專(zhuān)利名稱(chēng)：：通過(guò)△6-去飽和酶生產(chǎn)γ亞麻酸的制作方法通過(guò)Δ6-去飽和酶作用，亞油酸(18∶2)(LA)轉(zhuǎn)化為γ亞麻酸(18∶3)(GLA)。當(dāng)此酶或者編碼此酶的核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)生產(chǎn)LA的細(xì)胞時(shí)，生產(chǎn)出GLA。本發(fā)明提供含有Δ6-去飽和酶基因的核苷酸。尤其是此核苷酸包含Δ6-去飽和酶基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)域和終止區(qū)域。本發(fā)明進(jìn)一步目標(biāo)是建立重組結(jié)構(gòu)，它包含Δ6-去飽和酶編碼區(qū)域并與異源調(diào)節(jié)序列功能上相組合。本發(fā)明的核苷酸和重組結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)基因組織中生產(chǎn)GLA是有用的。不飽和脂肪酸比如亞油酸(C18Δ9,12)和α-亞麻酸(C18Δ9,12,15)是必需的飲食組成成份，它們不能被脊椎動(dòng)物合成，因?yàn)榧棺祫?dòng)物細(xì)胞能在飽和酸Δ9位置引入雙鍵，但是不能在Δ9雙鍵和脂肪酸鏈甲基末端之間引入其它雙鍵。因?yàn)樗鼈兪瞧渌a(chǎn)物的前體，亞油酸和α-亞麻酸是必需的脂肪酸，經(jīng)常從植物中獲取。亞油酸被哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)變成γ-亞麻酸(GLA，C18Δ6,9,12)，γ-亞麻酸接著被轉(zhuǎn)變成花生四烯酸(20∶4)，一個(gè)非常關(guān)鍵的脂肪酸，因?yàn)樗谴蠖鄶?shù)前列腺素的必需前體。飲食提供的亞油酸，因?yàn)榭梢赞D(zhuǎn)變?yōu)镚LA和花生四烯酸，滿(mǎn)足了飲食上對(duì)GLA和花生四烯酸的需要。然而已表明在飽和脂肪的消耗和健康危險(xiǎn)方面存在一個(gè)關(guān)系，這些健康危險(xiǎn)比如血膽固醇過(guò)多，動(dòng)脈粥樣硬化和對(duì)冠狀疾病敏感有關(guān)的其它臨床疾病。而消耗未飽和脂肪則與降低的血膽固醇濃度以及降低動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)有聯(lián)系。食用GLA治療的好處也許在于GLA是花生四烯酸的前體，因此有助于前列腺素的合成。相應(yīng)地，消耗更多的未飽和GLA而不是亞油酸，有潛在的健康益處。然而，GLA并不存在于任何商業(yè)性生長(zhǎng)的作物中。亞油酸通過(guò)Δ6-去飽和酶轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA。Δ6-去飽和酶，超過(guò)350個(gè)氨基酸，有一個(gè)膜固定區(qū)域和一個(gè)脂肪酸去飽和的活性位點(diǎn)。如果細(xì)胞內(nèi)源性生產(chǎn)亞油酸而不是GLA，當(dāng)Δ6-去飽和酶轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生GLA。通過(guò)提供編碼Δ6-去飽和酶的基因，本發(fā)明允許轉(zhuǎn)基因組織的生成，它含有功能性Δ6-去飽和酶，而且能生產(chǎn)GLA。除了允許生產(chǎn)大量GLA外，本發(fā)明提供GLA的新的飲食來(lái)源。本發(fā)明的目的在于分離Δ6-去飽和酶基因。尤其是分離的基因含有Δ6-去飽和酶啟動(dòng)子，編碼區(qū)域和終止區(qū)域。本發(fā)明進(jìn)一步目的在于組建含有Δ6-去飽和酶啟動(dòng)子，編碼區(qū)域和終止區(qū)域的表達(dá)載體。本發(fā)明另一方面是組建含有Δ6-去飽和酶編碼區(qū)域并與異源調(diào)節(jié)區(qū)域功能上相聯(lián)合的表達(dá)載體，異源調(diào)節(jié)區(qū)域即不起源于Δ6-去飽和酶基因的組份。含有本發(fā)明載體的細(xì)胞和組織以及這些組織的后代，也可以由本發(fā)明提供。本發(fā)明更進(jìn)一步在于提供分離的細(xì)菌的Δ6-去飽和酶。也可以提供分離的植物的Δ6-去飽和酶。本發(fā)明的另一方面是提供一種方法，用于生產(chǎn)具有增高γ亞麻酸成份的植物。本發(fā)明也提供一種方法用于生產(chǎn)耐寒性植物。圖1描述了集胞藻屬Δ6-去飽和酶(A組)和Δ12-去飽和酶(B組)推斷的氨基酸序列的水療(hydropathy)外形圖。推斷的跨膜區(qū)用實(shí)體棒表示，疏水指數(shù)經(jīng)過(guò)計(jì)算是19個(gè)氨基酸殘基的窗口大小[Kyte，etal.(1982)《分子生物學(xué)雜志》157]。圖2提供了野生型(A組)和轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻屬(B組)的氣液相色譜分布圖。圖3是帶有重疊區(qū)域和亞克隆的粘粒Csy75，Csy13和Csy7的圖的圖解。Csy75，Csy75-3.5和Csy7的亞克隆區(qū)域用添加的斜線(xiàn)表示出來(lái)。失活的限制性酶切位點(diǎn)放于括號(hào)內(nèi)。圖4提供了野生型(A組)和轉(zhuǎn)基因煙草(B組)的氣液相色譜分布圖。圖5A描述了從琉璃苣中分離的Δ6-去飽和酶的DNA序列。圖5B描述了分離出的琉璃苣的Δ6-去飽和酶cDNA中開(kāi)讀框架的蛋白序列。去飽和酶三個(gè)特有的氨基酸功能域顯示出來(lái)，依照順序分別是脂類(lèi)框，金屬框1和金屬框2圖6是一個(gè)樹(shù)狀圖，顯示了琉璃苣的Δ6-去飽和酶與其它膜固定的去飽和酶的類(lèi)似性。通過(guò)GeneWorks(IntelliGenetics)比較琉璃苣Δ6-去飽和酶與其它已知去飽和酶的氨基酸序列。各亞屬之間與相對(duì)系統(tǒng)發(fā)育距離有關(guān)的數(shù)值得到比較。圖7是221.Δ6.NOS和121.Δ6.NOS的限制性酶切圖譜。在221.Δ6.NOS中，質(zhì)粒余下的部分pBI221，在121.Δ6.NOS，質(zhì)粒余下的部分是pBI121。圖8提供了模擬轉(zhuǎn)化(A組)和221.Δ6.NOS轉(zhuǎn)化(B組)的胡蘿卜細(xì)胞的氣液相色譜圖。18∶2，18∶3α和18∶3γ(GLA)的位置得到顯示。圖9提供了未轉(zhuǎn)化的煙草葉子(A組)和用121.Δ6.NOS轉(zhuǎn)化的煙草葉子(B組)的氣液相色譜圖。18∶2，18∶3α，18∶3γ(GLA)和18∶4的位置得到顯示。圖10提供了未轉(zhuǎn)化的煙草種子(A組)和用121.Δ6.NOS轉(zhuǎn)化的煙草種子(B組)的氣液相色譜圖。18∶2，18∶3α，18∶3γ(GLA)的位置得到顯示。本發(fā)明提供分離的編碼Δ6-去飽和酶的核酸。為了確認(rèn)編碼Δ6-去飽和酶的核酸，DNA從生產(chǎn)GLA的組織中分離出來(lái)。所說(shuō)的組織可以是，例如動(dòng)物細(xì)胞，某些真菌(如被孢霉屬)，某些細(xì)菌(如集胞藻屬)或某些植物(琉璃苣、月見(jiàn)草屬、茶藨子類(lèi))?；蚪MDNA的分離可以通過(guò)許多方法來(lái)完成，這些方法是本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)技術(shù)之一，舉例說(shuō)明見(jiàn)Sambrooketal.(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港，紐約。分離的DNA通過(guò)物理方法或酶切方法片段化，克隆進(jìn)合適的載體，比如噬菌體或粘粒載體，這些都可以通過(guò)一系列熟知方法中的任一種來(lái)進(jìn)行，這些方法在文獻(xiàn)中可以找到，比如Sambrooketal(1989)。含有本發(fā)明DNA的表達(dá)載體在此得到重點(diǎn)考慮。編碼Δ6-去飽和酶的DNA通過(guò)功能獲得性分析得到證實(shí)。含有片段DNA的載體通過(guò)傳染，轉(zhuǎn)結(jié)合(transconjugation)，轉(zhuǎn)染等方法轉(zhuǎn)移進(jìn)產(chǎn)亞油酸而不產(chǎn)GLA的宿主組織。用在這里，“轉(zhuǎn)化”總的來(lái)說(shuō)是指吸收外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞。誘導(dǎo)重組DNA進(jìn)入宿主組織的方法對(duì)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員是熟知的常規(guī)技術(shù)之一，能在Sambrooketal(1989)中找到。這些組織生產(chǎn)的GLA(即功能的獲取)可以通過(guò)比如氣相色譜法或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的其它方法來(lái)測(cè)定。被誘導(dǎo)產(chǎn)生GLA，即通過(guò)導(dǎo)入載體而獲得功能的組織被確認(rèn)為表達(dá)DNA編碼的Δ6-去飽和酶，所說(shuō)的DNA從此組織中獲取。獲取的DNA再一次片段化，克隆進(jìn)表達(dá)載體，通過(guò)上述程序進(jìn)行功能性測(cè)試以更精確確認(rèn)編碼Δ6-去飽和酶的DNA。做為本發(fā)明的一個(gè)例子，隨機(jī)DNA從藍(lán)細(xì)菌集胞藻屬(PasteurCultureCollection(PCC)6803，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)27184)中分離出來(lái)，克隆進(jìn)粘粒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)結(jié)合誘導(dǎo)進(jìn)入GLA缺陷的藍(lán)細(xì)菌魚(yú)腥藻屬菌株P(guān)CC7120，ATCC27893。從魚(yú)腥藻屬的亞油酸中生產(chǎn)的GLA通過(guò)氣相色譜法來(lái)監(jiān)測(cè)，對(duì)應(yīng)的DNA片段被分離出來(lái)。分離的DNA進(jìn)行測(cè)序，此方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員中熟知的常規(guī)技術(shù)之一，見(jiàn)Sambrooketal(1989)。依據(jù)本發(fā)明，含有Δ6-去飽和酶基因的DNA分子已被分離。更確切地說(shuō)，一個(gè)3.588kb含有Δ6-去飽和酶基因的DNA已從藍(lán)細(xì)菌集胞藻屬中分離出來(lái)。3.588kbDNA的核苷酸序列已確定，顯示于SEQIDNO1。定義潛在編碼區(qū)域的開(kāi)讀框架位于核苷酸317至1507和2002至3081。為了確定編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸，賦于Δ6-去飽和酶活性的3.588kb的片段被切成兩個(gè)亞片段，每一個(gè)只含有一個(gè)開(kāi)讀框架。片段ORF1含有核苷酸1至1704，片段ORF2含有核苷酸1705至3588。每一片段都以正反兩個(gè)方向亞克隆進(jìn)一個(gè)共同的表達(dá)載體(AM542，Wolketal.《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》81，1561)此載體含有一個(gè)藍(lán)細(xì)菌1羧化酶啟動(dòng)子。產(chǎn)生的重組(即ORF1(F)，ORF1(R)，ORF2(F)和ORF2(R))通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)Wolketal.(1984)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》81，1561)結(jié)合進(jìn)野生型魚(yú)腥藻屬PCC7120；在選擇培養(yǎng)基(依據(jù)Rippkaetal.，(1979)普通微生物學(xué)雜志.111.1，標(biāo)準(zhǔn)礦物培養(yǎng)基BG11N+30ug/ml新霉素)上生長(zhǎng)兩周以后，在將要死亡的非結(jié)合細(xì)胞的棕色背景上，魚(yú)腥藻屬的結(jié)合細(xì)胞被確認(rèn)為NeoR綠色克隆。挑出綠色克隆，培養(yǎng)于選擇性液體培養(yǎng)基(BG11N+15ug/ml新霉素)內(nèi)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(如Dahmeretal.(1989)美國(guó)石油化學(xué)聯(lián)合物雜志66，543)脂類(lèi)從含有正反向ORF1和ORF2重組的轉(zhuǎn)結(jié)合物中抽提出來(lái)。做為對(duì)照，脂類(lèi)也從野生型的魚(yú)腥藻屬和集胞藻屬培養(yǎng)物中抽提出來(lái)。用氣液相色譜(GLC)分析脂肪酸甲酯，例如用Tracor-560氣液相色譜儀并配備一個(gè)氫火焰離子檢測(cè)器和一個(gè)毛細(xì)管柱。GLC分析結(jié)果顯示于表1表1在野生型和轉(zhuǎn)基因的藍(lán)細(xì)菌中C18脂肪酸的出現(xiàn)</tables>通過(guò)GLC分析，當(dāng)含有ORF2正方向的重組物通過(guò)轉(zhuǎn)結(jié)合被誘導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞時(shí)，GLA缺陷的魚(yú)腥藻屬獲得產(chǎn)GLA的功能。轉(zhuǎn)結(jié)合物中含有對(duì)于羥化酶啟動(dòng)子呈反方向的ORF2或ORF1正反方向重組物，未有GLA產(chǎn)生。此分析表明在1884bp片段的單個(gè)開(kāi)讀框架(ORF2)中編碼Δ6-去飽和酶。此1884bp片段顯示于SEQIDNO3。通過(guò)Δ6-去飽和酶和Δ12-去飽和酶(Wadaetal.(1990)《自然》347)水療圖全面相似性。這些得到具體證明，此圖分別顯示于圖1(A)和(B)。依據(jù)本發(fā)明，包含Δ6-去飽和酶基因的cDNA從琉璃苣中分離。此1.685kbcDNA的核苷酸序列得到確認(rèn)并顯示于圖5A(SEQIDNO4)ATG起始密碼子和終止密碼子下面劃線(xiàn)。對(duì)應(yīng)于琉璃苣Δ6-去飽和酶中開(kāi)讀框架的氨基酸序列顯示于圖5B(SEQIDNO5)。分離的編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸也可以通過(guò)上面描述的功能獲得分析法從其它生產(chǎn)GLA的組織中得到確認(rèn)，或者用分離出的編碼集胞藻屬或琉璃苣Δ6-去飽和酶的核苷酸作雜交探針，通過(guò)核酸雜交技術(shù)來(lái)確認(rèn)?；蚪M或cDNA克隆的方法對(duì)于熟練的技術(shù)人員是已知的，并在本發(fā)明中得到研究。雜交探針可以含有顯示于SEQIDNO1或SEQIDNO4全長(zhǎng)的DNA序列，或一個(gè)限制性片段或其它片段，并且包括寡核苷酸探針。通過(guò)交叉雜交克隆同源基因的方法對(duì)于普通的技術(shù)人員是已知的，可以在Sambrook(1989)和Beltzetal(1983)《酶學(xué)方法》100,266中找到。在另一個(gè)從生產(chǎn)GLA組織中確定Δ6-去飽和酶的方法中，從Poly-A+RNA制備cDNA文庫(kù)，而Poly-A+RNA是從多核糖體RNA中分離。為了從cDNA群中去除超豐富表達(dá)的基因，cDNA或其相對(duì)于超豐富cDNA基因的片段被用作對(duì)cDNA文庫(kù)雜交的探針。未雜交的噬菌斑切除下來(lái)，產(chǎn)生的細(xì)菌克隆孵育在液體培養(yǎng)基中并測(cè)序。例如，為了把從琉璃苣多核糖體RNA中制備的cDNA文庫(kù)中去除其它種子貯存蛋白cDNAs，對(duì)應(yīng)于豐富表達(dá)的種子貯存蛋白cDNA首先與cDNA文庫(kù)雜交?！安顪p”DNA文庫(kù)接著用于產(chǎn)生表達(dá)的序列標(biāo)簽(ETSs)，這些標(biāo)簽用于掃描數(shù)據(jù)庫(kù)，比如GenBank來(lái)確認(rèn)潛在的去飽和酶。通過(guò)導(dǎo)入編碼Δ6-去飽和酶DNA，轉(zhuǎn)基因組織獲得生產(chǎn)GLA功能的同時(shí)，也獲得了生產(chǎn)十八碳四烯酸(18∶4Δ6,9,12,15)的功能。十八碳四烯酸目前通常存在于魚(yú)油中和紫草科家族的某些植物種屬中(Craigetal，美國(guó)石油化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志，41,209-211；Grossetal.Can.J.Plant.Sci56,659-664)。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因組織中，十八碳四烯酸產(chǎn)生于Δ6-去飽和酶對(duì)α亞麻酸進(jìn)一步去飽和作用，或者通過(guò)Δ15-去飽和酶對(duì)GLA去飽和作用。被ORF2即編碼集胞藻屬Δ6-去飽和酶的開(kāi)讀框架所編碼的359個(gè)氨基酸，顯示于SEQIDNO2。編碼琉璃苣Δ6-去飽和酶的開(kāi)讀框架顯示于SEQIDNO5。本發(fā)明進(jìn)一步重點(diǎn)考慮編碼SEQIDNO2和SEQIDNO5中氨基酸的別的核苷酸序列。確認(rèn)這些序列是在普通的熟練的技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)，例如這些序列產(chǎn)生于遺傳密碼的破譯。此外，本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)之一是通過(guò)下面描述的功能獲得的分析，來(lái)決定含有編碼Δ6-去飽和酶開(kāi)讀框架的片段中更少的亞片段。本發(fā)明密切注視Δ6-去飽和酶的任何多肽片段和仍保持將LA轉(zhuǎn)變?yōu)镚LA活性的核苷酸。本發(fā)明的另一方面，一個(gè)含有本發(fā)明核苷酸的載體，或者一個(gè)含有Δ6-去飽和酶基因啟動(dòng)子，編碼序列和終止區(qū)域的小片段被轉(zhuǎn)化進(jìn)一個(gè)組織，比如藍(lán)細(xì)菌，其中Δ6-去飽和酶啟動(dòng)子和終止區(qū)域都是功能性的，因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生重組Δ6-去飽和酶的組織。本發(fā)明另一方面是提供分離Δ6-去飽和酶，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化方法，(比如見(jiàn)Ausubeletal(1987)《當(dāng)氣分子生物學(xué)方法》GreenpublishingAssociates，NewYork)可以從重組組織中純化出來(lái)。包含編碼Δ6-去飽和酶DNA的載體也可以由本發(fā)明指供。構(gòu)建合適的載體在各種組織中表達(dá)Δ6-去飽和酶的編碼序列明顯是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)之一。復(fù)制表達(dá)載體尤其得到優(yōu)選。在此描述的復(fù)制表達(dá)載體是工程化為了控制目的基因即Δ6-去飽和酶表達(dá)的DNA或RNA分子。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒，噬菌體，粘?；虿《尽４┧筝d體如描述于Wolketal.(1984)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》1561-1565和Bustosetal.(1991)J.Bacterol.174,7525-7533。依據(jù)本發(fā)明也可以考慮。Sambrooketal.(1989)，Goeddel，ed.(1990)《酶學(xué)方法》185，Academic.Press，和Perbal(1988)分子克隆操作指南，Johnwiley和Sons，Inc.提供了載體的詳細(xì)論著，編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸可以插入并表達(dá)。這些載體還包含能夠影響編碼Δ6-去飽和酶的核苷酸表達(dá)的核苷酸序列。能夠影響一個(gè)基因產(chǎn)物表達(dá)的序列元件包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、上游激活序列、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多腺苷酸位點(diǎn)。組成性的和組織特異的啟動(dòng)子都可以考慮。為了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，花椰菜花斑病毒(CaMV)355啟動(dòng)子和在植物種子成熟過(guò)程中被調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子尤其令人感興趣。所有這些啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，單個(gè)或組合形式，都可以在本復(fù)制表達(dá)載體中被考慮得到使用，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。CaMV35S啟動(dòng)子被Restrepoetal(1990)所描述，《植物細(xì)胞》2，987，遺傳工程和突變的調(diào)節(jié)序列也可以考慮。普通的技術(shù)人員能夠決定適合于在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體和調(diào)節(jié)元件。例如，一個(gè)載體含有來(lái)源于編碼魚(yú)腥藻屬羧化酶基因的啟動(dòng)子可操作性連接到Δ6-去飽和酶區(qū)域，進(jìn)一步可操作性連接到來(lái)源于集胞藻屬的終止信號(hào)上，此載體適合在藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)去飽和酶?！翱刹僮餍赃B接”在此文中指啟動(dòng)子和終止子序列能夠有效對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控行使功能，再舉一個(gè)例子，一個(gè)適合于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)Δ6-去飽和酶的載體可以含有來(lái)源于半日花素、napin、大豆球蛋白的種子特異性序列，可操作性連接到Δ6-去飽和酶的編碼區(qū)域，進(jìn)一步可操作性連接到一個(gè)種子終止信號(hào)或胭脂堿合成酶的終止信號(hào)上。再舉一例，一個(gè)在植物中表達(dá)Δ6-去飽和酶的載體，可以含有一個(gè)組成性的啟動(dòng)子或一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子可操作性連接到Δ6-去飽和酶的編碼區(qū)域。并進(jìn)一步可操作性連接到一個(gè)基本的或組織特異的終止子或胭脂堿合成酶的終止信號(hào)上。尤其是半日花素調(diào)節(jié)元件顯示于申請(qǐng)人共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)，申請(qǐng)流水號(hào)682,354，1991年4月8號(hào)提交，并引入本文作為參考，可以做為在本發(fā)明中指導(dǎo)Δ6-去飽和酶表達(dá)的啟動(dòng)子元件來(lái)考慮。修改顯示于此的核苷酸序列或調(diào)控元件，并同時(shí)維持在此所考慮的功能，是在本發(fā)明范圍之內(nèi)的。這些修飾包括插入，替換或刪除。特別是刪除，它反映了遺傳密碼的簡(jiǎn)并性。組建這些雜種載體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員是眾所周知的，可以在許多文獻(xiàn)中找到，此如Sambrooketal(1989)，或者是廣泛所找到的關(guān)于重組DNA技術(shù)的無(wú)數(shù)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)的任一種，有許多關(guān)于連接DNA片段的策略，選擇其中的策略依靠于DNA片段的性質(zhì)。依據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步考慮的是在雜種載體中包括一些有助于克隆，表達(dá)或者加工的其它核苷酸序列元件，例如編碼信號(hào)肽的序列，編碼KDEL的序列，此序列對(duì)于固定蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上是必需的，或者編碼轉(zhuǎn)運(yùn)多肽的序列，它能夠定向Δ6-去飽和酶至葉綠體中。這些序列是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的最優(yōu)。VandenBroecketal(1985)《自然》313,358描述了最優(yōu)的轉(zhuǎn)還多肽。Michaelisetal(1982)《Ann.Rev.Microbiol》36,425顯示了原核和真核的信號(hào)肽。本發(fā)明另一方面是提供除了藍(lán)細(xì)菌或植物之外的其它含有編碼本發(fā)明的Δ6-去飽和酶的組織。依據(jù)本發(fā)明考慮的轉(zhuǎn)基因組織包括細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物。本發(fā)明所分離的DNA可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法導(dǎo)入宿主，比如傳染、感染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)結(jié)合。把本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入這些組織的技術(shù)是廣泛熟知的，在文獻(xiàn)中可以找到，比如Sambrooketal.(1989)。一系列植物轉(zhuǎn)化方法也已熟知。Δ6-去飽和酶基因可以通過(guò)Horshetal.(1985)《科學(xué)》227,1229所描述的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化-再生程序?qū)胫参?。其它的轉(zhuǎn)化方法，比如原生質(zhì)體培養(yǎng)(Horschetal.(1984)《科學(xué)》223,496；DeBlocketal.(1984)EMBOJ.2,2143，Bartonetal.(1983)《細(xì)胞》32,1033)也可以使用，屬于本發(fā)明的范圍。一個(gè)優(yōu)選的具體化的植物可以用土壤桿菌屬起源的載體來(lái)轉(zhuǎn)化，然而把本發(fā)明的Δ6-去飽和酶插入植物細(xì)胞也可以使用其它方法。這些替代方法包括biolistic方法(Kleinetal.(1987)《自然》327,70)，電穿孔，化學(xué)誘導(dǎo)DNA的吸收，使用病毒或花粉做為載體。對(duì)于轉(zhuǎn)化方法所必要的是，本發(fā)明的Δ6-去飽和酶基因可以插入植物轉(zhuǎn)化載體，如Bevan(1984)《核酸研究》12,8111，上所描述的二元載體。植物轉(zhuǎn)化載體來(lái)源于修改根癌生桿菌的自然基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。自然系統(tǒng)包含一個(gè)大Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒，此質(zhì)粒中含有一個(gè)大片段，已知為T(mén)-DNA，它可以轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一個(gè)片段，Vir區(qū)域，負(fù)責(zé)T-DNA的轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)域與未端重復(fù)序列接界。在修飾的二元載體中，刪除了腫瘤誘導(dǎo)基因，Vir區(qū)域的功能用于轉(zhuǎn)移被T-DNA邊界序列所接界的外源DNA。T區(qū)域還含有一個(gè)抗生素抗性的選擇性標(biāo)記，和一個(gè)用于插入要轉(zhuǎn)移序列的多克隆位點(diǎn)。這些工程化的菌種已知為“去除武裝”的(“disarmed”)的根癌生桿菌菌種，允許有效地轉(zhuǎn)化T區(qū)域接界的序列進(jìn)入植物的核基因組。表面無(wú)菌葉盤(pán)與“去除武裝”(“disarmed”)含有外源DNA的根癌生桿菌孵育，培養(yǎng)兩天，然后轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基中。等到在含有抗生素的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出根后，選擇長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化的嫩芽，轉(zhuǎn)移到土壤中再生。本發(fā)明的另一方面是提供含有本發(fā)明分離DNA的轉(zhuǎn)基因植物或這些植物的后代。單子葉和雙子葉植物都可以考慮。通過(guò)上面描述的任一種植物轉(zhuǎn)化方法，用分離的編碼Δ6-去飽和酶DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，經(jīng)常在愈傷組織培養(yǎng)物或葉盤(pán)中，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)之一(如Horshetal.(1985)《科學(xué)》227,1129)再生成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是向日葵、油籽油菜、玉米、煙草、花生或大豆。因?yàn)檗D(zhuǎn)化植物的后代遺傳了編碼Δ6-去飽和酶的DNA，來(lái)源于轉(zhuǎn)化植物的種子或剪枝可以用做保持轉(zhuǎn)基因的植物系。本發(fā)明提供了一種方法用于提供具有增高的GLA含量的轉(zhuǎn)基因植物。這些方法包括誘導(dǎo)編碼Δ6-去飽和酶的DNA進(jìn)入植物細(xì)胞，此細(xì)胞缺少或只含有低含量的GLA，但含有LA，再生的植物從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中具有增開(kāi)的GLA含量。尤其是，商業(yè)中生長(zhǎng)的糧食植物做為轉(zhuǎn)基因組織可以考慮的有，向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和煙草，但并不限于此。本發(fā)明進(jìn)一步提供了方法用于提供含有GLA的轉(zhuǎn)基因組織。此方法包括誘導(dǎo)編碼Δ6-去飽和酶的DNA進(jìn)入組織，此組織缺少或含有低水平的GLA，但含有LA。在另一實(shí)施方案中，方法包括誘導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)含有編碼Δ12-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的表達(dá)載體進(jìn)入缺乏GLA和LA的組織。相應(yīng)的，通過(guò)Δ12-去飽和酶的表達(dá)，缺乏LA和GLA的組織被誘導(dǎo)產(chǎn)生LA，由于Δ6-去飽和酶的表達(dá)，接著產(chǎn)生GLA。含有編碼Δ12-去飽和酶或Δ12-去飽和酶和Δ6-去飽和酶的表達(dá)載體，可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知重組技術(shù)的方法來(lái)構(gòu)建(Sambrooketal.(1989)發(fā)表的Δ12-去飽和酶序列見(jiàn)(Sambrooketal.(1990)《自然》(倫敦)347,200-2030。此外，已發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明，SEQIDNO1的核苷酸2002-3081編碼藍(lán)細(xì)菌Δ12-去飽和酶。因此，此序列用于構(gòu)建目標(biāo)作物表達(dá)載體。尤其是，商業(yè)生長(zhǎng)的作物可以考慮做為轉(zhuǎn)基因的組織包括，但不限于此的有向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生和煙草。本發(fā)明進(jìn)一步目標(biāo)是提供在植物中誘導(dǎo)抗凍的方法。冷的敏感性也許是由于細(xì)胞膜中脂類(lèi)的相的轉(zhuǎn)換。相的轉(zhuǎn)換溫度依賴(lài)于細(xì)胞膜脂類(lèi)中脂肪酸的不飽和程度。這樣，例如通過(guò)導(dǎo)入Δ6-去飽和酶把LA轉(zhuǎn)變GLA，提高了不飽和的程度，就能誘導(dǎo)或增進(jìn)抗凍性。因此，本發(fā)明包括誘導(dǎo)編碼Δ6-去飽和酶的DNA進(jìn)八植物細(xì)胞，從所說(shuō)植物細(xì)胞中再生的植物具有增強(qiáng)的抗凍能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物可以是向日葵、大豆、油籽油菜、玉米、花生，或煙草植物。下面的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1菌株和培養(yǎng)條件集胞藻屬(PCC6803，ATCC27184)，魚(yú)腥藻屬(PCC7120，ATCC27893)和聚球藻屬(PCC7942，ATCC33912)光自養(yǎng)生長(zhǎng)于白熾燈照射下(60uE.m-2.S-1)，30℃BG11N+培養(yǎng)基中(Rippkaetal(1979)J.Gen.Microbiol111.1-61)選擇粘粒和質(zhì)粒，在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增，DH5α生長(zhǎng)于加入標(biāo)準(zhǔn)抗生素濃度的LB培養(yǎng)基中，描述見(jiàn)Maniatisetal(1982)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉，紐約。實(shí)施例2集胞藻屬粘?；蚪M文庫(kù)的建立集胞藻屬(PCC6803)總的基因組DNA用Sau3A部分酶切，在蔗糖梯度中分級(jí)分離(Ausubeletal(1987)《當(dāng)氣分子生物學(xué)方法》GreenepublishingAssociateandWileyinterscience，紐約)。含有30至40KbDNA片段的部分選擇出來(lái)，連接進(jìn)粘粒載體pDUCA7(Buikemetal.(1991)細(xì)菌學(xué)雜志173,1879-1885)的去磷酸化的BamHI位點(diǎn)。連接的DNA體外進(jìn)行包裝，見(jiàn)Ausubeletal.(1987)。包裝的噬菌體在含有AvaI和Eco4711甲基化酶輔助質(zhì)粒，pRL528(見(jiàn)Buikemaetal(1991)的大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增。隨機(jī)分離1152個(gè)克隆，分別培養(yǎng)于12個(gè)96孔微滴度板中。例3GLA在魚(yú)腥藻屬中功能獲得性表達(dá)魚(yú)腥藻屬(PCC7120)，一種絲狀藍(lán)細(xì)菌，缺乏GLA，但含有顯著量的亞油酸，即GLA的前體(圖2；表2)。實(shí)施例2中描述的集胞藻屬粘粒文庫(kù)結(jié)合進(jìn)魚(yú)腥藻屬(PCC7120)以確認(rèn)能夠生產(chǎn)GLA的轉(zhuǎn)結(jié)合物。魚(yú)腥藻屬細(xì)胞在BG11N液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，重新懸浮于相同的培養(yǎng)基中至終濃度約為每毫升2×109個(gè)細(xì)胞。生長(zhǎng)于含有氨芐青霉素LB中的大腸桿菌RP4(Burkavdtetal(1979)普通微生物學(xué)雜志114,341-348)的對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物被洗滌，重新懸浮于新鮮的LB培養(yǎng)基中。魚(yú)腥藻屬和RP4混合，均勻涂布于含有5％LB的BG11N平皿中。粘?；蚪M文庫(kù)影印鋪板于含有50ug/ml卡那霉素和17.5ug/ml的氯霉素的LB板上，然后挑斑放于含有魚(yú)腥藻屬和RP4的BG11N平皿上。30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，加入30ug/ml新霉素，30℃下培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)結(jié)合物出現(xiàn)。結(jié)合后單個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合物分離出來(lái)，生長(zhǎng)在加有15ug/ml新霉素的2mlBG11N液體培養(yǎng)基中。脂肪酸甲酯從野生型培養(yǎng)物以及10個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合物的細(xì)胞群培養(yǎng)物中參照如下制備。野生型和轉(zhuǎn)基因的藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)物通過(guò)離心收獲，用蒸餾水洗滌兩次。脂肪酸甲酯從這些培養(yǎng)物中抽提出來(lái)，見(jiàn)Dahmeretal(1989)美國(guó)石油化學(xué)聯(lián)合會(huì)雜志，66,543-548，通過(guò)氣液相色譜法分析(GLC)。GLC使用配備有氫火焰離子探測(cè)器和毛細(xì)柱(30m×0.25mmbondedFSOTSuperoxII，AlltechAssociatesInc.IL)的Tracor-560。保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)的共色譜(從Sigma化學(xué)公司獲得)用于確認(rèn)脂肪酸。平均脂肪酸成份由每個(gè)C18脂肪酸的峰區(qū)對(duì)內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的比率決定。典型GLC圖形顯示于圖2。顯示C18脂肪酸甲酯。通過(guò)與已知標(biāo)準(zhǔn)的脂肪酸甲酯比較洗脫時(shí)間確定峰值，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜加以確定。A組描述了野生型魚(yú)腥藻屬的脂肪酸GLC分析，箭頭表示GLA遷移時(shí)間。B組是用pAM542+1.8F轉(zhuǎn)化的魚(yú)腥藻屬轉(zhuǎn)結(jié)合物中脂肪酸的GLC圖。兩個(gè)生產(chǎn)GLA的混合細(xì)胞群(代表250個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合物的25個(gè)混合細(xì)胞群之中的)被確認(rèn)可以產(chǎn)生GLA。每個(gè)GLA陽(yáng)性混合細(xì)胞群中的單個(gè)轉(zhuǎn)結(jié)合物用于分析GLA的產(chǎn)生；兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)結(jié)合物AS13和AS75，分別來(lái)自此兩個(gè)混合細(xì)胞群被確認(rèn)可以表達(dá)顯著水平的GLA，并分別含有粘粒cSy13和cSy75(圖3)。粘粒重疊于一個(gè)大約7.5kb長(zhǎng)的區(qū)域內(nèi)，cSy75的一個(gè)3.5kb的NheI片段被重新克隆進(jìn)載體PDUCA7，并轉(zhuǎn)化進(jìn)魚(yú)腥藻屬產(chǎn)生一個(gè)GLA功能獲得性表達(dá)(表2)。cSy75-3.535kbNheI片段的兩個(gè)NheI/HindIII亞片段(1.8和1.7kb)重新亞克隆進(jìn)入pBLUESCR1PT(Stratagene)(圖3)進(jìn)行測(cè)序。執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，見(jiàn)Maniatisetal(1982)和Ausubeletal(1987)。通過(guò)由先進(jìn)DNA技術(shù)實(shí)驗(yàn)室(生物系，TexasACM大學(xué))合成的特定寡核苷酸引物，在兩條鏈上用“測(cè)序酶”(“SEQUENASE”)(美國(guó)生化)對(duì)pBS1.8進(jìn)行雙脫氧測(cè)序(Sangeretal.(1977)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》74,5463-5467)。DNA序列分析采用GCG(Madison，WI)軟件，見(jiàn)Devereuxetal(1984)《核酸研究》12,387-395。兩個(gè)NheI/HindIII亞片段相對(duì)于藍(lán)細(xì)菌羧化酶啟動(dòng)子分別以正反兩個(gè)方向連接進(jìn)一個(gè)共同的表達(dá)載體AM542，并通過(guò)結(jié)合誘導(dǎo)進(jìn)入魚(yú)腥藻屬。以正向進(jìn)入含1.8kb片段《AM542-1.8F)的轉(zhuǎn)結(jié)合物產(chǎn)生顯著量的GLA和十八碳四烯酸(圖2，表2)。含有其它重組的轉(zhuǎn)結(jié)物，如1.8kb片段的反向1.7kb的正反向，并不產(chǎn)生可檢測(cè)水平的GLA(表2)。圖2比較從野生型魚(yú)腥藻屬(圖2A)和從含有cSy75-3.5中1.8kb片段正向重組的轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻屬(圖2B)中抽提的C18脂肪酸圖。從AM542-1.8F的脂肪酸甲酯GLC分析中揭示，一個(gè)具有保留時(shí)間的峰與真正的GLA標(biāo)準(zhǔn)的峰是相同的。通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜[GC-MS]分析此峰證實(shí)它有GLA參考樣品同樣的物質(zhì)片段形式。具有改變的多不飽和脂肪酸水平的轉(zhuǎn)基因魚(yú)腥藻屬在生長(zhǎng)速率和形態(tài)上與野生型相似。表2在野生型和轉(zhuǎn)基因藍(lán)細(xì)菌中C18脂肪酸的組成脂肪酸(％)菌株18∶018∶118∶218.3(α)18.3(γ)18.4野生型集胞藻屬13.64.554.5-27.3-(種.PCC6803)魚(yú)腥藻屬2.924.837.135.2--(種.PCC7120)聚球藻屬20.679.4----(種PCC7942)魚(yú)腥藻屬的轉(zhuǎn)結(jié)合物cSy753.824.422.39.127.912.5cSy75-3.54.327.618.13.240.46.4pAM542-1.8R4.213.912.119.125.425.4pAM542-1.8R7.723.138.430.8--pAM542-1.7R2.827.836.133.3--pAM542-1.7R2.825.442.329.6--聚球藻屬轉(zhuǎn)化子pAM85427.872.2----pAM854-Δ124.043.246.0---pAM854-Δ618.281.8----pAM854-Δ12&amp;Δ1242.725.319.5-16.5-18∶0，硬脂酸；18∶1油酸；18∶2亞油酸；18∶3(α)亞麻酸；18∶3(γ)，γ亞麻酸；18∶4，十八碳四烯酸實(shí)施例4用Δ6和Δ12去飽和酶基因轉(zhuǎn)化聚球藻屬用已發(fā)表的集胞藻屬Δ12去飽和酶基因序列(Wadaetal.《自然》(倫敦)347,200-203)合成寡核苷酸，以此篩選集胞藻屬基因組文庫(kù)，分離到含有Δ12去飽和酶基因的第三個(gè)粘粒cSy70。以含有Δ12去飽和酶的此粘粒上確認(rèn)一個(gè)1.7kbAvaI片段，用做探針表明cSy13不僅含有Δ6-去飽和酶基因，而且還有Δ12-去飽和酶基因(圖3)?；蚪MSouthern點(diǎn)印跡分析進(jìn)一步表明Δ6和Δ12-去飽和酶基因在集胞藻屬基因組中是單一的，兩個(gè)與C18脂肪酸去飽和相關(guān)的功能性基因在集胞藻屬基因組中是緊密相連在一起的。單細(xì)胞的藍(lán)細(xì)菌聚球藻屬(PCC7942)在亞油酸和GLA上的缺乏的，Δ12和Δ6-去飽和酶基因分別或一起克隆進(jìn)pAM854(Bustosetal.細(xì)菌學(xué)雜志，174,7525-7533)，pAM854是一個(gè)穿梭載體，含有把外源DNA整合進(jìn)入聚球藻屬基因組所需的序列(Goldenetal.《酶學(xué)方法》153,215-231)用這些基因重組物轉(zhuǎn)化聚球藻屬，挑選克隆，從轉(zhuǎn)基因的聚球藻屬中抽提脂肪酸甲酯，并且GLC分析。表2顯示野生型聚球藻屬中主要的脂肪酸是硬脂酸(18∶0)和油酸(18∶1)。用pAM854Δ12轉(zhuǎn)化的聚球藻屬除了主要的脂肪酸外，還表達(dá)亞油酸(18∶2)。用pAM854Δ6和Δ12轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生亞油酸和GLA(表1)。這些結(jié)果表明，含有Δ12和Δ6去飽和酶基因的聚球藻屬已獲得了在C18脂肪酸Δ12位置上引入第二個(gè)雙鍵和在Δ6的位置上引入第三個(gè)雙鍵的能力。然而在含有pAM854-Δ6轉(zhuǎn)化子中沒(méi)有觀(guān)察到脂肪酸組份的變化，表明在缺少由Δ12去飽和酶合成底物的情況下，Δ6去飽和酶是無(wú)活性的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)1.8kbNheI/HindIII片段(圖3)含有集胞藻屬Δ6-去飽和酶基因的編碼區(qū)域和啟動(dòng)子區(qū)域。具有改變的多不飽和脂肪酸水平的轉(zhuǎn)基因聚球藻屬在生長(zhǎng)速率和形態(tài)上與野生型類(lèi)似。實(shí)施例5Δ6-去飽和酶的核苷酸序列鑒定包含功能性Δ6-去飽和酶基因的cSy75-3.5中1.8kb片段的核苷酸序列。確定了一個(gè)編碼359個(gè)氨基酸多肽的開(kāi)讀框架(圖4)。Kyte-Doolittle水療圖分析(Kyteetal.(1982)J.Mol.Biol.157,105-132)證實(shí)兩個(gè)疏水氨基酸區(qū)域代表了跨膜區(qū)(圖1A)；此外，Δ6-去飽和酶的水療圖與Δ12-去飽和酶(圖1B；Wadaetal)和Δ9-去飽和酶(Thiedeetal.J.Biol.Chem261,13230-13235)的類(lèi)似。然而，集胞藻屬Δ6和Δ12-去飽和酶序列相似性在核苷酸水平少于40％，在氨基酸水平大約有18％例6轉(zhuǎn)移藍(lán)細(xì)菌1Δ6-去飽和酶進(jìn)入煙草藍(lán)細(xì)菌Δ6-去飽和酶基因移動(dòng)至植物表達(dá)載體，用土壤桿菌屬介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)移至煙草。為了確保轉(zhuǎn)移的去飽和酶在葉中和正發(fā)育的種子中表達(dá)，以及去飽和酶基因產(chǎn)生定向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或葉綠體中，構(gòu)建各種帶有集胞藻屬Δ6-去飽和酶開(kāi)讀框架(ORF)的表達(dá)盒。這些盒的成份包括(i)35S啟動(dòng)子或來(lái)源于向日葵半日花素基因的種子特異性啟動(dòng)子去驅(qū)動(dòng)Δ6-去飽和酶基因在所有的植物組織或只在發(fā)育的種子中表達(dá)(ii)一個(gè)推斷的信號(hào)肽，或者來(lái)源于胡蘿卜伸展蛋白基因或者是向日葵半日花素基因，以定向新合成的Δ6-去飽和酶進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(iii)一個(gè)位于Δ6-去飽和酶開(kāi)讀框架羧基端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔保留信號(hào)序列(KDEL)，(iv)一個(gè)最優(yōu)的轉(zhuǎn)移多肽以定向Δ6-去飽和酶進(jìn)入葉綠體。35S啟動(dòng)子是PRTL2的衍生物，見(jiàn)Restrepoetal(1990)。優(yōu)化的轉(zhuǎn)移多肽序列見(jiàn)VandeBroecketal(1985)。胡蘿卜伸展蛋白信號(hào)肽見(jiàn)Chenetal(1985)EMBOJ.9,2145轉(zhuǎn)基因煙草植物產(chǎn)生，含有嵌合的藍(lán)細(xì)菌去飽和酶基因，組成有集胞藻屬Δ6-去飽和酶基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列(KDEL)融合，以及由CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的伸展蛋白信號(hào)肽。PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA顯示Δ6-去飽和酶基因已整合進(jìn)煙草基因組。抽提轉(zhuǎn)基因煙草葉中脂肪酸甲酯，并用氣液色譜法(GLC)分析。這些轉(zhuǎn)基因煙草中聚集了顯著數(shù)量的GLA(圖4)。圖4顯示了由GLC決定的脂肪酸甲酯。通過(guò)與脂肪酸甲酯比較已知標(biāo)準(zhǔn)確定峰值。相應(yīng)的，參與脂肪酸代謝的藍(lán)細(xì)菌1基因用于產(chǎn)生具有改變的脂肪酸組份的轉(zhuǎn)基因植物。例7構(gòu)建琉璃苣的cDNA文庫(kù)用Larkins和Davies(1975植物生理學(xué)，55749-756)為豌豆所建立的方法，從受粉后12天(12DPP)的琉璃苣種子中分離出膜結(jié)合的多核糖體。RNA被從多核糖體中抽提出來(lái)，見(jiàn)Mechler，(1987《酶學(xué)方法》152241-248，Academicpress)所述。用oligotex-dT小珠(Qiagen)將poly-ARNA從膜結(jié)合的核糖體RNA中分離出來(lái)。用Stratagene′sZAPcDNA合成試劑盒制備相應(yīng)的cDNA。用λZAPII載體試劑盒在λZAPII載體中構(gòu)建cDNA文庫(kù)。原始文庫(kù)在GigapackII金包裝提取物(Stratagene)中包裝，文庫(kù)用于產(chǎn)生表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)，對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)的序列用于掃描GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。例8雜交方法用于篩選琉璃苣cDNA文庫(kù)的雜交探針通過(guò)隨機(jī)引物DNA合成法產(chǎn)生，見(jiàn)Ausubeletal(1994《分子生物學(xué)現(xiàn)行方法》Wileyintezscience，N.Y)。此探針并與先前確認(rèn)的豐富表達(dá)的種子貯存蛋白cDNA相對(duì)應(yīng)。未摻入的核苷酸通過(guò)G-50旋轉(zhuǎn)柱(BoehringerManheim)除去。為了雜交，探針在沸水中煮5分鐘變性，然后迅速放入冰中冷卻。雜交膜于60℃在預(yù)雜交液[6XSSC(maniatisetal1984，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。1XDenharts溶液，0.05％焦磷酸鈉，100ug/ml變性鮭魚(yú)精子DNA]雜交2-4小時(shí)，變性探針加入雜交液中(6xSSC，1xDenharts溶液，0.05％焦磷酸鈉，100ug/ml變性鮭魚(yú)精子DNA)60℃攪拌孵育過(guò)夜。膜在4x，2x和1xSET中60℃下分別洗滌15分鐘。20xSET儲(chǔ)液是3MWacl，0.4MTris堿，20mMNa2EDTA-2H2O。4xSET洗滌是4xSET，12.5mMPO4，pH6.8和0.2％SDS，2×SET洗滌是2xSET，12.5mMPO4，pH6.8和0.2％SDS，1xSET洗滌是1xSET，12.5mMPO4，pH6.8和0.2％SDS。膜可以在空氣中干燥，然后用增感屏于-80℃下曝光X-光膠片24小時(shí)。實(shí)施例9從琉璃苣種子(12DPP)膜結(jié)合的核糖體文庫(kù)而來(lái)的cDNA的隨機(jī)測(cè)序琉璃苣cDNA文庫(kù)以低密度鋪板(5000pfu于150mmpetri細(xì)菌培養(yǎng)皿中)。用以前確認(rèn)的相應(yīng)的cDNA，通過(guò)篩選，差減去廣泛存在的種子貯存蛋白cDNA。未雜交的噬菌斑用Stratagene′s切除方法和試劑切除。產(chǎn)生的細(xì)菌克隆孵育于液基培養(yǎng)基中，手工測(cè)序或者用ABI自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。每個(gè)cDNA測(cè)序一次，從200至300個(gè)堿基對(duì)產(chǎn)生一個(gè)序列標(biāo)簽。所有測(cè)序通過(guò)循環(huán)測(cè)序(Epicentre)來(lái)執(zhí)行。產(chǎn)生超過(guò)300個(gè)ESTs。每個(gè)序列標(biāo)簽用BLASTX計(jì)算機(jī)程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，許多脂類(lèi)代謝的基因，包括Δ6去飽酶得以確認(rèn)。采用BLASTX在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索命名為mbp-65的cDNA克隆，發(fā)現(xiàn)與集胞藻屬的Δ6-去飽和酶有顯著的匹配。然而發(fā)現(xiàn)它并不是全長(zhǎng)cDNA。用mbp-65篩選琉璃苣膜結(jié)合的多核糖體文庫(kù)，分離出全長(zhǎng)cDNA。確定分離出的cDNA序列(圖5A，SEQIDNO4)，開(kāi)讀框架的蛋白質(zhì)序列(圖5B，SEQIDNO5)用Geneworks(IntelligGenetics)蛋白排列程序(圖2)與已知去飽和酶相比較。排列表明此cDNA是琉璃苣Δ6-去飽和酶基因。盡管與其它已知植物去飽和酶類(lèi)似，琉璃苣Δ6-去飽和酶是獨(dú)特的，即在圖6樹(shù)狀圖中所顯示的。此外，進(jìn)一步比較去飽和酶特征性的氨基酸序列，特別是那些參與金屬結(jié)合的氨基酸序列(金屬框1和金屬框2)，表明了琉璃苣Δ6-去飽和酶和別的植物去飽和酶的區(qū)別(表3)。琉璃苣Δ6-去飽和酶與藍(lán)細(xì)菌1的不僅所有序列不同(圖6)，而且在于脂類(lèi)框，金屬框1，金屬框2這些氨基酸框(表3)。依表3所顯示，所有3個(gè)基序在序列上是新的。只有琉璃苣Δ6-去飽和酶的金屬框2顯示出與集胞藻屬Δ6-去飽和酶的金屬框2有一些關(guān)系。此外，琉璃苣Δ6-去飽和酶與另一個(gè)琉璃苣去飽和酶基因，Δ12-去飽和酶也是有區(qū)別的。P1-81是通過(guò)EST分析確認(rèn)的全長(zhǎng)cDNA，表明與擬南芥屬Δ12-去飽和酶(Fad2)有高度類(lèi)似。比較琉璃苣Δ6和Δ12-去飽和酶中脂類(lèi)框，金屬框1和2這些氨基酸基序(表3)，顯示在這些區(qū)域有極少的同源性。把此這個(gè)序列放入圖6的樹(shù)狀圖中表明這兩個(gè)基因關(guān)系有多遠(yuǎn)。表3.比較膜結(jié)合的去飽和酶中普通的氨基酸基序氨基酸基序去飽和酶脂類(lèi)框金屬框1金屬框2破璃苣Δ6WIGHDAGH(SEQ.ID.NO6)HNAHH(SEQ.ID.NO12)FQIEHH(SEQ.ID.NO20)集胞藻屬Δ6NVGHDANH(SEQ.ID.NO7)HNYLHH(SEQ.ID.NO13)HQVTHH(SEQ.ID.NO21)擬南芥屬葉綠體Δ15VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)稻Δ15VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)甘氨酸葉綠體Δ15VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)擬南芥.fad3(Δ15)VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)蕓苔屬fad3(Δ15)VLGHDCGH(SEQ.ID.NO8)HRTHH(SEQ.ID.NO14)HVIHH(SEQ.ID.NO22)玻璃苣Δ12(P1-81)*VIAHECGH(SEQ.ID.NO9)HRRHH(SEQ.ID.NO15)HVAHH(SEQ.ID.NO23)擬南芥fad2(Δ12)VIAHECGH(SEQ.ID.NO9)HRRHH(SEQ.ID.NO15)HVAHH(SEQ.ID.NO23)擬南芥屬葉綠體Δ12VIGHDCAH(SEQ.ID.NO10)HDRHH(SEQ.ID.NO16)HIPHH(SEQ.ID.NO24)甘氨酸質(zhì)體Δ12VIGHDCAH(SEQ.ID.NO10)HDRHH(SEQ.ID.NO16)HIPHH(SEQ.ID.NO24)菠菜質(zhì)體n-6VIGHDCAH(SEQ.ID.NO10)HDQHH(SEQ.ID.NO17)HIPHH(SEQ.ID.NO24)集胞藻屬Δ12VVGHDCGH(SEQ.ID.NO11)HDHHH(SEQ.ID.NO18)HIPHH(SEQ.ID.NO24)魚(yú)腥藻屬Δ12VLGHDCGH(SEQ.1D.NO8)HNHHH(SEQ.ID.NO19)HVPHH(SEQID.NO25)*P1-81是通過(guò)EST分析確認(rèn)的全長(zhǎng)cDNA，顯示出與擬南芥屬Δ12去飽和酶(fad2)有高度類(lèi)似性實(shí)施例10構(gòu)建221.Δ6.NOS的瞬時(shí)表達(dá)載體pBI221(Jeffersonetal1987EMBOJ.63901-3907)用BamHI和EcoICRI(promega)酶切去除GUS編碼區(qū)域剩于完整的35S啟動(dòng)子和NOS完整的終止子，以制備連接片段。琉璃苣Δ6-去飽和酶cDNA用BamHI和xhoI酶切從Bluescript質(zhì)粒(Stratagene)上切下。XhoI末端用Klenow大片段補(bǔ)齊，此片段克隆進(jìn)pBI221的BamHI/EcoICRI位點(diǎn)，產(chǎn)生221Δ6.NOS(圖7)。在221.Δ6NOS中，圖7的限制性圖譜余下的部分骨架是pBI221。實(shí)施例11建立121Δ6.NOS的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體pBI121(Jeffersonetal.1981EMBOJ.63901-3907)通過(guò)BamHI和EcoICRI(Promega)酶切除去GUS編碼區(qū)域，剩下完整的35S啟動(dòng)子和NOS終止子，以制備連接片段。琉璃苣的Δ6-去飽酶cDNA用BamHI和XhoI酶切從Bluesoript質(zhì)粒(Stratagene)上切下。xhoI未端用Klenow大片段補(bǔ)平，此片段克隆進(jìn)pBI121的BamHI/EcoICRI位點(diǎn)，產(chǎn)生121.Δ6NOS(圖7)。在121.Δ6NOS中，圖7的限制性圖譜余下的部分(骨架)是pBI121。實(shí)施例12瞬時(shí)表達(dá)所有涉及原生質(zhì)體的工作全在無(wú)菌通風(fēng)櫥中進(jìn)行。1ml濃集的胡蘿卜懸浮細(xì)胞在30ml質(zhì)壁分離液中過(guò)夜消化(25g/lkol，3.5g/lCacl2·H2O，10mMMES，pH5.6和0.2M甘露醇)，此質(zhì)壁分離液中還含有1％纖維素酶，0.1％果膠酶和0.1％dreisalase，此消化于室溫下反應(yīng)，并避光。釋放出來(lái)的原生質(zhì)體通過(guò)150uM網(wǎng)過(guò)濾，然后離心沉淀(100xg，5分)。用質(zhì)壁分離液洗滌兩次，原生質(zhì)體用雙室血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。把106原生質(zhì)體和50-70ug質(zhì)粒DNA(221.Δ6NOS)用PEG處理，DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)原生質(zhì)體，方法見(jiàn)Nunberg和Thomos(1993《植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)的方法》B.R.GlickandJ.E.Thompson，eds，pp241-248)原生質(zhì)體在加有0.2M甘露醇和3uM2，4-D的5mlMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，并避光。實(shí)施例13煙草的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化除了開(kāi)始的轉(zhuǎn)化子在100ug/ml卡那霉素中選擇，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(Horshetal.，1985《科學(xué)》2271229-1231；Bogueetal.，1990Mol.Gen.Genet.221；49-57)，121.Δ6NOS質(zhì)粒通過(guò)土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacumcv.xanthi)。實(shí)施例14制備與分析脂肪酸甲酯(FAMEs)從轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化煙草植物中來(lái)源的組織凍于液氮中，過(guò)夜冷凍干燥。制備FAMEs，方法見(jiàn)Dahmeretal(1989J.Amer.OilChem.Soc.66543-548)。在一些情況下，溶劑再一次蒸發(fā)，F(xiàn)AMEs懸浮于乙酸乙酯中，并且無(wú)離子水抽提一次去除任何水溶性污染物。FAMEs通過(guò)氣相色譜法(GC)在一個(gè)J&amp;WScientificDB-wax柱(長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.25mm，0.25um膜)上分析。瞬時(shí)測(cè)定的實(shí)例顯示于圖8，它代表混合在一起的三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子。琉璃苣Δ6-去飽和酶的增加對(duì)應(yīng)于γ-亞麻酸(GLA)的出現(xiàn)，而GLA是Δ6-去飽和酶可能的產(chǎn)物之一。圖9和10描述了來(lái)源于對(duì)照和轉(zhuǎn)化煙草植物葉子和種子組織中FAMEs的GC圖。圖9A提供了野生型煙草葉組織的圖(Xanthi)，圖9B提供了在35SCaMV啟動(dòng)子(pBI121.Δ6NOS)轉(zhuǎn)錄調(diào)控下琉璃苣Δ6-去飽和酶轉(zhuǎn)化的煙草葉組織圖。峰值對(duì)應(yīng)于18∶2，18∶3γ(GLA)，18∶3α和18∶4(十八碳酸)。圖10A表明了野生型煙草種子的GC圖；圖10B表明用pBI121.Δ6NOS轉(zhuǎn)化的煙草種子組織的圖。峰值對(duì)應(yīng)于18∶2，18∶3γ(GLA)和18∶3α。C18脂肪酸在對(duì)照和轉(zhuǎn)基因煙草種子中的相對(duì)分布顯示于表4中。表4</tables>上述結(jié)果顯示，GLA已摻入含有琉璃苣Δ6-去飽和酶的轉(zhuǎn)基因煙草的葉與種子的三?；视王ブ小Ｐ蛄斜?1)總的信息(i)申請(qǐng)人Rhone-PoulencAgrochimie(ii)發(fā)明題目通過(guò)Δ6-去飽和酶生產(chǎn)γ-亞麻酸(iii)序列數(shù)目25(iv)通信地址(A)收信人Scully，Scott，Murphy&amp;Presser(B)街道400GardenCityPlaza(C)城市GardenCity(D)州NewYork(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)11530(v)機(jī)讀形式(A)媒質(zhì)形式Floppydisk(B)計(jì)算機(jī)兼容IBMPC機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentlnRelease#1.0，Version#1.25(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日期1994.12.30.(C)分類(lèi)(Viii)委托代理人信息(A)名字Presser，Leopold(B)登記號(hào)19,827(C)文獻(xiàn)/檔案號(hào)碼8383ZYXW(ix)通信信息(A)電話(huà)(516)742-4343(B)傳真(516)742-4366(C)電傳230901SANSUR(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3588個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型22(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(ix)特征(A)名字/鍵CDS(B)位置2002..3081(xi)序列說(shuō)明；SEQIDNO1GCTAGCCACCAGTGACGATGCCTTGAATTTGGCCATTCTGACCCAGGCCCGTATTCTGAA60TCCCCGCATTCGCATTGTTAATCGTTTGTTCAACCATGCCCTGGGTAAACGTTTAGACAC120CACCTTGCCAGACCACGTTAGTTTGAGTGTTTCCGCCCTGGCGGCCCCGATTTTTTCCTT180TGCGGCTTTGGGCAATCAGGCGATCGGGCAATTGCGTTTGTTTGACCAGACTTGGCCCAT240TCAGGAAATTGTCATTCACCAAGACCATCCCTGGCTCAATTTACCCCTGGCGGATTTATG300GGATGATCCGAGCCGAATGTTGATCTATTACCTACCGGCCCACAGTGAAACGGATTTAGT360AGGCGCAGTGGTGAATAATTTAACGTTGCAATCTGGGGACCATTTAATAGTGGGACAAAA420ACCCCAACCCAAGACCAAACGGCGATCGCCTTGGCGCAAATTTTCCAAACTGATTACCAA480CCTGCGGGAGTATCAGCGGTATGTCCAACAGGTGATATGGGTGGTGTTGTTTTTATTGTT540GATGATTTTTCTGGCCACCTTCATCTACGTTTCCATTGATCAACATATTGCCCCAGTGGA600CGCGTTGTATTTTTCCGTGGGCATGATTACCGGGGCCGGTGGCAAGGAAGAGGTGGCCGA660AAAGTCCCCCGATATCATCAAAGTATTCACAGTGGTGATGATGATCGCCGGGGCGGGGGT720GATTGGTATTTGTTATGCCCTACTGAATGATTTCATCCTTGGCAGTCGCTTTAGTCAGTT780TTTGGATGCGGCCAAGTTACCCGATCGCCATCACATCATCATTTGTGGGCTGGGGGGAGT840GAGCATGGCCATTATTGAAGAGTTAATTCACCAGGGCCATGAAATTGTGGTAATCGAAAA900GGATACAGATAATCGTTTCTTGCATACGGCCCGCTCCCTGGGGGTGCCCGTAATTGTGGA960GGATGCCCGCCTAGAAAGAACGTTGGCCTGCGCCAATATCAACCGAGCCGAAGCCATTGT1020GGTGGCCACCAGCGACGACACCGTTAACTTGGAAATTGGCCTAACTGCCAAGGCGATCGC1080CCCTAGCCTGCCAGTGGTGTTGCGTTGCCAGGATGCCCAGTTTAGCCTGTCCCTGCAGGA1140AGTATTTGAATTTGAAACGGTGCTTTGTCCGGCGGAATTGGCCACCTATTCCTTTGCGGC1200GGCGGCCCTGGGGGGCAAAATTTTGGGCAACGGCATGACCGATGATTTGCTGTGGGTAGC1260CCTAGCCACCTTAATCACTCCTAACCATCCCTTTGCCGACCAATTGGTTAAAATTGCAGC1320CCAAAAGTCTGATTTCGTTCCCCTCTATCTAGAACGGGGTGGCAAAACCATCCATAGCTG1380GGAATTATTGGGTACCCATCTCGACTCTGGAGACGTGTTGTATTTAACCATGCCCGCCAC1440TGCCCTAGAGCAACTTTGGCGATCGCCCCGTGCCACTGCTGATCCTCTGGACTCTTTTTT1500GGTTTAGCATGGGGGGATGGAACTCTTGACTCGGCCCAATGGTGATCAAGAAAGAACGCT1560TTGTCTATGTTTAGTATTTTTAAGTTAACCAACAGCAGAGGATAACTTCCAAAAGAAATT1620AAGCTCAAAAAGTAGCAAAATAAGTTTAATTCATAACTGAGTTTTACTGCTAAACAGCGG1680TGCAAAAAAGTCAGATAAAATAAAAGCTTCACTTCGGTTTTATATTGTGACCATGGTTCC1740CAGGCATCTGCTCTAGGGAGTTTTTCCGCTGCCTTTAGAGAGTATTTTCTCCAAGTCGGC1800TAACTCCCCCATTTTTAGGCAAAATCATATACAGACTATCCCAATATTGCCAGAGCTTTG1860ATGACTCACTGTAGAAGGCAGACTAAAATTCTAGCAATGGACTCCCAGTTGGAATAAATT1920TTTAGTCTCCCCCGGCGCTGGAGTTTTTTTGTAGTTAATGGCGGTATAATGTGAAAGTTT1980TTTATCTATTTAAATTTATAAATGCTAACAGCGGAAAGAATTAAATTTACC2031MetLeuThrAlaGluArgIleLysPheThr1510CAGAAACGGGGGTTTCGTCGGGTACTAAACCAACGGGTGGATGCCTAC2079GlnLysArgGlyPheArgArgValLeuAsnGlnArgValAspAlaTyr152025TTTGCCGAGCATGGCCTGACCCAAAGGGATAATCCCTCCATGTATCTG2127PheAlaGluHisGlyLeuThrGlnArgAspAsnProSerMetTyrLeu303540AAAACCCTGATTATTGTGCTCTGGTTGTTTTCCGCTTGGGCCTTTGTG2175LysThrLeuIleIleValLeuTrpLeuPheSerAiaTrpAlaPheVal455055CTTTTTGCTCCAGTTATTTTTCCGGTGCGCCTACTGGGTTGTATGGTT2223LeuPheAlaProValIlePheProValArgLeuLeuGlyCysMetVal606570TTGGCGATCGCCTTGGCGGCCTTTTCCTTCAATGTCGGCCACGATGCC2271LeuAlaIleAlaLeuAlaAlaPheSerPheAsnValGlyHisAspAla75808590AACCACAATGCCTATTCCTCCAATCCCCACATCAACCGGGTTCTGGGC2319AsnHisAsnAlaTyrSerSerAsnProHisIleAsnArgValLeuGly95100105ATGACCTACGATTTTGTCGGGTTATCTAGTTTTCTTTGGCGCTATCGC2367MetThrTyrAspPheValGlyLeuSerSerPheLeuTrpArgTyrArg110115120CACAACTATTTGCACCACACCTACACCAATATTCTTGGCCATGACGTG2415HisAsnTyrLeuHisHisThrTyrThrAsnIleLeuGlyHisAspVal125130135GAAATCCATGGAGATGGCGCAGTACGTATGAGTCCTGAACAAGAACAT2463GluIleHisGlyAspGlyAlaValArgMetSerProGluGlnGluHis140145150GTTGGTATTTATCGTTTCCAGCAATTTTATATTTGGGGTTTATATCTT2511ValGlyIleTyrArgPheGlnGlnPheTyrIleTrpGlyLeuTyrLeu155160165170TTCATTCCCTTTTATTGGTTTCTCTACGATGTCTACCTAGTGCTTAAT2559PheIleProPheTyrTrpPheLeuTyrAspValTyrLeuValLeuAsn175180185AAAGGCAAATATCACGACCATAAAATTCCTCCTTTCCAGCCCCTAGAA2607LysGlyLysTyrHisAspHisLysIleProProPheGlnProLeuGlu190195200TTAGCTAGTTTGCTAGGGATTAAGCTATTATGGCTCGGCTACGTTTTC2655LeuAlaSerLeuLeuGlyIleLysLeuLeuTrpLeuGlyTyrValPhe205210215GGCTTACCTCTGGCTCTGGGCTTTTCCATTCCTGAAGTATTAATTGGT2703GlyLeuProLeuAlaLeuGlyPheSerIleProGluValLeuIleGly220225230GCTTCGGTAACCTATATGACCTATGGCATCGTGGTTTGCACCATCTTT2751AlaSerValThrTyrMetThrTyrGlyIleValValCysThrIlePhe235240245250ATGCTGGCCCATGTGTTGGAATCAACTGAATTTCTCACCCCCGATGGT2799MetLeuAlaHisValLeuGluSerThrGluPheLeuThrProAspGly255260265GAATCCGGTGCCATTGATGACGAGTGGGCTATTTGCCAAATTCGTACC2847GluSerGlyAlaIleAspAspGluTrpAlaIleCysGlnIleArgThr270275280ACGGCCAATTTTGCCACCAATAATCCCTTTTGGAACTGGTTTTGTGGC2895ThrAlaAsnPheAlaThrAsnAsnProPheTrpAsnTrpPheCysGly285290295GGTTTAAATCACCAAGTTACCCACCATCTTTTCCCCAATATTTGTCAT2943GlyLeuAsnHisGlnValThrHisHisLeuPheProAsnIleCysHis300305310ATTCACTATCCCCAATTGGAAAATATTATTAAGGATGTTTGCCAAGAG2991IleHisTyrProGlnLeuGluAsnIleIleLysAspValCysGlnGlu315320325330TTTGGTGTGGAATATAAAGTTTATCCCACCTTCAAAGCGGCGATCGCC3039PheGlyValGluTyrLysValTyrProThrPheLysAlaAlaIleAla335340345TCTAACTATCGCTGGCTAGAGGCCATGGGCAAAGCATCGTGACATTGCC3088SerAsnTyrArgTrpLeuGluAlaMetGlyLysAlaSer350355360TTGGGATTGAAGCAAAATGGCAAAATCCCTCGTAAATCTATGATCGAAGCCTTTCTGTTG3148CCCGCCGACCAAATCCCCGATGCTGACCAAAGGTTGATGTTGGCATTGCTCCAAACCCAC3208TTTGAGGGGGTTCATTGGCCGCAGTTTCAAGCTGACCTAGGAGGCAAAGATTGGGTGATT3268TTGCTCAAATCCGCTGGGATATTGAAAGGCTTCACCACCTTTGGTTTCTACCCTGCTCAA3328TGGGAAGGACAAACCGTCAGAATTGTTTATTCTGGTGACACCATCACCGACCCATCCATG3388TGGTCTAACCCAGCCCTGGCCAAGGCTTGGACCAAGGCCATGCAAATTCTCCACGAGGCT3448AGGCCAGAAAAATTATATTGGCTCCTGATTTCTTCCGGCTATCGCACCTACCGATTTTTG3508AGCATTTTTGCCAAGGAATTCTATCCCCACTATCTCCATCCCACTCCCCCGCCTGTACAA3568AATTTTATCCATCAGCTAGC3588(2)SEQIDNO2的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度359個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)拓?fù)錁?gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO2MetLeuThrAlaGluArgIleLysPheThrGlnLysArgGlyPheArg151015ArgValLeuAsnGlnArgValAspAlaTyrPheAlaGluHisGlyLeu202530ThrGlnArgAspAsnProSerMetTyrLeuLysThrLeuIleIleVal354045LeuTrpLeuPheSerAlaTrpAlaPheValLeuPheAlaProValIle505560PheProValArgLeuLeuGlyCysMetValLeuAlaIleAlaLeuAla65707580AlaPheSerPheAsnValGlyHisAspAlaAsnHisAsnAlaTyrSer859095SerAsnProHisIleAsnArgValLeuGlyMetThrTyrAspPheVal100105110GlyLeuSerSerPheLeuTrpArgTyrArgHisAsnTyrLeuHisHis115120125ThrTyrThrAsnIleLeuGlyHisAspValGluIleHisGlyAspGly130135140AlaValArgMetSerProGluGlnGluHisValGlyIleTyrArgPhe145150155160GlnGlnPheTyrIleTrpGlyLeuTyrLeuPheIleProPheTyrTrp165170175PheLeuTyrAspValTyrLeuValLeuAsnLysGlyLysTyrHisAsp180185190HisLysIleProProPheGlnProLeuGluLeuAlaSerLeuLeuGly195200205IleLysLeuLeuTrpLeuGlyTyrValPheGlyLeuProLeuAlaLeu210215220GlyPheSerIleProGluValLeuIleGlyAlaSerValThrTyrMet225230235240ThrTyrGlyIleValValCysThrIlePheMetLeuAlaHisValLeu245250255GluSerThrGluPheLeuThrProAspGlyGluSerGlyAlaIleAsp260265270AspGluTrpAlaIleCysGlnIleArgThrThrAlaAsnPheAlaThr275280285AsnAsnProPheTrpAsnTrpPheCysGlyGlyLeuAsnHisGlnVal290295300ThrHisHisLeuPheProAsnIleCysHisIleHisTyrProGlnLeu305310315320GluAsnIleIleLysAspValCysGlnGluPheGlyValGluTyrLys325330335ValTyrProThrPheLysAlaAlaIleAlaSerAsnTyrArgTrpLeu340345350GluAlaMetGlyLysAlaSer355(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1884個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型22(D)拓?fù)錁?gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO3AGCTTCACTTCGGTTTTATATTGTGACCATGGTTCCCAGGCATCTGCTCTAGGGAGTTTT60TCCGCTGCCTTTAGAGAGTATTTTCTCCAAGTCGGCTAACTCCCCCATTTTTAGGCAAAA120TCATATACAGACTATCCCAATATTGCCAGAGCTTTGATGACTCACTGTAGAAGGCAGACT180AAAATTCTAGCAATGGACTCCCAGTTGGAATAAATTTTTAGTCTCCCCCGGCGCTGGAGT240TTTTTTGTAGTTAATGGCGGTATAATGTGAAAGTTTTTTATCTATTTAAATTTATAAATG300CTAACAGCGGAAAGAATTAAATTTACCCAGAAACGGGGGTTTCGTCGGGTACTAAACCAA360CGGGTGGATGCCTACTTTGCCGAGCATGGCCTGACCCAAAGGGATAATCCCTCCATGTAT420CTGAAAACCCTGATTATTGTGCTCTGGTTGTTTTCCGCTTGGGCCTTTGTGCTTTTTGCT480CCAGTTATTTTTCCGGTGCGCCTACTGGGTTGTATGGTTTTGGCGATCGCCTTGGCGGCC540TTTTCCTTCAATGTCGGCCACGATGCCAACCACAATGCCTATTCCTCCAATCCCCACATC600AACCGGGTTCTGGGCATGACCTACGATTTTGTCGGGTTATCTAGTTTTCTTTGGCGCTAT660CGCCACAACTATTTGCACCACACCTACACCAATATTCTTGGCCATGACGTGGAAATCCAT720GGAGATGGCGCAGTACGTATGAGTCCTGAACAAGAACATGTTGGTATTTATCGTTTCCAG780CAATTTTATATTTGGGGTTTATATCTTTTCATTCCCTTTTATTGGTTTCTCTACGATGTC840TACCTAGTGCTTAATAAAGGCAAATATCACGACCATAAAATTCCTCCTTTCCAGCCCCTA900GAATTAGCTAGTTTGCTAGGGATTAAGCTATTATGGCTCGGCTACGTTTTCGGCTTACCT960CTGGCTCTGGGCTTTTCCATTCCTGAAGTATTAATTGGTGCTTCGGTAACCTATATGACC1020TATGGCATCGTGGTTTGCACCATCTTTATGCTGGCCCATGTGTTGGAATCAACTGAATTT1080CTCACCCCCGATGGTGAATCCGGTGCCATTGATGACGAGTGGGCTATTTGCCAAATTCGT1140ACCACGGCCAATTTTGCCACCAATAATCCCTTTTGGAACTGGTTTTGTGGCGGTTTAAAT1200CACCAAGTTACCCACCATCTTTTCCCCAATATTTGTCATATTCACTATCCCCAATTGGAA1260AATATTATTAAGGATGTTTGCCAAGAGTTTGGTGTGGAATATAAAGTTTATCCCACCTTC1320AAAGCGGCGATCGCCTCTAACTATCGCTGGCTAGAGGCCATGGGCAAAGCATCGTGACAT1380TGCCTTGGGATTGAAGCAAAATGGCAAAATCCCTCGTAAATCTATGATCGAAGCCTTTCT1440GTTGCCCGCCGACCAAATCCCCGATGCTGACCAAAGGTTGATGTTGGCATTGCTCCAAAC1500CCACTTTGAGGGGGTTCATTGGCCGCAGTTTCAAGCTGACCTAGGAGGCAAAGATTGGGT1560GATTTTGCTCAAATCCGCTGGGATATTGAAAGGCTTCACCACCTTTGGTTTCTACCCTGC1620TCAATGGGAAGGACAAACCGTCAGAATTGTTTATTCTGGTGACACCATCACCGACCCATC1680CATGTGGTCTAACCCAGCCCTGGCCAAGGCTTGGACCAAGGCCATGCAAATTCTCCACGA1740GGCTAGGCCAGAAAAATTATATTGGCTCCTGATTTCTTCCGGCTATCGCACCTACCGATT1800TTTGAGCATTTTTGCCAAGGAATTCTATCCCCACTATCTCCATCCCACTCCCCCGCCTGT1860ACAAAATTTTATCCATCAGCTAGC1884(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1685個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型22(D)拓?fù)錁?gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO4AATATCTGCCTACCCTCCCAAAGAGAGTAGTCATTTTTCATCAATGGCTGCTCAAATCAA60GAAATACATTACCTCAGATGAACTCAAGAACCACGATAAACCCGGAGATCTATGGATCTC120GATTCAAGGGAAAGCCTATGATGTTTCGGATTGGGTGAAAGACCATCCAGGTGGCAGCTT180TCCCTTGAAGAGTCTTGCTGGTCAAGAGGTAACTGATGCATTTGTTGCATTCCATCCTGC240CTCTACATGGAAGAATCTTGATAAGTTTTTCACTGGGTATTATCTTAAAGATTACTCTGT300TTCTGAGGTTTCTAAAGATTATAGGAAGCTTGTGTTTGAGTTTTCTAAAATGGGTTTGTA360TGACAAAAAAGGTCATATTATGTTTGCAACTTTGTGCTTTATAGCAATGCTGTTTGCTAT420GAGTGTTTATGGGGTTTTGTTTTGTGAGGGTGTTTTGGTACATTTGTTTTCTGGGTGTTT480GATGGGGTTTCTTTGGATTCAGAGTGGTTGGATTGGACATGATGCTGGGCATTATATGGT540AGTGTCTGATTCAAGGCTTAATAAGTTTATGGGTATTTTTGCTGCAAATTGTCTTTCAGG600AATAAGTATTGGTTGGTGGAAATGGAACCATAATGCACATCACATTGCCTGTAATAGCCT660TGAATATGACCCTGATTTACAATATATACCATTCCTTGTTGTGTCTTCCAAGTTTTTTGG720TTCACTCACCTCTCATTTCTATGAGAAAAGGTTGACTTTTGACTCTTTATCAAGATTCTT780TGTAAGTTATCAACATTGGACATTTTACCCTATTATGTGTGCTGCTAGGCTCAATATGTA840TGTACAATCTCTCATAATGTTGTTGACCAAGAGAAATGTGTCCTATCGAGCTCAGGAACT900CTTGGGATGCCTAGTGTTCTCGATTTGGTACCCGTTGCTTGTTTCTTGTTTGCCTAATTG960GGGTGAAAGAATTATGTTTGTTATTGCAAGTTTATCAGTGACTGGAATGCAACAAGTTCA1020GTTCTCCTTGAACCACTTCTCTTCAAGTGTTTATGTTGGAAAGCCTAAAGGGAATAATTG1080GTTTGAGAAACAAACGGATGGGACACTTGACATTTCTTGTCCTCCTTGGATGGATTGGTT1140TCATGGTGGATTGCAATTCCAAATTGAGCATCATTTGTTTCCCAAGATGCCTAGATGCAA1200CCTTAGGAAAATCTCGCCCTACGTGATCGAGTTATGCAAGAAACATAATTTGCCTTACAA1260TTATGCATCTTTCTCCAAGGCCAATGAAATGACACTCAGAACATTGAGGAACACAGCATT1320GCAGGCTAGGGATATAACCAAGCCGCTCCCGAAGAATTTGGTATGGGAAGCTCTTCACAC1380TCATGGTTAAAATTACCCTTAGTTCATGTAATAATTTGAGATTATGTATCTCCTATGTTT1440GTGTCTTGTCTTGGTTCTACTTGTTGGAGTCATTGCAACTTGTCTTTTATGGTTTATTAG1500ATGTTTTTTAATATATTTTAGAGGTTTTGCTTTCATCTCCATTATTGATGAATAAGGAGT1560TGCATATTGTCAATTGTTGTGCTCAATATCTGATATTTTGGAATGTACTTTGTACCACTG1620TGTTTTCAGTTGAAGCTCATGTGTACTTCTATAGACTTTGTTTAAATGGTTATGTCATGT1680TATTT1685(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度448個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)拓?fù)錁?gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO5MetAlaAlaGlnIleLysLysTyrIleThrSerAspGluLeuLysAsn151015HisAspLysProGlyAspLeuTrpIleSerIleGlnGlyLysAlaTyr202530AspValSerAspTrpValLysAspHisProGlyGlySerPheProLeu354045LysSerLeuAlaG1yGlnGluValThrAspAlaPheValAlaPheHis505560ProAlaSerThrTrpLysAsnLeuAspLysPhePheThrGlyTyrTyr65707580LeuLysAspTyrSerValSerGluValSerLysAspTyrArgLysLeu859095ValPheGluPheSerLysMetGlyLeuTyrAspLysLysGlyHisIle100105110MetPheAlaThrLeuCysPheIleAlaMetLeuPheAlaMetSerVal115120125TyrGlyValLeuPheCysGluGlyValLeuValHisLeuPheSerGly130135140CysLeuMetGlyPheLeuTrpIleGlnSerGlyTrpIleGlyHisAsp145150155160AlaGlyHisTyrMetValValSerAspSerArgLeuAsnLysPheMet165170175GlyIlePheAlaAlaAsnCysLeuSerGlyIleSerIleGlyTrpTrp180185190LysTrpAsnHisAsnAlaHisHisIleAlaCysAsnSerLeuGluTyr195200205AspProAspLeuGlnTyrIleProPheLeuValValSerSerLysPhe210215220PheGlySerLeuThrSerHisPheTyrGluLysArgLeuThrPheAsp225230235240SerLeuSerArgPhePheValSerTyrGlnHisTrpThrPheTyrPro245250255IleMetCysAlaAlaArgLeuAsnMetTyrValGlnSerLeuIleMet260265270LeuLeuThrLysArgAsnValSerTyrArgAlaGlnGluLeuLeuGly275280285CysLeuValPheSerIleTrpTyrProLeuLeuValSerCysLeuPro290295300AsnTrpGlyGluArgIleMetPheValIleAlaSerLeuSerValThr305310315320GlyMetGlnGlnValGlnPheSerLeuAsnHisPheSerSerSerVal325330335TyrValGlyLysProLysGlyAsnAsnTrpPheGluLysGlnThrAsp340345350GlyThrLeuAspIleSerCysProProTrpMetAspTrpPheHisGly355360365GlySerGlnPheGlnIleGluHisHisLeuPheProLysMetProArg370375380CysAsnLeuArgLysIleSerProTyrValIleGluLeuCysLysLys385390395400HisAsnLeuProTyrAsnTyrAlaSerPheSerLysAlaAsnGluMet405410415ThrLeuArgThrLeuArgAsnThrAlaLeuGlnAlaArgAspIleThr420425430LysProLeuProLysAsnLeuValTrpGluAlaLeuHisThrHisGly435440445(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO6TrpIleGlyHisAspAlaGlyHis15(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO7AsnValGlyHisAspAlaAsnHis15(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO8ValLeuGlyHisAspCysGlyHis15(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO9ValIleAlaHisGluCysGlyHis15(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO10ValIleGlyHisAspCysAlaHis15(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO11ValValGlyHisAspCysGlyHis15(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO12HisAsnAlaHisHis15(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO13HisAsnTyrLeuHisHis15(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO14HisArgThrHisHis15(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO15HisArgArgHisHis15(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO16HisAspArgHisHis15(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO17HisAspGlnHisHis15(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO18HisAspHisHisHis15(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO19HisAsnHisHisHis15(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO20PheGlnIleGluHisHis15(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO21HisGlnValThrHisHis15(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO22HisValIleHisHis15(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO23HisValAlaHisHis15(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO24HisIleProHisHis15(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型直線(xiàn)(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(xi)序列說(shuō)明SEQIDNO25HisValProHisHis1權(quán)利要求1.編碼琉璃苣Δ6-去飽和酶的分離的核酸。2.權(quán)利要求1的分離出的核酸，包括SEQIDNO4的核苷酸序列。3.編碼SEQIDNO5的氨基酸序列的分離出的核苷酸。4.包含權(quán)利要求1-3中任何一個(gè)核酸的載體。5.一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的分離的核酸，其中該核酸可操作性地與啟動(dòng)子和任選的能夠影響所述分離核酸基因產(chǎn)物表達(dá)的終止序列連接。6.權(quán)利要求5的表達(dá)載體，其中所說(shuō)的啟動(dòng)子是Δ6去飽和酶啟動(dòng)子，魚(yú)腥藻屬羧化酶啟動(dòng)子，半日花素啟動(dòng)子，大豆球蛋白啟動(dòng)子，napin啟動(dòng)子，來(lái)源于CaMV的35S啟動(dòng)子或半日花素組織特異性啟動(dòng)子。7.權(quán)利要求5的表達(dá)載體，在此所說(shuō)的啟動(dòng)子是組成性的或組織特異性的。8.權(quán)利要求5的表達(dá)載體，在此所說(shuō)的終止信號(hào)是一個(gè)集胞藻屬終止信號(hào)，胭脂堿合成酶終止信號(hào)或種子終止信號(hào)。9.包含權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的載體的細(xì)胞。1O.權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所說(shuō)細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞，植物細(xì)胞，或真菌細(xì)胞。11.包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的核酸的轉(zhuǎn)基因生物體。12.包含權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)載體的轉(zhuǎn)基因生物體。13.權(quán)利要求11或12的轉(zhuǎn)基因生物體，其中所說(shuō)的生物體是細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物。14.從權(quán)利要求10的植物細(xì)胞再生而來(lái)的植物或所說(shuō)植物的后代。15.權(quán)利要求14的植物，其中所說(shuō)的植物是向日葵，大豆，玉米，煙草，花生，胡蘿卜或油籽油菜。16.生產(chǎn)具有增高的γ亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，包括(a).用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b).從所說(shuō)植物細(xì)胞再生具有增加的GLA含量的植物。17.生產(chǎn)具有增高的γ亞麻酸(GLA)含量的植物的方法，包括(a).用權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b).從所說(shuō)的植物細(xì)胞中再生具有增高的GLA含量的植物。18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所說(shuō)的植物是向日葵，大豆，玉米，煙草，花生，胡蘿卜和油籽油菜。19.在GLA缺陷或缺乏的生物體中誘導(dǎo)生產(chǎn)γ亞麻酸(GLA)的方法，包括用權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中分離核酸轉(zhuǎn)化所說(shuō)生物體。20.在GLA缺陷或缺乏的生物體中誘導(dǎo)生產(chǎn)γ亞麻酸(GLA)的方法，包括用權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)中的載體轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。21.在GLA和亞油酸缺陷或缺乏的生物體中誘導(dǎo)生產(chǎn)γ亞麻酸(GLA)的方法，包括用編碼琉璃苣Δ6-去飽和酶和編碼Δ12-去飽和酶的分離的核酸轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。22.權(quán)利要求21的方法，其中所說(shuō)的編碼Δ6-去飽和酶的分離的核酸包括SEQIDNO4的44至1390核苷酸。23.在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的生物體中誘導(dǎo)生產(chǎn)十八碳四烯酸的方法，包括用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的核酸轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。24在γ-亞麻酸缺陷或缺乏的生物體中誘導(dǎo)生產(chǎn)十八碳四烯酸的方法，包括用權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化所說(shuō)的生物體。25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所說(shuō)的生物體是細(xì)菌，真菌，植物或動(dòng)物。26.生產(chǎn)具有增強(qiáng)抗凍性植物的方法，包括(a).用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b).從所說(shuō)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生具有增強(qiáng)抗凍性的所說(shuō)植物。27.生產(chǎn)具有增強(qiáng)抗凍性植物的方法，包括(a).用權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b).從所說(shuō)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生具有增強(qiáng)抗凍性的所說(shuō)的植物。28.權(quán)利要求26或27的方法，其中所說(shuō)植物是向日葵，大豆，玉米，煙草，花生，胡蘿卜或者油籽油菜。全文摘要亞油酸被△6去飽和酶轉(zhuǎn)化為γ－亞麻酸。本發(fā)明涉及分離的包括△6去飽和酶基因的核酸。更具體地,分離的核酸包括△6去飽和酶基因的啟動(dòng)子,編碼區(qū)和終止區(qū)。本發(fā)明提供了包含與異源性調(diào)節(jié)序列功能性組合的△6去飽和酶編碼區(qū)的重組構(gòu)建體。本發(fā)明的核酸和重組構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因生物體GLA的產(chǎn)生中有用。文檔編號(hào)C12N15/74GK1177379SQ95197728公開(kāi)日1998年3月25日申請(qǐng)日期1995年12月28日優(yōu)先權(quán)日1994年12月30日發(fā)明者T·L·湯馬斯,A·S·雷迪,M·盧希奧,A·N·盧恩貝爾格,G·L·弗雷思勒特申請(qǐng)人:羅納-布朗克農(nóng)業(yè)化學(xué)公司