專利名稱：絲狀真菌中獨(dú)立復(fù)制的表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在絲狀真菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體系統(tǒng)。更確切地說，本發(fā)明涉及可在絲狀真菌中穿梭并獨(dú)立自主復(fù)制的載體質(zhì)粒及其在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。
絲狀真菌是在分類地位上是高于細(xì)菌和酵母菌的一類微生物，它能夠產(chǎn)生大量的胞外酶及其它代謝產(chǎn)物。因其具有生產(chǎn)諸多有機(jī)酸、醇類化合物、抗生素、氨基酸、核甘酸以及酶制劑等重要物質(zhì)的能力，故而絲狀真菌在目前的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中占有重要的地位。長期以來人們就一直用經(jīng)典的遺傳方法，各種理化誘變手段，炭氮源的利用和代謝調(diào)節(jié)等進(jìn)行改善及提高絲狀真菌各種生產(chǎn)能力的研究，并取得了很多成績。
研究表明，絲狀真菌本身不僅具有蛋白質(zhì)外泌的功能，而且其表達(dá)的真核基因產(chǎn)物更接近于自然狀態(tài)，再加上絲狀真菌有長期豐富的工業(yè)生產(chǎn)背景，易于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，因此，絲狀真菌被認(rèn)為是一個(gè)理想的高效表達(dá)外源基因并生產(chǎn)蛋白的系統(tǒng)和可能成為疫苗生產(chǎn)的理想系統(tǒng)。
八十年代后，人們除了對(duì)已建立的大腸桿菌和酵基因表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步改進(jìn)完善外，已經(jīng)將注意力轉(zhuǎn)向開發(fā)和利用絲狀真菌，研究建立絲狀真菌的基因表達(dá)和表達(dá)系統(tǒng)。
絲狀真菌在遺傳工程方面的研究之所以落后于大腸桿菌和酵母菌，是因其分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究不夠，了解的知識(shí)不夠。而且另一主要原因是缺乏大腸桿菌與酵母菌那樣的質(zhì)粒和體內(nèi)同源重組載體及人工構(gòu)建的穿梭(Shuttle Vector)的載體質(zhì)粒。而這正是對(duì)絲狀真菌進(jìn)行諸多研究所必須跨越的障礙。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)年來經(jīng)過人們不斷地深入研究，繼美國D.Cμllen等人首次報(bào)道外源真核牛的凝乳蛋白酶(Bovine Chymoin)在絲狀真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidμlans)中表達(dá)成功后(Daniel Cμllen.et a1.Bio/Technology.5369-376，April，1987)，已有人的干擾素及細(xì)菌內(nèi)葡聚糖酶在構(gòu)巢曲霉中的表達(dá)，血纖維蛋白溶酶原、甘露己糖、雞卵白溶菌酶、天門冬氨酸蛋白酶等在木霉(Trichoderma)，黑曲霉(Apergillus niger)，米曲霉(Apergillus oryzae)中的表達(dá)等文章陸續(xù)發(fā)表。我國也有乙肝表面抗原在臭曲霉(劉宏迪等，微生物學(xué)報(bào)30(2)98-104，1990)和米曲霉中表達(dá)成功的報(bào)道。
從大量有關(guān)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)的研究報(bào)道中，我們發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)化的外源DNA整合到了宿主染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀質(zhì)粒整合到染色體上的方式，主要分為基因取代和質(zhì)粒整合。質(zhì)粒整合又分為同源整合和非同源整合兩種。如果外源DNA片段兩側(cè)帶有人工構(gòu)建的旁側(cè)系列(從宿主染色體分離到的特定基因)，則其整合為單拷貝同源整合。由于這種目的基因或質(zhì)粒的單拷貝或多拷貝整合，可能造成(1)由于外源DNA整合到染色體上而滅活宿主正常基因或激活有害基因，對(duì)宿主的正常生長及表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生不利影響。(2)由于目的基因的整合，影響了其穩(wěn)定性，從而該目的基因的表達(dá)受到了影響。(3)外源基因的隨機(jī)整合不利于對(duì)其表達(dá)進(jìn)行控制。由于同源重組型表達(dá)載體存在不能穿梭、不是獨(dú)立自主復(fù)制、表達(dá)產(chǎn)量相對(duì)低等諸多特殊問題，因此，需要開放一種能克服上述問題的在絲狀真菌中可以獨(dú)立自主復(fù)制的穿梭質(zhì)粒。
本發(fā)明的目的在于提供可以在絲狀真菌中穿梭并獨(dú)立自主復(fù)制的載體質(zhì)粒，該載體質(zhì)粒包括的主要功能片段有a)牛的乳頭瘤病毒(BPV)片段；b)絲狀真菌的外源生物啟動(dòng)子；c)pBR322質(zhì)粒的PvuII和BamHI片段(包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和氨芐抗性基因)。本發(fā)明的目的還在于提供利用本發(fā)明的獨(dú)立自主復(fù)制載體質(zhì)粒生產(chǎn)多肽的方法，包括a)將外源基因與本發(fā)明的載體質(zhì)粒有效地連接；b)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞；c)在合適的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞并回收目的產(chǎn)物。
本發(fā)明的質(zhì)粒游離于宿主菌的染色體外，該載體攜帶的外源基因的表達(dá)不會(huì)由于整合而受到影響，始終以環(huán)狀DNA形式存在，保持了基因穩(wěn)定性。此外，外源基因在均一的核酸系列中有利于控制表達(dá)，并且質(zhì)粒游離排除了由于外源DNA整合而滅活宿主正?；蚧蚣せ钣泻虻目赡苄浴?br> 本發(fā)明的穿梭載體質(zhì)粒中所用的啟動(dòng)子可以是與絲狀真菌異源的任何外源生物啟動(dòng)子，其中優(yōu)選的是MT、SV40、35S啟動(dòng)子，MT啟動(dòng)子能在重金屬誘導(dǎo)下增加pBPV表達(dá)載體的表達(dá)調(diào)控能力。
本發(fā)明所選用的宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌和絲狀真菌，優(yōu)選絲狀真菌，更優(yōu)選的是曲霉菌屬。被轉(zhuǎn)化的絲狀真菌內(nèi)具有相對(duì)多而恒定的質(zhì)?？截悢?shù)，而且可以形成獨(dú)立的細(xì)胞株，并以孢子傳代的方式穩(wěn)定地傳代長期存活。本發(fā)明的載體不僅能表達(dá)原核生物的外源基因，而且能表達(dá)哺乳動(dòng)物、人的病毒部分基因(HBsAg，并裝配成22nm顆粒)；也能表達(dá)HAV的全部閱讀框架基因，并在體內(nèi)還可裝配成完整的病毒顆粒(HAV，27～32nm)。從外，還能表達(dá)并外泌具生物活性的蛋白酶和人神經(jīng)生長因子(hNGF)，其表達(dá)產(chǎn)物較原核表達(dá)系統(tǒng)更接近其自然狀態(tài)。所以利用本發(fā)明的表達(dá)載體及表達(dá)系統(tǒng)能夠高效穩(wěn)定地表達(dá)高活性的外源蛋白。
建立了高效表達(dá)的絲狀真菌系統(tǒng)，可以高效表達(dá)原核表達(dá)系統(tǒng)不能表達(dá)的外源真核基因。利用人們在發(fā)酵工業(yè)中積累的長期豐富的管理經(jīng)驗(yàn)及絲狀真菌發(fā)酵培養(yǎng)成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)具有其它任何系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢。
下面用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
圖1、顯示的載體質(zhì)粒圖譜是p50，該質(zhì)粒是用于表達(dá)乙肝表面抗原基因和甲肝的全部閱讀框架基因。圖2、顯示的載體質(zhì)粒圖譜是pBPV-hLY，該質(zhì)粒是用于表達(dá)人溶菌酶基因。圖3、顯示的載體質(zhì)粒圖譜是pSNB7，該質(zhì)粒是用于表達(dá)人神經(jīng)生長因子基因。圖4、顯示的是MT啟動(dòng)子在重金屬Cd2+誘導(dǎo)下人溶菌酶表達(dá)量的曲線圖。圖5、顯示的是甲肝的免疫電鏡圖。圖左側(cè)是發(fā)酵菌絲提取物中甲肝顆粒，圖右側(cè)是陽性甲肝顆粒。圖6、顯示的是乙肝的免疫電鏡圖。圖左側(cè)是發(fā)酵上清中HBsAg顆粒，圖右側(cè)是陽性HBsAg顆粒。圖7、顯示的是雞胚背根神經(jīng)節(jié)加入NGF陽性轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)上清液后神經(jīng)節(jié)的生長圖(圖7-1，陽性對(duì)照?qǐng)D7-2)。
實(shí)施例1自主復(fù)制型表達(dá)載體的構(gòu)建A.50載體(p50)1.說明大小11Kb原核系統(tǒng)構(gòu)件復(fù)制起始位點(diǎn)來源于pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)選擇標(biāo)記抗氨芐青霉素基因氨芐青霉素抗性真核系統(tǒng)構(gòu)件復(fù)制起始位點(diǎn)來源于BPV的復(fù)制起始位點(diǎn)啟動(dòng)子猴腎病毒(SV40)早期啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)BglII見說明書附圖，圖1。2.構(gòu)建過程(1).從pBPV上切下含BPV的BamHI-BamHI大小為7.9Kb的DNA片段。
以20μl pBPV質(zhì)粒(購自Pharmacia公司，20μg)、10μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶緩沖液E)、5μl限制性內(nèi)切酶BamHI(50unit)、65μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，37℃酶切5小時(shí)，低熔點(diǎn)膠法回收(參照《分子克隆》，第二版，(美)J.薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)獲得一個(gè)包含BPV的BamHI-BamHI大小為8Kb的DNA片段。(2).從pBR322中切下一個(gè)包含氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起始位點(diǎn)(Ori)PvuII-BamHI大小為2.67Kb的DNA片段。
以10μl pBR322質(zhì)粒(購自Pharmacia公司，20μg)、10μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶Core緩沖液)、5μl限制性內(nèi)切酶BamHI(50unit)、65μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，37℃酶切5小時(shí)，65℃，15min滅活BamHI，再補(bǔ)加5μl PvuII(50unit)，37℃酶切過夜，低熔點(diǎn)膠法回收(參照《分子克隆》，同上)獲得一個(gè)包含氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起始位點(diǎn)(Ori)PvuII-BamHI大小為2.67 Kb的DNA片段。(3).從猴腎病毒(SV40)上切下包含SV40早期啟動(dòng)子的PvuII-Hind III大小為0.34Kb的DNA片段。
以10μl SV40(購自Biolabs公司，20μg)、10μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶Core緩沖液)、5μl限制性內(nèi)切酶Hind III(50unit)、65μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，37℃酶切5小時(shí)，65℃，15min滅活BamHI，再補(bǔ)加5μlPvuII(50unit)，37℃酶切過夜，低熔點(diǎn)膠法回收(參照《分子克隆》，同上)獲得一個(gè)包含SV40早期啟動(dòng)子的PvuII-Hind III大小為0.34Kb的DNA片段。(4).將以上三個(gè)片段和序列為Hind III-BglII-BamHI的酶切位點(diǎn)連接、轉(zhuǎn)化。
將這四個(gè)片段混合液7μl、1μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司Ligase緩沖液)、1μl連接酶(Promega公司Ligase)為反應(yīng)體系，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli菌株JM109的感受態(tài)細(xì)胞(方法見《分子克隆》，同上)。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于氨芐青霉素LB平板。(5).篩選。
挑取氨芐青霉素LB平板上長出的菌落，提取質(zhì)粒(方法見《分子克隆》堿法提質(zhì)粒)，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，篩選出大小約為11Kb的質(zhì)粒。該質(zhì)粒用BamHI酶切，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，切出一個(gè)大小為7.9Kb的片段，則證明該質(zhì)粒帶有從pBPV上切下含BPV的BamHI-BamHIDNA片段。低熔點(diǎn)膠法回收另外的大小約3.1Kb的DNA片段，再用PvuII酶切，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，切成二個(gè)DNA片段，大小分別約為2 67Kb和0 34Kb，則證明該質(zhì)粒帶有從pBR322中切下一個(gè)包含氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起始位點(diǎn)(Ori)PvuII-BamHIDNA片段和從猴腎病毒(SV40)上切下的包含SV40早期啟動(dòng)子的PvuII-Hind III的DNA片段。完整質(zhì)粒用Hind III酶切，如切成二個(gè)DNA片段，大小分別為5.4Kb和5.6Kb，則證明該質(zhì)粒帶有的從pBPV上切下的含BPV的BamHI-BamHIDNA片段連接方向正確。完整質(zhì)粒用BglII酶切，切成一個(gè)線性DNA片段，證明該質(zhì)粒帶有酶切位點(diǎn)上的BglII位點(diǎn)。B.人的神經(jīng)生長因子表達(dá)載體(pSNB7)的構(gòu)建1.說明
大小11.1Kb原核系統(tǒng)構(gòu)件復(fù)制起始位點(diǎn)來源于pSP72的復(fù)制起始位點(diǎn)選擇標(biāo)記抗氨芐青霉素基因氨芐青霉素抗性真核系統(tǒng)構(gòu)件復(fù)制起始位點(diǎn)來源于BPV的復(fù)制起始位點(diǎn)啟動(dòng)子猴腎病毒(SV40)早期啟動(dòng)子插入外源片段人的神經(jīng)生長因子基因見說明書附圖，圖3。2.質(zhì)粒構(gòu)建a.pN9質(zhì)粒的構(gòu)建(1).pSp72-SV40片段的制備1.5ml離心管中加入8μg pSP72-SV40質(zhì)粒、20單位限制性內(nèi)切酶NcoI、20單位限制性內(nèi)切酶KpnI、5μl10倍反應(yīng)緩沖液A(Promega公司)、滅菌無離子水加至50μl，37℃溫育2小時(shí)后，電泳檢查已完全酶解，65℃ 15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。加入Klnow酶1μl，2.5mM 4xdNTP 1μl，37℃溫育半個(gè)小時(shí)，補(bǔ)平粘末端，65℃ 15分鐘滅活。加入堿性磷酸酶1單位，37℃ 1小時(shí)，對(duì)末端脫磷。加入1μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。走1％瓊脂糖凝膠，在354nm紫外燈下觀測，以透析帶電洗脫法進(jìn)行回收純化pSp72-SV40片段(見《分子克隆》第二版321頁)。(2).hNGF片段的制備250μl反應(yīng)體積中加入質(zhì)粒pNGFmp19(為β-hNGF的PCR片段重組入M13mp19構(gòu)建而成，詳見《科學(xué)通報(bào)》V.36 No.22 1745頁)10μg，限制性內(nèi)切酶Hind III和限制性內(nèi)切酶BamHI各20units，10倍反應(yīng)緩沖液5μl，補(bǔ)滅菌無離子水至50μl，37℃2小時(shí)。加入Klnow酶1μl，2.5mM 4xdNTP 1μl，37℃溫育半個(gè)小時(shí)，補(bǔ)平粘末端，65℃ 15分鐘滅活。走1％瓊脂糖凝膠，以透析帶電洗脫法進(jìn)行回收純化，得到hNGF片段。(3).將pSp72-SV40片段和hNGF片段連接、轉(zhuǎn)化。
取pSP72-SV40片段0.2μg、hNGF片段0.3μg、2單位連接酶、1μl連接酶反應(yīng)緩沖液、0.5μl 10mM ATP，滅菌無離子水加至10μl，在0.5ml離心管中，16℃過夜。連接反應(yīng)結(jié)束后，加入200μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞，混勻，在冰上放置30分鐘，然后熱沖擊90秒，再加入1ml SOC培養(yǎng)基，37℃溫育1小時(shí)，3000rpm離心2分鐘，去上清，用200μl SOC培養(yǎng)基將細(xì)胞涂布于帶有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。37℃培養(yǎng)過夜。(4).篩選。
在LB平板上挑取單細(xì)胞至試管中，試管中裝有含50μg/mlAp的3ml SOC培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)8-12小時(shí)，以堿法提取質(zhì)粒(見《分子克隆》第二版26頁)。用EcoRI酶切檢測加入質(zhì)粒DNA 1μg，限制性內(nèi)切酶EcoRI 2單位，高鹽緩沖液2μl，滅菌無離子水加至20μl，37℃溫育1小時(shí)，在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳半個(gè)小時(shí)后，紫外燈下觀測有一條約360bp大小的帶。說明此質(zhì)粒為pN9質(zhì)粒。b.pSN1質(zhì)粒的構(gòu)建(1)酶切pSP72-SV40載體。
加入20μg pSP72-SV40載體，20單位限制性內(nèi)切酶PvuII，5μl1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，5μl中鹽緩沖液，滅菌無離子水加至50μl，37℃溫育3小時(shí)。加入堿性磷酸酶1單位，37℃1小時(shí)，對(duì)末端脫磷。加入1μl 0.5MEDTA終止反應(yīng)。走1％瓊脂糖凝膠，在354nm紫外燈下觀測，以透析帶電洗脫法進(jìn)行回收純化，得到載體片段。(2)帶有ATG起始密碼子的hNGF片段的獲得。
加入20μg pN9質(zhì)粒，20單位限制性內(nèi)切酶SalI，20單位限制性內(nèi)切酶ClaI，5μl 1mg/ml BSA，5μl高鹽緩沖液，滅菌無離子水加至50μl，37℃溫育3小時(shí)。65℃15分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。加入Klnow酶1μl，2.5mM 4xdNTP 1μl，37℃溫育半個(gè)小時(shí)，補(bǔ)平粘末端，65℃ 15分鐘滅活。加入堿性磷酸酶1單位，37℃ 1小時(shí)，對(duì)末端脫磷。加入1μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)。走1％瓊脂糖凝膠，在354nm紫外燈下觀測，以透析帶電洗脫法進(jìn)行回收純化，得到帶有ATG起始密碼子的hNGF片段。(3)連接、轉(zhuǎn)化。
pSP72-SV40載體片段0.2μg、帶有ATG起始密碼子的hNGF片段0.3μg、2單位連接酶、1μl連接酶反應(yīng)緩沖液、0.5μl 10mM ATP，滅菌無離子水加至10μl，在0.5ml離心管中，16℃過夜。
連接反應(yīng)結(jié)束后，加入200μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞，混勻，在冰上放置30分鐘，然后熱沖擊90秒，再加入1ml SOC培養(yǎng)基，37℃溫育1小時(shí)，3000rpm離心2分鐘，去上清，用200μl SOC培養(yǎng)基將細(xì)胞涂布于帶有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。37℃培養(yǎng)過夜。(4)篩選。
在LB平板上挑取單細(xì)胞至試管中，試管中裝有含50μg/mlAp的3ml SOC培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)8-12小時(shí)，以堿法提取質(zhì)粒。酶切檢查20μl反應(yīng)體系中加入質(zhì)粒DNA 1μg，限制性內(nèi)切酶SacI 2單位，緩沖液2μl，滅菌無離子水加至20μl，37℃酶切1小時(shí)，紫外燈下觀測到一條約680bp的帶。證明得到了pSN1質(zhì)粒。
Southern印跡法證明該質(zhì)粒上帶有hNGF片段。取hNGFM13mp19 Hind III+BamIII雙酶切片段。利用Promega公司的Nick Translation System制備hNGF探針(詳見Promega公司data sheet DS002)。分取pN9，pSN1，pSP72-SV40，大腸桿菌DNA，hNGFM13mp19 0.5μg在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳1小時(shí)。按照《分子克隆》第二版475-490頁的方法將DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，固定，預(yù)雜交，雜交，放射自顯影。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pN9、pSN1，hNGFM13mp19為陽性，另兩個(gè)為陰性。c.pSNB7質(zhì)粒的構(gòu)建(1)酶切pSN1質(zhì)粒。
50μl反應(yīng)體系中加入20μg pSN1質(zhì)粒，20單位限制性內(nèi)切酶BglII，5μl1mg/ml BSA，5μl中鹽緩沖液，滅菌無離子水加至50μl，37℃溫育3小時(shí)。65℃滅活限制性內(nèi)切酶。(2)酶切pBPV質(zhì)粒(Pharmacia公司)。
50μl反應(yīng)體系中加入20μg pSN1質(zhì)粒，20單位限制性內(nèi)切酶BamHI，5μl1mg/ml BSA，5μl緩沖液，滅菌無離子水加至50μl，37℃溫育3小時(shí)。(3)連接、轉(zhuǎn)化pSN1載體片段0.20μg、BPV片段0.3μg、2單位連接酶、1μl連接酶反應(yīng)緩沖液、0.5μl 10mM ATP，滅菌無離子水加至10μl，在0.5ml離心管中，16℃過夜。連接反應(yīng)結(jié)束后，加入200μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞，混勻，在冰上放置30分鐘，然后熱沖擊90秒，再加入1ml SOC培養(yǎng)基，37℃溫育1小時(shí)，3000rpm離心2分鐘，去上清，用200μl SOC培養(yǎng)基將細(xì)胞涂布于帶有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。37℃培養(yǎng)過夜。(4)篩選。
在LB平板上挑取單細(xì)胞至試管中，試管中裝有含50μg/mlAp的3ml SOC培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)8-12小時(shí)，以堿法提取質(zhì)粒。由于BPV片段有8Kb，分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于pSN1載體，直接走電泳就看出區(qū)別。另外用EcoRI酶切可看到四條帶，如無插入則只有三條帶。C.人溶菌酶表達(dá)載體(pBPV-hLY)的構(gòu)建1.說明大小13kb原核系統(tǒng)構(gòu)件復(fù)制起始位點(diǎn)來源于pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)選擇標(biāo)記抗氨芐青霉素基因氨芐青霉素抗性真核系統(tǒng)構(gòu)件復(fù)制起始位點(diǎn)來源于BPV的復(fù)制起始位點(diǎn)啟動(dòng)子小鼠攝金蛋白基因(MT)啟動(dòng)子插入的外源片段人工合成的人溶菌酶基因見說明書附圖，圖2。2.質(zhì)粒構(gòu)建人溶菌酶基因采用DNA合成儀人工合成(錢世鈞等，生物工程學(xué)報(bào)，1994，10(1)34-38)，并克隆在質(zhì)粒pBluescriptII KS+上(簡稱質(zhì)粒KS+-hLY)。將克隆在質(zhì)粒pBluescriptII KS+的人工人溶菌酶基因構(gòu)建在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pBPV上，從而獲得人溶菌酶基因的絲狀真菌表達(dá)重組質(zhì)粒。
以10μl質(zhì)粒KS+-hLY(20μg)、10μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶緩沖液C)、6μl限制性內(nèi)切酶XhoI(60unit)、1.5μl限制性內(nèi)切酶SacII(15unit)、72.5μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，酶切并回收獲得一個(gè)包含人溶菌酶全基因并且5′端比人溶菌酶DNA片段大30個(gè)堿基的DNA片段；以3μl質(zhì)粒pBPV(5μg)、5μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶緩沖液C)、1μl限制性內(nèi)切酶XhoI(10unit)、0.5μl限制性內(nèi)切酶SacII(5unit)、40.5μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，酶切并回收獲得載體大片段。然后，以8μl回收的人溶菌酶基因片段(約0.1μg)和pBPV片段(約0.8μg)混合液、1μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司Ligase緩沖液)、1μl連接酶(Promega公司Ligase)為反應(yīng)體系，連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli菌株JM109的感受態(tài)細(xì)胞(方法見《分子克隆》，同上)。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于氨芐青霉素LB平板。
挑取氨芐青霉素LB平板上長出的菌落，提取質(zhì)粒(方法見《分子克隆》堿法提質(zhì)粒)，然后酶切(同上)并進(jìn)行瓊脂糖電泳檢驗(yàn)篩出陽性轉(zhuǎn)化子，從而獲得人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒，即簡稱pBPV-hLY。實(shí)施例2用p50載體表達(dá)甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因并在米曲霉(A.oryzae)內(nèi)裝配成病毒顆粒一、構(gòu)建甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為了在絲狀真菌中表達(dá)甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因，必須構(gòu)建能在絲狀真菌中表達(dá)的重組表達(dá)質(zhì)粒。甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因來源于甲肝原始質(zhì)粒(高峰等，病毒學(xué)報(bào)，1989，5301)。甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因構(gòu)建在本課題組構(gòu)建的絲狀真菌表達(dá)載體p50上，從而獲得甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因的絲狀真菌表達(dá)重組質(zhì)粒。
以10μl甲肝原始質(zhì)粒(20μg)、10μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶Core緩沖液)、5μl限制性內(nèi)切酶Smal I(60unit)、75μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，25℃酶切5小時(shí)，65℃，15min滅活Smal I，再補(bǔ)加5μl Stu I，37℃酶切過夜，低熔點(diǎn)膠法回收(參照《分子克隆》，同上)獲得一個(gè)包含甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因的大小約為6.8Kb的DNA片段；以3μl質(zhì)粒p50(5μg)、5μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司的限制性內(nèi)切酶緩沖液C)、1μl限制性內(nèi)切酶BglII(10unit)、41μl滅菌無離子水為反應(yīng)體系，37℃酶切并回收獲得載體片段。然后，將回收的載體片段3’端和5’端補(bǔ)平50μl反應(yīng)終體系中，9μlDNA片段(含5mMol/lMgCl2)，1μlklenow酶(500u/ml)，5μl緩沖液D，1μl dNTP(2.5mM)，34μl滅菌無離子水，37℃反應(yīng)15min，75℃滅活10min。加入等體積50μl TE(pH7.6)，用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，上清待用。連接反應(yīng)回收的甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因片段2μl和上步制備的平頭的p50載體DNA片段5μl混合液7μl、1μl反應(yīng)緩沖液(Promega公司Ligase緩沖液)、1μl連接酶(Promega公司Ligase)為反應(yīng)體系，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli菌株JMl09的感受態(tài)細(xì)胞(方法見《分子克隆》，同上)。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂于氨芐青霉素LB平板。
挑取氨芐青霉素LB平板上長出的菌落，提取質(zhì)粒(方法見《分子克隆》堿法提質(zhì)粒)，然后EcoRI酶切，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，如切出一個(gè)大小約7Kb的片段，則初步認(rèn)為是陽性轉(zhuǎn)化子，從而獲得甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因的重組質(zhì)粒，即簡稱p50-HAV。二、絲狀真菌原生質(zhì)體制備用無菌水或真菌液體培養(yǎng)基(葡萄糖100g、酵母提取物10g、玉米漿0.5g、加水至1000ml)少許從真菌土豆斜面(PDA斜面，200g馬鈴薯浸出液、20g葡萄糖、15g瓊脂、加水至1000ml)上洗下真菌孢子(米曲霉Apergillus oryzae)，獲得孢子懸液。將孢子懸液點(diǎn)種在覆蓋真菌固體培養(yǎng)基(真菌液體培養(yǎng)基+1.5％瓊脂)上的玻璃紙上，30℃培養(yǎng)過夜。制備新鮮的纖維素酶和蝸牛酶混合酶液(含0.5％纖維素酶+0.5％蝸牛酶的0.6M NaCl溶液)，過濾除菌。將長出真菌斑的玻璃紙從培養(yǎng)基平板上揭下并放入混合酶液中涮洗，洗下真菌斑。將含有真菌斑的混合酶液在37℃保溫2小時(shí)。顯微鏡檢查是否菌絲已酶解成球形細(xì)胞。將酶解好的原生質(zhì)體液1500rpm低速離心，沉淀用0.6M NaCl液懸浮。然后，再次1500rpm低速離心，將沉淀用少量0.6M NaCl溶液(通常200μl)懸浮，從而得到原生質(zhì)體懸液。三、原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化將200μl原生質(zhì)體懸液和20μg重組質(zhì)粒p50-HAV DNA放入電擊小杯，以電壓104V，脈沖數(shù)210，脈沖時(shí)間62.5μs、持續(xù)時(shí)間3.2s為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)電擊轉(zhuǎn)化(電穿孔儀Electric Gene Transfer System Baekon 2000，購自Baekon公司)。將電擊后混合液置于冰上10分鐘，稀釋后涂于真菌平板，30℃培養(yǎng)過夜。將長出的小菌落單個(gè)挑取，接到土豆斜面上，30℃培養(yǎng)3天。四、絲狀真菌陽性轉(zhuǎn)化株的鑒定提取米曲霉(A。oryzae)轉(zhuǎn)化株全DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的鑒定。提取真菌轉(zhuǎn)化株全DNA。將土豆斜面上轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)接種到真菌固體平板上，培養(yǎng)3～4天。然后，從平板上取0.2g轉(zhuǎn)化株菌絲體與200μl TE(pH8.0)(含少量巰基乙醇)、200μl飽和酚、少許金鋼沙混合，-70℃凍一小時(shí)。然后磨碎，12000rpm高速離心，取上清，用飽和酚氯仿、氯仿各抽提二遍，-20℃乙醇沉淀。
采用DIG酶聯(lián)免疫Dot Blotting檢出陽性轉(zhuǎn)化子。1)探針制備。按DIGLabeling and Detection kit(購自Boehringer公司)方法，將1μg酶切回收的HAV基因片段與dNTP、帶DIG標(biāo)記的dUTP、Klenow混合，37℃保溫過夜。然后，沉淀DNA于-20℃保存。2)點(diǎn)樣。將提取的米曲霉(A。oryzae)轉(zhuǎn)化株全DNA、陽性對(duì)照重組質(zhì)粒p50-HAV、陰性對(duì)照米曲霉(A。oryzae)原始株點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，風(fēng)干。3)DNA變性。將風(fēng)干的膜用10％SDS液處理3分鐘，然后置于變性液(0.5N NaOH、1.5M NaCl)作用5分鐘，重復(fù)一遍，最后放于中和液(pH7.4，1M Tris-HCl、1.5M NaCl)作用5分鐘，重復(fù)兩遍。風(fēng)干后，80℃烤干1小時(shí)。4)預(yù)雜交。將已烘干的膜放入雜交袋，放入適量的預(yù)雜交液(5×SSC、1％封閉試劑、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS)，68℃水浴過夜。5)探針變性。將適量探針加入100μl預(yù)雜交液中，100℃水浴5分鐘，然后立即插入冰中。6)雜交。倒出預(yù)雜交液，加入含適量變性探針的預(yù)雜交液，即雜交液。68℃雜交過夜。7)洗膜。用含2×SSC、0.1％SDS的溶液68℃作用15分鐘，重復(fù)兩遍；然后，用含0.1×SSC，0.1％SDS的溶液68℃作用15分鐘，重復(fù)兩遍。7)顯色。用洗液(pH7.5，含0.1M馬來酸、0.15M NaCl、0.3％Tween20)洗1～5分鐘。然后，加入1％封閉液(pH7.5，含1％封閉試劑、0.1M馬來酸、0.15MNaCl)封閉，室溫作用30分鐘。倒出1％封閉液，加入用1％封閉液稀釋的Anti-DIG-AP偶聯(lián)劑—即抗體溶液，室溫作用30分鐘。再用洗液洗15分鐘，重復(fù)兩次。最后用檢測溶液(pH9.5，含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，50mMMgCl2，)平衡后，加入10ml發(fā)色低物溶液(含33μl NBT，66μl X-phosphate的檢測溶液)。顯色后，用TE緩沖液(pH8.0)終止反應(yīng)。
如果轉(zhuǎn)化株全DNA顯出藍(lán)色，與陽性對(duì)照相同，那么可以確定此轉(zhuǎn)化株為陽性轉(zhuǎn)化株。也就是說，此陽性轉(zhuǎn)化株中已轉(zhuǎn)入了甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因。五、轉(zhuǎn)入絲狀真菌中的穿梭質(zhì)?；卮┧蟮紼.coli按上述方法提取HAV陽性絲狀真菌轉(zhuǎn)化株的全DNA，然后采用電穿孔法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞。將200μl原生質(zhì)體懸液和20μgDNA放入電擊小杯，以電壓104V，脈沖數(shù)210，脈沖時(shí)間62.5μs、持續(xù)時(shí)間3.2s為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。將電擊后混合液置于冰上10分鐘，稀釋后涂于真菌平板，30℃培養(yǎng)過夜。將長出的小菌落單個(gè)挑取，接到土豆斜面上，30℃培養(yǎng)3天。涂青霉素抗性選擇平板培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒用酶切法(EcoRI)檢測陽性。六、甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因在米曲霉A.oryzae中表達(dá)的鑒定HAV的提取。將陽性轉(zhuǎn)化株接種于真菌液體培養(yǎng)基，進(jìn)行28℃液體搖床發(fā)酵。培養(yǎng)三天后，紗布過濾菌絲體。液氮冷凍菌絲體，在攪拌機(jī)中攪碎，加入0.05M Tris-HCl(pH7.4)緩沖液繼續(xù)攪碎。紗布過濾攪碎液，向菌絲體中再加入緩沖液再攪碎一次。將兩次的過濾液3000rpm，15min離心，取上清。上清液中加入PEG(10g/100ml)、NaCl(2.3g/100ml)，充分?jǐn)嚢?-4小時(shí)，4℃冰箱過夜。8000rpm/min，離心20min，取沉淀。將沉淀重新懸浮于緩沖液中，攪拌懸浮液15min。加入體積比為2∶1的氯仿，充分振蕩混勻。10000rpm/min，離心10min，將上清33,000rpm/min，超離心1.5hr，棄上清，將沉淀溶于適量緩沖液，4℃保存。
點(diǎn)雜交檢驗(yàn)。分別取5-10μl陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品、陽性HAV、陰性對(duì)照米曲霉(A。oryzae)原始株的發(fā)酵液的病毒提取液點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，風(fēng)干，用封閉液(1％小牛血清溶于包被液)43℃封閉1hr。棄去封閉液，加入適量的酶標(biāo)抗體，43℃反應(yīng)1hr。將膜浸在洗液(0.85％生理鹽水，0.05％Tween-20)中1-2min。將膜浸在發(fā)色液(12.5ml 0.2M Na2HPO4，12.1ml0.1M檸檬酸，0.07ml 3％H2O2，40mg鄰苯二胺，25ml蒸餾水)中，避光發(fā)色0-15min。陽性對(duì)照產(chǎn)生黃褐色，陰性對(duì)照無色，陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品亦產(chǎn)生黃褐色，證明陽性轉(zhuǎn)化株中有甲肝病毒(HAV)全部開放閱讀框架基因的表達(dá)。
ELISA檢驗(yàn)(北京生物制品研究所提供試劑盒)。在微量反應(yīng)板上每孔加入100μl包被液(2.39g NaHCO3，1.59g Na2CO3，加蒸餾水至1000ml)，再分別在每孔中加入100μl倍比稀釋的陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品、陽性HAV、陰性對(duì)照米曲霉(A。oryzae)原始株的發(fā)酵液的病毒提取液。放入4℃冰箱過夜。取出板，倒出包被液，用洗液(0.85％生理鹽水，0.05％Tween-20)洗滌三次。每孔加入100μl酶標(biāo)抗體，43℃水浴1hr?；厥彰靠椎拿笜?biāo)抗體，用洗液(0.85％生理鹽水，0.05％Tween-20)洗滌孔二次。每孔加入100μl發(fā)色液(12.5ml 0.2MNa2HPO4，12.1ml 0.1M檸檬酸，0.07ml 3％H2O2，40mg聯(lián)苯二胺，25ml蒸餾水)，避光發(fā)色0-40min，每孔加入50μl硫酸終止反應(yīng)。陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品的P/N值約10。
免疫電鏡觀察并照相。將陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品于15,000rpm/min，4℃離心30min，取上清稀釋成不同稀釋度，分別加入相同濃度的抗體，混合后4℃冰箱過夜。15,000rpm，4℃離心30min，將沉淀溶解至5-10μl，點(diǎn)銅網(wǎng)，電鏡(日立H600型)放大40,000倍觀察，并獲得了與HAV顆粒大小相同的直徑為27-32nm的病毒顆粒照片。見


書，圖5。
免疫雙向瓊脂擴(kuò)散檢驗(yàn)。將陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品作為抗原制備抗血清。參照《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》第153頁“雙向瓊脂擴(kuò)散檢驗(yàn)”方法，進(jìn)行免疫雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。在陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品與抗血清之間產(chǎn)生沉淀線，在陰性對(duì)照米曲霉(A。oryzae)原始株的發(fā)酵液的病毒提取液與抗血清之間沒有沉淀線產(chǎn)生。實(shí)施例3用p50載體表達(dá)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)并在米曲霉(A.oryzae)內(nèi)裝配成病毒顆粒一、構(gòu)建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因來源于質(zhì)粒pAFH8HB(劉宏迪等，微生物學(xué)報(bào)30(2)98-104，1990)。該基因兩端為BglII粘性末端，同實(shí)施例2(一)的方法，將此基因與p50連接，構(gòu)建并篩選出了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，即簡稱p50-HBsAg。二、絲狀真菌原生質(zhì)體制備同實(shí)施例2的方法。三、原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化同實(shí)施例2的方法。四、絲狀真菌陽性轉(zhuǎn)化株的鑒定同實(shí)施例2的方法。五、轉(zhuǎn)入絲狀真菌中的穿梭質(zhì)粒回穿梭到E.coli同實(shí)施例2的方法，采用DIG酶聯(lián)免疫Dot Blotting檢出陽性轉(zhuǎn)化子。六、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在米曲霉A.oryzae中表達(dá)的鑒定同實(shí)施例2的方法，點(diǎn)雜交檢驗(yàn)，陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HBV樣品產(chǎn)生黃褐色，證明陽性轉(zhuǎn)化株中有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的表達(dá)。同實(shí)施例2的方法，ELISA檢驗(yàn)出陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品的P/N值約20。同實(shí)施例2的方法，免疫電鏡觀察并照相，獲得了與HBV顆粒大小相同的直徑為22nm的病毒顆粒照片。實(shí)施例4用p50載體表達(dá)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)并在黑曲霉(A.niger)內(nèi)裝配成病毒顆粒一、構(gòu)建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒同實(shí)施例3方法，構(gòu)建并篩選出了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，即簡稱p50-HBsAg。二、絲狀真菌原生質(zhì)體制備同實(shí)施例2的方法。三、原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化同實(shí)施例2的方法。四、絲狀真菌陽性轉(zhuǎn)化株的鑒定同實(shí)施例2的方法。五、轉(zhuǎn)入絲狀真菌中的穿梭質(zhì)粒回穿梭到E.coli同實(shí)施例2的方法，采用DIG酶聯(lián)免疫Dot Blotting檢出陽性轉(zhuǎn)化子。六、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在黑曲霉A.niger中表達(dá)的鑒定同實(shí)施例2的方法，點(diǎn)雜交檢驗(yàn)，陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HBV樣品產(chǎn)生黃褐色，證明陽性轉(zhuǎn)化株中有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的表達(dá)。同實(shí)施例2的方法，ELISA檢驗(yàn)出陽性轉(zhuǎn)化株中提取的HAV樣品的P/N值約20。同實(shí)施例2的方法，免疫電鏡觀察并照相，獲得了與HBV顆粒大小相同的直徑為22nm的病毒顆粒照片。見

書，圖6。實(shí)施例5用人的神經(jīng)生長因子表達(dá)載體(pSNB7)在米曲霉中表達(dá)有活性的人的神經(jīng)生長因子(hNGF)一、構(gòu)建人的神經(jīng)生長因子的重組表達(dá)質(zhì)粒(pSNB7)見實(shí)施例1B。二、絲狀真菌原生質(zhì)體制備見實(shí)施例2。三、原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化見實(shí)施例2。四、絲狀真菌陽性轉(zhuǎn)化株的鑒定提取米曲霉(A。oryzae)轉(zhuǎn)化株全DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的鑒定。將土豆斜面上轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)接種到真菌固體平板上，培養(yǎng)3～4天。然后，從平板上取0.2g轉(zhuǎn)化株菌絲體與200μl TE(pH8.0)(含少量巰基乙醇)、200μl飽和酚、少許金鋼沙混合，-70℃凍一小時(shí)。然后磨碎，12000rpm高速離心，取上清，用飽和酚氯仿、氯仿各抽提二遍，-20℃乙醇沉淀。
采用PCR的方法檢出陽性轉(zhuǎn)化子。取下列引物(由微生物所中心實(shí)驗(yàn)室合成)引物15’-CCAAGCTTGTCATCATCCCATCCCATCT-3’引物25’-CGGATCCTATCTCACAGCCTTCCTGCTG-3’50μl反應(yīng)體積引物1，2各加50pmol，質(zhì)粒DNA 0.1μg，2.5mM 4×dNTP4μl，Taq酶1unit，Taq酶10×緩沖液5μl，滅菌無離子水加至50μl。PCR反應(yīng)條件95℃ 1min、56℃ 1min、72℃ 2min，25個(gè)循環(huán)。1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測有一條約360bp大小的帶。證明此為陽性轉(zhuǎn)化株。電就是說，此陽性轉(zhuǎn)化株中已轉(zhuǎn)入了人的神經(jīng)生長因子基因。五、轉(zhuǎn)入絲狀真菌中的穿梭質(zhì)?；卮┧蟮紼.coli稱取10g干重菌絲，提取真菌的全DNA。采用CsCl-EB連續(xù)梯度平衡離心分離質(zhì)粒，方法詳見《分子克隆》第二版28-30頁。CsCl濃度為1g/ml，溶液終密度為1.55g/ml，EB(溴化乙錠)終濃度為740μg/ml。轉(zhuǎn)頭采用Beckman Ti35，4℃45000轉(zhuǎn)離心24小時(shí)。紫外燈下觀測除底部的RNA外有兩條DNA帶，穿刺取下面的帶。然后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在青霉素抗性選擇平板培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒用酶切、PCR法檢測陽性。六、hNGF外泌表達(dá)的檢測ELISA檢測。將菌株BEN1.1(pSNB7質(zhì)粒轉(zhuǎn)入米曲霉的菌株)接入真菌液體培養(yǎng)基，30℃下在搖床上培養(yǎng)3天，紗布過濾，取上清。采用直接法進(jìn)行檢測(詳見杜平編著的《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》221頁)，以上清+包被緩沖液(見實(shí)施例2)進(jìn)行包被，以PBS(PH7.0 0.05M)緩沖液作為稀釋液，以PBS+0.5％Tween20作為洗滌液，Anti-hNGF(sigma公司)稀釋40倍作為工作濃度。最后檢測P/N值高達(dá)20。
Western印跡法檢測。1)SDS-PAGE電泳發(fā)酵上清液用丙酮沉淀得到總蛋白。取BEN1.1、米曲霉(空白)各10-20μg蛋白，按《分子克隆》第二版上的方法電泳。2)轉(zhuǎn)膜石墨底槽放2張用陽極緩沖液I(0.3M Tris、20％甲醇)浸濕的濾紙，再在其上放2張用陽極緩沖液II(0.025M Tris、20％甲醇)濕透的濾紙；然后放上硝酸纖維素膜，在膜上放上電泳后的聚丙烯酰胺膠，最后在膠上放2張用陰極緩沖液(40mM甘氨酸、50mM Tris、20％甲醇)浸濕的濾紙。除氣泡，蓋緊石墨蓋，通電(0.65mA/cm2gel)1小時(shí)。3)抗體結(jié)合將放入雜交袋的硝酸纖維素膜用封閉液(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20、1％BSA)進(jìn)行預(yù)雜交(0.1ml/cm2NC)，室溫振蕩1小時(shí)。倒出預(yù)雜交液后，加入用封閉液稀釋的I抗血清(Anti-hNGF)，室溫振蕩1小時(shí)。然后，用TBST(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20)洗10分鐘，再用TBS洗10分鐘，重復(fù)兩次。洗膜后，加入用封閉液稀釋的Anti-rabbit IgG(Fc)ApConjμgate，室溫振蕩1小時(shí)。如上述方式洗膜。4)顯色加入顯色液(pH9.5，100mM Tris-HCl、5mM MgCl2、以及適量NBT和BCIP)，37℃避光保溫3-6分鐘，顯色后用TE緩沖液(pH8.0)終止反應(yīng)。
生物活性檢測。樣品送至軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，將表達(dá)產(chǎn)物人的NGF加入培養(yǎng)7天的雞胚背根神經(jīng)節(jié)和新生小鼠背根神經(jīng)節(jié)的原代培養(yǎng)細(xì)胞中，以從生物組織中提取的NGF為陽性對(duì)照，通過感覺神經(jīng)元突起的生長進(jìn)行了確認(rèn)。見說明書附圖，圖7。實(shí)施例6用人溶菌酶表達(dá)載體在絲狀真菌中表達(dá)人溶菌酶基因一、構(gòu)建人溶菌酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒見實(shí)施例1C。二、絲狀真菌原生質(zhì)體制備用無菌水或真菌液體培養(yǎng)基(葡萄糖100g、酵母提取物10g、玉米漿0.5g、加水至1000ml)少許從真菌土豆斜面(PDA斜面，200g馬鈴薯浸出液、20g葡萄糖、15g瓊脂、加水至1000ml)上洗下真菌孢子(米曲霉Apergillus oryzae)，獲得孢子懸液。將孢子懸液點(diǎn)種在覆蓋真菌固體培養(yǎng)基(真菌液體培養(yǎng)基+1.5％瓊脂)上的玻璃紙上，30℃培養(yǎng)過夜。制備新鮮的纖維素酶和蝸牛酶混合酶液(含0.5％纖維素酶+0.5％蝸牛酶的0.6M NaCl溶液)，過濾除菌。將長出真菌斑的玻璃紙從培養(yǎng)基平板上揭下并放入混合酶液中涮洗，洗下真菌斑。將含有真菌斑的混合酶液在37℃保溫2小時(shí)。顯微鏡檢查是否菌絲已酶解成球形細(xì)胞。將酶解好的原生質(zhì)體液1500rpm低速離心，沉淀用0.6M NaCl液懸浮。然后，再次1500rpm低速離心，將沉淀用少量0.6M NaCl溶液(通常200μl)懸浮，從而得到原生質(zhì)體懸液。三、原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化將200μl原生質(zhì)體懸液和20μg重組質(zhì)粒pBPV-hLY DNA放入電擊小杯，以電壓104V，脈沖數(shù)210，脈沖時(shí)間62.5μs、持續(xù)時(shí)間3.2s為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)電擊轉(zhuǎn)化(電穿孔儀Electric Gene Transfer System Baekon 2000，購自Baekon公司)。將電擊后混合液置于冰上10分鐘，稀釋后涂于真菌平板，30℃培養(yǎng)過夜。將長出的小菌落單個(gè)挑取，接到土豆斜面上，30℃培養(yǎng)3天。四、絲狀真菌陽性轉(zhuǎn)化株的鑒定提取米曲霉(A。oryzae)轉(zhuǎn)化株全DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的鑒定。將土豆斜面上轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)接種到真菌固體平板上，培養(yǎng)3～4天。然后，從平板上取0.2g轉(zhuǎn)化株菌絲體與200μl TE(pH8.0)(含少量巰基乙醇)、200μl飽和酚、少許金鋼沙混合，-70℃凍一小時(shí)。然后磨碎，12000rpm高速離心，取上清，用飽和酚氯仿、氯仿各抽提二遍，-20℃乙醇沉淀。
采用DIG酶聯(lián)免疫Dot Blotting檢出陽性轉(zhuǎn)化子。1)探針制備。按DIGLabeling and Detection kit(購自Boehringer公司)方法，將1μg酶切回收的溶菌酶基因片段與dNTP、帶DIG的dUTP、Klenow混合，37℃保溫過夜。然后，-20℃保存。2)點(diǎn)樣。將提取的米曲霉(A.oryzae)轉(zhuǎn)化株全DNA、陽性對(duì)照重組質(zhì)粒pBPV-hLY、陰性對(duì)照米曲霉(A.oryzae)原始株點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，風(fēng)干。3)DNA變性。將風(fēng)干的膜用10％SDS液處理3分鐘，然后置于變性液(0.5N NaOH、1.5M NaCl)作用5分鐘，重復(fù)一遍，最后放于中和液(pH7.4，1M Tris-HCl、1.5M NaCl)作用5分鐘，重復(fù)兩遍。風(fēng)干后，80℃烤干1小時(shí)。4)預(yù)雜交。將已烘干的膜放入雜交袋，放入適量的預(yù)雜交液(5×SSC、1％封閉試劑、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS)，68℃水浴過夜。5)探針變性。將適量探針加入100μl預(yù)雜交液中，100℃水浴5分鐘，然后立即插入冰中。6)雜交。倒出預(yù)雜交液，加入含適量變性探針的預(yù)雜交液，即雜交液。68℃雜交過夜。7)洗膜。用含2×SSC、0.1％SDS的溶液68℃作用15分鐘，重復(fù)兩遍；然后，用含0.1×SSC，0.1％SDS的溶液68℃作用15分鐘，重復(fù)兩遍。7)顯色。用洗液(pH7.5，含0.1M馬來酸、0.15M NaCl、0.3％Tween20)洗1～5分鐘。然后，加入1％封閉液(pH7.5，含1％封閉試劑、0.1M馬來酸、0.15M NaCl)封閉，室溫作用30分鐘。倒出1％封閉液，加入用1％封閉液稀釋的Anti-DIG-AP偶聯(lián)劑—即抗體溶液，室溫作用30分鐘。再用洗液洗15分鐘，重復(fù)兩次。最后用檢測溶液(pH9.5，含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，50mM MgCl2，)平衡后，加入10ml發(fā)色低物溶液(含33μl NBT，66μl X-phosphate的檢測溶液)。顯色后，用TE緩沖液(pH8.0)終止反應(yīng)。
如果轉(zhuǎn)化株全DNA顯出藍(lán)紫色，與陽性對(duì)照相同，那么可以確定此轉(zhuǎn)化株為陽性轉(zhuǎn)化株。也就是說，此陽性轉(zhuǎn)化株中已轉(zhuǎn)入了人溶菌酶基因。五、抗血清制備用于Western印跡法配制天然人溶菌酶抗原溶液11mg人溶菌酶溶于5.5ml無離子水，-20℃配制完全佐劑9份液體石蠟、1份羊毛脂、1mg卡介苗混合后，研缽磨成乳濁液，4℃保存。挑選實(shí)驗(yàn)用家兔2只，體重各約3公斤。常規(guī)免疫注射，耳靜脈采抗血清。首先，用蘸二甲苯的脫脂棉球摩擦耳部，使血管充分?jǐn)U張；然后，用酒精棉涂去二甲苯，將針頭刺入血管，血即淌出。采血可達(dá)20ml。采血結(jié)束后，用脫脂棉壓迫采血點(diǎn)2～3分鐘，即可止血。將采集到的血液4000g離心，分離得血清。然后過濾除菌，制成冷凍干粉。六、人溶菌酶基因在米曲霉A.oryzae中誘導(dǎo)表達(dá)及外泌的鑒定重組質(zhì)粒pBPV-hLY含鼠攝金蛋白啟動(dòng)子，以Cd2+等重金屬離子為誘導(dǎo)物能激活它，使它大量表達(dá)插入的外源基因產(chǎn)物。因此，培養(yǎng)液中加入一定濃度氯化鎘可以誘導(dǎo)插入pBPV的人溶菌酶基因表達(dá)。
將發(fā)酵上清濃縮并用透析袋透析，同時(shí)將磨碎菌絲體、12000rpm離心后的上清液透析濃縮，然后進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳(參考《分子克隆》方法)。
Western印跡法鑒定人溶菌酶蛋白存在。1)轉(zhuǎn)膜。放三張濾紙于正極側(cè)的多孔墊片上，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mM甘氨酸、48mM Tris、0.037％SDS、20％甲醇)浸濕；然后放上已浸濕的硝酸纖維素濾膜，再放上SDS-PAGE膠；最后，放三張已浸濕的濾紙?jiān)谀z上，并將兩側(cè)多孔墊片夾好插入轉(zhuǎn)移槽中。加入3升轉(zhuǎn)移緩沖液，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移(電流1.5A)。2)抗體結(jié)合。將放入雜交袋的硝酸纖維素膜用封閉液(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20、1％BSA)進(jìn)行預(yù)雜交(0.1ml/cm2膜)，室溫振蕩1小時(shí)。倒出預(yù)雜交液后，加入用封閉液稀釋的I抗血清(人溶菌酶兔抗血清)，室溫振蕩1小時(shí)。然后，用TBST(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20)洗10分鐘，再用TBS洗10分鐘，重復(fù)兩次。洗膜后，加入用封閉液稀釋的Anti-rabbit IgG(Fc)Ap偶聯(lián)劑，室溫振蕩1小時(shí)。如上述方式洗膜。3)顯色。加入10ml顯色液(pH9.5，100mMTris-HCl、5mM MgCl2、以及33μl NBT和66μl BCIP)，37℃避光保溫3-6分鐘，顯色后用TE緩沖液(pH8.0)終止反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陽性對(duì)照天然人溶菌酶(Sigma公司產(chǎn)品)對(duì)應(yīng)的位置上，加100μg氯化鎘的發(fā)酵上清和菌絲體提取液也顯相同的藍(lán)紫色，說明發(fā)酵產(chǎn)物與Sigma公司的天然人溶菌酶有相同的特異性抗原抗體反應(yīng)，一定濃度的Cd2+能成功誘導(dǎo)表達(dá)并外泌人溶菌酶蛋白。七、米曲霉(A.oryzae)誘導(dǎo)表達(dá)并外泌的人溶菌酶生物活性測定根據(jù)文獻(xiàn)，我們采用測定天然溶菌酶的通用方法測定表達(dá)的人溶菌酶生物活性。同上，將陽性轉(zhuǎn)化株接種于真菌液體培養(yǎng)基，進(jìn)行30℃液體發(fā)酵。發(fā)酵24小時(shí)后，以每100毫升培養(yǎng)液加終濃度為100μg氯化鎘，平行加入陽性轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵兩天。最后，用紗布過濾分離菌絲體，并分別保存發(fā)酵上清和菌絲體。
分別測定發(fā)酵上清和菌絲體提取液。配制OD450≈0.3的Micrococcuslysodeikticus懸液(pH6.4，含50mM磷酸鹽和50mM NaCl)。將300μl發(fā)酵上清液與1.2mlM.lysodeikticus懸液混合，測OD450。37℃保溫10分鐘后，再測OD450。從而，我們測出了發(fā)酵上清液的酶活酶活力＝OD450差值/(0.3×10)×106(單位/升發(fā)酵上清液)酶活單位的定義在上述條件下，于450nm光波長處，每分鐘使吸光度降低0.001所需的酶量。
實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)酵上清和菌絲體提取液中都有溶菌酶酶活，也就是說，在米曲霉(A.oryzae)陽性轉(zhuǎn)化株發(fā)酵上清和菌絲體中都存在具有生物活性的人溶菌酶。八、氯化鎘最適誘導(dǎo)條件的研究培養(yǎng)液中氯化鎘濃度的不同對(duì)陽性轉(zhuǎn)化株的誘導(dǎo)效應(yīng)是不同的。如果氯化鎘濃度太低，那么將無法激活攝金蛋白啟動(dòng)子，當(dāng)然無法誘導(dǎo)人溶菌酶基因表達(dá)；如果氯化鎘濃度太高，反而將使A.oryzae代謝和分裂生長受抑制，從而也無法高效表達(dá)人溶菌酶。因此，摸索出最佳的誘導(dǎo)物濃度是完全必要的。
以不同濃度氯化鎘誘導(dǎo)人溶菌酶表達(dá)并且測定酶活。兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖3a中曲線A、曲線B)表明，1.25μg/ml發(fā)酵液的氯化鎘誘導(dǎo)濃度可能是最佳的。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)摸索出的條件，在其它條件如氯化鎘加入時(shí)間等固定的前提下，以每100ml517號(hào)轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)液加入0、50、75、100、125、150、175、200μg的氯化鎘，測定發(fā)酵上清液及菌體粗提液的酶活。以此數(shù)據(jù)作氯化鎘最適誘導(dǎo)濃度曲線，如圖3b為氯化鎘最適誘導(dǎo)濃度曲線，圖3c為氯化鎘誘導(dǎo)的菌體內(nèi)酶活。
由氯化鎘最適誘導(dǎo)濃度曲線可知，在其他條件一定時(shí)，培養(yǎng)液中1.25μg/ml的氯化鎘誘導(dǎo)終濃度為最適誘導(dǎo)濃度；在此氯化鎘誘導(dǎo)濃度下，發(fā)酵液中最大的人溶菌酶外泌量為50000單位/升，即發(fā)酵液中人溶菌酶量為0.5mg/l(按文獻(xiàn)報(bào)道方法換算，Kozo Tsuchiya et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.38109-114)。九、重組質(zhì)粒pBPV-hLY為獨(dú)立自主復(fù)制的穿梭質(zhì)粒的研究我們利用Western印跡法和重組質(zhì)粒pBPV-hLY的回穿梭來驗(yàn)證該重組質(zhì)粒為獨(dú)立自主復(fù)制的穿梭質(zhì)粒。
利用Western印跡法，我們能證明重組質(zhì)粒pBPV-hLY在絲狀真菌中是否以游離狀態(tài)存在。Westem印跡法過程為1)樣品電泳。提取米曲霉陽性轉(zhuǎn)化子全DNA(見標(biāo)題四內(nèi)容)，然后將全DNA樣品、陽性對(duì)照重組質(zhì)粒pBPV-hLY、陰性對(duì)照原始米曲霉全DNA點(diǎn)樣走瓊脂糖電泳，25V。2)膠變性。電泳完畢后，將凝膠置于1.5M NaCl、0.5M NaOH中浸泡45分鐘并且不斷振蕩，使DNA變性。3)膠中和。將凝膠置于無離子水中漂洗后，浸泡于1M Tris-HCl(pH7.4)、1.5MNaCl溶液中，不斷振蕩15分鐘，重復(fù)兩次。4)轉(zhuǎn)膜。將兩張長條濾紙放在轉(zhuǎn)移槽平臺(tái)上，濾紙兩端伸入兩側(cè)裝有10×SSC的槽中。待濾紙濕透后，趕出氣泡而后將凝膠背面朝上放于濕濾紙上，除氣泡。用保鮮膜圍繞凝膠四周，然后把已浸濕的尼龍膜置于其上，除氣泡。在尼龍膜上再放兩張濕濾紙，除氣泡。最后，將一打紙巾放在濾紙上，并用一個(gè)約500克的重物壓在最上面。持續(xù)24小時(shí)。5)膜烘干。取下尼龍膜，放入6×SSC中室溫泡10分鐘。然后，取出晾干。將晾干的尼龍膜放于80℃烘干2小時(shí)。6)雜交。取出后，采用上述方法(見標(biāo)題四內(nèi)容)進(jìn)行DIG酶聯(lián)雜交。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與陽性對(duì)照重組質(zhì)粒pBPV-hLY相對(duì)應(yīng)的位置上，米曲霉(A.oryzae)陽性轉(zhuǎn)化株的全DNA提取物有相同的藍(lán)紫色，即米曲霉(A.oryzae)陽性轉(zhuǎn)化株中，重組質(zhì)粒pBPV-hLY以獨(dú)立自主復(fù)制的方式游離存在。
進(jìn)行轉(zhuǎn)入絲狀真菌中的穿梭質(zhì)粒回穿梭到E.coli的實(shí)驗(yàn)方法，我們可以證實(shí)重為穿梭質(zhì)粒。提取真菌的全DNA，然后以電壓5kv，脈沖數(shù)28，脈沖時(shí)間62.5us，持續(xù)時(shí)間3.2s為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)完成電擊轉(zhuǎn)化新鮮培養(yǎng)的E.coliDH5α。涂氨芐青霉素抗性選擇平板培養(yǎng)。挑轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒(見《分子克隆》，同上)按上述方法酶切、PCR法、Southern印跡法檢測陽性。
上述穿梭質(zhì)?；卮┧蟮紼.coli的實(shí)驗(yàn)表明，在米曲霉(A.oryzae)中的重組質(zhì)粒pBPV-hLY能穿梭回E.coli，也即穿梭質(zhì)粒。
權(quán)利要求
1.一類可以在絲狀真菌中獨(dú)立復(fù)制、在絲狀真菌和大腸桿菌中獨(dú)立穿梭的載體質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒含有下述主要功能片段a)牛的乳頭瘤病毒(BPV)片段；b)絲狀真菌的外源生物啟動(dòng)子；c)pBR322質(zhì)粒的PvuII和BamHI片段，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和氨芐抗性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的載體質(zhì)粒，其中用于轉(zhuǎn)化的宿主菌是絲狀真菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的載體質(zhì)粒，其中的外源生物啟動(dòng)子是MT、SV40或35S啟動(dòng)子。
4.一種用絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)多肽的方法，包括用權(quán)利要求1所述的獨(dú)立自主復(fù)制的穿梭載體質(zhì)粒在絲狀真菌中表達(dá)所述的多肽基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的宿主菌是絲狀真菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或6的方法，其中的啟動(dòng)子為MT、SV40或35S啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中被表達(dá)的基因是與絲狀真菌異源的任何外源基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中的外源基因是人β-NGF基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中的外源基因是HBsAg基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中的外源基因是HAV基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中的外源基因是HAV全部閱讀框架基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中的外源基因是人溶菌酶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類可以在絲狀真菌中獨(dú)立自主復(fù)制的穿梭載體質(zhì)粒及其在表達(dá)外源基因中的應(yīng)用。本發(fā)明的載體質(zhì)粒包括的主要功能片段有:a)牛的乳頭瘤病毒(BPV)片段;b)絲狀真菌的外源生物啟動(dòng)子;c)pBR322質(zhì)粒的PvuII和BamHI片段。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1190673SQ9610464
公開日1998年8月19日 申請(qǐng)日期1996年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月29日
發(fā)明者劉宏迪, 孫彤, 張軍, 郭偉, 王焱 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所