專利名稱：牛凝血酶的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其為牛凝血酶的提取分離方法。
凝血酶是良好的局部止血藥，其療效已被國內(nèi)外臨床醫(yī)師所認(rèn)可。目前，國內(nèi)商品凝血酶都是豬凝血酶，尚無作為藥用的牛凝血酶。在國外，英、美等國藥典雖早有牛凝血酶的記載，但工藝全過程未見系統(tǒng)發(fā)表。
本發(fā)明的目的在于提供一種在常溫下，操作簡便，成本低，比活力高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的牛凝血酶的提取分離方法，彌補國內(nèi)在這方面的不足以及便于與國外同類制品的接軌。
本發(fā)明所公開的牛凝血酶的提取分離方法是把過量的枸椽酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的抗凝牛血漿中加入BaCl2溶液，用帆布過濾出沉淀物，經(jīng)壓干、硫酸銨洗脫、鹽析，CM-Sephadex C-50柱層析分離制得牛凝血酶。
提取分離方法如下在牛血液中加0.1mol/L～0.17mol/L枸椽酸鈉溶液，枸椽酸鈉溶液與牛血液的體積比為1∶3～1∶5使之成為抗凝的牛血液。常規(guī)分離出抗凝牛血漿，加入0.5mol/L～2mol/L的BaCl2溶液，BaCl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為1∶6～1∶25，BaCl2與抗凝牛血漿中枸椽酸鈉生成枸椽酸鋇進而選擇性吸附牛凝血酶原，形成枸椽酸鋇與凝血酶原沉淀。帆布過濾出沉淀物，壓干，先用40％～45％飽和度的硫酸銨溶液洗脫沉淀中的凝血酶原，再補加硫酸銨使洗脫液中硫酸銨達65％～70％飽和度，鹽析出凝血酶原，經(jīng)透析去除硫酸銨后，用兔腦粉浸液和CaCl2溶液激活凝血酶原使之轉(zhuǎn)化為具有凝血活性的凝血酶。激活后的牛凝血酶用CM-Sephadex C-50柱層析進一步分離純化，得純化的牛凝血酶，收率為28.9u～119.8u/毫升血漿，比活力為1000u/mg～2000u/mg蛋白。
本發(fā)明所提供的牛凝血酶的提取分離方法，避免了在低溫狀態(tài)下使用有機溶劑和高速連續(xù)離心分離，使操作簡便，投資小，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
實施例1.
采集牛血液20000ml，加0.1mol/L的枸椽酸鈉溶液4000ml，常規(guī)離心分離。取離心上層抗凝牛血漿10000ml，加入0.5mol/LBaCl2溶液1600ml，攪拌15分鐘，靜置15分鐘，帆布過濾沉淀物壓干后加1000ml40％飽和度的硫酸銨溶液，攪拌15分鐘，靜置6小時，常規(guī)離心分離，取上層液加固體硫酸銨168g，攪拌使之溶解，靜置10小時，離心分離，得沉淀物，用20ml蒸餾水溶解后裝入透析袋，水透析10小時，用納氏試劑檢測內(nèi)液不含硫酸銨，終止透析。在37℃下加入0.25mol/L CaCl2溶液3ml和兔腦粉浸液2ml，保持37℃激活1.5小時。
激活后的牛凝血酶經(jīng)CM-SephadexC-50柱層析；用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(含0.1mol/L NaCl pH5.0)洗脫至流出液測OD280值小于0.2后再用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(含0.6mol/L NaCl pH5.0＋0.1)洗脫牛凝血酶。收集凝血酶峰層析液，得純化后的牛凝血酶，收率30u/ml血漿，比活力2000u/mg蛋白。
實施例2.
原料與試劑牛血液100000ml、0.13mol/L枸椽酸鈉溶液25000ml，取抗凝牛血漿50000ml、1mol/L BaCl2溶液4000ml，40％飽和度的硫酸銨溶液5000ml，硫酸銨粉末840g，蒸餾水100ml，0.25mol/L CaCl2溶液15ml，兔腦粉浸液10ml。
提取分離步驟與操作方法同實施例1.收率109u/ml血漿，比活力1800u/mg蛋白。
實施例3.
原料與試劑牛血液200000ml，0.17mol/L枸椽酸鈉溶液66000ml，取抗凝牛血漿100000ml，2mol/L BaCl2溶液4000ml，45％飽和度的硫酸銨溶液10000ml，硫酸銨粉末2100g，蒸餾水200ml，0.25mol/L CaCl2溶液30ml，兔腦粉浸液20ml。
提取分離步驟與操作方法同實施例1.收率110u/ml血漿，比活力1600u/mg蛋白。
權(quán)利要求
1.牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于把過量的枸椽酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的抗凝牛血漿中加入BaCl2溶液，用帆布過濾出沉淀物，壓干，硫酸銨洗脫、鹽析，后經(jīng)CM-Sephadex C-50柱層析純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于所用枸椽酸鈉的濃度為0.1mol/L～0.17mol/L，枸椽酸鈉溶液與牛血液的體積比為1∶3～1∶5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于所用BaCl2溶液濃度為0.5mol/L～2mol/L，BaCl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為1∶6～1∶25。
4.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的牛凝血酶的提取分離方法，其特征在于用40％～45％飽和度的硫酸銨溶液洗脫，用65％～70％飽和度的硫酸銨鹽析。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其為牛凝血酶的提取分離方法。本發(fā)明所公開的牛凝血酶的提取分離方法是把過量的枸椽酸鈉加入牛血液中，在常規(guī)離心分離出的抗凝牛血漿中加入BaCl
文檔編號C12N9/74GK1141951SQ96103650
公開日1997年2月5日 申請日期1996年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月6日
發(fā)明者文尚武, 李佑漢, 劉國良, 孔維權(quán), 李曉紅, 劉保山 申請人:濟南軍區(qū)生物制品藥物研究所, 皖南醫(yī)學(xué)院