專利名稱：Dna序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的DNA序列及其在轉(zhuǎn)化載體，宿主生物體和植物及產(chǎn)生雄性不育和展現(xiàn)出改變的花的顏色的新的植物中的應(yīng)用。
雄性不育植物在植物育種，尤其是雜交育種中發(fā)揮重要作用。生產(chǎn)雄性不育植物的許多方法已被公開，這些方法包括，例如特異地引起細胞損傷，例如在花藥中，干擾線粒體功能，用反義DNA為化學(xué)制劑創(chuàng)造機會以產(chǎn)生絕育效應(yīng)或抑制苯基苯乙烯酮的合成(cf.WO 90/08830，WO90/08831，WO 89/10396，EP-A-0 329 308和EP-A-0 335 451)。然而，到目前為止已用于生產(chǎn)雄性不育植物的方法在許多情況下未達到完全滿意的結(jié)果。除此之外，經(jīng)常得到的植物顯示對真菌病原體極大增長的易感性，基本上使得在實踐中很難處理它們。因此，十分需要免除這些不利之處的其它生產(chǎn)雄性不育植物的方法。
顯示花的顏色改變的植物的生產(chǎn)在裝飾植物的培養(yǎng)中特別有意義，因而在此領(lǐng)域的新方法中也很有意義。
新的DNA序列，以下稱為DNA序列I，現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)，其序列由下列成份組成，它們按照5′-3′方向順次排列。
a)啟動子，它與在植物中高度活躍和/或是花藥特異的或絨氈層特異的成份b是異源的，且合適地，位于一放大元件(增強子)的下游；b)編碼茋合酶的DNA序列；和c)3′多腺苷酸化序列；和DNA序列I一起也包含仍顯示完成本發(fā)明必須的特性的衍生的DNA序列。
此外已出乎意料地發(fā)現(xiàn)在其基因組中包含DNA序列I的植物是雄性不育的，且除此之外，顯示花的顏色與不含DNA序列I的相應(yīng)植物比較是改變的。
另外這些新的植物對微生物植物病原體具有增加的抵抗力，特別是致植物病的真菌。在許多情況，改變花的顏色使得在混合群體中識別雄性不育植物更為容易，這一點具有相當?shù)膶嶋H意義。
本發(fā)明因而也涉及新的植物(包括這些植物的部分和它們復(fù)制的材料，如原生質(zhì)體，植物細胞，愈傷組織，種子，塊莖或插條，等)，在其基因組中包含DNA序列I，并且是雄性不育的和/或顯示與不含DNA序列I的相應(yīng)植物比較改變的花的顏色。
在植物中高度活性，且可被應(yīng)用作為本發(fā)明的DNA序列I的成份a)的啟動子已被公開。核酮糖-1，5-二磷酸鹽羧化酶(rbcS)的小亞單位的基因的啟動子可作為實例被提及(cf，例如，EMBO Journal，vol.5，NO.9，2063-2071，(1986))。此外，在植物中高度活性的植物病毒啟動子也被應(yīng)用。這種啟動子已被公開，且CaMV 35S啟動子(cf，例如，科學(xué)(Science)250，959-960(1990))將作為實例被提及。
花藥特異性和/或絨氈層特異性的啟動子也可被應(yīng)用如DNA序列I的成份a)。在花藥或稱為絨氈層的花藥部位顯示特別顯著活性的此啟動子已被公開。TA29啟動子將作為實例提及(cf，例如，自燃(Nature)347，737-741(1990))。已從煙草中分離的，TA26和TA13基因的已知花藥特異性啟動子也適合于按照本發(fā)明的用途。
按照本發(fā)明，CaMV 35S啟動子優(yōu)選用作DNA序列I的成份a)。
在啟動子上游放置合適的放大元件(增強子)以放大期望的啟動子效應(yīng)是有利的。此增強子/啟動子結(jié)構(gòu)已被公開。例如，已知的CaMV 35S增強子，用作此增強子特別有利。
依照本發(fā)明，CaMV 35S啟動子特別優(yōu)選用作DNA序列I的成份a)。非常特別優(yōu)選地，由CaMV 35S增強子，并在其后5′-3′方向跟隨CaMV 35S啟動子組成的結(jié)構(gòu)物被運用。
按照本發(fā)明應(yīng)用的啟動子與成份b)是異源的，即與在自然茋合酶基因中發(fā)現(xiàn)的啟動子是不同的。
合適啟動子和增強子的分離已被公開，或可用技術(shù)人員熟悉的已知的步驟和方法實現(xiàn)。
任何編碼茋合酶的DNA可用作DNA序列I中的成份b)。茋合酶應(yīng)被理解為意味著能夠(在合適的環(huán)境尤其植物細胞中)產(chǎn)生茋的任何酶。茋這一術(shù)語描述了在植物中發(fā)現(xiàn)的一組化學(xué)物質(zhì)，其含有茋骨架(反-1，2-二苯基乙烯)作為其共同基本結(jié)構(gòu)。這基本骨架還可通過附加進一步集團被加強。二個重要且優(yōu)選的茋是3，5-二羥基-茋(赤松素)和3，4′，5-二羥基-茋(白藜蘆醇)。
編碼茋合酶的DNA序列已被公開，例如，在歐洲專利申請EP-A-0 309 862，EP-A-0 464 461和EP-A-0 533 010。這些專利申請描述了茋合酶基因的分離和它們在生產(chǎn)顯示對病原體增強抵抗力的轉(zhuǎn)基因植物中的用途。這些專利申請中描述的茋合酶-編碼DNA序列優(yōu)選地按照本發(fā)明應(yīng)用，特別的優(yōu)選采用編碼白藜蘆醇合酶的序列。另外，優(yōu)選先應(yīng)用在所述歐洲專利申請中描述的來自落花生植物(花生)和葡萄樹(葡萄)的茋合酶-編碼DNA序列。編碼茋合酶的DNA序列可呈現(xiàn)為下列形式，即它們被包含在包括可能存在的非編碼區(qū)(如內(nèi)含子)的相應(yīng)的天然植物基因中(“基因組形式”)，或?qū)?yīng)于可通過利用逆轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶自mRNA獲得且不再含有任何內(nèi)含子的cDNA(拷貝DNA)。此序列還可呈現(xiàn)在部分或完全合成的或自不同來源的部分裝配的形式中。
被包含在質(zhì)粒pGS 828.1(EP-A-0 309 862)，質(zhì)粒pin 5-49(EP-A-0 533 010)和非常特別優(yōu)選地，質(zhì)粒pVst1，pVst2和pVst12t3(EP-A-0 464 461)中的茋合酶-編碼DNA序列按照本發(fā)明特別優(yōu)選采用，借助于DNA序列(其被用作探針)能從植物中分離出來的其它的茋合酶編碼DNA序列也是如此。特別強調(diào)的是包含在質(zhì)粒pVst1(EP-A-0 464 461)中的茋合酶-編碼序列。
能夠作為DNA序列I的成份b)應(yīng)用的DNA序列的分離已被公開和/或能夠用已知的和技術(shù)人員熟悉的過程和方法實現(xiàn)。例如，編碼茋合酶的區(qū)域可以用多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))自質(zhì)粒pVst1，pVst2pVst12t3或pGS 828.1中分離。
擴增能夠通過PCR實現(xiàn)，用例如以下方案1x 95℃180秒72℃保溫(加入聚合酶)25x 95℃45秒55℃45秒72℃90秒1x 95℃45秒55℃45秒72℃300秒來自葡萄(var最優(yōu))的Vst1和Vst2茋合酶基因和來自花生(A.hyp)的茋合酶基因可用以下引物擴增引物 1Vst1 見SEQ ID NO1引物 1Vst2 見SEQ ID NO2引物 1 A.hyp.見SEQ ID NO3引物 2 Vst1見SEQ ID NO4引物 2 Vst2見SEQ ID NO5引物 2 A.hyp.見SEQ ID NO6被如此擴增的每個基因的所有編碼區(qū)域可被連接入常規(guī)載體的合適的限制性切割位點。
另外，編碼和終止序列還可用酶EcoRI和PstI還有EcoRI和SphI自pSSVst1(cf.下面)同時被分離。
被包含在DNA序列I如成份d)的3′多腺苷酸化序列可在大范圍內(nèi)變動，所有對植物中茋合酶的表達無損害效應(yīng)的合適序列可被應(yīng)用。特別地，當作為SEQ ID NO7中具體情況(cf.部分c)下所用技術(shù)的結(jié)果時，采用幾種不同來源的適當?shù)?例如，2)，依次插入的多腺苷酸化序列是有利的。為簡便起見，優(yōu)選使用在天然茋合酶基因中包含的3′多腺苷酸化序列，此序列可與茋合酶編碼序列一起自茋合酶基因中方便地分離。所以，按照本發(fā)明，如成份b)和c)，僅將天然啟動子去除的茋合酶基因也可被采用。在這種情況，只需要加上DNA序列I的成份a)，它是異源的啟動子，并在上游合適的位置加上增強子。
合適的3′多腺苷酸化序列可用一般慣例的和技術(shù)人員熟悉的步驟和方法分離。
按照SEQ ID NO7的DNA序列，或個體的或結(jié)合存在的，非常特別優(yōu)選用作DNA序列I的成份a)至c)。在SEQ ID NO7中，第1至720核苷酸組成雙35S CaMV RNA啟動子，其由CaMV 35S增強子和CaMV 35S啟動子(成份a))組成。第721至730核苷酸是一合成的連接序列。SEQ ID NO7的第731至2265核苷酸代表編碼茋合酶(成份b))的部分，第2266至2485核苷酸代表茋合酶基因的多聚A部分(成份c))。第2486至2728核苷酸代表衍生于CaMV 359 RNA在末端具有多聚連接序列的成份c)部分。
術(shù)語DNA序列I還包括仍然具有完成本發(fā)明所必須特性的所有衍生DNA序列，這些序列最終引起植物雄性不育性，并可引起花的顏色改變。在這些衍生序列中，單個DNA的密碼子和/或組成的序列將缺失(例如由于應(yīng)用了限制性酶)和/或被其它DNA的密碼子和/或組成的序列替代。這些改變可由于基因密碼的簡并化或在DNA序列的操作中呈現(xiàn)。新的DNA序列和/或它們的成份a)至c)也包含使它們易于操作的DNA的和/或DNA序列，例如所謂連接子或在操作后仍(例如在限制性酶切后)保留的這些連接子。DNA序列I的成份a)至c)可是自然起源的或以部分或完全合成的形式存在。
成份a)至d)可用一般常規(guī)的和技術(shù)人員熟悉的步驟和方法連接形成DNA序列I，它還可被認為是“嵌合基因”。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，DNA序列I由(a)由CaMV 35S啟動子和從屬CaMV 35S增強子組成的所謂CaMV 35S雙啟動子，和(b)編碼茋合酶(白藜蘆醇合酶)的序列，同時以及尾隨的3′多腺苷酸化序列組成正如存在于質(zhì)粒pVst1(cf.EP-A-0 464 461)中的。
此DNA序列包含在新的質(zhì)粒pSSVst1中，其構(gòu)建如

圖1所示。茋合酶基因Vst1的編碼區(qū)域能相應(yīng)地從質(zhì)粒pVst1中分離成-2.1KB MunI片段，質(zhì)粒pVst1包含作為4.9kB EcoRI片段的完全的茋合酶基因(Vst1基因)。然而，此MunI片段在編碼區(qū)域的5′末端缺乏前4個密碼子。方便地，純化的MunI片段隨后用限制性酶NruI消化且得到的1.7kBNruI/MunI片段與一編碼前四個氨基酸的寡核苷酸連接子相融合。由于EcoRI與MunI的限制性切點的突出末端是相同的，所以有必要防止MunI/EcoRI融合，寡核苷酸連接子被設(shè)計成EcoRI切點只通過隨后的限制性消化形成。得到的NruI/EcoRI片段在穿梭載體pSS的SmaI和EcoRI切點間連接，使得Vst1茋合酶基因的完整編碼區(qū)域在雙35S啟動子的控制下。然而，通過技術(shù)人員在其專業(yè)知識及本文所包含信息的基礎(chǔ)上，使用常規(guī)方法，相同的構(gòu)建物可被制備并付諸使用。
大腸埃希桿菌菌株RH pSSVst1包含質(zhì)粒pSSVst1。此大腸埃希桿菌菌株，RH pSSVst1被保存在Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen(DSM)[德國微生物保存中心]，Mascheroder Weg 1B，D 38124Braunschweig，聯(lián)邦德國，依照布達佩斯條約1994年10月18日為專利方法目的對國際微生物保存的要求，并給保存號為DSM 9501。
質(zhì)粒pSSVst1，和大腸埃希桿菌菌株RH pSSVst1，與它的仍顯示為完成本發(fā)明所必須的保存菌株特性的突變型，同樣是本發(fā)明的部分。
大腸埃希桿菌RH pSSVst1可用一般常規(guī)方法復(fù)制。質(zhì)粒pSSVst1可同樣用一般常規(guī)方法自此大腸埃希桿菌菌株中分離。技術(shù)人員將包含在質(zhì)粒pSSVst1中的DNA序列I分離出來也是件容易事。因此，包含在質(zhì)粒pSSVst1中的DNA序列I能夠，例如，用限制性酶SphI和PstI以大約2700bp(堿基對)大小DNA片段的形式從此質(zhì)粒中分離。
用常規(guī)和技術(shù)人員熟悉的方法一次或多于一次(例如一前一后排列)，優(yōu)選一次，作為“外源”DNA，將DNA序列整合入任何原核的(優(yōu)選細菌)或真核的(優(yōu)選植物)DNA是可能的。被如此修飾并能夠被用于，例如，轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞，并在轉(zhuǎn)化后被包含在植物或植物細胞中的重組體DNA，是本發(fā)明的組成部分。
DNA序列I，和重組體DNA能夠作為“外源”DNA被包含在載體(特別是質(zhì)粒，粘粒或噬菌體)，轉(zhuǎn)化的微生物(優(yōu)選細菌，特別是革蘭氏陽性菌，如大腸埃希桿菌)以及轉(zhuǎn)化的植物細胞和植物，或它們的DNA中。這些載體，轉(zhuǎn)化的微生物(它們也可能包含這些載體)以及轉(zhuǎn)化的植物細胞和植物，和它們的DNA，代表本發(fā)明的組成部分。如已提示的，按照本發(fā)明，DNA序列I被一次或多于一次(在基因組的相同或不同位點)地整合入天然植物基因組中。
本發(fā)明因而還涉及制備轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物的部分和種子)的方法，其中這些植物是雄性不育的且可能顯示花色的改變，此方法的特征在于a)DNA序列I和/或新的重組體DNA是/均是一次或多于一次插入植物細胞(包括原生質(zhì)體)的基因組中，并且是在適當時，b)自轉(zhuǎn)化的植物細胞(包括原生質(zhì)體)再生完整的，轉(zhuǎn)化的植物并且，在適當時復(fù)制，且在合適時，c)從所得的親代或從其獲得的其它代轉(zhuǎn)基因植物中分離期望的植物部分(包括種子)。
方法步驟(a)，(b)和(c)可用已知的步驟和方法以常規(guī)的方式完成。
一次或多于一次栽有作為“外源”DNA的DNA序列I的轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物部分和種子)，和其后代，還有那些能用上面方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物，和其后代，同樣屬于本發(fā)明。
下面也是本發(fā)明的部分a)DNA序列I和/或新的重組體DNA和/或新的重組載體和/或新的轉(zhuǎn)化的微生物在轉(zhuǎn)化植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物部分和種子)中的應(yīng)用。
b)新的轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物部分和種子)在生產(chǎn)復(fù)制材料和生產(chǎn)新的植物和它們的復(fù)制材料中的應(yīng)用，c)新的DNA序列I和/或新的重組體DNA在生產(chǎn)雄性不育性和，在合適時植物花色的改變中的應(yīng)用，d)包含在質(zhì)粒pSSVst1內(nèi)的DNA序列I在檢測植物中和還有(一般地)轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物部分和種子)的產(chǎn)物中DNA序列I的存在中的應(yīng)用，以及e)茋合酶編碼DNA序列在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，此植物是雄性不育的和/或與在其基因組中不包含此DNA的同樣植物相比花的顏色是改變的。
許多不同的方法可用于將DNA序列I作為“外源”DNA整合入植物或植物細胞的遺傳物質(zhì)中?；蜣D(zhuǎn)移可用一般常規(guī)的，已知的方法完成，且使技術(shù)人員無困難地確定每種情況合適的方法是可能的。
根瘤土壤桿菌的Ti質(zhì)粒用作將外來DNA轉(zhuǎn)移至雙子葉和單子葉植物基因組內(nèi)的特別良好和廣泛應(yīng)用的載體。為此，DNA序列I以一種合適的方式插入合適Ti質(zhì)粒的T-DNA(例如Zambryski等，1983)并通過感染植物轉(zhuǎn)移，感染植物部分或植物組織，如葉盤，莖，下胚軸，子葉或分生組織，和衍生自它們的組織，如次級胚胎和愈傷組織，或通過與根瘤土壤桿菌共培養(yǎng)原生質(zhì)體來完成。
替代辦法是與植物原生質(zhì)體(例如Hain等，1985年；Krens等，1982年；Paszkowski等，1984年)在聚陽離子或鈣鹽和聚乙二醇存在下孵育DNA序列I，或重組體DNA。
DNA攝取還可另外借助電學(xué)領(lǐng)域方法(電穿孔)(例如Fromm等，1986年)。
DNA還可以已知的方式，用植物花粉的辦法引入，例如通過用帶有DNA的物理加速顆?！稗Z擊”花粉或植物組織(cf.EP-A-0 270 356)。
植物用合適的營養(yǎng)介質(zhì)以已知的方法再生(例如Nagy和Maliga1976年)。
在新的方法(按照來自EP-A 116 718)的方法的優(yōu)選實施方案中，如包含在質(zhì)粒pSSVst1中的DNA序列I，被克隆入一合適的中介大腸埃希桿菌載體中，例如pGV700或pGV710(cf.EP-A 116 718)，或優(yōu)選另外包含報告基因如nptII(Herrera-Estrella等1983年)或hpt(Van denElzen等1986年)的其衍生物。
以此方法構(gòu)成的質(zhì)粒用常規(guī)方法(例如Van Haute等1983年)轉(zhuǎn)移入，含有如pGV 3850，或其衍生物(Zambryski等1983年)的根瘤土壤桿菌。替代地，DNA序列I能被克隆入穿梭載體中，例如PCV001.或PCV002(例如Koncz和Schell 1986年)并如上所述，轉(zhuǎn)移入合適的土壤桿菌屬菌株(Koncz和Schell 1986年)。得到的包含以可轉(zhuǎn)化至植物的形式存在的DNA序列I的土壤桿菌菌株，用于植物的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSSVst1也可直接轉(zhuǎn)化入合適的根瘤土壤桿菌菌株(cf.，例如，Koncz和Schell(1986年))。*在其它優(yōu)選實施方案中，包含有用于植物細胞的卡那霉素抗性報告基因的質(zhì)粒pSSVst1(例如Herrera-Estrella等，1983年)，通過直接基因轉(zhuǎn)移，以常規(guī)的方式轉(zhuǎn)移入植物原生質(zhì)體(例如Hain等，1985年)。雖然為此目的質(zhì)粒pSSVst1可以是環(huán)狀，但優(yōu)選線狀。當包含此報告基因的pSSVst1被應(yīng)用時，接著可檢查卡那霉素抗性原生質(zhì)體茋合成酶的表達。
轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)基因的)植物或植物細胞以已知的方法生產(chǎn)，例如籍轉(zhuǎn)化葉盤(例如Horsch等，1985年)，籍共培養(yǎng)再生植物原生質(zhì)體或細胞與根瘤土壤桿菌共培養(yǎng)(例如Marton等，1979年，Hain等，1985年)或籍用DNA的直接轉(zhuǎn)染。獲得的轉(zhuǎn)化的植物的檢測，或通過選擇報告基因的表達，例如通過體外硫酸卡那霉素的磷酸化(Reiss等，1984年，Schreier等1985年)或通過用Northern印跡分析和Western印跡分析篩選nopaline合酶(與Aerts等1983年一致)或茋合酶。此茋合酶和茋，還可在特異抗體的幫助下，以已知的方式，在轉(zhuǎn)化的植物中被檢測。茋合酶還可用酶活性試驗檢測(Rolfs等，植物細胞報告(Plant Cell Reports)1，83-85，1981年)。
轉(zhuǎn)化植物細胞的培養(yǎng)和在再生成完整植物，用適于每種情況的營養(yǎng)培養(yǎng)基，以一般常規(guī)的方法完成。
轉(zhuǎn)化的植物細胞和轉(zhuǎn)化的植物，它們包含本發(fā)明的組成部分的新的DNA序列I，均顯示潛在的強大的對病原體的抗性，尤其是致植物病的真菌。
關(guān)于本發(fā)明，“植物”一詞表示完整的植物，植物的部分，如葉子，莖或根，和復(fù)制材料，如種子，塊莖，插干，等?！爸参锛毎卑|(zhì)體，Zelllinien，植物愈傷組織，等。
如已解釋的，在其基因組中包含新的DNA序列I的植物顯示雄性水育性，且與不包含DNA序列I的相應(yīng)植物比較可能顯示花顏色的改變。
在觀賞植物和為鮮切花的情況，例如玫瑰，康乃馨，香雪蘭屬，扶郎花屬，等，花的顏色具有相當?shù)纳虡I(yè)的重要性。以特別的方式影響花的顏色，并達到穩(wěn)定的花色，常常是困難和復(fù)雜的事。本發(fā)明使之成為可能，以相對簡單的方式，改變所有的開有色花及具花色素特別是花色素苷的植物的花的顏色。作為規(guī)律，作為DNA序列I整合的結(jié)果，花色變淺，且常常是純白的。一般地，在不開有色花的植物的情況，變化不能辨認，或很難辨認。
植物的雄性不育性在關(guān)于雜交系和雜交種子的生產(chǎn)的植物育種中起重要作用。不幸地，許多雜交系對致植物病的真菌十分易感，極大地限制了它們的使用。雄性不育植物可在本發(fā)明的幫助下十分簡單地生產(chǎn)。這些植物另外具有對微生物的植物病原體如致植物病的真菌，細胞和/或病毒，特別是致植物病的真菌增強的抗性，因而是優(yōu)于用其它方法獲得的雄性不育植物。
實際上所有植物均被包括在通過整合(轉(zhuǎn)化)新的DNA序列I而獲得雄性不育的植物中。自然地，這一點十分需要培養(yǎng)的植物如提供糧食和生料植物的情況，例如谷類植物(特別是小麥，黑麥，大麥，燕麥，小米，大米和玉米)，土豆，豆料(如豆子作物和，特別地，苜蓿和大豆)，蔬菜(特別是甘藍變種和蕃茄)，水果(特別是蘋果，梨，櫻桃，葡萄，柑桔屬水果，菠蘿和香蕉)，油棕，茶，可可和咖啡灌木，煙草，西沙爾麻和棉花，還有在藥用植物的情況，如蘿芙木屬和毛地黃屬。大米，小麥，大麥，黑麥，玉米，甜菜，油菜和大豆可作為特別優(yōu)選者被提及。
下列典型實施方案意在闡明本發(fā)明I)植物的轉(zhuǎn)化1.載體pSSVst1的構(gòu)建和描述，質(zhì)粒pSSVst1的構(gòu)建已在前面詳述且以能被技術(shù)人員容易領(lǐng)會的方式描繪在圖1。
質(zhì)粒pSSVst1是pSS的衍生物。pSS是PCV001的衍生物(Koncz和Schell，1986年)，其包含基于質(zhì)粒pRT101(Tpfer等，1987年)表達盒，且其中CaMV 35S RNA增強子通過將Ddel/EcoRV片段克隆入Hincll切割位點而被復(fù)制。pSSVst1包含pVst1茋合酶的編碼序列和多聚A序列(cf.圖1)。pSSVst1包含植物卡那霉素抗性性和細菌氨芐青霉素抗性性。另外，pSSVst1包含起自根瘤土壤桿菌Ti-質(zhì)粒的邊界序列(Koncz和Schell，1986年)和根瘤土壤桿菌及大腸埃希桿菌的復(fù)制開端。質(zhì)粒pSSVst1可用菌株大腸埃希桿菌RH pSSVst1被直接移入合適的根瘤土壤桿菌菌株(例如Koncz和Schell 1986年)。
2.煙草的轉(zhuǎn)化a)培養(yǎng)煙草枝條和煙草原生質(zhì)體的分離煙草(Petit Havana SR1)在不含激素LS培養(yǎng)基(Linsmaier和Skoog1965年)上以無菌枝條(sterile shoot)培養(yǎng)而被復(fù)制。經(jīng)大約6-8周的間隔，枝條片段被轉(zhuǎn)移至新鮮LS培養(yǎng)基。枝條培養(yǎng)保存于24～26℃的培養(yǎng)室中被暴露于12h的光照時(1000-3000lux)。
為了分離葉子原生質(zhì)體，大約2g的葉子(約3-5cm長)被用新的剃刀刀片切成小碎片(0.5cm×1cm)。葉子材料在由K3培養(yǎng)基(Nagy和Maliga 1976年)，0.4m蔗糖，pH5.6，2％的R10纖維素酶(Serva)，0.5％的R10浸酶(Macerozyme)(Serva)組成的20ml酶溶液中，于室溫孵育14-16小時。此后，原生質(zhì)體經(jīng)過0.3mm和0.1mm的鋼篩過濾自細胞殘余物中分離出來。濾液于100xg離心10分鐘。經(jīng)過離心，完整的原生質(zhì)體漂浮并集中在酶溶液的上緣成一條帶。由細胞殘余物組成的沉淀，和酶溶液用一玻璃毛細管吸出。預(yù)純化的原生質(zhì)體用新鮮K3培養(yǎng)基(0.4M蔗糖作為滲透劑)制成10ml并再次漂浮。洗滌培養(yǎng)基被吸出且原生質(zhì)體被稀釋至1-2×105/ml供培養(yǎng)和隨后的用土壤桿菌屬感染(共培養(yǎng))。原生質(zhì)體濃度在計數(shù)室中檢測。
b)通過與根瘤土壤桿菌共培養(yǎng)的再生煙草原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化在下列內(nèi)容中，Marton等.，1979年的方法被經(jīng)輕度改變后應(yīng)用。原生質(zhì)體和所述的分離并，于26℃和1-2×105/ml密度，在K3培養(yǎng)基(0.4m蔗糖，0.1mg/lNAA，0.2mg激動素)中，黑暗中孵育2天且夠光線下(500lux)孵育1至2天。一旦原生質(zhì)體的首次分裂出現(xiàn)，包含序列I于其T-DNA或包含質(zhì)粒pSSVst1，在基本A(Am)培養(yǎng)基(密度大約109土壤桿菌/ml)內(nèi)的30μl土壤桿菌屬懸浮液被加入3ml的再生原生質(zhì)體中。在20℃，黑暗中共培養(yǎng)的時間是3-4天。此后，煙草細胞被置于12ml離心管內(nèi)，用海水(600mOsm/公斤)稀釋至10ml并于60xg沉淀10分鐘。此洗滌步驟進一步重復(fù)1-2遍，以除去大部分土壤桿菌屬。細胞懸浮液于5×104/ml密度，在含有每升1mg NAA(萘酰-1-乙酸)，每升0.2mg激動素和每升500mg先鋒霉素抗生素頭孢氨噻肟的K3培養(yǎng)基(0.3m蔗糖)中培養(yǎng)。每周，細胞懸浮液用新鮮K3培養(yǎng)基稀釋并每周培養(yǎng)基的滲透容積逐漸降低0.05m蔗糖(約60mOsm/公斤)。共培養(yǎng)2-3周后，于瓊脂糖珠型(bead-type)培養(yǎng)物中(Shillito等，1983年)開始用卡那霉素的篩選(100毫克/升硫酸卡那霉素(Sigma)，660毫克/克活性km)。開始篩選3-4周后，可能從緩長菌落的背景中區(qū)別卡那霉素抗性克隆。
c)煙草原生質(zhì)體用DNA硝酸鈣/PEG轉(zhuǎn)化的直接轉(zhuǎn)化。
約106原生質(zhì)體于180μl K3培養(yǎng)基中，與含有每μl 0.5μg質(zhì)粒pSSVst1，或自pSSVst1分離的DNA序列I作為DNA片段，和每μl 0.5μlpOGVneo 2103(Hain等1985年)的20μl水性DNA溶液，在細菌培養(yǎng)皿內(nèi)小心混合。200μl融合溶液(0.1m硝酸鈣，0.45M甘露醇，25％聚乙二醇(PEG 6000)，pH9)隨后被小心加入。15分鐘后，5ml洗滌溶液(0.275M硝酸鈣，pH6)被加入且，再過5分鐘后，原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)移入離心管中并于60xg沉淀。沉淀物被置入小量的K3培養(yǎng)基中并如下面部分所述被培養(yǎng)。替代地，原生質(zhì)體可如Hain等1983年所述的被轉(zhuǎn)化。
當來自pSSVst1 DNA序列I的轉(zhuǎn)化還可在不加每μl 0.5μg的pLGVneo 2103的情況下完成。由于此種情況未用報告基因，所以利用斑點雜交檢測所得愈傷組織以確定DNA序列I基因單位的存在。自pSSVst1的編碼序列可用作雜交探針。自然地，其它檢測方法，如用抗體測定或茋合酶的酶檢驗，也可被應(yīng)用。
d)培養(yǎng)已與DNA孵育的原生質(zhì)體和選擇卡那霉素抗性愈傷組織改良的串珠型(bead-type)培養(yǎng)技術(shù)(Shillito等1983年)被用于下述的卡那霉素抗性克隆的培養(yǎng)和選擇。原生質(zhì)體用DNA(cf.c)處理后1星期，3ml細胞懸浮液在5cm細菌培養(yǎng)皿中，與3ml K3培養(yǎng)基(0.3M蔗糖+激素)；1.2％(海噬斑(Seaplaque))LMT瓊脂糖(低熔點瓊脂糖，海生膠質(zhì))混合。為此目的，瓊脂糖在干燥狀態(tài)被高壓滅菌，且，K3培養(yǎng)基被加入后，在微波爐中短暫煮沸。瓊脂糖凝固后，含有包埋的煙草微愈傷組織的瓊脂糖串珠被轉(zhuǎn)移入10cm佩特里細菌培養(yǎng)皿中且每種情況加入10ml K3培養(yǎng)基(0.3M蔗糖，1毫克/升NAA，0.2毫克/升激動素)和100毫克/升硫酸卡那霉素(Sigma)，進一步培養(yǎng)和篩選。液體培養(yǎng)基每周更換，與此相聯(lián)系，培養(yǎng)基的滲透值被逐步地降低。
在替代培養(yǎng)基(K3+Km)中的蔗糖濃度以每周0.05m(約60mOsm)降低。
篩選DNA轉(zhuǎn)化后的卡那霉素抗性煙草集落的圖解0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M 液體培養(yǎng)基中的蔗糖UES K12 3 4 5 DNA攝取后6周(K3培養(yǎng)基，1毫克NAA，0.2毫克激動素)U＝DNA攝取E＝包埋于瓊脂糖中S＝用卡那霉素(100毫克硫酸卡那霉素/升)篩選K＝卡那霉素抗性集落能清晰地自背景中辨認e)卡那霉素抗性植物的再生一旦卡那霉素抗性集落達到直徑約0.5cm，其中的一半被放于再生培養(yǎng)基(LS培養(yǎng)基，2％蔗糖，0.5毫克/升芐氨基嘌呤BAP)上并當被暴露于12h的光線(3000-5000 lux)時于培養(yǎng)室中保持于24℃。另一半在含有1毫克/升NAA，0.2毫克/升激動素，0.1毫克/升BAP和100毫克/升硫酸卡那霉素的LS培養(yǎng)基上繁殖為愈傷組織培養(yǎng)物。當再生的枝條大約在1厘米尺寸的，它們被切掉并為固定被置于不含生長調(diào)節(jié)劑的1/2 LS培養(yǎng)基(1％蔗糖，0.8％瓊脂)上。枝條于含100毫克/升硫酸卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上生根并隨后被移植入土壤。
f)葉盤leafdiscs用根瘤土壤桿菌的轉(zhuǎn)化為葉盤的轉(zhuǎn)化(Horsch等，1985年)，來自無菌枝條培養(yǎng)物的約2-3厘米長的葉子打孔為直徑1厘米的盤狀，與包含質(zhì)粒pSSVst1或包含來自此質(zhì)粒的DNA序列I于其T-DNA中的合適的土壤桿菌屬懸浮液(約109/毫克)(cf.b)，于Am培養(yǎng)基(見下)中孵育約5分鐘。感染的葉片在不含激素的MS培養(yǎng)基(見下)上保持于24℃ 3-4天。在此期間，土壤桿菌屬長滿葉片。然后在Ms培養(yǎng)基(0.5毫克/毫升BAP，0.1毫克/毫升NAA)中洗滌葉片并放MS培養(yǎng)基上在含500克/毫升頭孢氨噻肟和100克/毫升硫酸卡那霉素(Sigma)的相同培養(yǎng)基(0.8％瓊脂)上。培養(yǎng)基必需在二周后更換。再過2-3周后轉(zhuǎn)化的枝條是可看見的。
檢測轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)方法新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II)酶檢驗新霉素在植物組織中的活性通過Reiβ等(1984年)描述的和Schreier等(1985年)改良的卡那霉素的原位磷酸化而被檢測，見下。50毫克植物組織在冰上和在加入的玻璃粉存在下，于50μl提取緩沖液(10％甘油，5％2-巰基乙醇，0.1％SDS，0.025％溴酚藍，62.5mM三羥甲基氨基甲烷，pH6.8)中攪勻并在Eppendorf離心機上于4℃離心10分鐘。50μl的上清液置于天然聚丙烯酰胺凝膠上(145×110×1.2毫米；分辨膠10％丙烯酰胺，0.33％雙丙烯酰胺，0.375M三羥甲基氨基甲烷，pH8.8，分離膠5％丙烯酰胺，0.165％雙丙烯酰胺，0.125M三羥甲基氨基甲烷，pH6.8)并于4℃和60V電泳過夜。一旦溴酚藍標記跑出膠外，后者用蒸餾水洗10分鐘二遍及用反應(yīng)緩沖液(67mM 3-馬來酸，pH7.1，42mM MgCl2，400mM氯化銨)洗30分鐘一遍。膠被平鋪于相同尺寸的玻璃盤上并在含底物硫酸卡那霉素(20克/毫升)和20-200 Ci32P ATP(Amersham)的反應(yīng)緩沖液中，在上平鋪40毫升1％瓊脂糖。此夾心膠于室溫孵育30分鐘，然后一張磷酸纖維素P81紙(Whatman)被鋪在瓊脂糖上。4層3毫米的濾紙(whatman)和一些紙巾被堆在頂部。原位磷酸化的，放射性的磷酸卡那霉素至P81紙的轉(zhuǎn)移在3-4小時后被停止。P81紙在蛋白酶K和1％十二烷基磺酸鈉(SDS)的溶液中，于60℃孵育30分鐘，然后在250ml，10mM磷酸緩沖液中，pH7.5，于80℃洗滌3-4次，在-70℃干燥和放射自顯影(Kodak XAR5膠片)1-12小時。
用Southern印跡分析證實按照上面實施例獲得的植物細胞和植物(煙草)中，編碼茋合酶DNA序列的存在。編碼茋合酶序列的表達用Northern印跡分析證明，而茋合酶和白藜蘆醇在特異抗體的幫助下被證明。轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的植物(為了對照)在溫室中培養(yǎng)至開花。轉(zhuǎn)化的植物顯示花顏色的改變(與未轉(zhuǎn)化的對照植物比較)且是雄性不育的。
在轉(zhuǎn)化植物和植物細胞中應(yīng)用的培養(yǎng)基已被描述，其中包括，在EP-A 0 309 862中上面實施例中和下面實施中所有百分比值均指重量百分比，除非另外指出。
II)檢查轉(zhuǎn)基因植物的花顏色改變及雄性不育性。
實施例A
按照上面實施例得到的轉(zhuǎn)基因煙草植物先在組織中預(yù)育種，然后于23℃和相對大氣濕度70-80％的溫室中育種，直至開花。提供給它們需要的肥料和水。
所有按照實施例1)轉(zhuǎn)化的植物顯示白色或粉白色花，且在與野生型回交后在F1代仍保持，而未轉(zhuǎn)化的相應(yīng)的對照植物，顯示濃的紅色，暗粉色或非紅色。
所有轉(zhuǎn)化的植物還是雄性不育的，并且此不育性也在F1代中保持。
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序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Bayer AG(B)街Bayerwerk(C)城市Leverkusen(D)國家德國(E)郵編D-51368(F)電話0214/30 66400(G)電傳0214/30 3482(H)電報85 101-265 by d(ii)申請名稱DNA序列及其應(yīng)用(iii)序列號7(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟盤PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPA)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假說無(xi)序列描述SEQ ID NO1TCCCCCGGGA TCCATGGCTT CAATTGAGGA AAT(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核苷酸
(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假說無(xi)序列描述SEQ ID NO2TCCCCCGGGA TCCATGGCGT CTGTGGAGGA AAT(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假說無(xi)序列描序SEQ ID NO3TCCCCCGGGA TCCATGGTGT CTGTGAGTGG AAT(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假說無(xi)序列描述SEQ ID NO4TGAATTCCCG GGTCAATTTG TAACCATAGG AA(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性
(ii)分子類型DNA(線性)(iii)假說無(xi)序列描述SEQ ID NO5CGGATCCCGG GTCAATTGGA ATCCCTAGGA A(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度2728個堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假說無(xi)序列描述SEQ ID NO6CGGATCCCGG GTCTTCGCAT AACGAATTAA CT(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度2728堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單(D)拓撲學(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(iii)假說無(xi)序列描述SEQ ID NO7AAGCTTGCAT GCCTGCAGGT CTCAGAAGAC CAGAGGGCTA TTGAGACTTT TCAACAAAGG 60GTAATATCGG GAAACCTCCT CGGATTCCAT TGCCCAGCTA TCTGTCACTT CATCGAAAGG 120ACAGTAGAAA AGGAAGATGG CTTCTACAAA TGCCATCATT GCGATAAAGG AAAGGCTATC 180GTTCAAGAAT GCCTCTACCG ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAACAT 240CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATAACAT 300GGTGGAGCAC GACACTCTCG TCTACTCCAA GAATATCAAA GATACAGTCT CAGAAGACCA 360GAGGGCTATT GAGACTTTTC AACAAAGGGT AATATCGGGA AACCTCCTCG GATTCCATTG 420CCCAGCTATC TGTCACTTCA TCGAAAGGAC AGTAGAAAAG GAAGATGGCT TCTACAAATG 480CCATCATTGC GATAAAGGAA AGGCTATCGT TCAAGAATGC CTCTACCGAC AGTGGTCCCA 540AAGATGGACC CCCACCCACG AGGAACATCG TGGAAAAAGA AGACGTTCCA ACCACGTCTT 600CAAAGCAAGT GGATTGATGT GATATCTCCA CTGACGTAAG GGATGACGCA CAATCCCACT 660ATCCTTCGCA AGACCCGTCC TCTATATAAG GAAGTTCATT TCATTTGGAG AGGACCTCGA 720GAATTCCACC ATGGCTTCAA TTGAGGAAAT TAGAAACGCT CAACGTGCCA AGGGTCCGGC 780CACCATCCTA GCCATTGGCA CAGCTACTCC CGACCACTGT GTCTACCAGT CTGATTATGC 840TGATTACTAT TTCAGAGTCA CTAAGAGCGA GCACATGACT GAGTTGAAGA AGAAGTTCAA 900TCGCATATGT AAGTATATAT ATTCATGCAT TAATTCTTAC ATTCACAACA TTTCTATACA 960TATACGAGTG TGCTATTAAG TGAGGGTCAC CTCCAAGTGA ATGAATGTTT CAAGCTTAGA 1020GAATAGCTTT TAGCTAAATT ACTTTAGGAA ACTTGAAAAT CATTTTACAT CAGTAACCGA 1080TATTCCTTTC ATTTGATTGT AAGGGCTTGA AGAGCTGTTC TTTGAATCAT GTAGCATTGC 1140TAGCTATAAT TAAGAATAAC CTTTTATAAT TTCTTCAATG TTAAATGCAT GTTGATCATC 1200TTCAAGAATA TACTATATGA CTAGTCGTTG GAAAACTAAT GTGTTCATCT TATTTCTTTT 1260ACAGGTGACA AATCAATGAT CAAGAAGCGT TACATTCATT TGACCGAAGA AATGCTTGAG 1320GAGCACCCAA ACATTGGTGC TTATATGGCT CCATCTCTCA ACATACGCCA AGAGATTATC 1380ACTGCTGAGG TACCTAAACT TGGTAAAGAA GCAGCATTGA AGGCTCTTAA AGAATGGGGT 1440CAACCAAAGT CCAAGATCAC CCATCTTGTA TTTTGTACAA CCTCCGGTGT AGAAATGCCC 1500GGTGCAGATT ACAAACTCGC TAATCTCTTA GGCCTTGAAA CATCGGTTAG AAGGGTGATC 1560TTGTACCATC AAGGTTGCTA TGCAGGTGGA ACTGTCCTTC GAACTGCTAA GGATCTTGCA 1620GAAAATAACG CAGGAGCACG AGTTCTTGTG GTGTGCTCTG AGATCACTGT TGTTACATTT 1680CGTGGGCCTT CCGAAGATGC TTTGGACTCT TTAGTAGGTC AAGCCCTTTT TGGTGATGGG 1740TCAGCAGCTG TGATTGTTGG ATCAGATCCA GATGTCTCCA TTGAACGACC CCTCTTCCAA 1800CTTGTTTCAG CAGCACAAAC GTTTATTCCT AATTCAGCAG GTGCTATTGC GGGTAACTTA 1860CGTGAGGTGG GACTCACCTT TCACTTGTGG CCTAATGTGC CTACTTTGAT TTCCGAGAAC 1920ATAGAGAAAT GCTTGAATCA GGCTTTTGAC CCACTTGGTA TTAGCGATTG GAACTCGTTA 1980TTTTGGATTG CTCACCCTGG TGGCCCTGCA ATTCTTGATG CAGTTGAAGC AAAACTCAAT 2040TTAGAGAAAA AGAAACTTGA AGCAACAAGG CATGTGTTAA GTGAGTATGG TAACATGTCT 2100AGTGCATGTG TCTTGTTTAT TTTGGATGAG ATGAGAAAGA AATCCCTAAA GGGGGAAAAA 2160GCTACCACAG GTGACGGATT GGATTGGGGN GTACTATTCG GTTTTGGGCC AGGCTTGACC 2220ATTGAGACCG TTGTGCTGCA TAGCGTTCCT ATGGTTACAA ATTGAGTGGA AAACGGTAAG 2280AGAAATGATA TAGGGGACAT GTCTTATTGT ATTACAGAGG AGGTGCTACG AAAGATATGT 2340ACATGTATCT TCAAAGTTAA TAATAGTACT CCTAAATCTT TTATTCCTAT CCTAACATTG 2400AGGGATTGTA ATTTAGTGAT TGTTGGAGGG TGCAGTCACG TCAGGCAAGT GGATGAAACT 2460GCAAGTGCTT GTCATTCTGT TATCGGGGGA TCCTCTAGAG TCCGCAAAAA TCACCAGTCT 2520CTCTCTACAA ATCTATCTCT CTCTATTTTT CTCCAGAATA ATGTGTGAGT AGTTCCCAGA 2580TAAGGGAATT AGGGTTCTTA TAGGGTTTCG CTCATGTGTT GAGCATATAA GAAACCCTTA 2640GTATGTATTT GTATTTGTAA AATACTTCTA TCAATAAAAT TTCTAATTCC TAAAACCAAA 2700ATCCAGTGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTT 2728
權(quán)利要求
1.DNA序列I，它由下列成份組成，這些成份按5′-3′方向順次排列a)啟動子，它與在植物中高度活躍和/或是花藥特異的或絨氈層特異的成份b)異源且在適合時位于一放大元件(增強子)的下游；b)編碼茋合酶的DNA序列；和c)3′多腺苷化序列；和由此衍生的DNA序列。
2.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中植物病毒啟動子和，適當時，增強子被用作成份a)。
3.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中花藥特異性或絨氈層特異性啟動子被用作成份a)。
4.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中CaMV 35S啟動子被用作成份a)。
5.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，被置于CaMV 35S增強子的下游的CaMV 35S啟動子被用作成份a)。
6.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中由CaMV 35S啟動子和CaMV35S增強子組成的結(jié)構(gòu)物被用作成份a)，此結(jié)構(gòu)物存在于質(zhì)粒pSSVst1中。
7.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中由CaMV 35S啟動子和CaMV35S增強子組成的結(jié)構(gòu)物用作成份a)，此結(jié)構(gòu)物由SEQ ID NO7的1至720核苷酸或由它衍生的序列組成。
8.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中編碼白藜蘆醇合酶DNA序列被用作成份b)。
9.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中來自花生或來自葡萄樹的白藜蘆醇合酶編碼DNA序列或其cDNA被用作成份b)。
10.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中來自葡萄樹的白藜蘆醇合酶編碼DNA序列或其cDNA被用作成份b)。
11.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中存在于質(zhì)粒pSSst1中的白藜蘆醇合酶編碼DNA序列，或由其衍生的序列，被用作成份b)。
12.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中由SEQ ID NO7的731至2265核苷酸或由其衍生的序列構(gòu)成的白藜蘆醇合酶編碼DNA序列被用作成份b)。
13.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中存在于各自天然茋合酶基因中的3′多腺苷酸序列被用作成份c)。
14.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中存在于質(zhì)粒pSSVst1中的3′多腺苷酸化序列被用作成份c)。
15.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其中由SEQ ID NO7的第2266至2485或第2266至2728核苷酸或由其衍生的序列構(gòu)成的3′多腺苷酸化序列被用作成份c)。
16.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其由成份a)至c)的組合構(gòu)成，此組合存在于質(zhì)粒pSSVst1或由其衍生的序列中。
17.按照權(quán)利要求1的DNA序列I，其由SEQ ID NO7的第1至2728位核苷酸或從其衍生的序列組成。
18.重組體原核或真核DNA，其包含按照權(quán)利要求1的DNA序列。
19.重組體DNA，其存在于植物或植物細胞中且包含按照權(quán)利要求1的DNA序列。
20.載體，其包含按照權(quán)利要求1的DNA序列或按照權(quán)利要求18的重組體DNA。
21.pSSVst1質(zhì)粒載體。
22.轉(zhuǎn)化的微生物，其包含DNA序列I或按照權(quán)利要求18的重組體DNA。
23.大腸埃希桿菌菌株RH pSSVst1(按照DSM 9501)，及其仍顯示為完成本發(fā)明所必須特性的突變型。
24.轉(zhuǎn)基因的植物(包括這些植物的部分和它們的復(fù)制材料，如原生質(zhì)體，植物細胞，愈傷組織，種子，塊莖或插條，等)，在其基因組中包含DNA序列I且是雄性不育的和/或與不含DNA序列I的相應(yīng)植物相比顯示花顏色的改變，及這些植物的后代。
25.按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其包含，作為DNA序列I的存在于質(zhì)粒pSSVst1中的或從其衍生的DNA序列I。
26.按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物，其包含，作為DNA序列I的包含SEQ ID NO1的1至2728位核苷酸或從其衍生的DNA序列I。
27.按照權(quán)利要求1的DNA序列I和/或按照權(quán)利要求18的重組體DNA和/或按照權(quán)利要求20的載體和/或按照權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)化的微生物在轉(zhuǎn)化植物細胞(包括原生質(zhì)體)和植物(包括植物的部分和種子)中的應(yīng)用。
28.制備按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于a)按照權(quán)利要求1的DNA序列I和/或按照權(quán)利要求4的重組體DNA被插入植物細胞(包括原生質(zhì)體)的基因組中且，在合適時b)從轉(zhuǎn)基因植物細胞(包括原生質(zhì)體)再生完全的，轉(zhuǎn)化的植物，并且在適當時復(fù)制，并且是在適當時，c)期望的植物部分(包括復(fù)制材料)自得到的親代或從其獲得的其它代的轉(zhuǎn)基因植物中分離。
29.按照權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用，用在生產(chǎn)復(fù)制材料和生產(chǎn)新植物中的應(yīng)用，其包含按照權(quán)利要求1的DNA序列I或按照權(quán)利要求18的重組體DNA，和它們的復(fù)制材料。
30.DNA序列的應(yīng)用，該DNA序列完全或部分對應(yīng)存在于質(zhì)粒pSSVst1的中作為DNA序列I的DNA，它作為探針用于在要被檢測含量時(Gehalt)，檢測DNA序列I的含量或其DNA組成。
31.茋合酶編碼DNA序列在生產(chǎn)雄性不育和/或與在基因組中不含此DNA的相應(yīng)植物相比表現(xiàn)花色改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的DNA序列及其在轉(zhuǎn)化載體，宿主生物體和植物及生產(chǎn)雄性不育和改變了花的顏色的新的植物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/29GK1162979SQ95196187
公開日1997年10月22日 申請日期1995年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月10日
發(fā)明者R·海恩, R·費斯徹 申請人:拜爾公司