專利名稱：小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株(g422)的誘發(fā)及建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用化學(xué)致癌劑在動物體內(nèi)誘發(fā)其病理形態(tài)和人體病態(tài)細(xì)胞基本相似的腫瘤模型，然后經(jīng)過移植傳代，建立起穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株(G422)的方法。
膠質(zhì)瘤是人腦中腦腫瘤的一種常見類型，但至今人們對其生物特性的了解不多，這樣就對尋求腦腫瘤治療方法造成很大的困難。
本發(fā)明的目的就是利用化學(xué)致癌劑在動物體內(nèi)誘發(fā)其病理形態(tài)和人體病態(tài)細(xì)胞基本相似的腫瘤模型，使腦內(nèi)接種者對藥物的治療反應(yīng)與腦病臨床化療結(jié)果相似。
本發(fā)明的誘發(fā)方案是將甲基膽蒽粉加熱溶解，再冷卻成大小為1毫米3、重1.0～1.2毫克的藥丸。采用健康昆明種雄性小鼠、年令6-8周、體重20-22克。用硫苯妥鈉麻醉小鼠，切開左頂皮膚、顱骨和腦膜，將甲基膽蒽丸植入腦實(shí)質(zhì)，覆蓋顱骨片，縫合切口。植入兩個月以后，小鼠可表現(xiàn)顱骨隆起，肢體無力或反射遲鈍，尾不能屈曲或尾巴反射消失，興奮抽搐或呆滯昏睡，陰莖勃起或脊柱后突，眼球凸出，眼球震顫。有上述一種或數(shù)種癥狀者，即予以處死，腦及內(nèi)臟進(jìn)行組織學(xué)檢查，腫瘤組織除常規(guī)的HE染色外，還作Foot，V-G.PTH染色，部分標(biāo)本還作Cajal和碳酸銀浸染。
本發(fā)明的傳代方法是對種植致癌劑后表現(xiàn)腦瘤癥狀的小鼠，在無菌操作下取一小塊腫瘤，用冰凍切片或壓片法檢查，確定是生長旺盛的膠質(zhì)瘤則進(jìn)行同種小鼠移植。同一腫瘤組織分種植在小鼠腦內(nèi)和腋部皮下，等頭部隆起或皮下生長出瘤的結(jié)節(jié)長到一定大小時處死，取出瘤組織再進(jìn)行移植傳代，每次均分別移植到小鼠的皮下和腦內(nèi)。在移植過程中精心挑選膠質(zhì)瘤標(biāo)本，廢棄那些有肉瘤變的材料，一直保留膠質(zhì)瘤的病理特性，腫瘤組織內(nèi)瘤細(xì)胞呈多角形，胞漿少，紅染，胞核相對較大，圓形或卵圓形，核膜清楚，中等量染色質(zhì)，核仁不明顯，每高倍視野可見有4-5個絲狀核分裂，瘤組織內(nèi)中等量血管成分，血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度增生，散在多數(shù)大小不一的變性壞死區(qū)，腫瘤細(xì)胞無特殊排列。在Foot’s染色切片中，纖細(xì)的網(wǎng)織纖維很少，只分布在血管壁上，腫瘤細(xì)胞之間沒有網(wǎng)織纖維形成，PTH染色，血管壁顯赭黃色，瘤細(xì)胞分布區(qū)普遍藍(lán)染，未見膠質(zhì)纖維，在Cajal浸染切片中，無膠質(zhì)纖維突起，而在瘤周腦組織內(nèi)星形細(xì)胞增生則明晰可見。根據(jù)以上特征，G422瘤株是一個分化度低，細(xì)胞原始的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
用本發(fā)明建立起來的小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株G422，皮下、肌內(nèi)或腦內(nèi)種植可100％生長，從無自發(fā)消退。肌內(nèi)或腦內(nèi)接種可形成比較規(guī)律的移植生腫瘤模型。此腫瘤對化療藥敏感性較好。肌內(nèi)接種可用做初篩模型，腦內(nèi)接種可用做復(fù)篩模型。腦內(nèi)接種者對藥物的治療反應(yīng)與腦瘤臨床化療結(jié)果有相似之處，一種新藥如能對G422腦內(nèi)接種模型平均延長生命50％以上，而且重復(fù)性好，則臨床可能出現(xiàn)較好的療效。生命延長大于20％，而且能重復(fù)出現(xiàn)者，也有臨床試用的價值。故可用來尋找新的腦瘤治療方法。
實(shí)施例(1)小鼠取健康昆明種雄性小鼠608只，年齡6-8周，體重都在20-22克之間，用瓦罐飼養(yǎng)，每罐5只，分別編號實(shí)驗(yàn)過程中瓦罐每周消毒一次，每日喂食二次，換水瓶一次。
(2)麻醉用0.5％硫苯妥鈉0.2毫升(相當(dāng)于1毫克)注入小鼠腹腔內(nèi)，在2-3分鐘內(nèi)即能達(dá)到小鼠全身麻醉，并保持30-60分鐘之久。
(3)致癌劑甲基膽蒽藥丸的制備；取甲基膽蒽粉劑，放在一個5毫升的小燒杯內(nèi)，再把燒杯浸浴在芝麻油，當(dāng)油加熱到180℃時，甲基膽蒽即逐漸溶解到液狀，此時用一端尖細(xì)的玻璃棒快速地浸入甲基膽蒽液內(nèi)，取出時在玻璃棒端即凝成一小丸，大小約為1立方毫米，取下后選擇重量在0.1-1.2毫克之間的藥丸即可備用。
(4)種植方法小鼠全麻后，用0.5％碘酒消毒頭皮，用拇指和食指固定頭部，在左側(cè)顱頂部作一0.5公分的縱形切口，用手指輕輕把皮膚扒開，充分暴露左側(cè)頂骨，距中線旁0.2-0.4公分處用注射針針頭在頂骨上鉆三個小孔，孔間距0.3公分，成一等邊三角形，再用小剪剪開兩邊，形成一“V”形，把骨片向前翻開，露出腦膜，挑破腦膜，即見腦組織，如有滲血，則用棉棍輕輕按壓，幾秒種后即能止血，然后用小鑷把甲基膽蒽藥丸傾斜埋入腦內(nèi)，覆蓋骨片，用細(xì)絲線縫合頭皮一針，手術(shù)完畢后將小鼠放在37℃溫箱內(nèi)保溫，醒后編號放入瓦罐內(nèi)，飼養(yǎng)的室溫18-30℃，密切觀察。
2.動物的檢查實(shí)驗(yàn)小鼠種植藥丸兩個月后，每天至少觀察二次，進(jìn)行細(xì)心的檢查，能及早發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長，努力避免因未被發(fā)現(xiàn)突然引起死亡或頭部被其他小鼠分食的現(xiàn)象發(fā)生。在檢查時如果發(fā)現(xiàn)下列現(xiàn)象，提示顱內(nèi)可能有腫瘤生長。
(1)用手指輕輕地順頭皮移動，可感到局部骨片隆起或有一腫物。
(2)提起小鼠尾巴，使其后腿懸空，當(dāng)小鼠前腿抓住鐵絲籠向前爬時，可發(fā)現(xiàn)一側(cè)無力，或當(dāng)肢體受到觸動時，反射反應(yīng)遲鈍。
(3)把小鼠放在手指上，小鼠尾巴不能自然卷曲手指上，甚至尾巴反射消失，顏色發(fā)紫。
(4)小鼠興奮不安，在瓦罐內(nèi)不停地轉(zhuǎn)圈，容易激怒，甚至發(fā)生癲癇樣抽搐，或者精神不振，軟弱，不進(jìn)食，皮毛蓬松，甚至昏睡，往往將在數(shù)小時內(nèi)死亡。
(5)因顱內(nèi)壓增高出現(xiàn)陰莖勃起，或者脊柱后凸，有時見有眼球突出，眼球震顫。
有上述癥狀的小鼠可予以處死，取出腦標(biāo)本和其他內(nèi)臟進(jìn)行檢查，如發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤，則進(jìn)行同種小鼠腫瘤移植。
結(jié)果種植手述后24小時內(nèi)死亡16只小鼠，占全部608只的2.6％，病理資料完整的小鼠有523只，一年內(nèi)產(chǎn)生腦瘤180只，誘發(fā)率為34.4％。其中膠質(zhì)瘤121只(單純膠質(zhì)瘤的誘發(fā)率為23.1％)，膠質(zhì)瘤合并肉瘤10只，肉瘤48只，疑似垂體瘤1只。
誘發(fā)膠質(zhì)瘤一般瘤體較小，多數(shù)局限在顱內(nèi)，在致癌劑周圍呈浸滑性生長，無包膜、膠胨狀，瘤體切面有小出血和壞死灶，部分有蛛網(wǎng)膜下腔或腦室內(nèi)播散，甚至在脊髓蛛網(wǎng)膜下腔播散，無內(nèi)臟轉(zhuǎn)移。少數(shù)腫瘤經(jīng)顱骨骨窗處突出顱處在頭皮下生長。鏡下很少呈單一細(xì)胞類型，多數(shù)為混合生，如分化不良的星形細(xì)胞瘤組織中混有少枝膠質(zhì)瘤為差。瘤內(nèi)或周圍腦組織內(nèi)可見有吞噬甲基膽蒽顆粒的吞噬細(xì)胞。依據(jù)腫瘤的主要細(xì)胞成分可將121只小鼠的誘發(fā)膠質(zhì)瘤分成以下幾種類型分化不良星形細(xì)胞瘤52，多形生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤7，室管膜瘤22，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤39，髓母細(xì)胞瘤1。
誘發(fā)肉瘤的瘤體較大，常經(jīng)骨窗突出至顱外頭皮下。腫瘤侵犯腦內(nèi)部分境界清楚，質(zhì)硬，粉紅色，似魚肉狀。鏡下呈纖維肉瘤結(jié)構(gòu)。有1只小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)甲基膽蒽丸位于鞍旁，其旁有一小塊瘤組織，鏡下似垂體腺瘤。未見腫瘤的小鼠腦內(nèi)，致癌劑周圍神經(jīng)細(xì)胞皺縮，核固縮，星形細(xì)胞增生，構(gòu)成包圍帶。
誘發(fā)肉瘤發(fā)生常早于膠質(zhì)瘤。肉瘤最早發(fā)生在種植后第76天，2/3的動物發(fā)生在100-200天之間，膠質(zhì)瘤最早在136天，4/5左右發(fā)生在200天以上。
處死發(fā)現(xiàn)有腫瘤生長的小鼠，在無菌條件下打開顱骨、先取一小塊腫瘤用壓片法鑒別出種瘤是膠質(zhì)瘤而且細(xì)胞生長旺盛者進(jìn)行同種小鼠移植，先擇小鼠仍為昆明種，年齡在4-6周，體重在20克左右。傳代分兩組進(jìn)行1.皮下組，取10只小鼠，不必麻醉，左腋部皮膚用0.5％碘酒消毒，然后在距肩胛下1.5公分處相當(dāng)于肋緣上把皮膚剪開一0.5公分的小口，再用小鑷取瘤組織2立方毫米一塊，從塊口塞入到腋下，切口用絲線縫合一針，一般傳代保種都用此法。
2.腦內(nèi)組，取10只小鼠作全麻后，在無菌條件下切開頭皮，顱骨鉆孔，翻開顱骨骨片，挑破腦膜，暴露腦組織，然后用小鑷把一塊1-1.5立方毫米的瘤組織埋入腦內(nèi)，覆蓋顱骨骨片，縫合頭皮。如有嚴(yán)重腦水腫時，可把腦皮層去掉一小塊，再植入瘤組織，以避免因腦水腫把瘤組織頂出到頭皮下。
本組實(shí)驗(yàn)中的25例膠質(zhì)瘤進(jìn)行了傳代，有6例傳到第二代生長成功，大多在第三、四周時即可見到頭部隆起或在皮下生長出一瘤結(jié)節(jié)，當(dāng)長到一定大小以后處死，取出種瘤組織再進(jìn)行移植傳代，每次均分別移植到皮下和腦內(nèi)各10只小鼠。在連續(xù)傳代過程中因瘤組織壞死，傳代失敗或因轉(zhuǎn)變?yōu)槿饬鼋Y(jié)構(gòu)被廢棄外，最后保存兩株腫瘤，此兩株腫瘤組織結(jié)構(gòu)基本相似，不論用組織塊或是用瘤組織磨成勻漿(1∶3-1∶10)在皮下或腦內(nèi)移植都能獲得100％生長，皮下移植經(jīng)7-10天開始觸摸到瘤結(jié)節(jié)，之后，腫瘤生長速度加快，生存期平均在25-30天左右。一般腦內(nèi)移植，腫瘤生長較皮下為慢，而且由于浸潤范圍和顱內(nèi)壓增高程度不同，其生存期差異也較大。在傳代過程中有的轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)瘤結(jié)構(gòu)而被廢棄，有的傳代不成功，最后獲得一個膠質(zhì)母細(xì)胞瘤瘤株(G422)。
G422的第一代是分化不良的星形細(xì)胞瘤。在最初的傳代過程中細(xì)胞類型可有變異。有時呈分化不良星形細(xì)胞瘤，細(xì)胞呈星狀，有膠質(zhì)纖維突起胞漿多少不一，核園形或卵園形、致密深染，可見絲狀分裂。有時出現(xiàn)少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)一致，核園形，胞頭透明。有時瘤內(nèi)出現(xiàn)室管膜瘤的管腔狀結(jié)構(gòu)。皮下傳代過程中血管外膜細(xì)胞活躍增生，常見大片細(xì)胞呈梭形，作旋渦狀或束狀編織樣結(jié)構(gòu)，多數(shù)核分裂，散在單核和多核瘤巨細(xì)胞，瘤中心區(qū)壞死，特殊染色示多量網(wǎng)織纖維和膠原纖維，甚至演變成典型的纖維肉瘤結(jié)構(gòu)。
G422自第120代起病理組織類型已基本穩(wěn)定，瘤細(xì)胞密集，胞漿少，嗜伊紅染色，胞核相對較大，園形或卵園形，核膜清楚，中等量染色質(zhì)，核仁不明顯，核分裂多見，瘤組織內(nèi)中等數(shù)量血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，散在變性壞死區(qū)。瘤組織內(nèi)無特殊排列結(jié)構(gòu)，F(xiàn)oot′s染色示網(wǎng)織纖維很少，僅分布在血管壁及其周圍，VanGieson′s染色只有在血管壁上有紅染的膠原纖維，瘤細(xì)胞分布區(qū)蘭染，Cajal浸染瘤細(xì)胞無膠質(zhì)纖維突起。根據(jù)以上特點(diǎn)，G422是一個分化度低，細(xì)胞類型原始的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
G422至今已傳350余代。無論用瘤塊或用細(xì)胞懸液，均可100％移植成功，沒有自發(fā)消退。常規(guī)保種采用腦內(nèi)插塊法，每兩周進(jìn)行一次。
權(quán)利要求
1.一種小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株(G422)的誘發(fā)及建立，其特征在于它是由甲基膽蒽植入小鼠腦內(nèi)誘發(fā)，經(jīng)過長期傳代演變而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用化學(xué)致癌劑在動物體內(nèi)誘發(fā)其病理形態(tài)和人體病態(tài)細(xì)胞基本相似的腫瘤模型，然后經(jīng)過移植傳代建立起的實(shí)驗(yàn)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤株(G422)，其特征在于它是由甲基膽蒽植入小鼠腦內(nèi)誘發(fā)，經(jīng)過120代長期傳代演變而成，病理組織基本穩(wěn)定，無論是用瘤塊或細(xì)胞懸液，均可100％移植成功，不會自發(fā)消退，腦內(nèi)接種者對藥物的治療反應(yīng)與腦瘤臨床化療結(jié)果有相似之處，一個新藥如果能對G422腦內(nèi)接種模型治療后，平均延長生命50％以上則該藥可對該種腦瘤病人生命延長大于20％。
文檔編號C12N5/06GK1156181SQ96100350
公開日1997年8月6日 申請日期1996年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月2日
發(fā)明者陳炳桓, 邵文釗, 徐慶中, 王天佑, 朱桂春, 陳冬玲, 王忠誠 申請人:北京市神經(jīng)外科研究所