專利名稱：膦?；鶈熙ズ怂帷⑵渲苽浞椒皯玫闹谱鞣椒?br> 本發(fā)涉及具有有用的物理學、生物學及藥理學性質(zhì)的新的寡核苷酸類似物，和其制備方法。它們的應用涉及用作基因表達的抑制劑(反義寡核苷酸、核酶、正義寡核苷酸及三鏈體形成寡核苷酸)、用作檢測核酸的探針及分子生物學中的輔助劑。
寡核苷酸作為基因表達的抑制劑應用于越來越廣泛(J.F.Milligan，M.D.Matteucci and J.C.Martin，J.Med.Chem.36(1993)1923；E.Uhlmann and A.Peyman，Chemical Peviews 90(1990)543；S.T.Crooke，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1992)329)。
反義寡核苷酸是其堿基序列與被抑制的mRNA互補的核酸片段。該靶mRNA可以是細胞、病毒或其他病原體來源的?？赡艿募毎行蛄欣缡鞘荏w、酶、生長因子、免疫調(diào)節(jié)劑、離子通道或致癌基因的序列。已描述了借助反義寡核苷酸抑制病毒復制，例如抑制RSV(Rous肉瘤病毒)、HSV-1和-2(I和II型單純皰疹病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)及流感病毒。在這種情況下，利用與病毒核酸互補的寡核苷酸。
然而要設計正義寡核苷酸的序列，以使它們結合(“俘獲”)例如核酸結合蛋白質(zhì)或核酸加工酶，并從而抑制它們的生物學活性(C.Helene and J.J.Toulme，Biochim，Biophys.Acta 1049(1990)99)。這里可以提到的病毒靶例如有反向轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及反式激活蛋白。一般說來，三鏈體形成寡核苷酸以DNA為靶，并在與之結合后形成三鏈螺旋結構。
借助反義寡核苷酸總地抑制mRNA的加工或抑制其翻譯成蛋白質(zhì)的，三鏈體形成寡核苷酸抑制DNA的轉(zhuǎn)錄和復制(N.T.Thuong，and C.Helene，Angew.Chem，105(1993)697；Uhlmann and Peyman，Chemnical Reviews 90(1990)543)。然而，也有可能在第一次形成雙鏈的雜交中用反義寡核苷酸結合單鏈核酸，然后在與三鏈體形成寡核苷酸的第二次雜交中形成三鏈體構。在此情況下反義和三鏈體結合區(qū)域可以容納于兩個分立的寡核苷酸中，或者在一個寡核苷酸中。
合成的寡核苷酸的進一步應用是所謂核酶，該酶作為其核酸酶活性的結果可破壞靶RNA(D.Castarrotto，J.J.Rossi.J.O.Deshler，Critical Rev.Eukar.Gene Expr.2(1992)331)。
在DNA診斷中，應用帶有適當標記的核酸片段作為所謂的DNA探針，與待檢測的核酸進行特異性雜交。在這種情況下，新雙鏈的特異形成是借助標記來監(jiān)測的，所說的標記以非放射活性的為好。用這種方法可以檢測遺傳性、腫瘤性、病毒性或其他病原體引起的疾病。
對于所提到的大多數(shù)應用來說，其天然存在形式寡核苷酸并不是很適用的或者說是完全不適用的。必須對它們進行化學修飾以使之適應特定需要。為了使寡核苷酸能應用于生物學系統(tǒng)，例如用于抑制病毒復制，它們必須滿足下列要求1.在體內(nèi)條件條件，即在血清和細胞內(nèi)它們必須有足夠高的穩(wěn)定性。
2.在它們的構成上必須能夠使之通過細胞和核膜。
3.它們必須在生理條件下以堿基特異方式與其靶核酸結合，以表現(xiàn)其抑制作用。
這些要求對于DNA探針不是必不可少的；然而，這些寡核苷酸必須被衍化，以使檢測得以實現(xiàn)，例如借助熒光、化學發(fā)光、比色或特異性染色(Beck and Koster，Anal.Chem，62(1990)2258)。
許多寡核苷酸的化學變異都是已知的，已經(jīng)合成了比未被修飾更好地滿足上述要求的寡核苷酸。通常經(jīng)適當?shù)匦揎椓姿狨ス羌?、核糖單位或核酸堿基進行對寡核苷酸的化學修飾(Uhlmannand Peyman，Chemical Review 90(1990)543)。修飾還包括用其他基團，例如已用“嗎啉代核苷”寡聚體(E.P.Stirchak et al.，Nucleic Acids Res.17(1989)6129)或″PNAs″(P.E.Nielsen etal.，Bioconj.Chem 5(1994)3)取代了其中之磷酸橋接和糖單位的寡核苷酸。具體地說，PNA特征在于其對靶RNA有高親和性，但又伴有其他一些不利性質(zhì)，如缺乏溶解性或缺乏細胞穿透性(W.Wang et al.，Tetrahedron Letters 36(1995)1181；M.Egholm et al.，in″Innovation and Perspectives in Solid PhaseSynthesis，Peptides、Proteins，Nucleic Acids″，Roger Epton，Ed.Mayflower Worldwide Limited，Birmingham，1994，145-148)。
因此目的之一是要找到具有有利性質(zhì)的新的寡核苷酸類似物。
因此本發(fā)明涉及式I的化合物 其中上述n為0至100的數(shù)，B各自是氫、羥基、(C1-C20)-烷基、(C1-C20)-烷氧基、(C1-C20)-烷硫基、(C6-C20)-芳基、(C6-C20)-芳基-C(C1-C6)-烷基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷氧基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷硫基、芳香基團或雜環(huán)基團，其中烷基、芳基和/或芳香或雜環(huán)基團可以被羥基、(C1-C4)-烷氧基、-NR9R10、-C(O)OH、氧代-C(O)OR8、C(O)NR9R10、-CN、-F、-Cl、-Br、-NO2、(C2-C6)-烷氧基烷基、-S(O)mR8、-(C1-C6)-烷基-S(O)mR8、-NHC(＝NH)NHR8、-C(＝NH)NHR8、-NR9C(＝O)R8、＝NOR8、NR9C(＝O)OR10、-OC(＝O)NR9R10和-NR9C(＝O)NR9R10一次或多次取代，或者B各自是天然核苷堿基、非天然核苷堿基或報告配基；A-B也可以是通過羧基基團縮合的D-或L-氨基酸或者由這些氨基酸組成的具有多達5個氨基酸殘基長度的肽，L各自是N或R1N+，且R1是氫或可被羥基、(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷硫基或氨基取代的(C1-C6)-烷基，優(yōu)選是氫或甲基；A各自是單鍵、亞甲基或式IIa或IIb的基團
Y1是＝O、＝S、＝CH2、＝C(CH3)2或＝NR1，其中R1是如上所限定的基團；M是單鍵、-O-、-S-或-NR1-，其中R1定義同上；R2和R3各自是氫、羥基、(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷硫基、氨基、鹵素如F、Cl或Br，或可被羥基、(C1-C6)-烷氧基或(C1-C6)-烷硫基取代的(C1-C6)-烷基，但優(yōu)選氫；p和q各自是0至5；r和s各自是0至5；D和G各自是CR5R6；R5和R6各自是氫、(C1-C6)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷基、羥基、(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷硫基、和可被SR1或NR1R′取代的烷基及芳基，其中R1定義同上，并且獨立于R1的R1′具有如R1的意義，但R5和R6較好是氫；X是-O-、-S-或-NR1-，其中R1定義同上；Y是＝O或＝S；Z是-OR8、NR9R10或X′Q″、其中X′定義同X，且Q″定義同Q；R8是氫、(C1-C18)-烷基、(C2-C18)-鏈烯基、(C3-C18)-炔基、(C6-C12)-芳基、(C6-C12)-芳基-(C1-C6)-烷基，其中烷基可以被羥基、(C1-C4)-烷氧基、F、Cl或Br取代一次或多次，且芳基可被羥基、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、F、Cl、Br、NO2、-NR9R10、-C(O)OH、-C(O)O-(C1-C6)-烷基或-C(O)NR9R10取代1-3次，但較好是氫、(C1-C6)-烷基、(C6-C12)-芳基或(C6-C12)-芳基-(C1-C6)-烷基，其中芳基可被(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、F、CL、Br或NO2單取代，并且特別優(yōu)選的是氫、(C1-C6)-烷基、苯基或2-(4-硝基苯基)乙基；R9和R10各自是氫、(C1-C18)-烷基、(C1-C18)-鏈烯基、(C1-C18)-炔基、(C6-C12)-芳基、(C6-C12)-芳基-(C1-C6)-烷基，其中烷基可被羥基、(C1-C4)-烷氧基、F、Cl或Br取代一次或多次，或者R9和R10可與連結它們的N原子一起形成4至7元環(huán)；Q和Q′各自是氫或R8，或有利地影響反義寡核苷酸或三鏈體形成寡核苷酸之性質(zhì)的偶聯(lián)物或作為DNA探針的標記或在寡核苷酸類似物與靶核酸的雜交中經(jīng)結合或交聯(lián)攻擊該靶核酸的偶聯(lián)物，或者是可以未被修飾或經(jīng)過修飾的寡核苷酸，可以舉出下例變異體作為某些修飾的例子(例如參見E.Uhlmann and A.Peyman，Chemical Reviews90(1990)543；″Protocals for Oligonucleotides and Anglogs″，Synthesis and Properties & Synthessis and Analytical Tech niques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993中所述的修飾)a)例如用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR4R4′-氨基磷酸酯、磷硼酸酯(boranophosphate)、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-〔(C6-C12)-芳基(C1-C12)-O-烷基〕酯、2，2，2-三氯二甲基乙基膦酸酯、(C1-C8)烷基膦酸酯或(C6-C12)-芳基膦酸酯橋完全或部分取代3′-和/或5′-磷酸二酯橋，其中R4和R4′各自是氫、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基或-(CH2)C-〔NH(CH2)C〕d-NR7R7，其中c是2到6的整數(shù)，d是0到6的整數(shù)，且R7各自是氫、(C1-C6)-烷基或(C1-C4)-烷氧基-(C1-C6)-烷基，R4和R4′優(yōu)選是氫、(C1-C8)-烷基或甲氧基乙基，特別優(yōu)選的是氫、(C1-C4)-烷基或甲氧基乙基，或者R4和R4′也可以連同連接它們的氮原子一起形成可以另外含有選自O、S和N系列之其他雜原子的5之或6元雜環(huán)；b)用“脫磷酸”橋接部分(例如參見Uhlmann and Peyman，″Methods in M o lcular Biolgy″，Vol.20，″Protocols forOligonucleotides a nd Analogs″，S.Agrawal，Ed.，HumanaPress，Totowa 1993，Chapter 16，355 ff)，例如用縮甲醛(formacetal)、3′-硫代縮甲醛、甲基羥胺、亞甲基二甲基聯(lián)亞氨基、二亞甲基砜或甲硅烷基完全或部分地取代3′-或5′-磷酸二酯橋接部分；c)例如用“嗎啉代核苷”寡聚體(E.P.Stirchak et al.，Nucleic Acids Res.17(1989)6129)或″PNAs″(P.E.Nielsen etal.，Bioconj.Chem.5(1994)3)或例如DE-P 4408528.1和EP-A 0 672 677(HOE 94/F 057)中所述的PNA-DNA雜合物完全或部分地取代磷酸糖酯骨架；d)例如用α-D-2′-脫氧核糖、L-2′-脫氧核糖、2′-F-2′脫氧核糖、2′-O-(C1-C6)烷基-核糖、2′-O-(C2-C6)鏈烯基核糖、2′-NH2-2′-脫氧核糖、β-D-木呋喃糖、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-二脫氧-β-D-赤吡喃己糖，和碳環(huán)(如參見Froehler，J.Am.Chem.Soc.114(1992)8320)和開鏈糖類似物(如參見Vandendriesshe et al.，Tetrahedron 49(1993)7223)或雙環(huán)糖類似物(如參見M.Tarkov et al.，Helv.Chim.Acta 76(1993)481)完全或部分地取代β-D-2′-脫氧核糖單位；e)例如用5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、假尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶(例如在Gutierrez et el.，J.Am.Chem.S oc.116(1994)540或Sagi et al.，Tetrahedron Lett.34(1993)2191中所描述的)、5-(C1-C6)烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)鏈烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶(Gutierrez等，J.Am.Chem.Soc.116(1994)540或Sagi等Tetrahedron Lett.34(1993)2191)、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶或7-脫氮雜-7-取代的嘌呤(如參見Seela，Nucl.Acids Res.20(1992)2297)；Heterocycles34(1992)229)完全或部分地取代天然核苷堿基。
Q和Q′也可以是有利地影響反義寡核苷酸或三鏈體形成寡核苷酸之性質(zhì)(例如細胞通透作用、核酸酶降解作用、對靶RAN/DNA的親和性、藥物動力學)的偶聯(lián)物，或作為DNA探針中的標記，或在寡核苷酸類似物與靶核酸的雜交中經(jīng)結合或交聯(lián)攻擊該靶核酸的偶聯(lián)物。這些偶聯(lián)物的例子是與多聚賴氨酸、與嵌入劑如嵌二萘、吖啶、吩嗪、菲啶與熒光化合物例如熒光素、與交聯(lián)劑如補骨脂素、迭氮基二氨基吖啶、與親脂分子如(C12-C20)-烷基、與脂如1.2-二-十六烷基-rac-甘油、與維生素如維生素E、與多聚或寡聚乙二醇、與(C12-C18)-烷基磷酸二酯、與-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基形成的偶聯(lián)物。優(yōu)選的偶聯(lián)物是與親脂分子如(C12-C20)-烷基、與類固醇如膽固醇或睪酮、與多聚或寡聚乙二醇、與維生素E、與嵌入劑如嵌二萘、與(C14-C18)-烷基磷酸二酯或與-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C16)-烷基形成的偶聯(lián)物。
這種類型的寡核苷酸偶聯(lián)物的制備是本領域技術人員已知的(例如參見Uhlmann & Peyman，Chem.Rev.90(1990)543；M.Manoharan in″Antisense Research and Applications″，Crookeand Lebleu，Eds.，CRC Press，boca Raton，1993，Chapter 17，P.303 ff和EP-A 0 522 766)。另外，寡核苷酸可在3′或5′末端上攜帶有3′-3′和5′-5′倒位(例如參見M.Koga et al.，J.Org.Chem 56(1991)3757)。
芳香基團例如可以是苯基、萘基、芘基、蒽基、菲基、聯(lián)苯基、雙萘基、并四苯基、并五苯基、并六苯基、苯并菲基、基或苯并芘基。
雜環(huán)基團按其意義例如可以是苯并二氫吡喃基、苯并吡喃鎓-1-基、呋喃基、異苯并二氫吡喃基、異苯并吡喃基、異喹啉基、哌嗪基、喹啉基、吡啶基、吡咯烷基、咪唑基、四氫呋喃基、氮丙啶基、環(huán)氧乙基、苯硫基、嘧啶基、硫雜茂烷基、噻唑基、氮雜基、吡咯基、四氫吡咯基、苯并呋喃基、吲哚基、異氮雜茚基、靛紅基、二氧吲哚基、吲哚氧基、香豆素基、苯并呋喃基、咔唑基、吡唑基、吡咯基、吲唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、1，2，4-三唑基、1，2，3-三唑基、四唑基、五唑基、哌啶基、噠嗪基、吩嗪基、吩噁嗪基、吩噻嗪基、嗎啉基、噻嗪基、苯并二氮雜基、嘌呤基、黃嘌呤基、次黃嘌呤基、二甲基黃嘌呤基、咖啡堿基(caffeinyl)、蝶啶基、蝶呤基、蝶啶基、咯嗪基和降托品基(nortropinyl)。
天然核苷堿基可以理解為例如尿嘧啶、胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤，并且非天然核苷堿基例如為5-硝基吲哚、5-(羥甲基)-尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、假尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C3-C6)-炔基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶和7-脫氮雜-7-取代的嘌呤如7-脫氮雜-7-(C3-C7)-炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C3-C7)-炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-烯基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤和7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤。
非天然的核苷堿基中優(yōu)選的是5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C3-C6)-炔基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶或7-脫氮雜-7-取代的嘌呤如7-脫氮雜-7-(C3-C7)-炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C3-C7)-炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤和7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤，特別優(yōu)選5-(C3-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C3-C6)-炔基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶或7-脫氮雜-7-取代的嘌呤，并且最優(yōu)選的是5-戊炔基胞嘧啶、5-己炔基尿嘧啶、5-己炔基胞嘧啶、7-脫氮雜-7-丙炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-丙炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-甲基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-丙炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤。
報告 配基例如是熒光素、生物素、吖啶、菲咯啉、菲啶和曙紅。
如果沒有特別指出，可列舉的D-或L-氨基酸如下(參見Schroder，Lubke，Peptides，Vol.1，New York 1965，pp.XXII-XXIII；Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie有機化學方法Vol.XV/1 and 2，Stuttgart 1974)Aad，Abu，γAbu，ABz，2ABz，εAca，Ach，Acp，Adpd，Ahb，Aib，βAib，Ala，βAla，ΔAla，Alg，All，Ama，Amt，Ape，Apm，Apr，Arg，Asn，Asp，Asu，Aze，Azi，Bai，Bph，Can，Cit，Cys，Cyta，Daad，Dab，Dadd，Dap，Dapm，Dasu，Djen，Dpa，Dtc，F(xiàn)el，Gln，Glu，Gly，Guv，hAla，hArg，hCys，hGln，hGlu，His，hlle，hLeu，hLys，hMet，hPhe，hPro，hSer，hThr，hTrp，hTyr，Hyl，Hyp，3Hyp，Ile，Ise，Iva，Kyn，Lant，Lcn，Leu，Lsg，Lys，βLys，ΔLys，Met，Mim，Min，hArg，Nle，Nva，Oly，Orn，Pan，Pec，Pen，Phe，Phg，Pic，Pro，ΔPro，Pse，Pya，Pyr，Pza，Qin，Ros，Sar，Sec，Sem，Ser，Thi，βThi，Thr，Thy，Thx，Tia，Tle，Tly，Trp，Trta，Tyr，Val等，沒有立體描述符的縮寫字是指L-型殘基，或者可以是環(huán)狀氨基酸如吡咯烷-2-羧酸；哌啶-2-羧酸；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸；十氫異喹啉-3-羧酸；八氫異喹啉-2-羧酸；十氫喹啉-2-羧酸；八氫環(huán)戊并〔b〕吡咯-2-羧酸；2-氮雜雙環(huán)〔2.2.2〕辛烷-3-羧酸；2-氮雜雙環(huán)〔2，2，1〕庚烷-3-羧酸；2-氮雜雙環(huán)〔2，2.1〕己烷-3-羧酸；2-氮雜螺〔4.4〕壬烷-3-羧酸；2-氮雜螺〔4.5〕癸烷-3-羧酸；螺〔(雙環(huán)〔2.2.1〕庚烷)-2，3-吡咯烷-5-羧酸〕；螺〔(雙環(huán)〔 2.2.2〕辛烷)-2，3-吡咯烷-5-羧酸〕；2-氮雜三環(huán)〔4.3.0.16.9〕癸烷-3-羧酸；十氫環(huán)庚〔b〕吡咯-2-羧酸；十氫環(huán)辛〔b〕吡咯-2-羧酸；八氫環(huán)庚〔C〕吡咯-2-羧酸；八氫異吲哚-1-羧酸；2，3，3a，4，6a-六氫環(huán)庚〔b〕吡咯-2-羧酸；2，3，3a，4，5，7a-六氫吲哚-2-羧酸；四氫噻唑-4-羧酸；異惡唑烷-3-羧酸；吡唑烷-3-羧酸；羥基吡咯烷-2-羧酸；所有這些都可以被取代 US-A 4,344,949， US-A 4,374,847， US-A 4,350,704，EP-A 29 488， EP-A 31 741， EP-A 46 953， EP-A 49 605，EP-A 49 658， EP-A 50 800， EP-A 51 020， EP-A 52 870，EP-A 79 022， EP-A 84 164， EP-A 89 637， EP-A 90 341，EP-A 90 362， EP-A 105 102， EP-A 109 020， EP-A 111 873，EP-A 271 865 and EP-A 344 682。
烷基和由之衍生的殘基如烷氧基和烷硫基可以是分支的、未分支的或環(huán)狀的，飽和的或單不飽和的或多不飽和的。
優(yōu)選的式I化合物是其中有下列基團的化合物n是0至50的數(shù)；B各自是天然核苷堿基或非天然核苷堿基；L是N；A是式IIb的基團，其中r＝1，S是零，且R2、R3＝H，Y’＝O且M是單鍵；D和G各自是CHR5；R5是氫；X是-O-；Y是＝O；Z是羥基、甲氧基、乙氧基、(4-硝基苯基)乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、戊氧基、苯氧基或烯丙氧基；Q和Q’各自是氫、R8或可被修飾或未被修飾的寡核苷酸，其中a)3’-和/或5’-磷酸二酯橋接部分被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR4R4’-氨基磷酸酯、N3’→P5’-氨基磷酸酯(例如在Gryaznov et al.，J.Am.Chem.Soc.116(1994)3143中描述的)、磷酸O-甲基酯、磷酸O-乙基酯、磷酸O-異丙基酯、甲基膦酸或苯基膦酸酯橋部分完全或部分地取代；b)嘧啶位中及5’末端和/或3’末端上的1個，2個或3個3’-或5’-磷酸二酯橋接部分被縮甲醛和/或3’-硫代縮甲醛取代；c)磷酸糖酯骨架被“PNA”或PNA-DNA雜合體完全或部分地取代；d)β-D-2’-脫氧核糖單位被2’-F-2’-脫氧核糖、2’-O-(C1-C6)-烷基核糖、2’-O-(C2-C6)鏈烯基核糖或2’-NH2-2’-脫氧核糖完全或部分地取代；e)天然核苷堿基被5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶/5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶/5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基腺嘌呤7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤。
更優(yōu)選的式I化合物是其中包括下列基團的化合物n是0至30的數(shù)；Q和Q1各自氫、R8，其中R8是H、(C1-C6)-烷基、苯基或2-(4-硝基苯基)乙基，或者是可未被修飾或被修飾的寡核苷酸，其中a)3’-和/或5’-磷酸二酯橋接部分被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲膦酸酯橋接部分完全或部分地取代；b)5’-和3’-末端上的1個、2個或3個3’-或5’-磷酸二酯橋接部分被取代；c)磷酸糖酯骨架被“PNA”或PNA-DAN復合物完全或部分地取代；d)β-D-2’-脫氧核糖被2’-F-2’-脫氧核糖、2’-O-(C1-C4)-烷基核糖、2’-O-(C2-C4)-鏈烯基核糖或2’-NH2-2’-脫氧核糖完全或部分地取代；e)天然核苷堿基被5-(C3-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤。
最優(yōu)選的式I化合物是其中包括下列基團的化合物n是從0到25的數(shù)；B各自是天然核苷堿基；Z是羥基、乙氧基、(4-硝基苯基)乙氧基或苯氧基；Q和Q’各自是氫、R8，其中R8是H、(C1-C6)-烷基、苯基或2-(4-硝基苯基)乙基，或者是可以未被修飾或被修飾的寡核苷酸，其中a)3’-和/或5’-磷酸二酯橋接部分被硫代磷酸酯橋接部分完全或部分地取代；c)磷酸糖酸骨架被“PNA”或PNA-DAN雜合物完全或部分地取代；d)β-D-2’-脫氧核糖被2’-O-甲基-、2’-O-烯丙基-或2’-O-丁基核糖完全或部分地取代；e)天然核苷堿基被5-己炔基胞嘧啶、5-己炔基尿嘧啶、5-己炔基胞嘧啶、7-脫氮雜-7-丙炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-丙炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-甲基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤完全或部分地取代。
本發(fā)明進一步涉及其中Q和Q’相連接，即形成環(huán)狀分子的式I的化合物，其中仍有Q和Q’一起提供一條單鍵的可能性?？砂凑找衙枋龅姆椒?，例如Gao等人(Nucl.Acids Res.23(1995)2025)或Wang和Kool(Nucl.Acids Res.22(1994)2326)所述方法合成這樣的化合物。
本發(fā)明進一步涉及寡核苷酸或被修飾的寡核苷酸，例如PNA，其中式I的化合物被摻入在3’末端或5’末端，或5’和3’末端。
寡核苷酸與式I化合物的鍵合優(yōu)選是通過核苷酸單位的5’-或3’-羥基基團，同樣也可通過膦酸單酯鍵完成。式XVIII和XIX中借助實例說明與寡核苷酸的鍵合. R17是H、OH、F、2’-O-(C1-C6)-烷基或2’-O-(C2-C6)-鏈烯基，較好是H或甲氧基或O-烯丙基，特別優(yōu)選的是H。所有其他可變基團如上文所述。
式XX和式XXI(其中可變基團具有如上所述的意義)舉例說明了用PNA的鍵合。
根據(jù)本發(fā)明的式I化合物(如果Q和Q’＝H即縮寫PMENA)與寡核苷酸或經(jīng)修飾的寡核苷酸(例如RNA或如上所述的其他修飾)的組合將再次用圖示說明(OLIGO是未被修飾的或經(jīng)過修飾的寡核苷酸)這種組合的例子是5′-OLIGO-PMENA5′-PMENA-OLIGO5′-OLIGO-PMENA-OLIGO所提到的進一步組合方式是5′-OLIGO-(PMENA-OLIGO)a(a＝1-20)5′-PMENA-OLIGO-PMENA5′-PMENA-(OLIGO-PMENA)a(a＝1-20)以這樣一種方式，即首先根據(jù)所合成的分子結構按如下所述方法合成PMENA單位，然后再將其與寡核苷酸單位偶聯(lián)以合成這些組合的化合物。在該方法中，寡核苷酸作為單體單位進行偶聯(lián)或經(jīng)固相合成法進行嵌段縮合或按本領域已知的方法(Sonveaux，Bioorganic Chemistry14(1986)274ff)進行溶液合成以完成偶聯(lián)。另外也可以按酰胺酯(amidite)方法、H-磷酸酯方法或磷酸三酯方法(Sonveaux，Bioorganic Chemisty 14(1986)274ff)進行縮合。相反，如果PMENA被偶聯(lián)到OLIGO單位上，則優(yōu)選使用f1)中所述的方法。以同樣的方式完成與PNA單位的偶聯(lián)，如果(單體或寡聚體)PNA單位偶聯(lián)到PMENA單位上，則用本領域技術人員已知的肽合成或酯合成方法。
本發(fā)明進一步涉及制備式I化合物的方法，該方法包括a1)使式III的化合物 其中D、G、L和X具有上述意義，并且S1是適當?shù)谋Ｗo基團，如二甲氧基三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、三苯甲基、Pixyl、叔丁氧基羰基或芴基甲氧基羰基，較好是一甲氧基三苯甲基或叔丁氧羰基，與式IV的化合物 其中R5和R6具有上述的意義，在適當?shù)挠袡C溶劑，如在甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、乙腈、二氯甲烷(DCM)、氯仿、苯、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙醚、乙酸乙酯(EA)、四氫呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮、石油醚、二甲苯或甲苯或適當溶劑的混合物中，較好在甲醇或乙醇中，于0℃到100℃，較好在10至50℃的溫度下反應，得到式Va或Vb的化合物 其中所選用的反應條件是本領域技術人員已知的(如參見S.R.Sandler，W.Karo“Organic Functional Group Preparations”，Vol.II，Second Edition，Academic Press，London，1986，Chapter 12(“Imines”))，要注意的是它們是與保護基團S1相適應的，即如果選擇對酸不穩(wěn)定的保護基團如一甲氧基三苯甲基保護基團，則在反應期間不應加酸，b1)使式Va和Vb的化合物與式VIa或VIb的化合物，較好是式VIa的化合物 其中Y是如上限定的基團，X’和X”各自是如X所限定的基團，S2和S3各自是保護基團，如甲基、乙基、苯基、2-氯苯基、2，5-二氯苯基、2，4-二氯苯基、4-硝基苯基、4-甲氧基苯基、2-氰乙基、2-(4-硝基苯基)乙基、烯丙基、芐基、2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙基、4-甲氧基芐基、2，2，2-三氯乙基、8-羥基喹啉或如本領域技術人員已知的其他磷酸酯保護基團(Sonveaux，Bioorganic Chemistry 14(1986)274ff)，但較好是甲基、乙基、苯基、2-(4-硝基苯基)乙基、烯丙基或2，2，2-三氯乙基，并且L1是離去基團，較好是(C1-C4)-烷基，在適當有機溶劑如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、乙腈、苯、DMF、DMSO、DCM、EA、氯仿、乙醚、THF、N-甲基吡咯烷酮、石油醚、二甲苯或甲苯或適當溶劑的混合物中，較好是在THF中，在0℃至100℃，較好在50至80℃的溫度下進行反應，必要時加入堿，如三-(C1-C6)-烷基胺、N-烷基嗎啉、吡啶、N，N-二甲基氨基吡啶、丁基鋰、二異丙基氨基鋰(LDA)、氫化鈉、氨基鈉、碳酸鉀、碳酸鈀、叔丁醇鉀或復合堿如氨基鈉-R11ONa，其中R11是(C2-C6)-烷基或CH3-CH2-O-CH2CH3，或不帶電荷的、全烷基化的聚氨基膦嗪堿(Schwesinger，Nachr，Chem.Techn Lab.38(1990)1214；Angew.Chen.99(1989)1212)，但較好是不加堿，以得到式VII的化合物 其中D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”和Y具有上文限定的意義；C1)使式VII的化合物與式VIII的化合物 其合成例如參見Dueholm等人(J.Org.Chem.59(1994)5767)所述，且其中A具有上述的意義，BPR具有如B的定義，但其可能以被保護的形成存在，即如果B是天然或非天然核苷堿基，則BPR是其氨基或羥基基團被適當?shù)囊阎Ｗo基團，如用于保護羥基基團的對硝基苯乙基、苯甲?；⑾┍蛯?(叔丁基)苯甲?；?，和用于保護氨基基團的乙酰基、苯甲?；?、對-(叔丁基)苯甲酰基、對-(甲氧基)苯甲酰基、對-硝基苯乙氧基羰基、異丁酰基、對-(叔丁基)苯乙?；?、N，N-二甲基甲酰亞氨基、芴基甲氧基羰基、芐氧基羰基或苯氧基乙酰，或在寡核苷酸化學中常用于核苷堿基的其他保護基團(Sonveaux，Bioorgaric Chemistry 14(1986)274ff；Beaueage，Tetrahedron 49(1993)2223ff)保護的核苷堿基，可提到的BPR的基團較好是 其中R12是氫、1-丙炔基、1-丁炔基、1-戊炔基或1-己炔基，特別是氫、1-丙炔基或己炔基；R13是氫、二苯基氨基甲?；?-(4-硝基苯基)-乙基，及R14是乙?；⒈郊柞；?(叔丁基)苯甲?；?、對-(甲氧基)苯甲?；?、對-硝基苯基乙氧基羰基、異丁?；?、對-(叔丁基)苯基乙酰、芐氧基羰基或苯氧基乙酰，且L2是本領域技術人員已知的離去基團，如Cl、Br、O-SO2甲基、O-SO2三氟甲基、O-甲苯磺酸酯或O-C6F5，或者如果A具有式IIb的意義，則其也可以是OH；在適當?shù)挠袡C溶劑，如在乙腈、苯、DMF、DMSO、DCM、EA、氯仿、乙醚、四甲基脲、THF、N-甲基吡咯烷酮、石油醚、二甲苯或甲苯或適當溶劑的混合物中，較好在DMF中，在-20℃到100℃，較好在0到50℃的溫度下進行反應，必要時可加入堿如三-(C1-C6)-烷基胺、N-烷基嗎啉、吡啶、N，N-二甲基氨基吡啶、丁基鋰、二異丙基氨基鋰(LDA)、氫化鈉、氨基鈉、碳酸鉀、碳酸銫、叔丁醇鉀或復合堿如氨基鈉-R11ONa，其中R11是(C2-C6)-烷基或CH3CH2-O-CH2CH3或不帶電荷的、全烷基化的聚氨基膦嗪堿(Schwesinger，Nachr.Chem.Techn.Lab.38(1990)1214；Angrew.Chem 99(1987)1212)，如果A是式IIb且L2是OH，優(yōu)選加入三乙胺、二異丙基乙胺或N-乙基嗎啉或不加堿，并加入常規(guī)用于偶聯(lián)肽鍵的偶聯(lián)劑，以得到或IX的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”和Y是如上限定的；d1)用已知方法(如參見Greene，Wuts，Protective Groupsin Organic Synthesis，J.Miley & Sons，New York 1991)從式IX的化合物中除去保護基團S3，例如，對于其中S2和S3是2-(4-硝基苯基)乙基的式IX的化合物，于室溫溶解于吡淀或乙腈中的0.1M 1，8-二氮雜雙環(huán)〔5.4.0〕十一碳-7-烯(DBU)處理，或者對于其中S2和S3是苯基或乙基的式IX的化合物，用氨水處理，或者對于其中S2是2-(4-硝基苯基)乙基且S3是烯丙基的式IX的化合物，用溶解于DSM中的Pd〔P(C6H5)3〕4和三苯膦處理(Hayakawa et al.，J Org.Chem，58(1993)5551)，或者對于其中S2是2-(4-硝基苯基)乙基且S3是烯丙基的式IX的化合物，用溶解于吡啶或乙腈中的0.5M DBU處理，或者對于其中S2是2-氰乙基且S3是烯丙基的式IX的化合物，用溶解于吡啶中的三乙胺處理，或者對于其中S2是2-(4-硝基苯基)乙基且S3是2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙基的式IX的化合物，則用三丁基膦外理，得到式X的化合物
其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X、X’、X”和Y是如上文所限定的；e1)用已知方法(如Greene，Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，J.Wiley & Sons，New York 1991；Sonveaux，Bioorganic Chemistry 14(1986)274ff)從式IX的化合物中除去保護基團S1，例如用酸處理，如用80％乙酸，用溶解于二氯甲烷或氯仿中的1-4％二氯乙酸，用溶解于DCM/甲醇中的對甲苯磺酸或氯仿中的1％三氟乙酸處理，以除去單甲氧基三苯甲基保護基團，得到式XI的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S2、S3、X、X’、X”和Y是如上文所限定的；f1)按照寡核苷酸化學中已知的“磷酸三酯法”(Sonveaux，Bioorganic Chemistry 14(1986)2744 ff，Reese，J.Chem，Soc，Perkin Trans.1993，2291ff)，使式XI的化合物與式X的化合物在適當?shù)挠袡C溶劑，如乙腈、苯、DMF、DMSO、DCM、EA、氯仿、乙醚、四甲基脲、THF、N-甲基吡咯烷酮、石油醚、二甲苯或甲苯或適當溶劑的混合物中，較好在吡啶中，于-20℃到100℃，較好0到50℃的溫度下反應，其中加入偶聯(lián)劑如6-硝基苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷六氟磷酸鹽(NBOP，Hashmi，Nucleosides & Nuclestides 13(1994)1059)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP，B.Castro，J.R.Dormmoy， G.Evin and C.Selve，Tetrahedron Lett.1975，1219-1222)、苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷-1-基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP，J.Coste，D.Le-Nguyen and B.Castro，Tetrahedron Lett.1990，205-208)、O-(7-氮雜)苯并三唑-1-基四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU，L.Carpino，J.Am.Chem.Soc.1993，115，4397)，N，N-雙〔2-氧代-3-惡唑烷基〕二氨基磷酰氯(Katti，Tetrahedron Lett.26(1985)2547)、2-氯-5，5-二甲基-2-氧代-1，3，2-二氧雜磷雜己環(huán)(Stawinski，Nucl，AcidsRes，Symp.Ser.24，1991 229)，或式XII的化合物 其中R15是(C6-C12)-芳基，其可以被(C1-6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、硝基、溴或氯取代1至4次，并且其中1至3個碳原子可以被雜原子，優(yōu)選氮取代，即例如苯基、甲苯基、2，4，6-三甲基苯基、2，4，6-三異丙基苯基、2，3，5，6-四甲基苯(Losse，LiebigsAm.Chem.1989，19ff)、4-溴苯、2-硝基苯、4-硝基苯或8-喹啉基，較好是2，4，6-三甲基苯基或2，4，6-三異丙基苯基，并且R16是離去基團如氯、溴、咪唑、三唑、4-硝基咪唑、1，2，3，4-四唑或3-硝基-1，2，4-三唑，優(yōu)選使用式XII化合物的偶聯(lián)劑或BOP、PyBOP或HATU，可以加入或不加催化劑(Reese，J.Chem，Soc.PerkinTrans，1993，2291 ff)，如N-甲基-咪唑，N-氧化吡啶如4-甲氧基吡啶-N-氧化物或4-乙氧基吡啶-N-氧化物、4，6-二硝基-1-羥基苯并三唑、1-羥基-5-苯基四唑、1-羥基-5-(4-硝基苯基)四唑、3-硝基-1H-1，2，4-三唑、5-(3-硝基苯基)-1H-四唑、5-(3，5-二硝基苯基)-1H-四唑、5-(1-甲基唑唑-2-基)-1H-四唑、5-〔(1-甲基咪唑-2-基)甲基〕-1H-四唑或1-羥基-4-硝基-6-(三氟甲基)苯并三唑，優(yōu)選用4-乙氧基吡啶-N-氧化物或4-甲氧基吡啶-N-氧化物作為催化劑，其中偶聯(lián)劑的制備可就地完成或者可分別完成并且可以在適當?shù)娜軇┲屑尤肱c偶聯(lián)劑組合的式(X)之被活化化合物的溶液，得到式XIII的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”和Y如上文所定義；g1)以上述式XIII的化合物為起始物，重復上述e1)和f1)步驟直至所需鏈長，得到式XIV的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”、Y和n如上文所定義；h1)按照已知方法(如Greene.Wuts，Protective Groupsin Organic Synthesis，J.Wiley & Sons，New York 1991)，除去保護基團S1、S2和S3以及BPR上的保護基團，即，例如按步驟e1)中所述方法除去保護基團S1，至于保護基團S2和S3，如果它們是2-(4-硝基苯基)乙基，于室溫下用溶解于吡啶或乙腈中的0.5M 1，8-二氮雜-雙環(huán)〔5.4.0〕十一碳-7-烯(DBU)處理，如果S2或S3是苯基，用氨水處理，如果S2或S3是烯丙基，用溶解于DCM中的Pd〔P(C6H5)3〕4三苯基膦處理(Hayakawaet al.，J.Org.Chem.58(1993)5551)，如果S2或S3是2-氰乙基，用溶解于吡啶中的三乙胺處理，或者如果S2或S3是2，2，2-三氯-1，1二甲基乙基，用三丁基膦處理，而BPR上的保護基團，例如，如果R14是對硝基苯基乙氧基羰基可用溶解于吡啶中的0.5M DBU處理，如果R14是是異丁?；虮郊柞；?qū)籽趸郊柞；瑒t于20至60℃用濃NH4OH處理，或者，如果R13是2-(4-硝基苯基)乙基，優(yōu)選用溶解于吡啶或乙腈中的0.5M DBU處理，如果S1等于一甲氧基三苯甲基并且S3等于2-(對硝基苯基)乙基，可首先按步驟e1)中所述除去一甲氧基三苯甲基，然后按上述方法除去S2，然后除去例如核堿基上的剩余保護基團；并且可以按本領域技術人員已知的方法(例如參見Uhlmann & Peyman，Chem.Rev.90(1990)543；M.Manoharan，in″Antisense Research and Applications″，Crooke and Lebleu，Eds.，CPR Press，Boca Raton，1993，Chapter 17，P.303ff；EP-A 0 552 766；S.Agrawal，inMethods in Molecular Biology，Vol.26，P.93 ff，Humann，Press，Totowa 1994)引入基團Q和Q′，并且可以按Wang(Nucl.Acids Res.22(1994)2326)所述方法環(huán)化所得到的化合物，從而得到式I的化合物。
另外，也可以按本領域技術人員已知的方法(J.March，″Advanced Organic Chemistry″，F(xiàn)ourth Ed.，J.Wiley & Sons，1992)將偶聯(lián)物Q′摻入式XXII的單體單位中，然后按已述方法將其摻入式I的化合物中。 對于Q′＝烷基者，例如可以使式XXIII的化合物與式VIa或VIb的化合物反應并進一步進行類似于式Va和Vb所述的反應，以制備式XXII的化合物。 也可以通過除去保護基團S1并按已知方法(J.March，″Advanced Organic Chemistry″，F(xiàn)ourth Ed.，J.Wiley & Sons，1992)引入基團Q′而從式IX的化合物制備式XXII的化合物。
另外，也可以按本領域技術人員已知的方法(J.March，″Advanced Organic Chemisty″，4th Ed.，J.Wiley & Sons，1992)將偶聯(lián)物Q和Q″摻入式XXIV的單體單位中，然后再按所提到的方法將其摻入式I的化合物中。 例如在Houben-Weyl，Metthoden der OrganischenChemie，〔有機化學方法〕Vol. 15/2，Georg Thieme VerlagStuttgart 1974中描述的連接肽鍵的偶聯(lián)劑(參見c1))及其他試劑如BOP(B.Castro，J.R.Dormoy，G.Evin and C.Selve，Tetrahedron Lett.1975，1219-1222)、PyBOP(J.Coste，D.Le-Nguyen and B.Castro，Tetrahedron Lett.1990，205-208)、BroP(J.Coste，M.-N.Dufour，A.Pantaloni and B.Castro，Tetrahedron Lett.1990，669-672)、PyBroP(J.Coste，E.Frerot，P.Jouin and B.Castro，Tetrahedron Lett.1991，1967-1970)和脲陽離子試劑，如HBTU(V.Dourtoglou，B.Gross，V.Lambropoulou，C.Zioudron，Synthesis 1984，572-547)、TBTU、TPTU、TSTU、TNTU(R.Knorr，A.Trzeciak，W.Bannwarth and D.Gillessen，Tetrahedron Lett.1989，1927-1930)、TOTU(EP-A 0 460446)、HATU(L.A Carpino，J.Am.Chem.Soc.1993，115，4397-4398)、HAPyU、TAPipU(A.Ehrilich，S.Rothemund，M.Brudel，M.Beyermann，L.A.Carpino and M.Bienert，Tetrahedron L e tt.1993，4781-4784)、BOI(K.Akaji，N.Kuriyama，T.Kimura，Y.Fujiwara and Y.Kiso，Tetrahedrou Lett.1992，3177-3180)或?；然蝓；?L.A.Carpino，H.G.Chao，M.Beyermann and M.Bienert，J.Org.Chem.，56(1991)，2635；J.-N.Bertho，A.Loffet，C.Pinel，F(xiàn).Reuther and G.Sennyey in E.Giralt and D.Andreu(Eds.)Peptides 1990，Escom Science Publishers B.V.1991，pp.53-54；J.Green and K.Bradley，Tetrahedron1993，4141-4146)，2，4，6-三甲基苯磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑酰胺(MSNT)(B.Blankemeyer-Menge，M.Nimitzand R.Frank，Tetrahedron Lett.1990，1701-1704)、2，5-二苯基-2，3-二氫-3-氧代-4-羥基噻吩二氧化物(TDO)(R.Kirstgen，R.C.Sheppard，W.Steglich，J.Chem.Soc.Chem.Commun.1987，1870-1871)或各個參考文獻中公開的活化的酯(D.Hudson，Peptide Res.1990，51-55)。
另外優(yōu)選使用碳化二亞胺，如二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺。還優(yōu)選使用磷鎓試劑，如PyBOP或PyBrop、脲陽離子試劑，如HBTU、TBTU、TPTU、TSTU、TNTU、TOTU或HATU及BOI。
在這種情況下，可以使用活化試劑并加入式VIII的化合物而直接完成偶聯(lián)，并可任選加入1-羥基苯并三唑(HOBt)(W.Konig，R.Geiger，Chem.Ber.103，788(1970))或3-羥基-4-氧代-3，4-二氫苯并三嗪(HOObt)(W.Konig，R.Geiger，Chem.Ber.103，2034(1970))添加劑，或者也可以分別預活化作為活化酯的單位，并可加入活化物質(zhì)在適當溶劑中形成的溶液。
本發(fā)明進一步涉及制備其中n是1到100的式I的化合物的方法，該方法包括，在式XV和XVI的化合物中 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”和Y如上文所限定，o和p各自是0至50，較好是0至20并且o+p+l＝n；a2)在式XV的化合物中按e1)所述方法除去保護基團S1，b2)在式XVI的化合物中按d1)所述方法除去保護基團S3，并c2)按f1)所述方法將所得化合物相互偶聯(lián)，得到式XIV的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”、Y和n具有如上所限定的意義，d2)按h1)所述使這些化合物反應，得到式I的化合物。
本發(fā)明的進一步涉及制備式I的化合物的方法，該方法包括a3)按照已知方法，通過SPACER將式X的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X’、X”和Y和具有如上所限定的意義偶聯(lián)到固相載體上，得到式XVII的化合物， 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X、X’、X”和Y和具有如上所限定的意義SS是適用于固相合成的固相載體，如氨基丙基-CPG(CPG＝Cotrolled Pore Glass)或Tentagel，并且SPACER是在發(fā)生合成后可從載體上除去的基團，其為本領域技術人員已知的(Sonveaux，Bioorganic Chemistry 14(1986)274ff)，例如EP-A 0 552 766(HOE 92/F012)中的所述的雙(羥乙基)磺?；鶊F，或者SPACER是雙功能團偶聯(lián)物分子Q，其通過已知的可除去基團被連接到固相載體上，例如通過琥珀酸殘基結合到固相載體的核苷酸或寡核苷酸(Sonveaux，Bioorganic Chemistry 14(1986)274ff)，或通過琥珀酸殘基結合到固相載體上的多聚-或寡聚乙二醇(Jaschke，Tetrahedron Lett.34(1993)301)，或者例如是通過琥珀酸殘基連接到固相載體上的膽固醇衍生物(Mackellar，Nucl.AcidsRes.20(1992)3411)；b3)按e1)所述方法從式XVII的化合物除去保護基團S1 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、SS、SPACER、X、X’、X”和Y和具有如上所限定的意義，c3)按f1)所述方法，使所得到的化合物與式X的化合物反應 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X、X’、X”和Y和具有如上所限定的意義；d3)重復步驟b3)和c3)直到達到所需的鏈長度；e3)或者可以用已知方法(如參見Uhlmann & Peyman，Chem.Rev.90(1990)5 43；M.Manoharan in″AntisenseResearch and Applications，″Crooke and Lebleu，Eds.，CRCPress，Boca Raton，1993，Chapter 17，P.303 ff；EP-A 0552 766；S. Agrawal in″Methods in Molecular Biology″，Vol.26，P.93 ff，Humana Press，Totowa 1994)偶聯(lián)偶聯(lián)物Q′；f3)用已知方法從固相載體上除去以這樣產(chǎn)生的化合物，例如，按EP-A 0 552 766(HOE92/F012)中所述，經(jīng)用DBU處理除去雙(羥乙基)磺酰接頭，經(jīng)用氨水處理除去琥珀酸接頭，以及如步驟h1)中所述除去保持基團，也可以在從載體上裂碎之前除去保護基團，并且可以按已知方法偶聯(lián)偶聯(lián)物Q，從而可改變Q和Q′的偶聯(lián)次序〔e3，f3〕，并可以環(huán)化或不環(huán)化所得到的化合物。
式I的化合物被用作基因表達的抑制劑。因此本發(fā)明進一步涉及使用根據(jù)本發(fā)明的治療活性化合物生產(chǎn)藥物，以及生產(chǎn)藥物的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的化合物與生理上可接受的賦形劑及必要時與適當?shù)奶砑觿┖?或輔助劑混合。
治療活性化合物一般是(基于相當于核苷堿基之單位B的序列)作為反義寡核苷酸、三鏈體形成寡核苷酸、aptamers(可與特異性靶分子如蛋白質(zhì)或受體結合的RAN或DNA分子，如參見L.C.Bock et al.，Nature 1992，355，564)或核酶(催化RNA，例如參見Castanetto et al.，Critical Rev.Eukar，GeneExpr，1992，2，331)類似物發(fā)揮功能，特別是作為反義寡核苷酸和三鏈體形成寡核苷酸的類似物。
再者，本發(fā)明進一步涉及使用根據(jù)本發(fā)明的化合物作為診斷劑，例如檢測生物學樣品中是否存在特異性雙鏈或單鏈核酸分子或其量。
為了按照本發(fā)明使用，本發(fā)明的化合物具有大約6-100，較好大約10-40，特別是大約12-31核苷酸的長度。同樣，如上文所述優(yōu)選范圍、修飾或結合方式也適用于此。
本發(fā)明的藥物可用于治療如由病毒，例如HIV、HSV-1、HSV-2、流感病毒、VSV、乙型肝炎或乳頭瘤病毒引起的疾病。
有抗這種類型的靶之活性的本發(fā)明的序列(堿基序列)例如是a)抗HIV，例如ACACCCAATTCTGAAAATGGSEQ ID NO1AGGTCCCTGTTCGGGCGCCASEQ ID NO2GGTCCCTGTTCGGGCGCCA SEQ ID NO26GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAASEQ ID NO3GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA SEQ ID NO4GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG SEQ ID NO5GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGG SEQ ID NO6b)抗HSV-1，例如GCGGGGCTCCATGGGGGTCGSEQ ID NO7GGAGGATGCTGAGGAGG SEQ ID NO28GGAGGATGCTGAGG SEQ ID NO29CAGGAGGATGCTGAGGAGG SEQ ID NO30本發(fā)明的藥物也適用于治療腫瘤或再狹窄癥。例如，在這種情況下可使用對抗負責腫瘤發(fā)生或腫瘤生長之靶的序列(堿基序列)。這種靶例如是1)核癌蛋白質(zhì)如c-myc、N-myc、c-myb、c-fos、c-fos/jun、PCNA、P120，2)胞漿/膜相關癌蛋白質(zhì)如EJ-ras、c-Ha-ras、N-ras、rrg、bcl-2、cdc-2、c-raf-1、c-mos、c-src、c-abl，3)細胞受體如EGF受體、c-erbA、類視色素受體、蛋白質(zhì)激酶調(diào)節(jié)亞單位、d-fms，
4)細胞因子、生長因子、細胞外基質(zhì)如CSF-1、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、bFGF、成髓細胞素、纖連蛋白。
有對抗這種類型靶的活性的本發(fā)明的序列(堿基序列)例如是a)抗c-Ha-ras，例如CAGCTGCAACCCAGC SEQ ID NO8c)抗c-myc，例如GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC SEQ ID NO9AACGTTGAGGGGCAT SEQ ID NO10d)抗c-myb，例如GTGCCGGGGTCTTCGGGC SEQ ID NO11GTGCCGGGGTCTTCGGG SEQ ID NO27e)抗c-fos，例如GGAGAACATCATGGTCGAAGSEQ ID NO12CCCGAGAACATCATGGTCGAAG SEQ ID NO13GGGGAAAGCCCGGCAAGGGGSEQ ID NO14f)抗p120，例如CACCCGCCTTGGCCTCCCACSEQ ID NO15g)抗EGF受體，例如GGGACTCCGGCGAGCGC SEQ ID NO16GGCAAACTTTCTTTTCCTCCSEQ ID NO17h)抗p53腫瘤抑制因子，例如GGGAAGGAGGAGGATGAGG SEQ ID NO18GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG SEQ ID NO19
i)抗bFGF，例如GGCTGCCATGGTCCC SEQ ID NO31本發(fā)明的藥物進一步適于如治療受整聯(lián)蛋白或細胞-細胞粘附受體，例如VLA-4、VLA-2、ICAM或ELAM的影響所致的疾病。
有抗這種類型靶的活性的本發(fā)明的序列(堿基序列)例如是a)VLA-4，例如GCAGTAAGCATCCATATC SEQ ID NO20b)ICAM，例如CCCCCACCACTTCCCCTCTCSEQ ID NO21CTCCCCCACCACTTCCCCTCSEQ ID NO22GCTGGGAGCCATAGCGAGG SEQ ID NO23c)ELAM-1，例如ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG SEQ ID NO24CAATCAATGACTTCAAGAGTTC SEQ ID NO25本發(fā)明的藥物還適于如治療由如因子a-TNF誘發(fā)的疾病。
有抗這種類型靶活性的本發(fā)明的序列(堿基序列)例如是a)a-TNF，例如TCATGGTGTCCTTTGCAGCC SEQ ID NO32TCATGGTGTCCTTTGCAGSEQ ID NO33該藥物可以以藥物制劑的形式使用，其可例如表皮或口服給藥，如以片劑、包衣片劑、硬或軟明膠膠囊、溶液、乳劑或懸液形式給藥。它們可以經(jīng)直腸，例如以栓劑形式給藥，或者例如以注射溶液的形式經(jīng)胃腸道外給藥。為了生產(chǎn)藥物制劑，可將這些些化合物配制在治療上呈惰性的有機或無機賦形劑中。用于片劑、包衣片劑及硬明膠膠囊的這種賦形劑的例子是乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石和硬脂酸或其鹽。用于生產(chǎn)溶液的適當?shù)馁x形劑是水、多元醇、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖和葡萄糖。用于生產(chǎn)注射液的適當?shù)馁x形劑是水、醇、多元醇、甘油和植物油。用于生產(chǎn)栓劑的適用的賦形劑是植物油和硬化油、石蠟、脂肪和半液態(tài)多元醇。藥物制劑也可含防腐劑、溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香味劑、改變滲透壓的鹽、緩沖劑、包衣組合物、抗氧化劑、以及必要時還會有其他治療活性化合物。
優(yōu)選的給藥方法是口服給藥。進一步的優(yōu)選給藥方法是注射。為此，可將反義寡核苷酸配制成溶液，較好是在生理上可接受的緩沖液如Hank氏溶液或Ringer氏溶液中配制。但根據(jù)本發(fā)明的治療活性化合物也可配制成固體形式，并在使用前溶解或懸浮之。全身給藥的優(yōu)選劑量是每天每公斤體重大約0.01mg到大約50mg。


圖1表示在10mM HEPES，20mMgCl2；1MNaCl；pH7.5中，在1當量(dA)9存在下〔PMENA-t9〕的紫外吸收度對溫度的曲線；圖2表示用凝膠遷移證明PMENA-DNA的結合。
序列表ACACCCAATTCTGAAAATGG SEQ ID NO1AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA SEQ ID NO2GTCGACACCCAATTCTGAAAATGGATAA SEQ ID NO3GCTATGTCGACACCCAATTCTGAAA SEQ ID NO4GTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTCCTG SEQ ID NO5GTCTCCGCTTCTTCTTCCTGCCATAGGSEQ ID NO6GCGGGGCTCCATGGGGGTCG SEQ ID NO7CAGCTGCAACCCAGCSEQ ID NO8GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC SEQ ID NO9AACGTTGAGGGGCATSEQ ID NO10GTGCCGGGGTCTTCGGGC SEQ ID NO11GGAGAACATCATGGTCGAAAG SEQ ID NO12CCCGAGAACATCATGGTCGAAG SEQ ID NO13GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG SEQ ID NO14CACCCGCCTTGGCCTCCCAC SEQ ID NO15GGGACTCCGGCGCAGCGC SEQ ID NO16GGCAAACTTTCTTTTCCTCC SEQ ID NO17GGGAAGGAGGAGGATGAGGSEQ ID NO18GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG SEQ ID NO19GCAGTAAGCATCCATATC SEQ ID NO20CCCCCACCACTTCCCCTCTC SEQ ID NO21CTCCCCCACCACTTCCCGTC SEQ ID NO22GCTGGGAGCCATAGCGAGGSEQ ID NO23ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG SEQ ID NO24CAATCAATGACTTCAAGAGTTC SEQ ID NO25GGTCCCTGTTCGGGCGCCASEQ ID NO26GTGCCGGGGTCTTCGGG SEQ ID NO27GGAGGATGCTGAGGAGG SEQ ID NO28GGAGGATGCTGAGG SEQ ID NO29CAGGAGGATGCTGAGGAGGSEQ ID NO30GGCTGCCATGGTCCCSEQ ID NO31TCATGGTGTCCTTTGCAGCC SEQ ID NO32TCATGGTGTCCTTTGCAG SEQ ID NO33
實施例1)N-(4-甲氧基三苯基甲氧基)乙基氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯1a)N-芴基甲氧基羰基-2-氨基乙醇將8.61g(0.141mol)2-氨基乙醇溶解在250ml二惡烷和150ml水中。于15-20℃，首先加入17.79g(0.212mol)NaHCO3，然后數(shù)次加入50g(0.148mol)芴基甲氧羰基-N-琥珀酰亞胺。將混合物于室溫下攪拌1小時，然后蒸發(fā)至干。使殘留物分配在二氯甲烷(DCM)和H2O之間，用Na2SO4干燥有機相并在真空下蒸發(fā)除去溶劑。殘留物加100ml乙醚攪拌，抽吸過濾產(chǎn)物并用水洗。產(chǎn)率為38.77g(97％)。MS(ES+)284.2(M+H)+；1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝3.05(dd，2H，CH2OH)；3.39(dd，2H，N＝CH2)；4.25(m，3H，Ar-CH-CH2)；4.61(t，1H，OH)；7.14-7.98(m，15H，Ar-H，NH).
1b)N-芴基甲氧基-2-氨基-1-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙烷于0℃用5.93g(45.93mmol)二異丙基乙胺(DIPEA)和10.91g(35.3mmol)4-甲氧三苯基甲基氯處理溶解于100ml無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10g(35.3mmol)N-芴基甲氧羰基-2-氨基乙醇(得自實施例1a)，于0℃攪拌1小時后再于室溫下攪拌1小時。蒸發(fā)反應混合物并使殘留物分配于DCM和飽和NaHCO3水溶液之間。水洗有機相并用Na2SO4干燥，再于空真下蒸發(fā)除去溶劑。為了純化產(chǎn)物，在硅膠上(首先正庚烷/乙酸乙酯(EA)/三乙胺(TEA)70∶29∶1，然后EA/TEA99∶1)層析之。產(chǎn)率為14.4g(73％)。MS(FAB)562.3(M+Li)+；1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.95(t，2H，CH2O-MMTr)；3.21(dd，2H，N-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；4.25(m，3H，Ar-CH-CH2)；4.61(t，1H，OH)；6.80-7.96(m，23H，Ar-H，NH).
1c)2-氨基-1-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙烷室溫下用6.55g(90mmol)二乙胺處理溶解于50ml無水DMF中的5.0g(9mmmol)N-芴基甲氧羰基-2-氨基-1-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙烷(得自實施例1b)并將混合物攪拌2小時。在硅膠上層析(首先正庚烷/EA/TEA 50∶49∶1，然后EA/甲醇/TEA 79∶20∶1)純化之。產(chǎn)率為2.96g(98.7％)。MS(ES+)340.3(M+Li)+；1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.75(t，2H，CH2O-MMTr)；2.93(dd，2H，N-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；6.83-7.47(m，14H，Ar-H).
1d)2-甲基亞氨基-1-(4-甲氧三苯基甲氧)乙烷(三聚體)冰冷卻下用1.08g(13.22mmol)37％甲醛處理溶解于10ml甲醇中的2.96g(8.9mmol)2-氨基-1-(4-甲氧基三苯甲氧基)乙烷(得自實施例1c)，并于室溫下攪拌4小時，形成粘性沉淀物。蒸發(fā)反應混合物，并在硅膠上層析(正庚烷/EA/TEA 50∶49∶1)純化所得殘留物。產(chǎn)率為1.7g(55％)。MS(FAB)1042.8(M+Li)+；1034.8(M-H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.60(t，6H，O-CH2)；2.99(t，6H，N-CH2)；3.69(s，9H，OCH3)；6.78-7.42(m，42H，Ar-H).1e)亞磷酸二(2-(4-硝基苯基)乙基)酯在氬氣環(huán)境下，將23，42g(0.1mol)亞磷酸二苯酯與33.43g(0.2mol)對硝基苯基乙醇于100℃加熱14小時，然后在硅膠上層析(正庚烷/EA 50∶50，然后EA/甲醇80∶20)純化之。產(chǎn)率55％。MS(FAB)403.1(M+Na)+；381.1(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝3.03(t，4H，Ar-CH2)；4.20(4H，dt，O-CH2)；6.71(d，J＝140Hz；1H，PH)；7.52(d，4H，Ar-H)；8.17(d，4H，Ar-H).
1f)N-(4-甲氧基三苯甲氧基)乙氨基甲膦酸二-(2-(對硝基苯基)乙基)酯將341mg(0.329mmol)2-甲亞氨基-1-(4-甲氧基三苯甲氧基)乙烷(三聚物)(得自實施例1d)加到溶解于2ml無水四氫呋喃(THF)中的500mg(1.32mmol)亞磷酸二(2-(4-硝基苯基)乙基)酯(得自實施例1e)中，并將混合物于80℃攪拌3小時。蒸發(fā)掉溶劑并將殘留物于100℃繼續(xù)攪拌30分鐘。在硅膠上層析(首先用EA/TEA 99∶1，然后用EA/甲醇/TEA 90∶9∶1洗脫)純化之。產(chǎn)率83％。MS(FAB)732.3(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.64-3.06(m，10H，Ar-CH2+P-CH2+CH2-OMMTr+N-CH2)；3.73(s，3H，OCH3)；4.16(dt，4H，PO-CH2)；6.78-8.08(m，22H，Ar-H).
2)N-(N6-甲氧苯酰)胞嘧啶)-1-基-乙酰-N-(4-甲氧基三苯甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)
酯2a)將0.952g(8.27mmol)N-乙基嗎啉(NEM)、0.834g(2.76mmol)(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酸和1.153g(3.03mmol)O-(7-氮雜)苯并三唑-1-基四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU，L.Carpino，J.Am.Chem.Soc.1993，115，4397)加到溶解于60ml無水DMF中的2.00g(2.76mmol)N-(4-甲氧基三苯甲氧基)乙氨基甲磷酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(得自實施例1f)中，并將混合物于室溫攪拌12小時。然后再一次加入同樣量的HATU并將混合物繼續(xù)室溫攪拌3小時。在硅膠上層析(DCM/甲醇/TEA95∶4∶1)以純化之。產(chǎn)率為2.7g(97％)。MS(ES+)1012.0(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.94(t，4H，P-O-CH2-CH2-Ar)；3.06(t，2H，MMTr-O-CH2)；3.23-3.63(m，4H，P-CH2+N-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；3.83(s，3H，OCH3)；4.10(dt，4H，P-O-CH2)；4.79(s，寬峰，2H，CO-CH2)；6.80-8.18(m，28H，Ar-H，胞嘧啶基-H)；11.03(s，寬峰1H，NH).
2b)制備如實施例2a中所述的混合物，但用O-(氰基(乙氧基羰基)亞甲氨基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TOTU，EP 0 460 446)代替HATOc產(chǎn)率為57％。光譜數(shù)據(jù)見實施例2a。
3)N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸(2-(對硝基苯基)乙基)單脂(三乙銨鹽)將1g(0.99mmol)N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(得自實施例2)溶解于20ml 1，8-二氮雜雙環(huán)〔5.4.0〕十一碳-7-烯(DBU)在無水乙腈中制成的0.1M溶液中，并將混合物室溫攪拌4小時。使反應混合物分配于DCM和KH2PO4水溶液(pH7)之間，用Na2SO4干燥有機相并真空蒸發(fā)掉溶劑。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 70∶29∶1)純化殘留物。產(chǎn)率為540mg(57％)。MS(FAB)906.5(M-H+2Na)+；884.6(M+Na)+；862.5(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝3.00(m，4H，P-O-CH2-CH2-Ar+MMTr-O-CH2)；3.38-3.60(m，4H，P-CH2+N-CH2)；3.73(s，3H，OCH3)；3.82(s，3H，OCH3)；4.01(dt，2H，P-O-CH2)；4.79&5.03(每種情況下s，寬峰，2H，CO-CH2)；6.78-8.20(m，24H，Ar-H，胞嘧啶基-H)；11.00(s寬峰，1H，NH).
4)N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)乙氨基-甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯將1.00g(0.99mmol)N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙?；?N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(得自實施例2)溶解于80ml80％乙酸水溶液中，并將所得溶液室溫攪拌4小時。蒸發(fā)掉溶劑并將殘留物與苯共蒸發(fā)兩次。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 85∶14∶1)以純化之。產(chǎn)率為522mg(71％)。MS(FAB)761.2(M+Na)+；739.3(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.98(t，4H，P-O-CH2-CH2-Ar)3.38-3.67(m，4H，N-CH2CH2-OH)；3.80-3.89(m，2H，P-CH2)；3.91(s，3H，OCH3)；4.12(dt，4H，P-O-CH2)；4.78 & 4.87(每種情況下s，寬峰，2H，CO-CH2)；6.98-8.19(m，14H，Ar-H，胞嘧啶基-H)；11.02(s，寬峰，1H，NH).
5)5′-MMTr-CAn(P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2按與實施例7相似的方法，從N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸(2-(對硝基苯基)乙基)單酯(三乙銨鹽)(實施例3)和N-(N6-甲氧苯甲酰)-胞嘧啶-1-基-乙?；?N-(2-羥基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(實施例4)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 85∶14∶1)純化該化合物。產(chǎn)率73％。MS(FAB)1605(M+Na)+；1583(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.94-3.18(m，6H，P-O-CH2-CH2-Ar)3.26-3.95(m，10H)；3.75(s，3H，OCH3)；3.85(s，6H，OCH3)；3.99-4.36(m，8H，P-O-CH2)；4.75-4.92(m，寬峰，4H，CO-CH2)；6.83-8.18(m，38H，Ar-H，胞嘧啶基-H)；10.98&11.03(每種情況下s，寬峰，2H，NH).
6)5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2按實施例4的相似方法從“5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2”(實施例5)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 85∶14∶1)純化該化合物。產(chǎn)率為74％。
MS(FAB)1332.4(M+Na)+；1310.3(M+H)+；7)N-(4-甲氧基三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二乙酯按實施例1f的相似方法，但使用亞磷酸二乙酯進行合成。產(chǎn)率為87.5％。MS(FAB)490.2(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.22(t，6H，CH2-CH3)；2.80(t，2H，N-CH2)；2.91(d，J＝12.5Hz，2H，P-CH2)；3.02(t，2H，CH2-OMMTr)；3.75(s，3H，OCH3)；4.01(dq，4H，PO-CH2)；6.84-7.45(m，14H，Ar-H).
8)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧基三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二乙酯將570.3mg(4.22mmol)羥基苯并三唑(HOBT)、972.1mg(8.44mmol)NEM、777mg(4.22mmol)胸腺嘧啶-1-基-乙酸和639mg(5.06mmol)二異丙基碳二亞胺加入溶解于50ml無水DMF中的2.04g(4.22mmol)-N-(4-甲氧基三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例7)的溶液內(nèi)。將混合物室溫攪拌16小時。蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶解在DCM中并用飽和NaHCO3水溶液提取該溶液，然后再用NaCl水溶液飽和之。用Na2SO4干燥提取物并蒸發(fā)除掉溶劑。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA98∶2∶1)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為2.47g(90％)。MS(FAB)662.3(M+Na)+； 656.3(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.12-1.32(m，6H，CH2-CH3)；1.68 & 1.75(每種情況下s，3H，T-CH3)；3.10-3.40(m，2H，CH2-OMMTr)；3.53-3.70(m，4H，P-CH2+N-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；3.83-4.16(m，4H，PO-CH2)；4.62 & 4.72(每種情況下s，2H，CO-CH2)；6.83-7.42(m，15H，Ar-H，T-H)；11.28(s，1H，NH).
9)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸單乙酯(三乙銨鹽)將811mg(1.25mmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例8)懸浮在3.75ml 1N NaOH中。將混合物于室溫下攪拌3小時，然后于50℃攪拌6小時，在真空下濃縮反應混合物并在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 100∶10∶10，然后100∶40∶10)純化殘留物。產(chǎn)率為897mg(99.5％)。MS(ES-)620.4(M-H)-.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.18(t，9H，N-CH2-CH3)；1.68 & 1.74(各情況下s，3H，T-CH3)；2.96-3.08(q，6H，N-CH2-CH3)；3.35(m，2H，N-CH2)；3.43-3.70(d，J＝11Hz，2H，P-CH2)；3.63(t，2H，CH2-OMMTr)；3.75(s，3H，OCH3)；3.78(dq，2H，PO-CH2)；4.60 & 4.86(各情況下s，2H，CO-CH2)；6.82-7.41(m，15H，Ar-H，T-H)；11.24(s，1H，NH).
10)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)-乙氨基甲膦酸二乙酯按實施例4的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例8)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇90∶10)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率80％。MS(FAB)400.1(M+Na)+；378.1(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.17-1.32(m，6H，CH2-CH3)；1.78(s，3H，T-CH3)；3.40-3.69(m，4H，CH2-OH+N-CH2)；3.89(d，J＝11Hz，2H，P-CH2)；3.92-4.19(m，4H，PO-CH2)；4.70(s，2H，CO-CH2)；4.98(t，1H，OH)；7.22 & 7.30(各情況下s，1H，T-H)；11.25(s，1H，NH).
11)N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二苯酯按實施例1f)的方法進行合成，但其中使用的是亞磷酸二苯酯。產(chǎn)率100％。
MS(FAB)58.2(M+Li)+。
12)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸單苯酯(三乙銨鹽)按實施例9)的相似方法從N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨甲膦酸二苯酯(實施例11)和胸腺嘧啶-1-基-乙酸進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA/H2O 90∶10∶5∶0.5)純化該產(chǎn)物。產(chǎn)率47％。MS(FAB)682.3(M+2Li-H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.16(t，9H，N-CH2-CH3)；1.67 & 1.72(各情況下s，3H，T-CH3)；2.96-3.70(m，12H，N-CH2-CH3+N-CH2+P-CH2+CH2-OMMTr)；3.75(s，3H，OCH3)；4.58 & 4.88(各情況下s，2H，CO-CH2)；6.74-7.46(m，20H，Ar-H，T-H)；11.23(s，1H，NH).
13)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸苯基酯4-硝基苯基乙基酯用無水吡啶將385.4mg(0.5mmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基乙氨基甲膦酸單苯酯(三乙銨鹽)(實施例12)和92mg(0.55mmol)4-硝基苯乙醇共蒸發(fā)三次，然后溶解于15ml無水吡啶中。于0℃加入403.4mg(0.15mmol)3-硝基-1-(對甲苯磺酰基)-1H-1，2，4-三唑(TSNT)，然后于0-5℃將混合物攪拌16小時，真空下蒸餾除去吡啶，將殘留物重新溶解于EA中，并先用飽和NaHCO3水溶液、再用NaCl溶液連續(xù)洗滌該所得溶液。在硅膠上層析(EA/TEA100∶2)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為162mg。
MS(FAB)831.3(M+2Li-H)+；(M+Li)+。
14)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯按實施例8的相似方法從N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(實施例1f)和胸腺嘧啶-1-基-乙酸進行合成。產(chǎn)率63％。MS(ES+)898.4(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.65 & 1.72(每種情況下s，3H，T-CH3)；2.96(t，4H，P-O-CH2-CH2-Ar)；3.06(t，2H，N-CH2)；3.67(d，J＝11Hz，2H，P-CH2)；3.70(m，2H，MMTr-O-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；3.83(s，3H，OCH3)；4.10(dt，4H，P-O-CH2)；4.59 & 4.62(每種情況下s，寬峰，2H，CO-CH2)； 6.83-8.18(m，23H，Ar-H，T-H)；11.30(s，寬峰，1H，NH).
15)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸4-硝基苯基乙基單酯(三乙銨鹽)15a)從30mg N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸苯基酯4-硝基苯乙酯(實施例13)合成將30mg N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸苯基酯4-硝基苯乙酯(實施例13)溶解于1ml TEA、1ml二噁烷和80mg對硝基苯甲肟的混合物中，并將所得溶液室溫攪拌3小時。真空蒸除溶劑并將殘留物與吡啶其蒸發(fā)3次，再與甲苯共蒸發(fā)2次。在硅膠上層析(EA/TEA 100∶2，然后EA/甲醇/TEA60∶40∶2)純化殘留物。產(chǎn)率為23mg。MS(FAB)755.3(M+2Li-H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.15(t，9H，N-CH2-CH3)；1.60 & 1.79(m，3H，T-CH3)；2.80-3.60(m，14H，N-CH2-CH3+N-CH2+P-CH2+CH2-OMMTr+Ar-CH2)；3.73(s，3H，OCH3)；4.01(dt，2H，P-O-CH2)；4.58-4.92(m，2H CO-CH2)；6.82-8.18(m，19H，Ar-H，T-H)；11.30(s，1H，NH).
15b)從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(實施例14)合成按實施例3的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(實施例14)開始合成。但其中使用吡啶作為溶劑。產(chǎn)率82％。光譜數(shù)據(jù)見實施例15a。
16)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸按實施例15b的相似方法進行合成。以18％的產(chǎn)率得到作為副產(chǎn)物的N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸。
MS(ES-)592.2(M-H)-。
17)5′-MMTr-T-P(O-乙基)-T-P(O-乙基)2將361mg(0.5mmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸單乙酯(三乙銨鹽)(9)和188.7mg(0.5mmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-羥基)-乙氨基甲膦酸二乙酯(10)與無水吡啶一起共蒸發(fā)2次，然后溶解于10ml無水吡啶中。于5-10℃加入1.5mmolTSNT并將混合物于室溫下攪拌16小時。真空蒸發(fā)除掉吡啶，將殘留物溶解于EA中，依次用Na2HCO3飽和水溶液和NaCl溶液連續(xù)洗滌所得溶液。用Na2SO4干澡后濃縮并在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA92∶8∶2)純化該殘留物。產(chǎn)率為223mg(46％)。MS(FAB)987.5(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H & 胸腺嘧啶-H6.82-7.43(m，16H)；CO-CH24.59-4.78(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.63-1.80(m，6H).
18)5′-HO-T-P(O-乙基)-T-P(O-乙基)2按實施例4的相似方法從5′-MMTr-T-P(O-乙基)-T-P(O-乙基)2(實施例17)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA85∶15∶2，然后改為100∶50∶1.5)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為95％。MS(FAB)731.2(M+Na)+709.1.(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是胸腺嘧啶-H7.21-7.36(m，2H)；CO-CH24.60-4.76(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.63-1.79(m，6H).
19)5′-MMTr-T-P(O-苯基)-T-P(O-乙基)2按實施例17的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)-乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例10)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸單苯酯(三乙銨鹽)(實施例12)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 93∶7∶2)純化產(chǎn)物。產(chǎn)率58％。MS(FAB)1051.4(M+Na)+；1029.5(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H&胸腺嘧啶-H6.82-7.53(m，21H)；CO-CH24.52-4.82(m，4R)；胸腺嘧啶-CH31.62-1.80(m，6H).
20)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥乙基)氨基甲膦酸二(4-硝基苯基乙基)酯按實施例4的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇90∶10)純化產(chǎn)物。產(chǎn)率為85％。MS(ES+)620.3(M+H)+.1H-NMR(500MHz，DMSO，TMS)δ＝1.73(s，3H，T-CH3)；2.97(t，4H，P-O-CH2-CH2-Ar)；3.41(m，2H，N-CH2)；3.59(m，2H，CH2-OH)；3.83(d，2H，J＝11Hz；P-CR2)；4.08-4.30(m，4H，P-O-CH2)；4.54 & 4.78(每種情況下s，寬峰，2H，CO-CH2)；4.99(t，1H，OH)；7.14-8.19(m，9H，Ar-H，胸腺嘧啶-H)；11.30(s，寬峰，1H，NH).
21)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(O-乙基)2
按實施例17的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例10)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)進行合成。用3-硝基-1-(2，4，6-三異丙基苯磺酰)-1H-1，2，4-三唑(TIPSNT)代替TSNT進行偶聯(lián)。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA95∶5∶2，然后改為90∶10∶2)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率＞90％。MS(ES+)1109.0(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H & 胸腺嘧啶-H6.82-8.18(m，20H)；CO-CH24.51-4.76(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.61-1.78(m，6H).
22)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例21的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例10)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)進行合成。利用3-硝基-1-(2，4，6-三異丙基苯磺酰)-1H-1，2，4-三唑(TIPSNT)代替TSNT進行偶聯(lián)。產(chǎn)率＞90％。
光譜數(shù)據(jù)見實施例21。
23)5′HO-T-P(ONPE)T-P(OEt)2按實施例4的相似方法A從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例22)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA90∶10∶2，然后是80∶20∶2)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為75％。MS(ES+)836.3(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是 Ar-H & 胸腺嘧啶-H7.11-8.22(m，6H)；CO-CH24.55-4.77(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.71(s，寬峰，6H).24)5′-HO-T-P(OH)-T-P(O-乙基)2將10mg(0.012mmole)“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例23)溶解在DBU在吡淀中制成的1ml 0.5M溶液內(nèi)并先于4℃攪拌24小時，然后于室溫攪拌24小時。真空下蒸發(fā)除去溶劑，用戊烷消化殘留物兩次，然后再用乙醚消化兩次。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 9∶1∶0.2，然后是70∶30∶2，再后是60∶40∶2)純化合成產(chǎn)物。產(chǎn)率10.2mg。MS(FAB)725.3(M+2Na-H)+；703.3(M+Na)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是胸腺嘧啶-H7.15-7.70(m，2H)；CO-CH24.67-4.92(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.67-1.81(m，6H).
25)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例17的相似方法在5′-HO-T-P(ONPE)T-P(OEt)2(實施例22)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)中加入1.5當量基于實施例23)N-氧化-4-甲氧基吡啶進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 90∶10∶2，然后85∶15∶2)純化產(chǎn)物。產(chǎn)率61％。MS(ES+)1555.8(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H & 胸腺嘧啶-H6.83-8.20(m，25H)；CO-CH24.52-4.75(m，6H)；胸腺嘧啶-CH31.61-1.78(m，9H).
26)5 ′HO-T-P(ONPE)T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按與實施例4相似的方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例25)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 70∶30∶2)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為89％。
MS(ES+)1283.1(M+H)+；1305.0(M+Na+)。
27)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按與實施例17相似的方法在“5′-HO-T-P(ONPE)T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例26)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)中加入1.5當量(基于實施例23)N-氧化-4-甲氧基吡啶進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA90∶10∶2，然后80∶20∶2)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率15％。MS(ES+)2007(M+H)+；2029(M+Na)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H & 胸腺嘧啶-H6.79-8.21(m，30H)；CO-CH24.53-4.87(m，8H)；胸腺嘧啶-CH31.58-1.89(m，12H).
28)5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例4所述的相似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例27)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA70∶30∶2)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為55％。
MS(FAB)1735(M+H)+；1757(N+Na)+。
29)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2按實施例17所述的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥乙基)氨基甲膦酸二(4-硝基苯基乙基)酯(實施例20)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 100∶10∶1，然后90∶10∶1)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為87％。MS(FAB)1356.2(M+2Li-H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H & 胸腺嘧啶-H6.82-8.18(m，28H)；CO-CH24.50-4.71(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.59-1.78(m，6H).
30)5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2按實施例4所述相似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2”(實施例20)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA85∶15∶1，然后80∶20∶1)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為78％。MS(ES+)1072.7(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)特征性信號是Ar-H & 胸腺嘧啶-H7.08-8.20(m，14H)；CO-CH24.52-4.80(m，4H)；胸腺嘧啶-CH31.70(s，寬峰，6H).
31)5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2按實例17的相似方法從N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸2-(對硝基苯基)乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例3)和“5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2”(實施例6)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶19∶1)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率66％。
MS(FAB)2155(M+H)+；2161(M+Li)+；2177(M+Na)+。
32)5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2按實施例4的相似方法從5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2(實施例31)進行合成。在硅凝膠上層析(EA/甲醇/TEA 85∶15∶1，然后80∶20∶1)純化所得合成產(chǎn)物。產(chǎn)率為70％。
MS(FAB)1882(M+H)+；1904(M+Na)+。
33)N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸烯丙基酯2-(對硝基苯基)乙基酯按實施例17的相似方法從N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸烯丙基酯2-(對硝基苯基)乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例3)和烯丙醇進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA95∶5∶1)以純化合成的產(chǎn)物。MS(ES+)902.1(M+H)+；924.1(M+Na)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.94-3.70(m，8H，P-O-CH2-CH2-Ar+MMTr-O-CH2+N-CH2+P-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；3.86(s，3H，OCH3)；4.10-4.60(m，4H，P-O-CH2)；4.79 & 4.84(各情況下s，寬峰，2H，CO-CH2)；5.09-5.39(m，2H，H2C＝CH-)；5.71-6.00(m，1H，H2C＝CH-)；6.83-8.19(m，24H，Ar-H，胞嘧啶基-H)；11.03(B，寬峰，1H，NH).
34)N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-羥基)乙氨基甲膦酸烯丙基酯2-(對硝基苯基)乙酯按實施例4的相似的方法從N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸烯丙酯2-(對硝基苯基)乙酯(實施例33)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 94∶5∶1)純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率為83％。MS(ES+)630.2(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝3.02(t，2H，P-O-CH2-CH2-Ar)；3.37-3.72(m，4H，HO-CH2-CH2)；3.86(s，3H，OCH3)；3.91(d，J＝11Hz，2H，P-CH2)；4.22(dt，2H，P-O-CH2-CH2-Ar)；4.40(dd，2H，O-CH2-CH＝CH2)；4.78 & 501(m，2H，CO-CH2)；5.11-5.33(m，2H，H2C＝CH-)；5.71-6.00(m，1H，H2C＝CH-)；6.99-8.21(m，14H，Ar-H，胞嘧啶基-H)；11.03(s，寬峰，1H，NH).
35)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸烯丙基酯2-(對硝基苯基)乙基酯按實施例17的相似的方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸4-硝基苯基乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)和烯丙醇進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 97∶3∶20以純化的合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率為100％。
MS(FAB)805.3(M+Na)+。
36)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)乙氨基膦酸2-(對硝基苯基)乙酯按實施例4的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧苯)乙氨基甲膦酸烯丙酯2-(對硝基苯基)乙基酯(實施例35)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA90∶10∶2)純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率為86％。
MS(ES+)511.1(M+H)+。
37)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)按實施例17的相似方法從N-胸腺嘧啶-1基-乙酰-N-(2-羥基)-乙氨基甲膦酸烯丙酯2-(對硝基苯基)乙基酯(實施例36)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧苯)乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 90∶10∶2)以純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率為90％。
MS(FAB)1257.3(M+Na)+。
38)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例17的相似方法從“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例28)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙?；?N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙按鹽)(實施例15)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶20∶2)以純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率57％。
MS(FAB)2460(M+H)+；2482(M+Na)+。
39)5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例4的相似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例38)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA70∶30∶2)以純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率為55％。
MS(FAB)2209(M+Na)+。
40)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2將4.0mg(0.00183mmol)“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例39)溶解在DBU在吡啶中制成的1.1ml 0.5M溶液中并于室溫下攪拌24小時。真空蒸發(fā)反應混合物并將殘留物與甲苯一起攪拌幾次。使用注射器除去溶劑，并用戊烷再次攪拌殘留物，再次使用注射器除去溶劑。真空中干燥產(chǎn)物。所得強吸溫粉末的產(chǎn)率為4mg。
MS(ES-)1589.7(M-H)-；1611.8(M+Na-2H)-。
41)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2a)按實施例17的相似方法從“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例39)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙碳基-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸4-硝基苯基乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶20∶2，然后改為70∶30∶2)以純化所合成的產(chǎn)物。
MS(FAB)2934(M+Na)+，2957(M+2Na-H)+，2978(M+3Na-2H)+。
b)按實施例17的相似方法從“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例28)和“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)”(實施例42)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 80∶20∶2，然后為70∶30∶2)以純化所合成的產(chǎn)物。在真空下蒸發(fā)除去溶劑得目標部分，然后加戊烷和乙醚研制之。MS檢測結果同上。
42)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)將24.7mg(0.02mmol)“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)(實施例37)連同16.2mg(0.12mmol)二乙銨碳酸氫鹽溶解于2ml無水DCM中。在15-20℃，在2分鐘期間內(nèi)滴加13.9mg(0.012mmol)四(三苯基膦)鈀(0)和2.1mg(0.008mmol)三苯膦在2ml無水DCM中制成的溶液。室溫下將混合物攪拌30分鐘。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 80∶20∶1，然后60∶40∶1)上述反應混合物以純化所需產(chǎn)物。在真空下蒸發(fā)產(chǎn)物部分并先用戊烷、再用EA/乙醚、然后用戊烷研磨殘留物并在真空中干燥之。產(chǎn)率57％。MS(ES-)1193.6(M-H)-.1H-NMR(200MMz，DMSO，TMS)特征性信號δ＝1.67 & 1.72(每種情況下s，3H，T-CH3)；4.60 & 4.82(每種情況下s，2H，CO-CH2)；6.83-8.19(m，24H，Ar-H，T-H)；
43)5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例4的類似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例41)進行合成。反應發(fā)生后濃縮反應混合物，將殘留物與甲苯共蒸發(fā)3次，然后先與EA/乙醚、再與戊烷一起攪拌。在真空中干燥殘留物。
MS(FAB)2662(M+Na)+。
44)5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)按實施例4的方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)”(實施例37)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 90∶10∶1，然后改為80∶20∶1)純化所需產(chǎn)物。產(chǎn)率為87％。
MS(EAB)963.0(M+H)+；985.1(M+Na)+。
45)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)a)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)按實施例17的相似方法從“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)”(實施例44)和N-胸腺嘧啶-1-基-乙?；?N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 90∶10∶1，然后改為85∶15∶1)純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率55％。
b)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)按實施例42中所述使“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(O-烯丙基)”(實施例45a)與四(三苯膦)-鈀(0)反應。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 80∶20∶2，然后70∶30∶2)以純化產(chǎn)物。在真空中蒸發(fā)產(chǎn)物物部分，并加戊烷和乙醚研磨殘留物。產(chǎn)率98％。
MS(ES+；LiCl)1654.1(M+Li+)。
46)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例17的相似方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙?；?N-(2-羥基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例10)和“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)”(實施例45b)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA90∶10∶2，然后80∶20∶2)純化該產(chǎn)物。加工、純化和特征鑒定同實施例27中所述。
47)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例17的相似方法從“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P-(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例26)和“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)”(實施例45b進行合成。在硅凝膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶20∶2)純化所合成的產(chǎn)物。真空下蒸發(fā)產(chǎn)物部分，與甲苯共蒸發(fā)并用制備型HPLC(高壓液相層析法)純化之RPS LiChrospher 60，水/乙腈1∶1；0.1％乙酸銨；1ml/分鐘。Rf＝12.97分鐘。
48)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-P(OH)T-P(OEt)2a)5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例4的相似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPT)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例47)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 70∶30∶2，然后改為60∶40∶2)以純化所合成的產(chǎn)物。在真空蒸發(fā)產(chǎn)物部分，先加戊烷，再加乙醚攪拌殘留物，并真空干燥之。產(chǎn)率100％。
MS(FAB)2662(M+Na)+，2684(M+2Ma-H)+，2706(M+3Na-2H)+。
b)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2使“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(0NPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2(實施例48a)與DBU反應并按實施40所述相似方法處理。
MS(ES-)1892(M-H-)；1915(M+Na-ZH)-49)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例17的相似方法從“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(OHPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例28)和“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)”(實施例45b)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶20∶2，然后為70∶30∶2)以純化所得產(chǎn)物。真空下蒸發(fā)產(chǎn)物部分，與甲苯共蒸發(fā)并用制備型HPLC純化之RP8 LiChrospher60，水/乙腈1∶1；0.1％乙酸銨；1ml/分鐘。Rf＝15.24分鐘。
MS(FAB)3386(M+Na)+，3409(M+2Na-H)+。
50)5′-OH-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P-(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按實施例4的相似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例49)進行合成。為純化該產(chǎn)物，真空中蒸發(fā)并與甲苯共蒸發(fā)3次，先加戊烷再加乙醚攪拌殘留物，并真空干燥。產(chǎn)率＞90％。
MS(FAB)3114(M+Na)+。
51)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2使“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例50)與DBU反應并按實施例40的相似方法處理。
MS(ES-)2196(M-H-)-；2218(M+Na-2H)-。
52)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按與實施例17相似的方法從“5’-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例48a)和“5 ′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OHPE)(OH)”(實施例45b)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/EA 70∶30∶2，然后是60∶40∶2)以純化合成的產(chǎn)物。真空干燥產(chǎn)物部分，與甲苯共蒸發(fā)并用制備型HPLC純化之RP8 LiChrospher 60，水/乙腈1∶1；0.1％乙酸銨；1ml/分鐘。Rf＝23.95分鐘。
53)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)LTLP(OH)-T-P(OEt)2a)5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2按與實施例4相似的方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例52)進行合成。為了純化產(chǎn)物，在真空中蒸發(fā)并與甲苯共蒸發(fā)3次，殘留物先與戊烷再與乙醚一起攪拌，并真空干燥。產(chǎn)率＞90％。
b)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2
使“5′-HO-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(OEt)2”(實施例53a)與DBU反應并按實施例40所述相似方法進行處理。
MS(ES-)2802(M-H-)-；2825(M+Na-2H)-。
54)2-(N′-叔丁氧基羰基氨基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯a)1-甲基亞氨基-2-(N′-叔丁氧基羰基氨基)乙烷(三聚體)冰冷卻下用1.5ml(18.72mmol)37％甲醛處理溶解于8ml甲醇中的2.0g(12.5mmol)2-氨基-1-(N′-叔丁氧基羰基氨基)乙烷，并將混合物室溫攪拌/1小時。將殘留物重新溶解于EA中，先用飽和NaHCO3溶液洗兩次再用NaCl溶液洗，干燥后過濾并真空蒸發(fā)。在硅膠上層析(EA/TEA 100∶0.2，然后改為EA/甲醇/TEA 90∶10∶0.2)。產(chǎn)率為0.8g。MS(FAB/LiCl)523.4(M+2Li-H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.38(s，27H，tBu-H)；2.40(t，6H，N-CH2)；2.99(t，6H，N-CH2)；3.25(t，6H，N-CH2)；6.81(t，寬峰，3H，NH).
b)2-(N′-叔丁氧基羰基氨基)乙氨基甲膦酸2-二(2-(對硝基苯基)乙基)酯按照與實施例1f相似的方法使1-甲基亞氨基-2-(N′-叔丁氧基羰基氨基)乙烷(三聚物)(實施例54a)與二(2-(4-硝基苯基))乙基)亞磷酸酯(實施例1e)反應。在硅膠上層析(首先甲苯/EA/TEA 20∶80∶0.2；然后EA/TEA 100∶0.2；最后EA/甲醇/TEA0.5∶5∶0.2)。產(chǎn)率為25％。MS(ES+/LiCl)553.3(M+H)+，559.3 M+Li)+，1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.37(s，9H，tBu-H)；2.83(d，J＝12Hz，2H，P-CH2)；2.55(t，4H，Ar-CH2)；2.90-3.09(m，4H，N-CH2-CH2-N)；4.16(dt，4H，PO-CH2)；7.52 & 8.15(每種情況下d，8H，Ar-H).
55)N-胸腺嘧啶-1-基-乙?；?N-(2-N′-叔丁氧基羰基氨基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯按實施例8相似的方法從2-(N′-叔丁氧基羰基氨基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯和胸腺嘧啶-1-基-乙酸進行合成。產(chǎn)率86％。MS(FAB/LiCl)725.3(M+Li)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝1.42(s，9H，tBu-H)；1.91(s，3H，T-CH3)；2.99-3.58(m，8H，P-O-CH2-CH2-Ar & N-CH2-CH2-N)；3.75(d，J＝12Hz，2H，P-CH2)；4.06-4.38(m，4H，PO-CH2)；7.37 & 8.15(每種情況下d，8H，Ar-H).
56)與DNA相互作用UV熔化曲線以實例方式，通過記錄“5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2”(實施例53b)與(dA)9的UV熔化曲線以證明本發(fā)明的化合物與互補核酸的相互作用。為此，在各情況下均在1ml緩沖液(1mM NaCl、20mMMgCl2、10mM HEPES、pH7.5)中制備0.3 OD的“5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P-(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2”和(dA)9，并記錄作為溫度(0到80℃)函數(shù)的260nm的消光改變。結果可在圖1中看出。根據(jù)所得到的熔化曲線確定Tm值為約23℃。
57)與DNA的值互作用凝膠遷移實驗在凝膠遷移實驗中將“5′-HO-T-P(OH)-T-P-(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2”(實施例53b)和(dA)9雜交，以實例證明本發(fā)明的化合物與互補核酸的相互作用，每種情況下均將以上兩物質(zhì)自身或它們的1∶1、1∶2、1∶5及1∶10的混合物加于非變性聚丙烯酰胺凝膠(20％，電泳緩沖液1×TBE，10mM MgCl2)上并確定電泳遷移。結果可從圖2中看出(dA)9遷移比“5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2”快，在1∶1混合物中兩者只能微弱可見，而代之以形成一條相當于兩成分間的復合物的較慢的帶。在2∶1混合物中，不再能看到(dA)9，而新帶是更加清楚。5∶1或10∶1混合物也是這種情況，其中另外可測到明顯過量的“5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OEt)2”。
58)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(O-乙基)2(還參見實施例21，另一種合成方法)a)將8.44mg(10μmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例15)、3.77mg(10μmol)N-胸腺嘌呤-1-基-乙酰-N-(2-羥基)乙氨基甲膦酸二乙酯(實施例10)和64.6mg(500μmol)N-乙基二異丙基胺(DIPEA)溶解于0.3ml無水DMF中。向其中加入44.2mg(100μmol)(苯并三唑基氧基)三(二甲氨基)鏻六氟磷酸鹽(BOP)。室溫下將混合物攪拌24小時。根據(jù)TLC(EA/甲醇/TEA 100∶20∶2；Rf＝0.5)產(chǎn)率約為70％b)按照實施例58a的相似方法合成，但使用30μmol HATU(O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽代替100μmol BOP。根據(jù)TLC產(chǎn)率約為65％。
59)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸2-(對硝基苯基)乙基酯5’-〔3’-(4-氧代戊酰)〕胸腺嘧啶酯按照實施例17的方法從N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸4-硝基苯乙基單酯(三乙銨鹽，實施例15)和3′-(4-氧代戊酰)胸腺嘧啶進行合成。在硅膠上層析(DCM/甲醇/TEA 98∶2∶0.25)純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為46％。
MS(FAB/LiCl)1071.4(M+Li)+。
60)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸2-(對硝基苯基)乙基5′-胸腺嘧啶二酯將64mg(0.06mmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧苯)乙氨基甲膦酸2-(對硝基苯基)乙基酯5′-〔3′-(4-氧代戊酰)〕胸腺嘧啶酯(實施例59)溶解在0.5ml二惡烷中。加入溶于0.12ml水中的9mg(0.23mmol)NaBH4并將混合物于室溫下攪拌20分鐘。真空除去溶劑。將殘留物重新溶解于DCM中并用水提取所得溶液，然后于燥之。在硅膠上層析(DCM/甲醇/TEA 92∶8∶0.5)以純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率為72％。MS(FAB/LiCl)973.4(M+Li)+，979.4(M+2Li-H)+，985.4(M+3Li-2H)+.
61)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)-乙氨基甲膦酸2-(對硝基苯基)乙基酯5′-胸腺嘧啶脫氧核苷-3′-(N，N-二異丙基氨基磷酸氰乙酯)酯將31mg(0.032mmol)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸2-(對硝基苯基)乙基5′-胸腺嘧啶二酯(實施例60)與無水CH3CN共蒸發(fā)兩次并溶解于0.4ml無水THF中。先向其中加入12.4mg(0.096mmol)二異丙基乙基胺，再加入9.8mg(0.045mmol)氯代二異丙基氨基磷酸氰乙酯。將混合物攪拌3小時，過濾并真空蒸發(fā)。產(chǎn)率為63％。Ms(FAB/LiCl)1173.3(M+Li)+，1180.4(M+2Li-H)+，1186.4(M+3Li-2H)+.
62)N-〔N9-(O6-二苯基氨基甲?；?N2-乙酰鳥嘌呤〕乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯按實施例2的相似方法從N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基酯和O6-二苯基氨基甲?；?N2-乙酰鳥嘌呤乙酸進行合成。在硅膠上層析(EA/TEA98∶2)純化所合成的產(chǎn)物。產(chǎn)率87％。
MS(FAB/LiCl)1154.8(M+H)+，1160.7(M+Li)+。
63)N-〔N9-(N4-甲氧苯甲酰)腺嘌呤〕乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯按實施例2的相似方法從N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(實施例1f)和N4-甲氧苯甲酰腺嘌呤乙酸進行合成。在硅膠上層析(DCM/甲醇/TEA 95∶4∶1)純化合成產(chǎn)物。產(chǎn)率82％。
MS(ES+)1035.7(M+H)+.1H-NMR(200MHz，DMSO，TMS)δ＝2.93(t，4H，P-O-CH2-CH2-Ar)；3.09(t，2H，MMTr-O-CH2)；3.23-3.75(m，4H，P-CH2+N-CH2)；3.75(s，3H，OCH3)；3.87(s，3H，OCH3)；4.08(dt，4H，P-O-CH2)；5.28-5.42(m，2H，CO-CH2)；6.81-8.20(m，28H，Ar-H，A-H)；11.00(s broad，1H，NH).
64)N-〔N9-(N4-甲氧苯甲酰腺嘌呤〕乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸單(2-(對硝基苯基)乙基)酯按實施例3的相似方法從N-〔N9-(N4-甲氧苯甲酰腺嘌呤〕乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(實施例63)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 65∶35∶2)以純化產(chǎn)物。產(chǎn)率52％。
MS(FAB/LiCl)874.3(M+2Li-H)+。
65)N-胸腺嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯按如實施例2所述的相似方法從N-(2-甲氧基)乙氨基甲膦酸二(2-(對硝基苯基)乙基)酯(按實施例1所述相似方法從2-甲氧基乙胺開始，經(jīng)與甲醛和亞磷酸二(2-(4-硝基苯基)乙基)酯反應合成)及胸腺嘧啶-1-基乙酸反應而合成。在硅膠上層析(EA/甲醇90∶10)以純化產(chǎn)物。產(chǎn)率64％MS(FAB/LiCl)640.3(M+Li)+。
66)5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(O-烯丙基)按照實施例17所述的相似方法從N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧苯)乙氨基甲膦酸(2-(對硝基苯)乙基)單酯(三乙銨鹽，實施例3)和N-(N6-甲氧苯甲酰)胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(2-羥基)乙氨基甲膦酸烯丙基2-(對硝基苯基)乙基二酯(實施例34)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA85∶14∶1)以純化合成產(chǎn)物。產(chǎn)率36％。
MS(FAB)1474(M+H)+；1496(M+Na)+。
67)5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(O-烯丙基)按實施例4的相似方法從“5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(O-烯丙基)”(實施例66)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶19∶1)純化所需產(chǎn)物。產(chǎn)率約55％。
MS(FAB)1201.3(M+H)+，1223.3(M+Na)+。
68)5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(O-烯丙基)
按照實施例17所述的相似方法從N-(N6-甲氧苯甲酰)-胞嘧啶-1-基-乙酰-N-(4-甲氧三苯基甲氧基)乙氨基甲膦酸2-(對基苯基)乙基單酯(三乙銨鹽)(實施例3)和5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(O-烯丙基)(實施例67)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA80∶20∶1)以純化產(chǎn)物。產(chǎn)率58％MS(FAB)2046(M+H)+；2068(M+Na)+。
69)5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(OH)按照實施例42的相似方法從“5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(O-烯丙基)”(實施例68)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA 60∶38∶2)以純化所得產(chǎn)物。產(chǎn)率66％。
MS(FAB)2027(M+Na)+；2049(M+2Na-H)+。
70)5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-p(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2按照實施例17的相似方法從“5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(OH)”(實施例69)和“5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2”(實施例32)進行合成。在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA70∶30∶2)以純所得需產(chǎn)物。產(chǎn)率58％。
MS(FAB)3892(M+Na)+；3914(M+2Na-H)+。
71)5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2按照實施例17的相似方法從“5′-MMTr從T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)(OH)”(實施例45)和“5′-HO-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2”(實施例32)進行合成。為純化產(chǎn)物，在硅膠上層析(EA/甲醇/TEA60∶40∶2)。真空蒸發(fā)產(chǎn)物部分并用制備性HPLC(高壓液相層析法)純化之RP8 LiChrosper 60，水/乙腈1∶1；0.1％乙酸銨；1m/分鐘。Rf＝16.6分鐘。
MS(FAB)3534(M+Na)+；3556(M+Na-H)+。
72)5′-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-CAn-P(OH)-CAn-P(OH)-CAn-P(OH)2按照實施例40的相似方法從“5′-MMTr-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)2”(2mg)(實施例71)合成。
MS(ES-)2466.4(M-H)。
73)5′-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)2用3ml 33％NH4OH水溶液處理約1mg“5′-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-CAn-P(OH)-CAn-P(OH)-CAn-P(OH)2”(實施例72)并于室溫下攪拌24小時。真空蒸發(fā)反應混合物。產(chǎn)率約0.6mg(19 OD)。
MS(ES-)2064.5(M-H)-。
74)5′-HO-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)2將8OD的“5′-MMTr-T-P(OH)-T-P(OH)-T-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)-C-P(OH)2”(實施例73)溶解于0.5ml水中并加到Poly pakTM(Glen Research，#60-1100-10)上。按制造商的說明(Glen Research User Guede)除去MMTr基團。產(chǎn)率約0.35mg(11 OD)。
MS(ES-)1792.6(M-M)-。
75)5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)-T-P(ONPE)2按照實施例17的相似方法從“5′-MMTr-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)-CAn-P(ONPE)(OH)”(實施例69)和“5′-HO-T-P(ONPE)T-P(OHPE)-T-P(OEt)2”(實施例26)合成。在硅凝膠上層析(EA/甲醇/TEA 80∶20∶2；然后70∶30∶2)以純化合成的產(chǎn)物。產(chǎn)物部分與甲苯共蒸發(fā)，真空蒸發(fā)并加戊烷研磨。產(chǎn)率48％。
MS(FAB)3744(M+Na)+；3766(M+2Na-H)+。
序列表(1)一般信息(iii)申請人(A)名稱Hoechst Akitengesellschaft(C)城市Frankfurt(E)國家德國(F)郵政編碼65926(ii)申請的題目膦?；鶈熙ズ怂幔渲苽浞椒皯?iii)序列數(shù)33(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentrn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ IDNO1的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO1ACACCCAATT CTGAAAATGG(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO2AGGTCCCTGT TCGGGCGCCA(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..28(xi)序列描述SEQ ID NO3GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA(2)SEQ I NO4的信息(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1.25(xi)序列描述SEQ ID NO4GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAA(2)FORSEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)名稱/鍵外顯子(B)定位1..26(xi)序列描述SEQ ID NO5GTCGCTGTCT CCGCTTCTTCTTCCTG(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..27(xi)序列描述SEQ ID NO6GTCTCCGCTT CTTCTTCCTG CCATAGG(2)SEQ IN NO7的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..15(xi)序列描述SEQ ID NO8CAGCTGCAAC CCAGC(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..21(xi)序列描述SEQ ID NO9GGCTGCTGGA GCGGGGCACA C(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..15(xi)序列描述SEQ ID NO10AACGTTGAGG GGCAT(2)SEQ IN NO11的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..18(xi)序列描述SEQ ID NO11GTGCCGGGGT CTTCGGGC(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..21(xi)序列描述SEQ ID NO12GGAGAACATC ATGGTCGAAAG(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..22(xi)序列描述SEQ ID NO13CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO14GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO15CACCCGCCTT GGCCTCCCTC(2)(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..18(xi)序列描述SEQ ID NO16GGGACTCCGG CGCAGCGC(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO17GGCAAACTTT CTTTTCCTCC(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..19(xi)序列描述SEQ ID NO18GGGAAGGAGG AGGATGAGG(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..21(xi)序列描述SEQ ID NO19GGCAGTCATC CAGCTTCGGAG(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..18(xi)序列描述SEQ ID NO20GCAGTAAGCA TCCATATC(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO21CCCCCACCAC TTCCCCACTC(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO22CTCCCCCCACC ACTTCCCCTC(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..19(xi)序列描述SEQ ID NO23GCTGGGAGCC ATAGCGAGG(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..19(xi)序列描述SEQ ID NO24ACTGCTGCCT CTTGTCTCAGG(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..22(xi)序列描述SEQ ID NO25CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..19(xi)序列描述SEQ ID NO26GGTCCCTGTT CGGGCGCCA(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..17(xi)序列描述SEQ ID NO27GTGCCGGGGTCTTCGGG(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..17(xi)序列描述SEQ ID NO28GGAGGATGCT GAGGAGG(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度14堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..14(xi)序列描述SEQ ID NO29GGAGGATGCT GAGG(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..19(xi)序列描述SEQ ID NO30CAGGAGGATG CTGAGGAGG(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..15(xi)序列描述SEQ ID NO31GGCTGCCATG GTCCC(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..20(xi)序列描述SEQ ID NO32TGATGGTGTC CTTTGCAGCC(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單股(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)反義是(ix)特征(A)名稱/鍵外顯子(B)定位1..18(xi)序列描述SEQ ID NO33TCATGGTGTC CTTTGCAG
權利要求
1.式I的化合物 其中n是0到100的數(shù)；B各自是氫、羥基、(C1-C20)-烷基、(C1-C20)-烷氧基、(C1-C20)-烷硫基、(C6-C20)-芳基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷氧基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷硫基、芳香基團或雜環(huán)基團，其中烷基、芳基和/或芳香或雜環(huán)基團可以被羥基、(C1-C4)-烷氧基、-NR9R10、-C(O)OH、氧代、-C(O)OR8、-C(O)NR9R10、-CN、-F、-Cl、-Br、-NO2、(C2-C6)-烷氧基烷基、-S(O))mR8、-(C1-C6)-烷基-S(O)mR8、-NHC(＝NH)NHR8、-C(＝NH)NHR8、-NR9C(O)R8、＝NOR8、NR9C(＝O)OR10、-OC(＝O)NR9R10和-NR9C(＝O)NR9R10一次或多次取代，或者B各自是天然核苷堿基、非天然核苷堿基或報道配基；A-B也可以是通過羧基基團縮合上的D或L-氨基酸或由具有長度達5個氨基酸殘基的這些氨基酸組成的肽，L各自是N或R1N+，且R1是氫或可被羥基、(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷硫基或氨基取代的(C1-C6)-烷基，較好是氫或甲基；A各自是單鍵、亞甲基或式IIa或IIb的基團 Y’是＝O、＝S、＝CH2、＝C(CH3)2或-HR1，其中R1定義同上；M是單鍵、-O-、-S-或-NR1-，其中R1定義同上；R2和R3各自為氫、羥基、(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷硫基、氨基、鹵素如F、Cl或Br、或可被羥基、(C1-C6)烷氧基或(C1-C6)-烷硫基取代的(C1-C6)-烷基；p和q各自是0到5；r和s各自是0到5；D和G各自是CR5R6；R5和R6各自是氫、(C1-C6)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C20)-芳基-(C1-C6)-烷基、羥基、(C1-C6)-烷氧基、(C1-C6)-烷硫基、且烷基和芳基可被SR1或NR1R1′取代，其中R1定義同上，R1′獨立于R1具有如R1相同的意義；X是-O-、-S-或-NR1-，其中R1是如上所定義；Y是＝O或＝S；Z是-OR8、-NR9R10或X′Q″，其中X′定義同X，且Q″定義同Q；R8是氫、(C1-C18)-烷基、(C2-C18)鏈烯基、(C3-C18)炔基、(C6-C12)-芳基、(C6-C12)-芳基-(C1-C6)-烷基，其中烷基可被羥基、(C1-C4)-烷氧基、F、Cl或Br取代一次或多次，且芳基可被羥基、(C1-C4)-烷氧基、(C1-C4)-烷基、F、Cl、Br、NO2、-NR9R10、-C(O)OH、-C(O)O-(C1-C6)-烷基或-C(O)NR9R10取代1-3次，但較好是氫、(C1-C6)-烷基、(C6-C12)-芳基或(C6-C12)-芳基-(C1-C6)-烷基、其中芳基或被(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷基、F、Cl、Br或NO2單取代，并且最好是氫、(C1-C6)-烷基、苯基或2-(4-硝基苯基)乙基；R9和R10各自是氫、(C1-C18)-烷基、(C1-C18)-鏈烯基、(C1-C18)-炔基、(C6-C12)-芳基、(C6-C12)-芳基-(C1-C6-烷基、其中烷基可被羥基、(C1-C4)-烷氧基，F(xiàn)、Cl或Br取代一次或多次，或者R9和R10可與連結它們的N原子一起形成4到7元環(huán)；Q和Q’各自是氫或R8，或有利地影響反義寡核苷酸或三鏈體形成寡核苷酸之性質(zhì)的偶聯(lián)物或作為DNA探針的標記或在寡核苷酸類似物與靶核酸的雜交中經(jīng)結合或交聯(lián)攻出該靶核酸的偶聯(lián)物，或者是可以未被修飾或經(jīng)過修飾的寡核苷酸。
2.如權利要求1中限定的式I的化合物，其中n是0到50的數(shù)；B各自是天然核苷堿基或非天然核苷堿基；L是N；A是式IIb的基團，其中r＝1，s是零，且R2，R3＝H，Y’＝O且M是單鍵；D和G各自為CHR5；R5是氫；X是-O-；Y是＝O；Z是羥基、甲氧基、乙氧基、(4-硝基苯基)乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、戊氧基、苯氧基或烯丙氧基；Q和Q′各自是氫、R8或可未被修飾或被修飾的寡核苷酸，其中a)3′-各/或5′-磷酸二酯橋接部分被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR4R4′-氨基磷酸酯、磷酸O-甲基酯、磷酸O-乙基酯、磷酸O-異丙基酯、甲基膦酸酯或苯基膦酸酯橋接部分完全或部分取代；b)嘧啶位置中及5′末端和/或3′末端上的1個、2個或3個3′-或5′-磷酸二酯橋接部分被甲縮醛和/或3′-硫代甲縮醛取代；c)磷酸糖酯骨架被“PNA”或PNA-DNA雜合體完全或部分地取代；d)B-D-2′-脫氧核糖單位被2′-F-2′-脫氧核糖、2′-O-(C1-C6)烷基核糖、2′-O-(C2-C6)-鏈烯基核糖或2′-NH2-2′-脫氧核糖完全或部分地取代；e)天然核苷堿基被5-(C1-C6)烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤。
3.如權利要求1或2中限定的式I的化合物，其中n是0到30的數(shù)；Q的Q′各自是氫、R8，其中R8是H、(C1-C6)-烷基、苯基或2-(4-硝基苯基)乙基，或可未被修飾或被修飾的寡核苷酸，其中a)3′-和/或5′-磷酸二酯橋接部分被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯橋接部分完全或部分地取代；b)在5’-和3’-末端的1個、2個或3個3′-或5’-磷酸二酯橋接部分被取代；c)磷酸糖酯骨架被“PNA”或PNA-DNA雜合物完全或部分地取代；d)B-D-2′-脫氧核糖單位被2′-F-2′-脫氧核糖、2′-O-(C1-C4)-烷基核糖、2′-O-(C2-C4)-鏈烯基核糖或2′-NH2-2′-脫氧核糖完全或部分地取代；e)天然核苷堿基被5-(C3-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基尿嘧啶、5-(C2-C6)炔基胞嘧啶、5-(C2-C6)-鏈烯基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-(C2-C7)-炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-(C2-C7)-鏈烯基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-(C2-C7)-鏈烯基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-(C1-C7)-烷基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤。
4.如權利要求1-3中所限定的式I的化合物，其中n是0到25的數(shù)；B各自是天然核苷堿基；Z是羥基、乙氧基、(4-硝基苯基)乙氧基或苯氧基；Q和Q′各自是氫、R8，其中R8是H、(C1-C6)-烷基、苯基或2-(4-硝基苯基)乙基，或者是可未被修飾或被修飾的寡核苷酸，其中a)3′-和/或5′-磷酸二酯橋接部分被硫代磷酸酯橋接部分完全或部分地取代；c)磷酸糖酯骨架被“PNA”或PNA-DNA雜合物完全或部分地取代；d)β-D-2′-脫氧核糖被2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基-或2′-O-丁基核糖完全或部分地取代；e)天然核苷堿基被5-己炔基胞嘧啶、5-己炔基尿嘧啶、5-己炔基胞嘧啶、7-脫氮雜-7-丙炔基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-丙炔基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-甲基鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜-7-溴鳥嘌呤、7-脫氮雜-7-溴腺嘌呤完全或部分地取代。
5.制備如權利要求1-4限定的式I化合物的方法，其包括a1)使式III的化合物 其中D、G、L和X具有如權種要求1-4中限定的意義，并且Si是適當?shù)谋Ｗo基團，如二甲氧基三苯甲基、一甲氧基三苯甲基、三苯甲基、pixyl、叔丁氧基羰基或芴基甲氧羰基，—與式IV的化合物 其中R5和R6具有如權利要求1-4中限定的意義—在適當?shù)挠袡C溶劑中，于0到100℃的溫度下反應，得式Va或Vb的化合物 b1)使式Va或Vb的化合物與式VIa或VIb的化合物 其中Y是如權利要求1-4中限定的基團，X′和X″各自是如X所限定的基團，S2和S3各自是保護基團，在適當?shù)挠袡C溶劑中，于0℃到100℃的溫度下，必要時加入堿、復合堿或不帶電荷的、全烷基化的聚氨基膦嗪堿進行反應，以得到式VII的化合物 其中D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X′、X″和Y定義同上；C1)使式VII的化合物與式VIII的化合物 其中A具有如權利要求1-4中限定的意義，BPR具有如B的同樣意義，但其可能以被保護的形式存在，并且L2是本領域技術人員已知的離去基團，或者，如果A具有式IIb的意義，則其也可以是OH；—在適當?shù)挠袡C溶劑中，于-20℃到100℃的溫度下，必要時加入堿、復合堿或未帶電荷的、全烷基化的聚氨基膦嗪堿，或不加堿而加入常規(guī)用于偶聯(lián)肽鍵的偶聯(lián)劑進行反應，以得到式IX的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X′、X″和Y定義同上；d1)用已知方法從式IX的化合物中除去保護基團S3，得到式IX的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X、X′、X″和Y定義同上；e1)用已知方法從式IX的化合物中除去保護基團S1，得到式XI的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S2、S3、X、X′、X″和Y定義同上；f1)按照寡核苷酸化學中已知的“磷酸三酯法”使式XI的化合物與式X化合物在適當有機劑中、于-20℃到100℃的溫度下反應，其中加入偶聯(lián)劑或式XII的化合物 其中R15是(C6-C12)-芳基，其可以被(C1-C6)-烷基、(C1-C6)-烷氧基、硝基、氯或溴取代1到4次，并且其中1以3個碳原子可被雜原子取代，并且R16是脫離基團—可以加入或不加入催化劑，其中偶聯(lián)劑的制備可就地進行，或者可分別完成并且可以在適當?shù)娜軇┲屑尤氡换罨衔锏娜芤海缘玫绞絏III的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X′、X″和Y定義同上；g1)從式XIII的化合物開始，重復步驟e1)和f1)直到所需的鏈長度，得到式XIV化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X′、X″和Y定義同上，并且n如權利要求1-4中所限定；h1)按照已知方法除去保護基團S1、S2和S3以及BPR上的保護基團；并且可以按照本領域技術人員已知的方法引入或不引入基團Q和Q’，并可以環(huán)化所得到的化合物，從而得到式I的化合物。
6.制備如權利要求1到4中限定的式I的化合物方法，其中n是1至100，該方法包括，在式XV和XVI的化合物中 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X′X″和Y如權利要求1-4中限定，o和p各自是0到50，并且o+p+l＝n；a2)在式XV的化合物中按權利要求5中e1)所述的方法除去保護基團S1b2)在XVI的化合物中按權利要求5中d1)所述方法除去保護基S3，以及c2)按權利要求5中f1)所述方法將所得化合物相互偶聯(lián)、得到式XIV的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、S3、X、X′、X″、Y和n定義同上，d2)并按權利要求5中h1)所述的方法使這些化合物反應，得到式I的化合物。
7.制備如權利要求1至4中限定的式I化合物的方法，其包括a3)將式X的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X、X’、X”和Y如權利要求1-4中所定義，按已知方法通過SPACER偶聯(lián)到固相載體上，得到式XVII的化合物 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X、X′、X″和Y定義同上，SS是適用于固相合成的固相載體，并且SPACER是在已發(fā)生合成后可從載體上除去的基團，例如是本領域技術人員已知的基團，或者SPACER是雙功能團偶聯(lián)分子Q，其通過已知的可除去基團被連接到固相載體上；b3)按權利要求5中e1)所述方法，從式XVII的化合物除去保護基團S1 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、SS、SPACER、X、X′、X″和Y定義同上；c3)按權利要求5中f1)所述方法，使所得化合物與式X的化合物反應 其中A、BPR、D、G、L、R5、R6、S1、S2、X′、X″和Y定義同上；d3)重復步驟b3)和c3)直到所需的鏈長度；e3)根據(jù)需要用已知方法偶聯(lián)到偶聯(lián)物Q′上；f3)用已知方法從固相載體上除去以這樣產(chǎn)生的化合物，其中也可以在從載體上裂解之前除去保護基團，并可以用已知方法偶聯(lián)至偶聯(lián)物Q，其中可以改變Q和Q′的偶聯(lián)(e3、f3)次序，并可以環(huán)化或不環(huán)化所得到的化合物。
8.如權利要求1中限定的式1化合物用作基因表達抑制劑。
9.使用如權利要求1到4中限定的式I的化合物作為診斷劑、用于治療由病毒引起的、受整聯(lián)蛋白或細胞-細胞粘附受體影響的、或由因子如γ-TNF誘導的疾病，以及用于治療腫瘤或再狹窄癥。
10.具有下列式之一的化合物5′-OLIGO-PMENA；5′-PMENA-OLIGO；5′-OLIGO-PMENA-OLIGO；5′-OLIGO-(PMENA-OLIGO)a；5′-PMENA-OLIGO-PMENA；5′-PMENA-(OLIGO-PMENA)a其中a為1-20，OLIGO代表任選被修飾的寡核苷酸，并且PMENA代表權利要求1-4的式I化合物，其中Q和Q′是氫。
全文摘要
描述了式(I)的新的寡核苷酸類似物，其中A、B、D、G、L、P、Q、Q′、R
文檔編號C12Q1/70GK1138588SQ96100508
公開日1996年12月25日 申請日期1996年3月13日 優(yōu)先權日1995年3月13日
發(fā)明者A·裴曼, E·烏赫曼, G·布萊鮑爾, H·瓦邁爾 申請人:赫徹斯特股份公司