(yùn)用，上述描寫(xiě)的系統(tǒng)也能使用。上述條款(3)中提及的方法，在核苷酸序已清楚時(shí)可以使用，本發(fā)明中以此為實(shí)施例在下文加以描述。
按照上述條款(2)、條款(3)的方法所得目的基因有時(shí)沒(méi)有獨(dú)自的啟動(dòng)子。在這種情況下，可將棒狀細(xì)菌中有活性啟動(dòng)子的DNA片段插入目的基因的上游以使目的基因表達(dá)。為使目的基因能增強(qiáng)表達(dá)，可將目的基因連接在強(qiáng)啟動(dòng)子下游。在棒狀細(xì)菌細(xì)胞中可用的啟動(dòng)子中強(qiáng)啟動(dòng)子有大腸桿菌lac啟動(dòng)子、tac-啟動(dòng)子，及trp啟動(dòng)子(Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa及K.Saho，生物技術(shù)雜志，5卷，305-312頁(yè)(1987年)。另外，棒狀細(xì)菌的trp啟動(dòng)子也是較優(yōu)選的啟動(dòng)子(日本專利公開(kāi)號(hào)62-195294)。該啟動(dòng)子在本發(fā)明的下文中用來(lái)作為表達(dá)PEPC基因的實(shí)施例。
由源自產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的表面活性劑溫度敏感突變株生產(chǎn)L-谷氨酸本發(fā)明中生產(chǎn)L-谷氨酸的方法包括，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)由上述方法制備的、源自產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌的表面活性劑溫度敏感突變株，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累谷氨酸，最后由培養(yǎng)基中收集谷氨酸。
根據(jù)本發(fā)明，使用一種常規(guī)的含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)成分的液體培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)上述突變菌株。本發(fā)明的突變菌株在無(wú)生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中也能產(chǎn)生L-谷氨酸，即使該液體培養(yǎng)基中含有過(guò)量的生物素。
葡萄糖、果糖、蔗糖、廢糖漿，淀粉水解物等碳水化合物；乙醇、甘油等醇類；乙酸等有機(jī)酸均可用來(lái)作為碳源。硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨、氨水、胨、肉膏浸出物，酵母浸出物，谷物浸漬液等可用來(lái)作為氮源。當(dāng)使用的突變菌株是營(yíng)養(yǎng)缺陷型時(shí)，加入所需成分的制備物或含該成分的天然材料。
發(fā)酵在有氧狀態(tài)進(jìn)行2-7天，培養(yǎng)過(guò)程中振蕩、攪動(dòng)培養(yǎng)物并使之通氣，保持培養(yǎng)液pH為5-9。用尿素、碳酸鈣、氨氣、氨水等調(diào)節(jié)pH值。培養(yǎng)溫度為24-37℃。然而只有在起始培養(yǎng)溫度為31.5℃，進(jìn)而升溫至33-40℃，最優(yōu)選的是培養(yǎng)中期為37℃，這才能獲得好的培養(yǎng)結(jié)果。即細(xì)菌在最適生長(zhǎng)溫度附近得到充分增殖，隨后培養(yǎng)中再升溫。這樣生產(chǎn)L-谷氨酸從開(kāi)始就不需加入任何生物素活性抑制劑，L-谷氨酸能在液體培養(yǎng)基中有相當(dāng)量的產(chǎn)生與積累。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)一種DTSR蛋白缺陷的菌株，它能在無(wú)任何生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中產(chǎn)生L-谷氨酸，即使該液體培養(yǎng)基中含有過(guò)量的生物素。該DTSR蛋白缺陷的菌株培養(yǎng)需油酸。然而，表面活性劑溫度敏感突變株在常規(guī)培養(yǎng)溫度即31.5℃時(shí)不需油酸。
由液體培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生與積累的L-谷氨酸可按常規(guī)方法進(jìn)行。例如，可用陰離子交換樹(shù)脂方法，結(jié)晶化方法等。具體地說(shuō)，L-谷氨酸通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂被吸附和分離，或通過(guò)中和作用被結(jié)晶化。
<2>制備能產(chǎn)生L-賴氨酸的表面活性劑溫度敏感突變株，以及生產(chǎn)L-賴氨酸，L-谷氨酸當(dāng)在含過(guò)量的不低于10μg/L生物素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌的常規(guī)已知產(chǎn)生L-賴氨酸細(xì)菌時(shí)，它像其它上述提及的產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌一樣只產(chǎn)生和積累L-賴氨酸和其它非L-谷氨酸，除非在培養(yǎng)起始或中期過(guò)程中的培養(yǎng)基內(nèi)加諸如表面活性劑或抗生素等生物素活性抑制劑。本發(fā)明所得的突變菌株即使在含有過(guò)量生物素的任何液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸、L-谷氨酸也無(wú)需向其中添加任何生物素活性抑制劑。這樣的變異株具有上述L-谷氨酸細(xì)菌的變異株對(duì)表面活性劑溫度敏感的特性，并能產(chǎn)生L-賴氨酸。即本發(fā)明的第二突變株源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，帶有產(chǎn)生L-賴氨酸及生物素活性抑制劑溫度敏感的突變，具有在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸、L-谷氨酸而無(wú)需生物素活性抑制劑的能力。
L-賴氨酸的生產(chǎn)能力可通過(guò)對(duì)S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(此后簡(jiǎn)稱為“AEC”)抗性突變而得到(日本專利出版號(hào)48-28078)。其它一些產(chǎn)生L-賴氨酸的突變菌株有需要氨基酸如L-高絲氨酸才生長(zhǎng)的突變菌株(日本專利出版號(hào)56-6499)；對(duì)AEC表現(xiàn)抗性且需要氨基酸如L-亮氨酸，L-高絲氨酸，L-輔氨酸，L-絲氨酸，L-精氨酸，L-丙氨酸，L-纈氨酸等氨基酸才生長(zhǎng)的突變株(美國(guó)專利號(hào)3,708,395和3,825,472)；對(duì)DL-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺，α-氨基-月桂酰內(nèi)酰胺，天冬氨酸類似物，磺胺類藥物，醌類，N-月桂酰亮氨酸等表現(xiàn)抗性的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變株；對(duì)含氧乙酸(oxyaloacetate)脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶等的抑制劑表現(xiàn)抗性的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變菌株(日本專利公開(kāi)號(hào)50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995和56-39778，和日本專利出版號(hào)53-43591及53-1833)；需要肌醇或乙酸才能生長(zhǎng)的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變菌株(日本專利公開(kāi)號(hào)55-9784和56-8692)；對(duì)氟代丙酮酸及不低于34℃溫度敏感的產(chǎn)生L-賴氨酸突變菌株(日本專利公開(kāi)號(hào)55-9873和53-86090)；和產(chǎn)生L-賴氨酸突變菌株(美國(guó)專利號(hào)4,411,997)等等。
本發(fā)明的第二突變株可以通過(guò)誘導(dǎo)所產(chǎn)生L-賴氨酸且源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，賦予它們以表面活性劑及抗生素等生物素活性抑制劑溫度敏感特征。
它們的溫度敏感特征可采用上述條款<1>中在本發(fā)明第一突變株引入溫度敏感的方法。即可采用下列突變處理的方法獲得生物素活性抑制劑溫度敏感突變株，它包括紫外線照射，X-光照射，輻射照射及誘變劑等處理具產(chǎn)生L-賴氨酸活性的產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，再以含生物素活性抑制劑的瓊脂平板培養(yǎng)基重復(fù)該過(guò)程。即在33-37℃培養(yǎng)條件下觀察幾個(gè)濃度下父系菌株的生長(zhǎng)情況，優(yōu)化選擇是在不低于34℃時(shí)選擇可識(shí)別細(xì)胞生長(zhǎng)的最大生物素活性抑制劑濃度。分離所得的突變菌株，該株在上述同樣溫度及最大生物素活性抑制劑濃度下不生長(zhǎng)或緩慢生長(zhǎng)。或者如條款<1>[2]中所示，生物素活性抑制劑溫度敏感突變株也能通過(guò)基因重組方法獲得。
或者本發(fā)明的第二突變株也能通過(guò)以下方法得到，即先誘導(dǎo)生物素活性抑制劑溫度敏感突變株，該株由產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌而得，再賦予該突變株生產(chǎn)L-賴氨酸的能力。
按照上述方法賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌以生物素活性抑制劑溫度敏感特性及生產(chǎn)L-賴氨酸的能力。進(jìn)而對(duì)這種突變菌株進(jìn)行繁殖，該菌株在含過(guò)量生物素且無(wú)任何生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中既能產(chǎn)生L-賴氨酸又能產(chǎn)生L-谷氨酸。
如同條款<1>[3]中所述，本發(fā)明第二突變株產(chǎn)生L-谷氨酸的能力可按上述谷氨酸生物合成系統(tǒng)基因的增強(qiáng)來(lái)改善。同樣，產(chǎn)生L-賴氨酸的能力也可通過(guò)賴氨酸生物合成系統(tǒng)基因的增強(qiáng)來(lái)改善。
細(xì)胞內(nèi)賴氨酸生物合成系統(tǒng)基因增強(qiáng)已知的實(shí)施例對(duì)L-賴氨酸和L-蘇氨酸所抑制協(xié)同反饋基本不反應(yīng)的編碼天冬氨酸激酶α-亞基或β-亞基蛋白基因基本不反應(yīng)(WO94/25605國(guó)際公開(kāi)本)，源自棒狀細(xì)菌的野生型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(日本專利公開(kāi)號(hào)60-87788)，源自棒狀細(xì)菌的編碼野生型二氫吡啶二羧酸合成酶基因(日本專利出版號(hào)6-55149)等。
一種常見(jiàn)的培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等，它的成分與上述用來(lái)培養(yǎng)第一突變株相同，它被用作本發(fā)明中第二突變株培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明的第二突變株具有在即使含過(guò)量生物素也無(wú)任何生物素活性抑制劑的任何液體培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸及L-谷氨酸的能力。
發(fā)酵在有氧狀態(tài)進(jìn)行2-7天，培養(yǎng)過(guò)程中振蕩，攪動(dòng)培養(yǎng)物并使用之通氣，保持培養(yǎng)液pH為5-9。用尿素、碳酸鈣、氨氣、氨水等調(diào)節(jié)pH值。培養(yǎng)溫度為24-37℃。然而只有在起始培養(yǎng)溫度為31.5℃，進(jìn)而升溫至33-40℃，最優(yōu)化的是培養(yǎng)中期為37℃，這樣才能獲得好的培養(yǎng)結(jié)果。即L-賴氨酸主要在31.5℃時(shí)產(chǎn)生，而產(chǎn)生L-谷氨酸的速度會(huì)隨著培養(yǎng)過(guò)程中溫度的升高而增加。利用此現(xiàn)象，可根據(jù)期望來(lái)調(diào)控L-賴氨酸與L-谷氨酸在液體培養(yǎng)基中最后的比例。
一種常規(guī)的方法可用來(lái)收集在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生與積累的L-賴氨酸和L-谷氨酸。例如，離子交換樹(shù)脂方法，結(jié)晶法等都可使用。當(dāng)使用離子交換樹(shù)脂方法時(shí)，L-賴氨酸首先在培養(yǎng)基中由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附并分離，隨后L-谷氨酸由陰離子交換樹(shù)脂吸附并分離，或由中性化使其結(jié)晶。當(dāng)使用L-賴氨酸及L-谷氨酸混合物時(shí)，自然就無(wú)需將兩者分開(kāi)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示出PESP在31.5℃、35℃時(shí)對(duì)乳發(fā)酵短桿菌AJ13029及其親代菌株ATCC13869生長(zhǎng)情況的影響。
圖2示出已導(dǎo)入攜dts R基因質(zhì)粒的乳發(fā)酵短桿菌AJ11060的表面活性劑抗性。
圖3示出了PESP在31.5℃、34℃時(shí)對(duì)乳發(fā)酵短桿菌AJ12993生長(zhǎng)情況的影響。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明將參照下列實(shí)施例明確加以解釋。
實(shí)施例1制備原自產(chǎn)L-谷氨酸棒狀細(xì)菌的生物素活性抑制劑溫度敏感突變株1.通過(guò)影印法測(cè)量產(chǎn)生L-谷氨酸細(xì)菌對(duì)生物素活性抑制劑的敏感性按照影印法測(cè)量乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869對(duì)聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯(PESP)的敏感性。
乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869于31.5℃在CM2B瓊脂平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜以獲得細(xì)菌細(xì)胞，該培養(yǎng)基成分在表1中示出。細(xì)菌在無(wú)菌的生理鹽水中懸浮，接種至上述瓊脂平板培養(yǎng)基，在31.5℃培養(yǎng)20-30小時(shí)至形成克隆。它們影印至加有每一濃度PESP的CM2B瓊脂培養(yǎng)基上，在35℃培養(yǎng)20-30小時(shí)觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。
表1成分 濃度蛋白胨(polypeptone)(Nihon藥廠生產(chǎn))1.0％酵母浸出物(Difo生產(chǎn)) 1.0％氯化鈉0.5％D-生物素 10μg/L瓊脂 1.5％pH7.2結(jié)果表明在35℃培養(yǎng)時(shí)，允許細(xì)菌生長(zhǎng)的PESP濃度在3mg/dl附近為其閾值，如表2所示。
表2PESP濃度 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30(mg/dl)克隆形成 + ++++- -
2.誘導(dǎo)時(shí)生物素活性抑制劑表現(xiàn)溫度敏感的突變菌株乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869于31.5℃在瓊脂肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)以獲得細(xì)菌細(xì)胞。所得細(xì)菌細(xì)胞置30℃在250μg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍水溶液中處理30分鐘。存活率為1％的懸浮細(xì)菌細(xì)胞隨后接種于CM2B瓊脂平板培養(yǎng)基上，在31.5℃培養(yǎng)20-30小時(shí)以形成克隆。它們被相應(yīng)地影印至CM2B瓊脂培養(yǎng)基及加有3mg/dl PESP的CM2B瓊脂培養(yǎng)基上，在35℃培養(yǎng)20-30小時(shí)。由此獲得細(xì)菌菌株，它們能在CM2B培養(yǎng)基上生長(zhǎng)但在含3mg/dl PESP的CM2B培養(yǎng)基上無(wú)可見(jiàn)的生長(zhǎng)。從約10,000個(gè)克隆中獲得720個(gè)菌株。每一個(gè)獲得的細(xì)菌菌株在35℃時(shí)在含3mg/dl PESP的CM2B瓊脂培養(yǎng)基上是否生長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行再次驗(yàn)證。明顯無(wú)敏感性的菌株被排除，獲得435株表現(xiàn)敏感性的菌株。
3.驗(yàn)證生物素活性抑制劑溫度敏感突變株生產(chǎn)L-谷氨酸的能力在條款2中所得435個(gè)突變菌株及其親代菌株ATCC13869按如下方法驗(yàn)證它們生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。
ATCC13869菌株及每一突變菌株于31.5℃，分別在CM2B瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30小時(shí)，隨之將所得細(xì)菌細(xì)胞接種至成分如表3所示培養(yǎng)基A的液體培養(yǎng)基中，在31.5℃溫度中振蕩培養(yǎng)。大約22小時(shí)后，再重新加入培養(yǎng)基使最終濃度同表3中的培養(yǎng)基B，隨后于31.5℃培養(yǎng)24小時(shí)或?qū)⑴囵B(yǎng)溫度調(diào)至35℃或37℃再培養(yǎng)同樣時(shí)間。培養(yǎng)完畢后，用Asahi化學(xué)工業(yè)公司生產(chǎn)的生物技術(shù)分析器(Biotech Analyzer)檢測(cè)L-谷氨酸產(chǎn)生與否。結(jié)果表明435個(gè)突變株中有106個(gè)突變株可產(chǎn)生谷氨酸。
表3成分 培養(yǎng)基A 培養(yǎng)基B葡萄糖 3g/dl5g/dlKH2PO40.14g/dl 0.14g/dlMgSO4·7H2O 0.04g/dl 0.04g/dlFeSO4·7H2O 0.001g/dl0.001g/dlMnSO4·4H2O 0.001g/dl0.001g/dl硫酸銨(NH4)2SO41.5g/dl 2.5g/dl大豆蛋白水解液1.5ml/dl0.38ml/dl鹽酸硫胺素 0.2mg/l 0.2mg/l生物素 0.3mg/l 0.3mg/l消泡劑0.05ml/l 0.05ml/lCaCO35g/dl5g/dlpH7.0(以氫氧化鉀調(diào)pH值)表4中示出了ATCC13869菌株及其它突變株的代表株在每一溫度下積累產(chǎn)生的L-谷氨酸數(shù)量。
表4突變菌株積累的L-谷氨酸數(shù)量(g/dl)細(xì)菌菌株溫度轉(zhuǎn)換后的培養(yǎng)溫度31.5℃35℃37℃ATCC13869 0.0 0.0 0.2No.21 0.3 2.8 2.9No.36 2.4 2.6 2.7No.58 0.2 1.9 2.7No.100 0.4 1.5 2.8No.121 0.5 1.7 1.94.驗(yàn)證生物素活性抑制劑的溫度敏感活性上述條款3中所述對(duì)PESP溫度敏感在液體培養(yǎng)中由如下方法驗(yàn)證。
每一個(gè)突變株及其親代菌株在CM2B瓊脂平板培養(yǎng)基于31.5℃培養(yǎng)24小時(shí)以獲得細(xì)菌細(xì)胞。所得細(xì)菌細(xì)胞接種至CM2B液體培養(yǎng)基及含濃度為3mg/dl PESP的CM2B液體培養(yǎng)基中，在31.5℃和37℃中振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。在660nm處測(cè)定液體培養(yǎng)基光密度值。假定無(wú)PESP的培養(yǎng)基在每一溫度的生長(zhǎng)程度為100，據(jù)此確定添加PESP培養(yǎng)基中細(xì)菌的相對(duì)生長(zhǎng)程度。結(jié)果在表5中示出
表5細(xì)菌菌株 相對(duì)生長(zhǎng)程度31.5℃37℃ATCC 13869 9885No.21 8133No.36 5215No.58 8532No.1008232No.1219540如表中所示，乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869作為親代菌株在3mg/dl的PESP濃度、37℃時(shí)其相對(duì)生長(zhǎng)程度為85，而每一突變株在有PESP時(shí)相對(duì)生長(zhǎng)程度為40或更低，表明它們對(duì)3mg/dl濃度的PESP的敏感性。
上述條款3中提及的突變株之一-21號(hào)突變株及其親代菌株ATCC13869，它們?cè)趲讉€(gè)濃度的PESP及31.5℃和35℃時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)程度由圖1示出。
突變菌株中21號(hào)稱為乳發(fā)酵短桿菌AJ13029，1994年9月2日保藏于通產(chǎn)和科學(xué)技術(shù)省國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，其貯存號(hào)為FERM P-14501，根據(jù)布達(dá)佩思公約1995年8月1日轉(zhuǎn)至國(guó)際保藏庫(kù)，其保藏號(hào)為FERM BP-5189。
實(shí)施例2生產(chǎn)L-谷氨酸1.培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換時(shí)間設(shè)定的研究乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869或AJ13029接種至成分如表中所示的種子培養(yǎng)基中，在31.5℃中振蕩培養(yǎng)24小時(shí)以獲得種子培養(yǎng)物。成分如表6中所示的進(jìn)行大量培養(yǎng)的培養(yǎng)液每份為300ml加至容積為500ml的玻璃發(fā)酵罐中，加熱消毒。此后向其中加入40ml種子培養(yǎng)物。培養(yǎng)時(shí)攪動(dòng)速率為800-1,300rpm，通氣量為1/2或1/1vvm，培養(yǎng)溫度為31.5℃。使用氨氣使培養(yǎng)液體pH值保持在7.5。在開(kāi)始培養(yǎng)后8小時(shí)、12小時(shí)或16小時(shí)將培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)為37℃。同時(shí)也設(shè)置了一個(gè)培養(yǎng)溫度不變的對(duì)照，這樣該培養(yǎng)物仍在31.5℃中繼續(xù)培養(yǎng)。
表6成分 濃度種子培養(yǎng)物大量培養(yǎng)物葡萄糖5g/dl 15g/dlKH2PO40.1g/dl0.2g/dlMgSO4·7H2O 0.04g/dl 0.15g/dlFeSO4·7H2O1mg/dl 1.5mg/dlMnSO4·4H2O1mg/dl 1.5mg/dl大豆蛋白水解液 2ml/dl 5ml/dl生物素 50μg/l 200μg/l鹽酸硫銨素 200μg/l 300μg/l在每一試驗(yàn)中，培養(yǎng)過(guò)程在20-40小時(shí)之間的某一時(shí)間點(diǎn)終止，此時(shí)葡萄糖已完全耗盡。對(duì)培養(yǎng)液中產(chǎn)生與積累的L-谷氨酸數(shù)量測(cè)定。結(jié)果在表7中示出。
表7溫度轉(zhuǎn)換時(shí)間選擇(小時(shí))產(chǎn)生L-谷氨酸數(shù)量(g/dlATCC13869AJ1302980.5 8.3120.1 7.0160.0 5.4- 0.0 2.1據(jù)此結(jié)果，可以認(rèn)為當(dāng)培養(yǎng)溫度由31.5℃轉(zhuǎn)至37℃時(shí)，AJ13029菌株即使在含有過(guò)量生物素的且無(wú)任何生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中仍能產(chǎn)生L-谷氨酸，且L-谷氨酸量的增加與培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換時(shí)間早晚成比例。相反，其親代菌株ATCC13869即使轉(zhuǎn)換培養(yǎng)溫度也幾乎不產(chǎn)生L-谷氨酸。
離心去取已經(jīng)過(guò)8小時(shí)溫度轉(zhuǎn)換后的1升液體培養(yǎng)物中細(xì)菌細(xì)胞。運(yùn)用常規(guī)的離子交換樹(shù)脂法從所得上清中分離與提純L-谷氨酸。所得L-谷氨酸鈉晶體為64.3克。
2.研究轉(zhuǎn)換溫度按照上述條款1中同樣方式使用容積為500ml玻璃發(fā)酵罐在31.5℃下培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和AJ13029。在開(kāi)始培養(yǎng)后8小時(shí)將培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換至34℃，37℃或39℃。培養(yǎng)溫度不轉(zhuǎn)換的對(duì)照繼續(xù)在31.5℃中培養(yǎng)。在每一實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)過(guò)程在20-40小時(shí)之間的某一時(shí)間點(diǎn)終止，此時(shí)葡萄糖已完全耗盡。對(duì)培養(yǎng)液中產(chǎn)生與積累的L-谷氨酸數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在表8中示出。
表8轉(zhuǎn)換后溫度(℃) 產(chǎn)生L-谷氨酸數(shù)量(g/dl)ATCC13869 AJ1302934 0.05.837 0.58.339 0.99.2- 0.02.1據(jù)此結(jié)果，可以認(rèn)為當(dāng)溫度轉(zhuǎn)換后隨著溫度升高，AJ13029菌株產(chǎn)生L-谷氨酸數(shù)量有增加的趨勢(shì)。
實(shí)施例3用基因重組方法制備源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感的突變株1.制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869(產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌的野生株)的染色體DNA將乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869接種至100ml T-Y培養(yǎng)基中(細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Difco)1％、Bacto-酵母浸出物(Difco)0.5％、氯化鈉0.5％(pH7.2))，于31.5℃培養(yǎng)8小時(shí)獲得培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物以3,000r.p.m.離心15分鐘獲0.5g濕潤(rùn)細(xì)菌細(xì)胞。用Saito和Miura(生物化學(xué)、生物物理學(xué)報(bào)，72卷，619頁(yè)(1963年))方法從該濕潤(rùn)細(xì)菌細(xì)胞中獲得染色體DNA。下一步，將60μg的染色體DNA及3個(gè)單位的限制性酶Sau 3AI分別與10mM Tris-鹽酸緩沖液(含50mM氯化鈉，10mM硫酸鎂及1mM二硫蘇糖醇(pH7.4))混合，于37℃反應(yīng)30分鐘。用常規(guī)酚提取及乙醚沉淀法處理完全反應(yīng)后的溶液以獲得50g被Sau 3AI消化的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段。
2.利用質(zhì)粒載體DNA構(gòu)建乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869基因文庫(kù)為使制備的基因文庫(kù)既能導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞又能導(dǎo)入棒狀細(xì)菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，制備了能在兩者胞內(nèi)自主復(fù)制的質(zhì)粒。確切地說(shuō)，能在棒狀細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制且已獲得的質(zhì)粒pHM1519(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，48卷，2901-2903頁(yè)，(1984年))的復(fù)制起點(diǎn)，被包含在質(zhì)粒pHK4(日本專利公開(kāi)號(hào)5-7491)中。這種質(zhì)粒以限制性酶Bam HI及Kpn I消化后得到帶有復(fù)制起點(diǎn)的基因片段。用產(chǎn)生平滑末端試劑盒(TakaraShuzo公司生產(chǎn)Blunting Kit)獲得平滑末端基因片段，使用生產(chǎn)Sal I銜接物(Takara Shuzo公司生產(chǎn))將其插入質(zhì)粒載體pHSG399(Takara Shuzo公司生產(chǎn))的Sal I位點(diǎn)以構(gòu)建pSAC4。帶有pHK4的大腸桿菌HB101菌株稱為大腸桿菌AJ13136，于1995年8月1日保藏于通產(chǎn)和科學(xué)技術(shù)省國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，其保藏號(hào)為FERM BP-5186。
上述構(gòu)建的質(zhì)粒pSAC4(20μg)與限制性酶Bam HI(20單位)在50mM Tris-鹽酸緩沖液中(含有100mM氯化鈉及10mM硫酸鎂(pH7.4))，在37℃反應(yīng)2小時(shí)以獲得消化液。該溶液按常規(guī)方法以酚抽提及乙醇沉淀。此后，為防止來(lái)自質(zhì)粒載體的DNA自身重新環(huán)化連接，運(yùn)用分子克隆第二版中(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，p1.56(1989年))的細(xì)菌堿性磷酸酶處理，使DNA片段去除磷酸基團(tuán)方法，然后再運(yùn)用常規(guī)的酚抽提及乙醇沉淀處理的方法。
將Bam HI消化的pSAC4(1μg)，條款1中所得Sau 3AI消化的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA片段，及T4DNA連接酶(2單位)(Takara Shuzo公司生產(chǎn))加入含有66mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇和10mM ATP的66mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)中，于16℃反應(yīng)16小時(shí)使DNA進(jìn)行連接。下一步，用常規(guī)方法使DNA混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，轉(zhuǎn)化后該菌在含170μg/ml氯霉素的L-瓊脂培養(yǎng)基上涂布生長(zhǎng)。最終得到約20,000個(gè)克隆。至此建成基因文庫(kù)。
3.轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌AJ11060由上述約20,000個(gè)克隆中回收重組DNA。回收方法同上述Saito及Miura的方法。
重組DNA混合物分成50批運(yùn)用常規(guī)的電脈沖(日本專利公開(kāi)號(hào)2-207791)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入表面活性劑敏感性增加的突變菌株AJ11060。轉(zhuǎn)化體接種至添加有葡萄糖的L-瓊脂培養(yǎng)基中，在31.5℃中連續(xù)培養(yǎng)。最后出現(xiàn)了20,000個(gè)轉(zhuǎn)化體。這些轉(zhuǎn)化體影印至含30mg/l表面活性劑的平板上。從上可得到對(duì)表面活性劑有抗性且能在上述平板上生長(zhǎng)的一些菌株。
4.檢驗(yàn)帶有多個(gè)拷貝dts R基因菌株的表面活性劑抗性由一些生長(zhǎng)的菌株中提取相應(yīng)的重組DNA，用它們?cè)俅无D(zhuǎn)化AJ11060菌株。由此實(shí)驗(yàn)也獲得表面活性劑抗性的菌株。該菌株帶有的重組DNA稱為“pDTR6”，質(zhì)粒中帶有的表面活性劑抗性基因稱為“dts R”。導(dǎo)入該質(zhì)粒的AJ11060菌株在添加有3g/L表面活性劑的液體培養(yǎng)基(80克葡萄糖，1g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15毫升大豆水解液，200μg鹽酸硫胺素，300μg生物素，4mg氯霉素，3.0g聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯及50g CaCO3等溶于1升純水中(用氫氧化鉀調(diào)培養(yǎng)基pH值至8.0))中。其生長(zhǎng)抑制作用受到抑制(見(jiàn)圖2)。
5.制備質(zhì)粒DNA按常規(guī)方法從上述所得含有重組DNA的AJ11060/pDTR6中制備質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌JM109。所得JM109/pDTR6于37℃在20毫升培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。該培養(yǎng)基組成為1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出物和0.5％氯化鈉。所得培養(yǎng)液體(20毫升)接種上述同樣組成的培養(yǎng)基(1升)中在37℃培養(yǎng)3小時(shí)，隨后加入氯霉素(0.2g)。同樣溫度下再培養(yǎng)20小時(shí)得到液體培養(yǎng)物。然后將該培養(yǎng)物3,000rpm離心10分鐘，再將獲得的每2g濕潤(rùn)細(xì)菌細(xì)胞懸浮于含25％蔗糖的350mMTris-鹽酸緩沖液中(20毫升，pH8.0)。然后分別加入溶菌酶(Sigma公司生產(chǎn))10mg，0.25M EDTA溶液(8ml，pH8.0)，以及20％十二烷基磺酸鈉(8ml)。60℃保溫處理30分鐘得到細(xì)菌裂解液。向溶液中再加5M氯化鈉(13ml)后于4℃保溫處理16小時(shí)，隨后15,000r.p.m.離心30分鐘。所得上清按常規(guī)沉淀DNA的方法用酚抽提及乙醇沉淀。
沉淀物在減壓條件下干燥，以含1mM EDTA的10mM Tris-鹽酸緩沖液(6ml，pH7.5)溶解。向其中加入氯化銫(6g)及溴化乙錠(0.2ml，19mg/ml)。利用超速離心機(jī)在39,000r.p.m.平衡密度梯度離心42小時(shí)來(lái)分離DNA。用正丁醇除去溴化乙錠，隨后對(duì)含1mMEDTA的10mM Tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)透析得到約500μg純化的pDTR6重組DNA。私人命名大腸桿菌JM109.pDTR6為AJ12967。該菌株于1994年2月22日保藏在通產(chǎn)和科技省國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，其保藏號(hào)為FERM P-14168，根據(jù)布達(dá)佩思公約于1995年2月9日轉(zhuǎn)存至國(guó)際保藏庫(kù)，其保藏號(hào)為FERM BP-4994。
6.含有dts R基因DNA的核苷酸序列分析用上述條款5中所得重組DNA確定核苷酸序列。利用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing試劑盒(Applied Biochemical公司生產(chǎn))按照Sanger的方法確定核苷酸序列。所得帶有dts R基因的DNA其核苷酸序列在序列表中以SEQ ID No1示出。在該序列中存在的最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框架在SEQ ID No1序列中從359位A起至1987位G止。然而，根據(jù)該基因上游存在的共有序列分析推測(cè)467-469位的ATG可能是起始密碼子。由開(kāi)放閱讀框架359位A至1987位G編碼的氨基酸序列，在序列表中SEQ ID No1內(nèi)與其相應(yīng)的核苷酸序列共同示出。序列表中以SEQ ID No2單獨(dú)示出其氨基酸序列。由包含467-1987位核苷酸的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)稱為“DTSR蛋白質(zhì)”。
眾所周知，蛋白質(zhì)N末端存在的甲硫氨酸在翻譯之后被肽酶所除去。這是因?yàn)镹末端的甲硫氨酸來(lái)源于作為翻譯起始密碼子的ATG，它實(shí)際上與蛋白質(zhì)主要功能并不相關(guān)。很可能在本發(fā)明中的DTSR蛋白質(zhì)也被除去甲硫氨酸。
核苷酸序列及氨基酸序列分別與所知的序列比較它們的同源性。以EMBL及SWISS-PROT為資料庫(kù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列表中SEQ IDNo1所示基因及其編碼的蛋白質(zhì)是新序列。當(dāng)然，結(jié)果也顯示它與已報(bào)道蛋白質(zhì)有同源性。這種蛋白質(zhì)在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，83卷，8049-8053頁(yè)，1986年；美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，83卷，4864-4868頁(yè)，1986年；及基因，122卷，199-202頁(yè)，1992年等刊物中稱為丙?；?輔酶A羧化酶(PPC)蛋白質(zhì)β亞基。
7.制備突變型dts R基因。
按照下述方法獲得編碼溫度敏感突變型DTSR蛋白質(zhì)的dts R基因。參照文獻(xiàn)Shortle，D.和Nathans，D.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，75卷，270頁(yè)(1978年)中描述方法在體外用羥胺處理質(zhì)粒pDTR6，再將其通過(guò)上述電脈沖方法導(dǎo)入AJ11060細(xì)胞中。在M-CM2G瓊脂培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)30小時(shí)約有20,000個(gè)轉(zhuǎn)化體形成克隆。每一平板上的克隆都影印至另外兩塊含30mg/l表面活性劑的培養(yǎng)基平板上，分別在31.5℃及35℃中培養(yǎng)20小時(shí)。此后得到兩株在31.5℃時(shí)生長(zhǎng)而在35℃時(shí)不生長(zhǎng)的菌株。用常規(guī)方法從此兩株菌株中提取質(zhì)粒。因此獲得pDTR6-11及pDTR6-77。
8.通過(guò)基因替換法構(gòu)建導(dǎo)入突變型dts R基因的菌株使用日本專利公開(kāi)號(hào)5-7491中所述的溫度敏感質(zhì)粒，按照同源重組方法獲得突變型dts R基因替換菌株。確切地說(shuō)，上述pDTR6-11及pDTR6-77以Xba I及Kpn I消化，所得到的含有dts R基因的片段按上述方法分別與Xba I及Kpn I消化的pHSG398(Takara SHuzo公司生產(chǎn))相連接，最后相應(yīng)地得到pHSGX-K-11及pHSGX-K-77。
其次，由能在棒狀細(xì)菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒中獲得pHSC4質(zhì)粒，它帶有溫度敏感自主復(fù)制能且具有突變型復(fù)制起點(diǎn)(日本專利公開(kāi)號(hào)5-7491)。用限制性酶Bam HI及Kpn I消化pHSC4質(zhì)粒，得到帶復(fù)制起點(diǎn)的基因片段。使用形成DNA平末端試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn)，平末端試劑盒)得到帶平末端DNA片段，利用Kpn I銜接物(Takara公司生產(chǎn))將其插入pHSGX-K-11及pHSGX-K-77質(zhì)粒中Kpn I識(shí)別的位點(diǎn)，從而構(gòu)成質(zhì)粒pKTCX-K-11及pKTCX-K-77。帶有pHSC4質(zhì)粒的大腸桿菌AJ12571菌株于1990年10月11日保藏于通產(chǎn)和科技省，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，其保藏號(hào)為FERM P-11763，根據(jù)布達(dá)佩思公約于1991年8月26號(hào)轉(zhuǎn)存至國(guó)際保藏庫(kù)，其保藏號(hào)為FERM BP-3524。
運(yùn)用電脈沖法分別將兩個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869，按照日本專利公開(kāi)號(hào)5-7491中所述方法將染色體上dts R基因替換為突變型。確切地說(shuō)，乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869/pKTCX-K-11及ATCC13869/pKTCX-K-77在M-CM2G液體培養(yǎng)基中于25℃振蕩培養(yǎng)6小時(shí)，隨后在含有5μg/ml氯霉素的M-CM2G培養(yǎng)基中涂布生長(zhǎng)。在34℃能形成克隆的菌株被認(rèn)為是已導(dǎo)入質(zhì)粒的菌株。其次，通過(guò)影印的方法由導(dǎo)入質(zhì)粒的菌株中得到34℃對(duì)氯霉素敏感菌株。由敏感菌株中獲得第11號(hào)及第77號(hào)菌株，它們?cè)?4℃時(shí)喪失表面活性劑抗性。在這些菌株中，其染色體上dts R基因已被替換為突變型。以質(zhì)粒pHSGX-K-11為模板，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增帶有第11號(hào)菌株中的突變型dts R基因得到DNA片段，并將它插入質(zhì)粒pHSG299(TakaraShuzo公司生產(chǎn))中Hinc II位點(diǎn)，最終得到質(zhì)粒pHSGDTSR11。導(dǎo)入質(zhì)粒pHSGDTSR11的大腸桿菌JM109菌株稱為AJ13137，1995年8月1日保藏于通產(chǎn)和科技省，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，其保藏號(hào)為FERM BP-5187?？赏ㄟ^(guò)限制性酶Sph I及Kpn I消化質(zhì)粒pHSGDTSR11，從而得到第十一號(hào)菌株的突變型dts R基因。
9.第11號(hào)菌株及第77號(hào)菌株的L-谷氨酸生產(chǎn)能力上述條款8中得到的第11號(hào)菌株及第77號(hào)菌株其L-谷氨酸生產(chǎn)能力按照實(shí)施例2中同樣方法進(jìn)行評(píng)估。確切地說(shuō)，使用實(shí)施例2中同樣的培養(yǎng)基，開(kāi)始培養(yǎng)后第8個(gè)小時(shí)培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換為37℃。結(jié)果表明帶有突變型基因的菌株其L-谷氨酸生產(chǎn)能力得到改進(jìn)，由表9示出。
表9細(xì)菌菌株 L-谷氨酸(g/dl)ATCC 138690.5第11號(hào)(No.11)菌株 7.5第77號(hào)(No.77)菌株 6.9實(shí)施例4源自產(chǎn)L-谷氨酸細(xì)菌且?guī)в斜砻婊钚詣囟让舾型蛔冎曛泄劝彼嵘锖铣上到y(tǒng)的基因的增強(qiáng)1.克隆gdh、gltA及icd基因乳發(fā)酵短桿菌的gdh(谷氨酸脫氫酶基因)，gltA(檸檬酸合成酶基因)以及icd(異檸檬酸脫氫酶基因)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法克隆。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所用引物根據(jù)已報(bào)道的谷氨酸棒狀桿菌中g(shù)dh基因序列(分子微生物學(xué)，6卷第3期，317-326頁(yè)，(1992年))，glt A基因序列(微生物學(xué)，140卷，1817頁(yè)-1828頁(yè)，(1994年))以及icd基因序列(細(xì)菌學(xué)雜志，177卷，774-782頁(yè)，(1995年))來(lái)合成。序列表中SEQ ID No3(5’端)及SEQ ID No4(3’端)所示寡核苷酸用作擴(kuò)增gdh基因的引物，SEQ ID No5(5’端)及SEQ ID No6(3’端)所示寡核苷酸用作擴(kuò)增glt A基因的引物，SEQ ID No7(5’端)及SEQ ID No8(3’端)所示寡核苷酸用作擴(kuò)增icd基因的引物，將它們分別合成并使用。
按照上述實(shí)施例3所述的方法制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體組DNA，利用上述寡核苷酸作為引物，以此DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用商用的DNA平末端形成試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn)，Blunting Kit)使獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物兩末端平，隨后將它們的克隆進(jìn)入載體質(zhì)粒pHSG 399的Sma I位點(diǎn)最后分別得到pHSG-gdh，pHSG-gltA以及pHSG-icd。
2.克隆PPC基因按照實(shí)施例3中所述方法制備乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體組DNA，以它為模板通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法獲得編碼PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白)的ppc基因約34Kbp的DNA片段。PCR方法中所用引物根據(jù)已報(bào)道谷氨酸棒狀桿菌(基因，77卷，237-251頁(yè)(1989年))中ppc基因序列合成。PCR反應(yīng)按照上述同樣方式進(jìn)行。所用引物的序列在SEQ ID No9(5’端)及ID No10(3’端)中示出。
PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物由限制酶Sal I(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化后插入質(zhì)粒pHSG 399的SalI位點(diǎn)得到質(zhì)粒pHSG-ppc’。pHSG-ppc’的ppc基因插入方向與pHSG 399質(zhì)粒中l(wèi)ac啟動(dòng)子方向相反。
其次，已知在乳發(fā)酵短桿菌中可操縱的色氨酸操縱子的啟動(dòng)子(基因，53卷，191-200頁(yè)，(1987年))。將其插入pHSG-ppc’中ppc基因上游。該啟動(dòng)子表現(xiàn)活性的序列在序列表中SEQ ID No11示出，包括51個(gè)核苷酸。合成具備SEQ ID No11中所示序列的核苷酸鏈及SEQ ID No12中所示的與其互補(bǔ)的序列的核苷酸鏈，以得到表現(xiàn)啟動(dòng)子活性的51個(gè)堿基對(duì)形成的雙鏈DNA，它們兩端與限制性酶Kpn I和Xba I消化得到的片段相吻合。
合成的DNA各以約10pmol/μl濃度混合，100℃加熱10分鐘，然后降至室溫以退火。pHSG-ppc’用限制性酶Kpn I及Xba I消化(Takara Shuzo公司生產(chǎn))，與上述啟動(dòng)子相連接。使用連接試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))進(jìn)行連接反應(yīng)。由此得到在ppc基因上游插入一個(gè)色氨酸操縱子的pHSG-ppc質(zhì)粒。
3.構(gòu)建導(dǎo)入gdh、gltA及icd等三類基因的質(zhì)粒將gdh、gltA及icd等三類基因連接以構(gòu)建質(zhì)粒。確切地說(shuō)，質(zhì)粒pHSG-gdh由限制性酶EooR I消化，使用商用DNA平末端形成試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn)，Blunting Kit)得到平末端，它與按上述方法產(chǎn)生平末端的glt基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 連接后得到質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA。進(jìn)而，質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA用限制性酶Kpn I消化，并按同樣方法形成平末端，它與按照上述在兩端得到平末端的icd基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接后得到質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA＋icd。
4.構(gòu)建導(dǎo)入gdh、gltA及ppc等三類基因的質(zhì)粒將gdh、gltA及ppc等三類基因連接以構(gòu)建質(zhì)粒。確切地說(shuō)，質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA以限制性酶Kpn I消化。質(zhì)粒pHSG-ppc以限制性酶Kpn I及Sal I消化以得到在其上游有色氨酸操縱子的啟動(dòng)子的ppc基因片段。所得片段使用DNA平末端形成試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn)，Blunting Kit)產(chǎn)生平末端，隨后使用Kpn I接頭(Linker)將其插入質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA的Kpn I位點(diǎn)得到質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA＋ppc。
5.在上述質(zhì)粒中導(dǎo)入棒狀細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)為使質(zhì)粒pHSG-gdh，pHSG-gltA，pHSG-ppc，pHSG-icd，pHSG－gdh＋gltA＋icd以及pHSG－gdh＋gltA＋ppc等能在棒狀細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制，將能在棒狀細(xì)菌內(nèi)自主復(fù)制且源自質(zhì)粒pHM1519(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，48卷，2901-2903頁(yè)，(1984年))中已獲得的復(fù)制起點(diǎn)導(dǎo)入上述質(zhì)粒。
確切地說(shuō)，帶有源自pHM1519復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒pHK4(日本專利公開(kāi)號(hào)5-7491)用限制性Bam HI酶及Kpn I消化得到含復(fù)制起點(diǎn)的基因片段。所得片斷使用平末端形成試劑盒產(chǎn)生平末端(Takara Shuzo公司生產(chǎn)，Blunting Kit)，隨后利用Kpn I銜接物(Takara Shuzo公司生產(chǎn))分別插入pHSG-gdh，pHSG-gltA，pHSG-ppc和pHSG-icd等質(zhì)粒的Kpn I位點(diǎn)中去得到質(zhì)粒pGDH，pGLTA，pPPC，及pICD。源自pHM1519的復(fù)制起點(diǎn)利用Sal I銜接物以相同方法分別插入質(zhì)粒pHSG－gdh＋gltA＋icd及pHSG－gdh－gltA＋PPc等質(zhì)粒的Sal I位點(diǎn)中得到質(zhì)粒pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD及pGDH＋GLTA＋PPC。
6.確證質(zhì)粒pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD和pGDH＋GLTA＋PPC等所包括的每個(gè)基因的表達(dá)本發(fā)明驗(yàn)證了質(zhì)粒pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD和pGDH＋GLTA＋PPC等所包括的每個(gè)基因均能在乳發(fā)酵短桿菌的細(xì)胞中表達(dá)，并且這些質(zhì)粒能進(jìn)行基因擴(kuò)增。
確切地說(shuō)，將上述每個(gè)質(zhì)粒根據(jù)電脈沖法(日本專利公開(kāi)號(hào)2-207791)導(dǎo)入乳發(fā)酵短桿菌所得轉(zhuǎn)化體在含4μg/ml氯霉素的CM2G平板培養(yǎng)基(每升純水中含蛋白胨10g，酵母浸出物10g，葡萄糖5g，氯化鈉5g及15g瓊脂，pH7.2)上篩選。所得轉(zhuǎn)化體在CM2G瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后接種至下列培養(yǎng)基中于31.5℃培養(yǎng)16小時(shí)，該培養(yǎng)基每升純水中含葡萄糖80g，磷酸二氫鉀1g，七水硫酸鎂0.4g，硫酸銨30g，七水硫酸亞鐵0.01g，七水硫酸錳0.01g，大豆水解液15ml，鹽酸硫銨素200μg，生物素300μg，碳酸鈣50g(使用氫氧化鉀調(diào)pH至8.0)。按常規(guī)方法離心培養(yǎng)液收集細(xì)菌細(xì)胞。
按照分子微生物學(xué)6卷(3期)，317頁(yè)-326頁(yè)(1992年)中所述方法用破碎細(xì)菌細(xì)胞后所得粗提液檢測(cè)下列菌株ATCC13869/pGDH，ATCC13869/pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD及ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC的GDH(谷氨酸脫氫酶)活性。結(jié)果表明，與正常對(duì)照ATCC13869/pSAC4相比，每一轉(zhuǎn)化體其GDH活性要高約13倍(見(jiàn)表10)。
ATCC13869/pGLTA，ATCC13869/pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD，和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC等菌株的CS(檸檬酸合成酶)活性按照微生物學(xué)140卷，1817-1828頁(yè)(1994年))中所述方法進(jìn)行檢測(cè)。ATCC13869/pICD及ATCC13869/pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD菌株的ICDH(異檸檬酸脫氫酶)活性按照細(xì)菌學(xué)雜志177卷，774-782頁(yè)(1995年))中所述方法進(jìn)行檢測(cè)。ATCC13869/pPPC及ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC菌株的PEPC活性按照基因77卷，237-251頁(yè)(1989年))中所述方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果在表11-13中示出。結(jié)果表明以ATCC13869/pSAC4為對(duì)照，轉(zhuǎn)化體中每一目的酶的活性約升高2-20倍。據(jù)此認(rèn)為pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD和pGDH＋GLTA＋PPC等質(zhì)粒所帶每一基因均能在乳發(fā)酵短桿菌中表達(dá)并實(shí)現(xiàn)其功能。
表10細(xì)菌菌株 GDH活性(△Abs/min/mg蛋白)ATCC13869/pGDH 1.36ATCC13869/pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD 1.28ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC 1.33ATCC13869/pSAC4 0.11表11細(xì)菌菌株 CS活性(μmol/min/mg蛋白)ATCC13869/pGLTA 5.5ATCC13869/pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD 4.8ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC 4.8ATCC13869/pSAC4 0.7表12細(xì)菌菌株P(guān)EPC活性(Units/min/mg蛋白)ATCC13869/pPPC 1.12ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC 1.04ATCC13869/pSAC4 0.11表13細(xì)菌菌株ICDH活性(Units/min/mg蛋白)ATCC13869/pICD 3.5ATCC13869/pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD 2.8ATCC13869/pSAC4 1.07.用AJ13029菌株及攜帶擴(kuò)增的gdh，gltA，ppc及icd基因的AJ13029菌株生產(chǎn)L-谷氨酸在1升水中含有如下成分葡萄糖60g，磷酸二氫鉀1g，七水硫酸鎂0.4g，硫酸銨30g，七水硫酸亞鐵0.01g，七水硫酸錳0.01g，大豆水解液15ml，鹽酸硫銨素及生物素450μg的培養(yǎng)基置容積為1升的發(fā)酵罐中，加熱滅菌。將在CM2G瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的各個(gè)菌株的細(xì)菌細(xì)胞接種至其內(nèi)，在31.5℃培養(yǎng)30小時(shí)并利用氨氣控制pH為7.0。
按照上述同樣方法檢測(cè)培養(yǎng)后培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞的密度及累積的L-谷氨酸數(shù)量。結(jié)果在表14中示出。
表14細(xì)菌菌株 質(zhì)粒細(xì)胞密度L-谷氨酸(OD) (g/l)AJ13029 - 0.95 33AJ13029 pGDH 1.01 35AJ13029 pGLTA 0.93 37AJ13029 pICD 0.93 37AJ13029 pPPC 0.84 38AJ13029 pGDH＋GLTA＋I(xiàn)CD 1.05 39AJ13029 pGDH＋GLTA＋PPC 0.95 41AJ13029 pSAC4 0.93 33實(shí)施例5由源自產(chǎn)L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌產(chǎn)L-賴氨酸株制備對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感的突變型菌株1.通過(guò)影印方法檢測(cè)產(chǎn)L-賴氨酸菌株的生物素活性抑制劑的敏感性由乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869通過(guò)誘導(dǎo)突變后得到的乳發(fā)酵短桿菌AJ11446菌株(日本專利公開(kāi)號(hào)62-24073)，該菌能產(chǎn)生L-賴氨酸并有AEC抗性，它對(duì)聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯(PESP)的敏感性利用影印法按如下進(jìn)行。
乳發(fā)酵短桿菌AJ11446在表15所示成分的MCM2G瓊脂平板培養(yǎng)基上于31.5℃培養(yǎng)過(guò)夜以得到細(xì)菌細(xì)胞。它們?cè)跍缇纳睇}水中懸浮后，接種至上述瓊脂平板培養(yǎng)基于31.5℃培養(yǎng)20-30小時(shí)以形成克隆。它們被影印至添加有不同濃度PESP的MCM2G瓊脂培養(yǎng)基上，在34℃培養(yǎng)20-30小時(shí)以觀測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)。
表15成分濃度葡萄糖 0.5％蛋白胨(polypeptone)(Nihon制藥廠生產(chǎn))1.0％酵母浸出物(Difco公司生產(chǎn)) 1.0％氯化鈉 0.5％DL-甲硫氨酸 0.02％瓊脂1.5％pH7.2結(jié)果表明這種情況下PESP濃度在3mg/dl附近為細(xì)菌生長(zhǎng)的閾值，由表16示出。
表16PESP濃度 00.10.31.03.01030(mg/dl)生長(zhǎng)狀況 ++ + + + - -2.誘導(dǎo)對(duì)生物素活性抑制劑表現(xiàn)溫度敏感的突變菌株乳發(fā)酵短桿菌AJ11446在瓊脂肉湯培養(yǎng)基中于31.5℃培養(yǎng)24小時(shí)以獲得細(xì)菌細(xì)胞。所得細(xì)菌細(xì)胞在30℃用含250μg/ml N-甲基N’-硝基-N-亞硝基胍的水溶液處理30分鐘。存活率為1％的細(xì)菌細(xì)胞懸液接種至MCM2G瓊脂平板培養(yǎng)上，于31.5℃培養(yǎng)20-30小時(shí)以形成克隆。它們分別被影印至MCM2G瓊脂培養(yǎng)基以及含3mg/dl PESP的MCM2G瓊脂培養(yǎng)基上，然后在34℃培養(yǎng)20-30小時(shí)。收集在MCM2G培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在添加有3mg/dl PESP的MCM2G培養(yǎng)基上卻不生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株。由10,000個(gè)克隆中共獲得250個(gè)這樣的菌株。對(duì)所得的每一個(gè)細(xì)菌菌株在3mg/dl PESP的MCM2G培養(yǎng)基上于34℃再次驗(yàn)證其生長(zhǎng)與否。無(wú)明顯敏感性的菌株被排除，最終得到166個(gè)表現(xiàn)溫度敏感的菌株。
3.確證生物素活性抑制劑溫度敏感突變株同時(shí)生產(chǎn)L-賴氨酸及L-谷氨酸的能力由條款2中所得166個(gè)突變株及其親本AJ11446按如下方法驗(yàn)證它們產(chǎn)生L-賴氨酸及L-谷氨酸的能力。
AJ11446菌株及每一突變菌株分別在MCM2G瓊脂培養(yǎng)基上于31.5℃培養(yǎng)20-30小時(shí)以獲得細(xì)菌細(xì)胞，隨后將其接種至表17所示成分的液體培養(yǎng)基中于31.5℃振蕩培養(yǎng)。16小時(shí)后培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換為34℃并培養(yǎng)使整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程達(dá)48小時(shí)。通過(guò)薄層色譜法分析培養(yǎng)完畢后L-賴氨酸與L-谷氨酸產(chǎn)生與否。結(jié)果顯示166個(gè)突變菌株中有31個(gè)菌株能同時(shí)產(chǎn)生兩種氨基酸。這31個(gè)菌株如在31.5℃培養(yǎng)48小時(shí)而不轉(zhuǎn)換培養(yǎng)溫度，則僅有3個(gè)菌株能同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸及L-谷氨酸。
表17成分 濃度葡萄糖 10g/dl磷酸二氫鉀0.1g/dl七水硫酸鎂 0.04g/dl七水硫酸亞鐵0.001g/dl四水硫酸錳 0.001g/dl硫酸銨 2g/dl大豆蛋白水解液 3ml/dlDL-丙氨酸 0.35g/d煙酰胺 5mg/l鹽酸硫銨素0.2mg/l生物素0.3mg/l消泡劑 0.05ml/l碳酸鈣 5g/dlpH7.0
突變菌株的代表菌株及AJ11446菌株所積累L-賴氨酸及L-谷氨酸數(shù)量在表18中示出。
表18細(xì)菌菌株 溫度轉(zhuǎn)換 賴氨酸谷氨酸(g/dl)(g/dl)AJ11446 是2.09 0.00否2.41 0.00EK-015 是2.17 0.07否2.35 0.00EK-036 是2.35 0.34否2.20 0.14EK-100 是1.69 0.93否1.71 0.47EK-112 是1.96 0.69否2.50 0.00EK-117 是0.99 1.88否1.70 0.004.確證生物素活性抑制劑溫度敏感性在上述條款3中得到的同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸及L-谷氨酸細(xì)菌，其對(duì)PESP的溫度敏感性按下述在液體中培養(yǎng)的方法驗(yàn)證。
每一突變株及其親本株在MCM2G瓊脂平板培養(yǎng)基上于31.5℃培養(yǎng)24小時(shí)以獲得細(xì)菌細(xì)胞，所得細(xì)菌細(xì)胞接種至MCM2G液體培養(yǎng)基及含1mg/dl濃度PESP的MCM2G液體培養(yǎng)基中于31.5℃及34℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。在660nm處測(cè)定所得液體培養(yǎng)物的光密度值(O.D.)。以未添加PESP的培養(yǎng)基中的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況為100，據(jù)此決定添加PESP的培養(yǎng)基中細(xì)菌的相對(duì)生長(zhǎng)程度。結(jié)果由表19示出。
表19細(xì)菌菌株 相對(duì)生長(zhǎng)程度31.5℃ 34℃AJ11446 95 90EK-01590 27EK-03684 45EK-10087 22EK-11298 36EK-11784 47如表中所示，在1mg/dl PESP存在時(shí)，每一個(gè)突變菌株在31.5℃時(shí)其相對(duì)生長(zhǎng)程度大于等于80，而在34℃時(shí)它的相對(duì)生長(zhǎng)程度小于等于50，明顯顯示了對(duì)PESP的敏感性。
圖3示出了PESP在31.5℃及34℃對(duì)于條款3中所得菌株之一EK-112的生長(zhǎng)狀況的影響。在添加不超過(guò)1mg/dl PESP濃度時(shí)，31.5℃培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀況與無(wú)PESP時(shí)大致相當(dāng)。然而，與無(wú)PESP時(shí)培養(yǎng)相比，添加1mg/dl PESP的細(xì)菌生長(zhǎng)狀況在34℃時(shí)受到顯著抑制。這表明該突變株有溫度敏感特性。
在這些突變菌株中，EK-112稱為乳發(fā)酵短桿菌AJ12993，1994年6月3日保藏于通產(chǎn)和技術(shù)省，生命科學(xué)與人體技術(shù)研究所，其保藏號(hào)為FERM P-14348，根據(jù)布達(dá)佩思公約于1995年8月1日轉(zhuǎn)存至國(guó)際保藏處，其保藏號(hào)為FERM BP-5188。
實(shí)施例6共同發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸1.培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換時(shí)間的研究乳發(fā)酵短桿菌AJ11446或AJ12993接種至上述表6所示成分的種子培養(yǎng)物培養(yǎng)基中，在31.5℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)以獲得種子培養(yǎng)物。成分如表6所示的大規(guī)模培養(yǎng)基分裝為每份300ml加至容積為500ml的玻璃發(fā)酵罐中，加熱滅菌。此后，接種進(jìn)40ml的種子培養(yǎng)物，開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)振蕩速度為800-1,300rpm，通氣量為1/2-1/1vvm，培養(yǎng)溫度為31.5℃。使用氨氣將培養(yǎng)液的pH值維持在7.5。在開(kāi)始培養(yǎng)后8，12或16小時(shí)將溫度轉(zhuǎn)換至34℃。設(shè)置對(duì)照使其培養(yǎng)溫度始終保持為31.5℃不變。
在每一實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)過(guò)程在40-50小時(shí)之內(nèi)某一時(shí)間點(diǎn)終止以使葡萄糖完全耗盡。檢測(cè)流體培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累的L-賴氨酸及L-谷氨酸的數(shù)量。結(jié)果如表20所示。
表20溫度轉(zhuǎn)換時(shí)間(小時(shí)) AJ11446AJ12993賴氨酸谷氨酸賴氨酸 谷氨酸(g/dl)(g/dl)(g/dl) (g/dl)8 5.4 0.0 4.4 1.812 5.5 0.0 4.5 1.616 5.6 0.0 4.7 1.2- 5.9 0.0 6.0 0.0據(jù)此結(jié)果可知AJ12993菌株即使在有過(guò)量生物素且無(wú)任何生物素活性抑制劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，它可通過(guò)培養(yǎng)溫度由31.5℃轉(zhuǎn)換為34℃同時(shí)產(chǎn)生L-賴氨酸及L-谷氨酸，并且L-谷氨酸的產(chǎn)量與隨著轉(zhuǎn)換培養(yǎng)溫度時(shí)間的提前增加，L-賴氨酸的產(chǎn)量則隨著轉(zhuǎn)換溫度時(shí)間的推后而增加。至于親代菌株AJ11446則相反，它只產(chǎn)生L-賴氨酸，即使進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換也無(wú)L-谷氨酸的產(chǎn)生。
在開(kāi)始培養(yǎng)8小時(shí)后進(jìn)行溫度轉(zhuǎn)換的培養(yǎng)完畢的流體培養(yǎng)物1升，通過(guò)離心除去細(xì)菌細(xì)胞。使用離子交換樹(shù)脂通過(guò)常規(guī)方法由所得上清中提純L-賴氨酸及L-谷氨酸。所得L-鹽酸賴氨酸晶體為31.7克，L-谷氨酸鈉晶體為13.9克。
2.轉(zhuǎn)換溫度的研究按照條款1中所述同樣方法使用容積為500ml的玻璃發(fā)酵罐在31.5℃開(kāi)始培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌AJ11446及AJ12993。在開(kāi)始培養(yǎng)8小時(shí)后，將培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換至33℃，34℃及35℃。設(shè)置對(duì)照使其培養(yǎng)溫度不變而始終保持為31.5℃。在每一實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)過(guò)程在40-50小時(shí)后結(jié)束。檢測(cè)液體培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累的L-賴氨酸及L-谷氨酸數(shù)量。結(jié)果如表21所示。
表21轉(zhuǎn)換后溫度(℃) AJ11446AJ12993賴氨酸 谷氨酸 賴氨酸 谷氨酸(g/dl) (g/dl) (g/dl) (g/dl)33 5.6 0.04.9 1.134 5.4 0.04.4 1.835 5.2 0.03.8 2.1-5.9 0.06.0 0.0據(jù)此結(jié)果可知在AJ12993菌株的培養(yǎng)過(guò)程中存在這樣一種趨勢(shì)，即L-谷氨酸產(chǎn)量隨著轉(zhuǎn)換后溫度的升高而增加，而L-賴氨酸的產(chǎn)量則隨著轉(zhuǎn)換后溫度的降低而增加。
工業(yè)實(shí)用性據(jù)此發(fā)明，賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌對(duì)生物素活性抑制劑溫度敏感特性。即使使用含過(guò)量生物素的原料作為碳源時(shí)，仍能通過(guò)發(fā)酵方法穩(wěn)定且廉價(jià)地制備L-谷氨酸。
另外，還賦予它生產(chǎn)L-賴氨酸能力。因此即使使用含過(guò)量生物素的原料作為碳源時(shí)，仍能通過(guò)發(fā)酵方法穩(wěn)定且廉價(jià)地制備L-賴氨酸和L-谷氨酸。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人AJINOMOTO有限責(zé)任公司(ii)發(fā)明名稱生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸的方法(iii)序列數(shù)目12(iv)通迅地址(A)收信人(B)街(C)城市(D)州(省)(E)國(guó)家(F)郵政編碼(v)計(jì)算機(jī)可讀表格(A)介質(zhì)類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBC PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release #1.0，Version#1.30(EPO)(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)備檔日期(C)分類(vii)以前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朖P6/195465(B)提交日期1994，8，19(viii)律師/代理人信息(A)姓名(B)登記號(hào)(C)參考/存檔號(hào)(ix)電信信息(A)電話(B)傳真(2)SEQ ID No1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2733堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(脫氧核糖核酸)(基因組)(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(vi)原始材料來(lái)源(A)生物體乳發(fā)酵短桿菌(B)菌株ATCC13869(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置359..1987(xi)序列描述SEQ ID No1GATCTTGGAA CTCGACAGTT TTCACCGTCC AGTTTGGAGC GCCTGAGCTT GCAAGCTCCA 60GCAAGTCAGC ATTAGTGGAG CCTGTCACTT TTTCGTAAAT GACCTGGCCA AAGTCACCGT120TTTGGAGCAA TTTTTCCTTC AGGAGCTCAA CGTTTAGCGG CTCTCTGGAT CGTGAAATGT180CAACGTTCAT GGAAGCCAAT GTAGTGGGGT CGCGTCGAAA AGCGCGCTTT AAGGGCGACA240CGCCCAAAAA GTTTTACCTT TAAAAACTAC CCGCACGCAG CACGAACCTG TTCAGTGATG300TAAATCACCG CGGAAATATT GTGGACGTTA CCCCCGCCTA CCGCTACGAT TTCAAAAC 358ATG ACC ATT TCC TCA CCT TTG ATT GAC GTC GCC AAC CTT CCA GAC ATC 406Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Ash Leu Pro Asp Ile1 5 10 15AAC ACC ACT GCC GGC AAG ATC GCC GAC CTT AAG GCT CGC CGC GCG GAA 454Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu20 25 30GCC CAT TTC CCC ATG GGT GAA AAG GCA GTA GAG AAG GTC CAC GCT GCT 502Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala35 40 45GGA CGC CTC ACT GCC CGT GAG CGC TTG GAT TAC TTA CTC GAT GAG GGC 550Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly50 55 60TCC TTC ATC GAG ACC GAT CAG CTG GCT CGC CAC CGC ACC ACC GCT TTC 598Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65 70 75 80GGC CTG GGC GCT AAG CGT CCT GCA ACC GAC GGC ATC GTG ACC GGC TGG 646Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp85 90 95GGC ACC ATT GAT GGA CGC GAA GTC TGC ATC TTC TCG CAG GAC GGC ACC 694Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr100 105 110GTA TTC GGT GGC GCG CTT GGT GAG GTG TAC GGC GAA AAG ATG ATC AAG 742Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys115 120 125ATC ATG GAG CTG GCA ATC GAC ACC GGC CGC CCA TTG ATC GGT CTT TAC 790Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr130 135 140GAA GGC GCT GGC GCT CGC ATT CAG GAC GGC GCT GTC TCC CTG GAC TTC 838Glu GIy Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145 150 155 160ATT TCC CAG ACC TTC TAC CAA AAC ATT CAG GCT TCT GCC GTT ATC CCA 886Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro165 170 175CAG ATC TCC GTC ATC ATG GGC GCA TGT GCA GGT GGC AAC GCT TAC GGC 934Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly180 185 190CCA GCC CTG ACC GAC TTC GTG GTC ATG GTG GAC AAG ACC TCC AAG ATG 982Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met195 200 205TTC GTT ACC GGC CCA GAC GTG ATC AAG ACC GTC ACC GCC GAG GAA ATC 1030Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile210 215 220ACC CAG GAA GAG CTT GGC GGA GCA ACC ACC CAC ATG GTG ACC CCT GGC 1078Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225 230 235 240AAC TCC CAC TAC ACC GCT GCG ACC GAT GAG GAA GCA CTG GAT TGG GTA 1126Ash Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val245 250 255CAG GAC CTG GTG TCC TTC CTC CCA TCC AAC AAT CGC TCT TAC ACA CCA 1174Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro260 265 270CTG GAA GAC TTC GAC GAG GAA GAA GGC GCC GTT GAA GAA AAC ATC ACC 1222Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr275 280 285GCT GAC GAT CTG AAG CTC GAC GAG ATC ATC CCA GAT TCC GCG ACC GTT 1270Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val290 295 300CCT TAC GAC GTC CGC GAT GTC ATC GAA TGC CTC ACC GAC GAT GGC GAA 1318Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305 310 315 320TAC CTG GAA ATC CAG GCA GAC CGC GCA GAA AAC GTT GTT ATT GCA TTC 1366Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe325 330 335GGC CGC ATC GAA GGC CAG TCC GTT GGA TTT GTT GCC AAC CAG CCA ACC 1414Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr340 345 350CAG TTC GCT GGC TGC CTG GAC ATC GAC TCC TCT GAG AAG GCA GCT CGC 1462Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg355 360 365TTC GTC CGC ACC TGC GAC GCG TTT AAC ATC CCA ATC GTC ATG CTT GTC 1510Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val370 375 380GAC GTC CCC GGC TTC CTT CCA GGC GCA GGC CAG GAG TAT GGT GGC ATC 1558Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385 390 395 400CTG CGT CGT GGC GCA AAG CTG CTC TAC GCA TAC GGC GAA GCA ACC GTT 1606Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val405 410 415CCA AAG ATT ACC GTC ACC ATG CGT AAG GCT TAC GGC GGA GCG TAC TGC 1654Pro Lys lle Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys420 425 430GTG ATG GGT TCC AAG GGC TTG GGC TCT GAC ATC AAC CTT GCA TGG CCA 1702Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro435 440 445ACC GCA CAG ATC GCC GTC ATG GGC GCT GCT GGC GCA GTC GGA TTC ATC1750Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile450 455 460TAC CGC AAG GAG CTC ATG GCA GCT GAT GCC AAG GGC CTC GAT ACC GTA1798Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465 470 475 480GCT CTG GCT AAG TCC TTC GAG CGC GAG TAC GAA GAC CAC ATG CTC AAC1846Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn485 490 495CCG TAC CAC GCT GCA GAA CGT GGC CTG ATC GAC GGC GTG ATC CTG CCA1894Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro500 505 510AGC GAA ACC CGC GGA CAG ATT TCC CGC AAC CTT CGC CTG CTC AAG CAC1942Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His515 520 525AAG AAC GTC ACT CGC CCT GCT CGC AAG CAC GGC AAC ATG CCA CTG1987Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu530 535 540TAAATCGGCG AATCCATAAA GGTTCAAAAG AATTCAATAA GGATTCGATA AGGGTTCGAT 2047AAGGGTTCGA TAAGGGCCGA CTTAAATGAT TGGATGTAAA GAAATACCAA TGAAAATTGG 2107CAACTCTTTA CACCCAATCT TTAAGACATG GGGGGTGGCG CTGGGCTAAT ATAACCGGTT 2167AGCGAAACGA TTAGTCCCTT GTTAGGGGGA TTAACCCTCG AAGTGGGTCG TATTTTGGCG 2227TTTGTATGTT CACACAAGAA CCCTGCACAA CGCCTTCAAA GTACGTCGAC CACGACCAAG 2287CGCATTATTC ACTCTCACCC TTCAGGATTT AGACTAAGAA ACCATGACTG CAGCACAGAC 2347CAAACCTGAC CTCACCACCA CGGCTGGAAA GCTGTCCGAT CTTCGCTCCC GTCTTGCAGA 2407AGCTCAAGCT CCAATGGGCG AAGCAACTGT AGAAAAAGTG CACGCTGCTG GCAGGAAGAC 2467TGCCCGCGAA CGTATCGAGT ATTTGCTCGA TGAGGGCTCT TTCGTAGAGA TCGATGCTCT 2527TGCTCGTCAC CGTTCCAAGA ACTTCGGCCT GGATGCCAAG CGTCCAGCTA CTGACGGTGT 2587TGTGACTGGT TACGGCACCA TCGATGGCCG TAAGGTCTGT GTGTTCTCCC AGGACGGCGC 2647TGTATTCGGT GGCGCTTTGG GTGAAGTTTA TGGTGAAAAG ATCGTTAAGG TTATGGATCT 2707TGCGATCAAG ACCGGTGTGC CTTTGATCGG AATCAATGAG GGTGCTGGTG CGCGTATCCA 2767GGAAGGTGTT GTGTCTCTGG GTCTGTACTC ACAGATTTTC TACCGCAACA CCCAGGCGTC 2827TGGCGTTATC CCACAGATCT CTTTGATC 2855(2) SEQ ID No2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度543個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID No2Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile1 5 10 15Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu20 25 30Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala35 40 45Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly50 55 60Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65 70 75 80Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp85 90 95Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr100 105 110Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys115 120 125Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr130 135 140Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145 150 155 160Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro165 170 175Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly180 185 190Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met195 200 205Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile210 215 220Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225 230 235 240Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val245 250 255Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro260 265 270Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr275 280 285Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val290 295 300Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305 310 315 320Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe325 330 335Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr340 345 350Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg355 360 365Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val370 375 380Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385 390 395 400Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val405 410 415Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys420 425 430Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro435 440 445Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile450 455 460Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465 470 475 480Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn485 490 495Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Ala Val Ile Leu Pro500 505 510Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His515 520 525Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu530 535 540(2)SEQ ID No3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它類型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(xi)序列描述SEQ ID No3GCTAGCCTCG GGAGCTCTAG20(2)SEQ ID No4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它類型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(xi)序列描述SEQ ID No4GATCTTTCCC AGACTCTGGC 20(2)SEQ ID No5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子結(jié)構(gòu)其它類型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(xi)序列描述SEQ ID No5TAATGCCACC GACACCCACC 20(2)SEQ ID No6序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子結(jié)構(gòu)其它類型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈有(xi)序列描述SEQ ID No6TCAACGCCCA CATAGTGGAC 20(2)SEQ ID No7序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)
(iv)反義鏈無(wú)(xi)序列描述SEQ ID No7GAATTCGCTC CCGGTGACGC 20(2)SEQ ID No8序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈有(xi)序列描述SEQ ID No8GATGCAGAAT TCCTTGTCGG 20(2)SEQ ID No9序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷型(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它類型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(xi)序列描述SEQ ID No9GTCGACGGCG GACTTGTCGG 20(2)SEQ ID No10序列信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈有(xi)序列描述SEQ ID No10GTCGACAAAA CCCAAAAAAA 20(2)SEQ ID No11序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈無(wú)(xi)序列描述SEQ ID No11CTGCGGAAAC TACACAAGAA CCCAAAAATG ATTAATAATTGAGACAAGCT T 51(2)SEQ ID No12序列信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度59個(gè)堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它合成DNA
(iii)假設(shè)無(wú)(iv)反義鏈有(xi)序列描述SEQ ID No12CTAGAAGCTT GTCTCAATTA TTAATCATTT TTGGGTTCTTGTGTAGTTTC CGCAGGTAC 59
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，這包括如下的步驟在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種突變菌株；在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累L-谷氨酸；以及由培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸，該菌株源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，對(duì)生物素活性抑制劑有溫度敏感突變，具備在含過(guò)量生物素的任何培養(yǎng)基中不需任何生物素活性抑制劑來(lái)生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，其中生物素活性抑制劑為聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1及2的一種生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，其中選自谷氨酸脫氫酶基因，檸檬酸合成酶基因，磷酸烯醇式丙酮酸脫氫酶基因及異檸檬酸脫氫酶基因等基因中一個(gè)或多個(gè)基因其表達(dá)被增強(qiáng)。
4.一種通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸及L-谷氨酸的方法，它包括如下的步驟在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種突變菌株；在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累L-賴氨酸及L-谷氨酸；以及由培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸及L-谷氨酸，該菌株源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌，具備產(chǎn)生L-賴氨酸能力及對(duì)生物素活性抑制劑的溫度敏感突變，具備在含過(guò)量生物素的任何培養(yǎng)基中不需任何生物素活性抑制劑來(lái)生產(chǎn)L-賴氨酸及L-谷氨酸的能力。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的一種產(chǎn)生L-賴氨酸、L-谷氨酸的方法，其中生物素活性抑制劑為聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯。
6.一種源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌的突變株，對(duì)生物素活性抑制劑有溫度敏感突變，具備在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中不需任何生物素活性抑制劑來(lái)生產(chǎn)L-谷氨酸的能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的一個(gè)突變菌株，其中生物素活性抑制劑為聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯。
8.一種源自產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌的突變株，它具備產(chǎn)生L-賴氨酸能力及對(duì)生物素活性抑制劑的溫度敏感突變，具備在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中不需任何生物素活性抑制劑來(lái)生產(chǎn)L-賴氨酸和L-谷氨酸的能力。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的一種突變菌株，其中生物素活性抑制劑為聚氧乙烯山梨聚糖-棕櫚酸酯。
10.一種繁殖突變菌株的方法，該菌株具備在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中無(wú)需任何生物素活性抑制劑產(chǎn)生L-谷氨酸的能力，該方法包括賦予產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌以生物素活性抑制劑溫度敏感特點(diǎn)。
11.一種繁殖突變菌株的方法，該菌株具備在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中無(wú)需任何生物素活性抑制劑產(chǎn)生L-賴氨酸和L-谷氨酸的能力，該方法包括賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的棒狀細(xì)菌以生物素活性抑制劑溫度敏感特點(diǎn)及產(chǎn)生L-賴氨酸的能力。
全文摘要
通過(guò)賦予產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌以生物素活性抑制劑溫度敏感突變，從而得到具備在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中無(wú)需任何生物素活性抑制劑產(chǎn)生L-谷氨酸能力的突變菌株。該菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸。通過(guò)賦予產(chǎn)生L-谷氨酸棒狀細(xì)菌以生物素活性抑制劑溫度敏感和產(chǎn)生L-賴氨酸的突變，從而得到具備在含過(guò)量生物素的培養(yǎng)基中無(wú)需任何生物素活性抑制劑產(chǎn)生L-賴氨酸和L-谷氨酸能力的突變菌株。該菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以在培養(yǎng)基中同時(shí)產(chǎn)生和積累L-谷氨酸與L-賴氨酸。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1161059SQ95195728
公開(kāi)日1997年10月1日 申請(qǐng)日期1995年8月9日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月19日
發(fā)明者木村英一郎, 朝倉(cāng)陽(yáng)子, 上原章敬, 井上壽美男, 河原義雄, 吉原康彥, 中松亙 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社 被以下專利引用 (1),