專利名稱：酶抑制劑存在下酶法合成β-內(nèi)酰胺抗生素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種改進的制備式(I)和式(II)的青霉素和頭孢菌素的酶學方法 式中X為S或CH2，R為被任意取代的6元烴環(huán)，R1為氫原子、鹵原子、甲基、甲氧基、C1-C4鏈烯基或通過氧、硫或氮原子與有機基結合的亞甲基。
US-A-3816253公開了一種制備青霉素或頭孢菌素的方法，該方法是在+5℃至+50℃的溫度下，優(yōu)選+20℃至+40℃下，在水溶液中有活性微生物或酶的存在下將α-取代的α-氨基酸與7-氨基頭孢烷酸或7-氨基去乙酸基頭孢烷酸的衍生物反應。已發(fā)現(xiàn)按照之后的美國專利中所述的方法操作，由于平行的伴隨反應生成了難以從反應混合物中分離的副產(chǎn)物，因此所期望的最終產(chǎn)率大為降低。
EP-A-0473008提供了一種生產(chǎn)式(I)或式(II)的青霉素及頭孢菌素的方法，其目的在于克服或至少減少上述缺點。在該方法中，在固定化青霉素?；傅拇嬖谙聦?-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸與式R-CH(NH2)COOH的α-取代的α-氨基酸或其活性衍生物反應，反應在水介質中進行，溫度為-5℃至+20℃，優(yōu)選約+4℃。
EP-A-0473008中清楚地描述了反應條件，其中還詳細描述了25個制備實施例，所需最終產(chǎn)物的產(chǎn)率很高(90％或更高)。
在這一方面應注意到，只有產(chǎn)率足夠高(約90％)且最終產(chǎn)物易于純化該方法才能工業(yè)應用。
EP-A-0473008提到通常以α-取代的α-氨基酸或其活性衍生物作為原料，具體提及的氨基酸只有D-苯基甘氨酸甲酯。
本申請人按照EP-A-0473008中給出的實施例中所述步驟進行了許多精心的實驗。但所得結果完全不盡人意。
在這一方面已證實，如果反應介質中所述氨基酸的摩爾比小于4摩爾每摩爾所用的6-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸，所需最終產(chǎn)物的產(chǎn)率則很低(小于約60％)，并且因此是工業(yè)上不能接受的。
只有反應中D-苯基甘氨酸甲酯的量為4至6摩爾每摩爾所用的6-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸的比例時才能獲得工業(yè)上可接受的高產(chǎn)率。
但在這種情況下不僅難以接受成本的增加(D-苯基甘氨酸甲酯的價格很高)，而且還生成了難以或不可能從反應的所需最終青霉素或頭孢菌素中除去的副產(chǎn)物。
已嘗試使用不同的D-苯基甘氨酸酯或不同氨基酸的酯。但這些嘗試都失敗了。
使用各種活性氨基酸衍生物得到了同樣消極的結果。
德國專利申請?zhí)?214444報道了頭孢菌素(具體地說是頭孢氨芐)的酶法合成，該方法是在青霉素?；傅拇嬖谙聦?-ADCA與苯基甘氨酰胺反應。所得產(chǎn)率很低。
PCT/DK91/00188(WO92/01061)和PCT/DK92/00388(WO93/12250)報道了通過酶法酰化作用制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，根據(jù)該方法在固定化青霉素酰化酶的存在下將式(III)的酰胺 與6-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸進行反應。
這些方法是適用的。但發(fā)現(xiàn)可估測量的酰胺(III)被酶本身水解，因此在所需的最終產(chǎn)物中增加了雜質的數(shù)量。還有少量最終產(chǎn)物被同樣的酶水解。
早在青霉素?；?E.C.3.5.1.11)的最初應用時就已知，當存在苯乙酸、苯氧基乙酸和/或其它抑制劑時該酶被抑制，在抑制劑的存在下酶喪失活性并且催化趨于停止。這是酰化含有痕量苯乙酸、苯氧基乙酸或其它抑制劑的β-內(nèi)酰胺環(huán)時的一個問題。
尋求不表現(xiàn)這類抑制的酶時常常面臨這一問題(參見D.D.Y.Ryu等人，Biotechnology and Bioengineering 1985，Vol.XXVIIp.953-960；A.M.Blinkowsky等人，Enzyme Microbial Technol-ogy 1993，Vol.15，p.965-973)。從各種微生物來源(醋桿菌，黃單孢菌)選擇出酶(常見的有氨芐青霉素?；富蝓０访?、頭孢菌素酰化酶或酰胺酶，頭孢氨芐合成酶等)。但是，這些酶均不能商購，也不能大規(guī)模制備，而這是工業(yè)應用所必需的。由于需要大量研究投資來改進合成β-內(nèi)酰胺抗生素的特異性催化劑，因此不贊成使用這種方法。
另一種克服酶抑制作用的方法是在進行酶法?；俺ニf的抑制劑，例如PCT/DK91/00188中所述的用有機溶劑進行提取。準確地說，該方法的主要缺點就是有機溶劑的使用。引入β-內(nèi)酰胺環(huán)的酶法酰基化就是為了省去所述溶劑的使用從而獲得對環(huán)境無害的方法，因此這種方法到目前為止尚未給出令人滿意的結果。
在專門研究青霉素?；复呋姆磻倪^程中，本申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)上述抑制作用是可以避免的，在即使有大量上述抑制劑存在的情況下也能反應合成β-內(nèi)酰胺抗生素。如下文所述，通過加入一定量的起初未存在的或僅少量存在的抑制劑，在某些情況下甚至可以利用對合成有益的酶抑制作用。
因此，本發(fā)明提供了一種改進的分別制備按前面所述的式(I)和式(II)的青霉素和頭孢菌素的酶學方法，其中，在-5℃至+35℃的溫度下，在呈游離或固定化形式的青霉素?；傅拇嬖谙拢瑢⑹?IV)或(V)的6-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸 其中X和R1具有上面所述的含義，與式(III)的酰胺反應 其中R具有上面所述的含義，R2和R3分別獨立地為氫原子或者直鏈或支鏈C1-C3烷基，或其鹽，摩爾比為1至6摩爾所述酰胺(III)每摩爾酸(IV)或(V)，其特征在于向反應混合物中加入式(VI)的酶抑制劑 其中R4為直鏈或支鏈C1-C5烷基、被取代或未被取代的芳環(huán)、鹵素或質子，Y可以不存在，或者如果存在則為O、S、CH2、苯基或鹵素；R5為羧基、直鏈或支鏈C1-C4酯或-CONH2基團；R6為H、OH、OCHO或CH3；抑制劑以0.0001至0.5的摩爾濃度存在。
具體地說，所述抑制劑(VI)以0.0005至0.2的摩爾濃度存在并且選自苯乙酸、苯氧基乙酸和扁桃酸、以及這些酸的(直鏈或支鏈)C1-C5酰胺和酯。
本發(fā)明還涉及含有按本發(fā)明所述方法制備的青霉素或頭孢菌素、以及藥學上可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物。
一般用常規(guī)方法制備含青霉素或頭孢菌素的藥物組合物并以適宜的藥學形式給藥。
參照式(I)和(II)，R可以為例如苯基、環(huán)己二烯基或者為未被取代的或被羥基、鹵素、烷基、烷氧基、羧基、硝基或氨基取代的環(huán)己烯基。
R1可為氫原子、鹵原子、甲基或者與有機基團相結合的亞甲基，具體地說是與烷氧基或烷氧羰基或含有1至4個選自O、S和N的雜原子的5元或6元雜環(huán)基團相結合，雜環(huán)基團通過O、S或N原子與亞甲基結合并且可被選自羥基、鹵素、烷基、烷氧基、羰基、羧基、腈基、氨基等基團的一個或多個基團任意取代。
此處所用術語“烷基和烷氧基”是指含有1至6個碳原子，優(yōu)選1至4個碳原子的基團。
具有式(III)酰胺的α-氨基酸包括例如D-苯基甘氨酸、D-對羥基苯基甘氨酸和D-1，4-環(huán)己二烯-1-基-甘氨酸。
適宜的酰胺的鹽是其諸如氫氯酸、氫氟酸、氫溴酸、硫酸或硝酸這樣的無機酸的鹽，或者是其諸如乙酸、甲酸或馬來酸這樣的有機酸的鹽。
下述酸特別適合于式(IV)和(V)的化合物6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基頭孢烷酸、7-氨基-3-氯頭孢烷酸、7-氨基-3-甲氧基頭孢烷酸、7-氨基苯乙?；ヒ宜峄^孢烷酸、7-氨基苯氧基乙?；ヒ宜峄^孢烷酸、7-氨基-3-氯碳頭孢菌烷(7-amino-3-chlorocarbacephem)，青霉素G和青霉素V。
一般用青霉素G或V以及7-氨基苯乙?；?去乙酸基頭孢烷酸分別作為制備6-APA和7-ADCA的原料，然后用后者制備氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、頭孢氨芐和頭孢羥氨芐。目前為止必需從這些中間體(6-APA和7-ADCA)中除去苯乙酸或苯氧基乙酸以便能將中間體用于酶的?；磻鏟CT/DK91/00188所述。能在抑制劑存在下合成這些化合物是指不需要純化中間體便可有利地進行合成，獲得一種節(jié)省并避免使用有機溶劑的重要方法。
酶抑制劑可存在于合成開始時的反應混合物中，也可以在反應期間任一時刻加入。通常也可以在酶反應結束時加入所述抑制劑以便于產(chǎn)物分離和后繼加工。
在現(xiàn)有方法中用作催化劑的酶是青霉素酰胺水解酶，其分類為E.C.3.5.1.11(也被稱為青霉素?；浮⑶嗝顾厮饷?、氨芐青霉素?；傅?，該酶是從任意微生物來源產(chǎn)生的，特別是從黃單胞菌、假單胞菌、節(jié)桿菌、Kluyvera、醋桿菌、埃希氏菌、芽孢桿菌或單胞菌菌桿產(chǎn)生的。特別優(yōu)選從大腸埃希氏菌的天然或工程菌株產(chǎn)生的酶。其中有些酶是可以大量并以固定化形式商購的。
該酶可以游離形式(即溶解)使用，或者可被固定在固體基質上。對于后者來說，特別優(yōu)選那些專門用于生物分子固定化的支持物，如合成環(huán)氧脂或吖內(nèi)酯樹脂。
實施例1通過7-ADCA與D(-)苯基甘氨酰胺的酶法?；饔煤铣深^孢氨芐將9g(42毫摩爾)7-氨基去乙酸基頭孢烷酸和15.7g(100毫摩爾)D(-)苯基甘氨酰胺溶于水中(終體積300ml)。將溶液冷卻至約4℃并調(diào)節(jié)至pH 6.8，然后轉入與控制系統(tǒng)(如下文所稱的恒-pH-槽)相連的冷卻反應器中，通過自動加入4N硫酸保持pH恒定。
將5400IU固定化形式(在吖內(nèi)酯或環(huán)氧樹脂上)的青霉素酰胺水解酶加入上述溶液中，在恒定的4℃及pH 6.8溫育。
約75分鐘后從溶液中過濾分離出酶。將溶于稀苛性蘇打溶液的約4g β-萘酚加入該溶液中。回收了16.6g以頭孢氨芐/β-萘酚復合物形式存在的產(chǎn)物，摩爾產(chǎn)率為初始環(huán)的74％。然后(按已知方法)從β-萘酚復合物獲得高品質的頭孢氨芐一水合物。實施例2苯乙酸存在下合成頭孢氨芐將17g(0.077摩爾)含1.18％苯乙酸和1.63％7-氨基苯乙酰基去乙酸基頭孢烷酸雜質的不純的7-氨基去乙酸基頭孢烷酸、以及42.68g(0.28摩爾)D(-)苯基甘氨酰胺溶于水中，至終體積為600ml。
將恒-pH-槽調(diào)至pH 7.6并將恒溫槽調(diào)至2℃，用7560 IU固定化酶并按照實施例1中所述進行反應。5小時30分鐘后中斷反應并濾去青霉素酰化酶。用6gβ-萘酚沉淀產(chǎn)物，所得摩爾產(chǎn)率為87.5％。然后如實施例1所述獲得了頭孢氨芐一水合物。實施例3從7-氨基苯乙酰基去乙酸基頭孢烷酸和D(-)苯基甘氨酰胺合成頭孢氨芐將16g(0.048摩爾)7-氨基苯乙?；ヒ宜峄^孢烷酸溶于水中，并加入足量稀NaOH至pH 8.0，然后將溶液加熱至28℃并用水稀釋至終體積為320ml，然后轉入與恒-pH-槽相連的適宜的反應器中并浸于溫度控制浴中。
將約14000 IU固定化形式的青霉素?；讣尤朐撊芤?溶液A)，然后保持恒定pH(通過加入2N NaOH)和恒定溫度。
另外制備濃度約為180g/l的D(-)苯基甘氨酰胺水溶液(溶液B)。
反應約2小時后，將約190ml溶液B加入溶液A，如需要，調(diào)整pH和溫度。通過加入4N硫酸保持pH恒定。
7小時后真空過濾除去酶。通過沉淀頭孢氨芐/β-萘酚復合物從所得溶液中回收頭孢氨芐，產(chǎn)量相當于摩爾產(chǎn)率為80.8％。按已知步驟從頭孢氨芐/β-萘酚復合物中回收質量滿足市售的頭孢氨芐一水合物。實施例4在7-氨基-3-氯頭孢烷酸的酶法?；幸种苿┑挠猛救鐚嵤├?中的方法進行反應，但用9.85g(0.042摩爾)7-氨基-3-氯頭孢烷酸。反應結束時加入1.5g溶于稀NaOH的苯乙酸，然后如實施例1-3中所述針對頭孢氨芐的方法沉淀頭孢氯/β-萘酚復合物。
以7-氨基-3-氯頭孢烷酸計的摩爾產(chǎn)率為70％。通過分解頭孢氯/β-萘酚復合物獲得頭孢氯一水合物(按已知方法)。實施例5抑制劑存在下6-氨基青霉烷酸的酶法酰化用已知方法通過酶解從青霉素G獲得6-氨基青霉烷酸(此后稱之為6-APA)，并通過酸沉淀從水溶液中得以分離。按此方法獲得的產(chǎn)物含有苯乙酸雜質。
將20.8g濃度為80％(0.0077摩爾)的潮濕的不純的6-APA溶于水中，并按實施例2中所述方法與D(-)苯基甘氨酰胺混合，得到含有約0.7g/l苯乙酸的溶液。加入6670單位青霉素酰化酶，并如實施例2中所述方法進行反應。獲得82.4％的6-APA轉化率。實施例6苯乙酸存在下合成頭孢氨芐過程中青霉素G?；傅乃庖种谱饔脤?3g(60.75毫摩爾)7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)、46.5g(230.84毫摩爾)D-苯基甘氨酸甲酯.HCl和140mg(1.03毫摩爾)苯乙酸溶于水中至終體積為1000ml。
由17.5g(3000 IU)青霉素G?；高M行?；磻?，條件是起始pH為7.25且溫度為3℃。約3小時后已有93％的7-ADCA轉化成頭孢氨芐。
93％的7-ADCA轉化成頭孢氨芐后，合成的頭孢氨芐產(chǎn)物與水解形成的D-苯基甘氨酸的比率為2.15，而沒有抑制劑時其比率為1.44。
權利要求
1.一種制備式(I)或(II)的青霉素或頭孢菌素的方法 式中X為S或CH2，R為被選擇性取代的6元烴環(huán)，R1為氫原子、鹵原子、甲基、甲氧基、C1-C4烷基或通過氧、硫或氮原子與有機基結合的亞甲基，在該反應中，在-5℃至+35℃的溫度下，在呈游離或固定化形式的青霉素?；傅拇嬖谙拢瑢⑹?IV)或(V)的6-氨基青霉烷酸或7-氨基頭孢烷酸 其中X和R1具有上面所述的含義，與式(III)的酰胺反應 其中R具有上面所述的含義，R2和R3分別獨立地為氫原子或者直鏈或支鏈C1-C3烷基，或其鹽，摩爾比為1至6摩爾酰胺(III)每摩爾酸(IV)或(V)，其特征在于向反應混合物中加入式(VI)的酶抑制劑 其中R4選自直鏈或支鏈C1-C5烷基、被取代或未被取代的芳環(huán)、鹵素、質子；Y可以不存在，或者如果存在則為O、S、CH2、苯基或鹵素；R5選自羧基、直鏈或支鏈C1-C4酯或-CONH2基團；R6選自H、OH、OCHO，CH3；抑制劑以0.0001至0.5的摩爾濃度存在。
2.一種根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于所述抑制劑的摩爾濃度優(yōu)選為0.0005至0.2。
3.一種根據(jù)權利要求1和2的方法，其特征在于該抑制劑(VI)選自苯乙酸、苯氧基乙酸、扁桃酸以及這些酸的(直鏈或支鏈)C1-C5酰胺和酯。
4.一種根據(jù)權利要求1和2的方法，其特征在于所述酰胺(III)選自D-苯基甘氨酸及其與有機或無機酸的鹽。
5.一種含有按權利要求1至4中所要求的方法獲得的青霉素或頭孢菌素的藥物組合物。
全文摘要
一種通過將β-內(nèi)酰胺環(huán)與酰胺反應制備青霉素和頭孢菌素的方法。該反應由青霉素酰化酶催化并且是在酶抑制劑的存在下進行的。
文檔編號C12N9/86GK1137568SQ9610255
公開日1996年12月11日 申請日期1996年2月27日 優(yōu)先權日1995年2月28日
發(fā)明者M·真奧尼, A·R·塔格里尼, E·卡納斯, A·溫圖列里 申請人:艾斯·多伯法股份公司