專利名稱：可可的酶處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用來(lái)改善可可豆肉或可可汁的風(fēng)味前體成份的酶促處理方法，利用這種方法可使得各種發(fā)酵狀態(tài)下的可可豆得以利用。
巧克力的品質(zhì)直接受到可可豆的生長(zhǎng)地理?xiàng)l件、基因來(lái)源以及可可豆的加工條件的影響，即從可可豆在田地里生長(zhǎng)到在工廠中進(jìn)行加工處理都對(duì)巧克力的品質(zhì)有影響。在生長(zhǎng)可可的國(guó)家，可可收獲后經(jīng)發(fā)酵和自然干燥以使風(fēng)味前體出現(xiàn)。但是成熟可可豆的收獲時(shí)機(jī)和可可豆的發(fā)酵條件并不總是得到充分控制的。另外，Theobroma cacao種的三種主要可可樹(shù)Criollo，F(xiàn)orastero和Trinitario所長(zhǎng)出的可可豆各自具有不同的成分。最后還有一點(diǎn)是，在將可可豆運(yùn)至專門(mén)從事可可豆加工的國(guó)家的運(yùn)輸過(guò)程中，干豆可能會(huì)被損壞。因此工業(yè)生產(chǎn)中必須正視同一批可可豆會(huì)出現(xiàn)組份不同的問(wèn)題(例如，見(jiàn)Smaffer M.，TheManufacturing Confectioner，92-94，June 1994)。
然后，經(jīng)發(fā)酵并干燥處理的可可豆一般都經(jīng)不同程度的碾磨，脫去外面的豆皮，然后進(jìn)行焙炒，適當(dāng)時(shí)配以堿化處理，這樣做是為了使可可呈現(xiàn)香味和顏色。焙炒步驟還包括在還原糖和蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物，特別是氨基酸和水解產(chǎn)物之間的美拉德反應(yīng)(Maillard reaction) (Wood and Lass，Cocoa，LongmanScientific & Technical，Longman Group UK，England，1985，ISBN 0-582-46352-1)。
風(fēng)味前體僅在可可豆的自然發(fā)酵中出現(xiàn)，是水解反應(yīng)的結(jié)果。有關(guān)未發(fā)酵可可豆或可可豆碎塊的玻璃容器內(nèi)保溫實(shí)驗(yàn)表明，這些水解反應(yīng)依賴于PH值、溫度以及酶的區(qū)域化和可可豆中底物的區(qū)域化。此外水解反應(yīng)對(duì)多酚的存在也很敏感。因此利用丙酮從可可豆中提取多酚是有益的，將上述可可豆在醋酸中保溫而使酶及底物非區(qū)域化也是有好處的(Biehl B.et a1.，J.Sci.Food.Agric.，33，1280-1290，1982)。
此外，其他研究表明，可可豆至少含有3種涉及可可風(fēng)味前體的出現(xiàn)的質(zhì)子活性物，即在PH 3.5時(shí)具有最佳活性的蛋白質(zhì)內(nèi)切酶，在PH 5.8時(shí)具有最佳活性的羧肽酶和在PH 7時(shí)具有最佳活性的氨肽酶。有關(guān)除去多酚的純化了的可可豆球蛋白水解反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)采用了工業(yè)用蛋白酶和/或純化可可蛋白質(zhì)內(nèi)切酶和羧肽酶，該實(shí)驗(yàn)表明，水解球蛋白優(yōu)選連續(xù)地在PH 3.5條件下使用可可蛋白質(zhì)內(nèi)切酶，然后在PH5-6下使用可可羧肽酶或工業(yè)用羧肽酶，用這種方法使可得到水解產(chǎn)物和氨基酸成分，它們有益于后續(xù)在還原糖存在的條件下焙炒混合物過(guò)程中產(chǎn)生可可風(fēng)味(Voigt J.et al.，F(xiàn)ood Chemistry，50，177-184，1994)。
此外，US2965490介紹了一種用于對(duì)未發(fā)酵可可豆(青可可豆)進(jìn)行玻璃容器內(nèi)水解的方法，這種方法可以替代可可豆的自然發(fā)酵。為達(dá)此目的，青可可豆蛋白質(zhì)被酸水解或酶促水解，上述可可豆中的碳水化合物被酶促水解為單糖，兩種水解物在無(wú)水條件下、一定溫度下反應(yīng)足夠時(shí)間，產(chǎn)生一種風(fēng)味物質(zhì)。然而應(yīng)該說(shuō)明的是，青可可豆中的多酚極大地限制了儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的酶促水解作用。
最后，上述方法和研究明顯是為了用一種對(duì)青可可豆(由多酚造成的問(wèn)題)或是對(duì)可可豆的鈍化蛋白質(zhì)(已除去多酚)進(jìn)行受控酶促水解反應(yīng)的方法來(lái)替代可可豆的自然發(fā)酵。此外，人們尚不清楚在焙炒過(guò)程中得以形成良好可可風(fēng)味所需的可可豆風(fēng)味前體的質(zhì)量和數(shù)量。
本發(fā)明的目的是為了克服經(jīng)發(fā)酵處理的可可豆的風(fēng)味前體成份的可變性問(wèn)題并且賦予可可豆肉或可汁最佳風(fēng)味前體成份。
為達(dá)此目的，本發(fā)明所涉及的方法中，可可豆肉或可可汁是用發(fā)酵1-15天的可可豆制得的，在PH3-8的含水介質(zhì)中至少與一種蛋白酶混合，將混合物在足夠溫度條件下保溫一定時(shí)間以水解蛋白質(zhì)和肽。
更適合的方法是，將混合物在足夠的溫度條件下保溫一定時(shí)間，使每克干物質(zhì)至少得到10μmol疏水氨基酸，和/或與可可豆中原先存在的水解產(chǎn)物相比至少多1.4倍。
利用本發(fā)明的方法可以增強(qiáng)可可豆中儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的水解作用，這種水解作用開(kāi)始發(fā)生在可可豆的自然發(fā)酵中，直到得到了足夠量的合適的氨基酸和水解產(chǎn)物成份為止。
按本發(fā)明的方法對(duì)混合物進(jìn)行下一步焙炒可以得到良好的可可風(fēng)味，與焙炒傳統(tǒng)發(fā)酵的可可豆得到的可可風(fēng)味比更強(qiáng)烈、濃郁。
也可以利用取自不同發(fā)酵階段的可可豆，例如不含足夠風(fēng)味前體的發(fā)酵不足的可可豆，不含合適的風(fēng)味前體成份的發(fā)酵過(guò)頭的可可豆或是如含有劣質(zhì)風(fēng)味前體成份的發(fā)酵不良的可可豆。同樣地，可可豆也可產(chǎn)自不同植物和來(lái)源于不同地區(qū)。因此，本發(fā)明的方法可以使不同來(lái)源和取自不同發(fā)酵階段的可可豆混合物產(chǎn)生的風(fēng)味前體成份得以均勻化。
此外，由于酶對(duì)可可豆中多酚的敏感性，用工業(yè)酶水解可可豆肉或可可汁令人出乎意料。本方法表明，自然發(fā)酵至少1天的可可豆的多酚含量明顯低，使得工業(yè)用酶在本方法中沒(méi)有被明顯抑制。另外由于青可可豆的多酚含量太高，所以本發(fā)明不采用青可可豆。
特別的是，添加轉(zhuǎn)化酶有利于提高混合物中天然葡萄糖和果糖的含量，這樣有助于在隨后對(duì)混合物進(jìn)行焙炒中可可風(fēng)味的形成。
最后，本發(fā)明中可應(yīng)用各種工業(yè)酶，可以產(chǎn)生消費(fèi)者所喜愛(ài)的各種不同的可可風(fēng)味。

圖1水與未充分發(fā)酵的可可豆的混合物在一種轉(zhuǎn)化酶作用下產(chǎn)生的葡萄糖的量隨處理時(shí)間及轉(zhuǎn)化酶添加量而變化的關(guān)系圖。
一個(gè)酶促活性單位被定義為每分鐘所轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物的μmol量。除有特殊說(shuō)明，百分量以重量表示。
″發(fā)酵不足的可可豆″是指可可豆經(jīng)傳統(tǒng)發(fā)酵1-4天并干燥，在聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE色譜分析中，其中的蛋白質(zhì)顯示出相當(dāng)于21kD和31kD/47kD儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的兩條可見(jiàn)區(qū)帶(見(jiàn)WO91/00913和WO91/00914)。而且，這種可可豆不含足夠的氨基酸和肽，在隨后的焙炒中不能形成可可風(fēng)味。
″發(fā)酵良好的可可豆″是指可可豆經(jīng)傳統(tǒng)發(fā)酵2-10天并干燥，在聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE色譜分析中，其中的蛋白質(zhì)顯示出相當(dāng)于21kD儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的一個(gè)可見(jiàn)區(qū)帶和相當(dāng)于被部分或完全降解了的21kD和47kD蛋白質(zhì)的兩條區(qū)帶。而且，這些可可豆含有足夠的氨基酸和肽，在隨后的焙炒中形成可可風(fēng)味。
″發(fā)酵過(guò)頭的可可豆″指經(jīng)7-15天傳統(tǒng)發(fā)酵并干燥的可可豆，在聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE色譜分析中，可可豆中的蛋白質(zhì)沒(méi)有顯示相當(dāng)于21kD和31kD/47kD儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的清晰可辨的兩條區(qū)帶。而且，這些可可豆含有足夠的氨基酸和不足量的肽在隨后的焙炒中形成可可風(fēng)味。
最后，為達(dá)本發(fā)明的目的，可可豆肉是通過(guò)用傳統(tǒng)方法碾磨發(fā)酵的或未發(fā)酵的可可豆得到的，可可汁是不同程度地碾磨可可豆或可可豆肉直至細(xì)胞中的可可脂被磨出而制得的。
為實(shí)施本方法，可可豆肉或可可汁是用經(jīng)1-15天發(fā)酵的可可豆制得的。因此，可以使用取自不同發(fā)酵階段如發(fā)酵不足的、發(fā)酵良好的、發(fā)酵過(guò)頭的或發(fā)酵不良的可可豆，可以混合使用或是以別的方式使用。采自不同基因型的可可樹(shù)的可可豆，如采自Theobroma cacao Criollo，F(xiàn)orastero和/或Trinitario的，可以被混合使用或以其他方式使用?？蓪⒖煽啥谷饣蚩煽芍鬯槌杉?xì)粉，不過(guò)必須注意，如果可可豆肉或可可汁在高于35-45℃的條件下進(jìn)行酶促處理，可可汁或可可塊將會(huì)熔化，這樣可使酶到達(dá)混合物最內(nèi)層的物質(zhì)處。
然后在PH3-8的水介質(zhì)中將可可豆肉或可可汁與至少一種蛋白酶混合。蛋白酶可以是由蛋白質(zhì)內(nèi)切酶、羧肽酶和氨肽酶組成的一組酶中的一種酶單獨(dú)使用，也可以多種酶混合使用。水性介質(zhì)的PH值可以通過(guò)添加無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸來(lái)調(diào)節(jié)或是通過(guò)選用食品加工中常用的緩沖劑，特別是由檸檬酸鹽、磷酸鹽或醋酸鹽制成的緩沖劑來(lái)調(diào)節(jié)。比較理想的是選用PH 3-5，以便激活可可豆內(nèi)的內(nèi)生蛋白質(zhì)內(nèi)切酶；不過(guò)，最終最好選用在此酸度范圍內(nèi)具有活性的工業(yè)酶。
混合物可含有10-80％，尤其是20-70％的可可豆肉或可可汁，每克混合物可含1-100單位的蛋白酶，尤其是0.01-5％(重量/重量)的商業(yè)性工業(yè)轉(zhuǎn)化酶制劑。
為實(shí)施本發(fā)明，混合物在足夠溫度下保溫一定時(shí)間以水解混合物中的蛋白質(zhì)和肽。
更合適的方法是，混合物在足夠溫度下保溫一定時(shí)間使得每克干物質(zhì)至少得到10μmol的疏水氨基酸和/或與原先存在于加工過(guò)的可可豆中的水解產(chǎn)物相比，水解產(chǎn)物至少多1.4倍，甚至多1.7或2倍。這種情況下可以將從用本發(fā)明方法處理前和處理后的可可豆中發(fā)現(xiàn)的相同的水解產(chǎn)物(肽和氨基酸)的數(shù)量進(jìn)行比較。還可注意到，較之未經(jīng)本發(fā)明方法處理的豆肉中存在的水解產(chǎn)物，有新的水解產(chǎn)物的存在，但它們受到青可可豆經(jīng)天然發(fā)酵而明顯具有的那些水解產(chǎn)物的限制。特別的是，將保留時(shí)間約為9，17，24和29.5分鐘的四種水解產(chǎn)物的數(shù)量在C18反相高效液相色譜(HPLC)柱(No.218TP54 Vydac；USA)上進(jìn)行洗提分析比較，以恒量流速為1ml/min、含有0.1％三氟乙酸和2％乙腈水溶液的洗脫液洗提10分鐘，然后用線性梯度的含0.1％三氟乙酸和2％-52.7％的乙腈的洗脫液洗提50分鐘。在215和280nm處檢測(cè)經(jīng)洗提的水解產(chǎn)物。
同樣還可注意到，作為疏水氨基酸，只有主要存在于經(jīng)本發(fā)明方法處理的豆肉中的那些，例如苯丙氨酸，亮氨酸和丙氨酸。
例如，為了得到足夠量的疏水氨基酸和水解產(chǎn)物，混合物可以在10-60℃下保溫30分鐘至20小時(shí)。但是，水解時(shí)間和溫度應(yīng)根據(jù)水解介質(zhì)、酶的種類(lèi)、可可豆的發(fā)酵程度和可可豆的來(lái)源情況選定。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，可可豆肉可可汁是由發(fā)酵1-15天的可可豆制備來(lái)的，與PH3-6的水性介質(zhì)混合，在40-60℃下將混合物保溫10分鐘至20小時(shí)，以提高可可蛋白質(zhì)內(nèi)切酶的活性，將介質(zhì)的PH調(diào)到4-8，至少向其中添加一種工業(yè)酶，將混合物在10-60℃下保溫5分鐘至20小時(shí)，以得到蛋白質(zhì)和肽的水解產(chǎn)物，但較合適的是每克干物質(zhì)至少得到10μmol的疏水氨基酸和/或與原先存在于可可豆中的水解產(chǎn)物相比，水解產(chǎn)物(肽和氨基酸)至少多1.4倍。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，可可豆肉或可可汁是由發(fā)酵1-15天的可可豆制備來(lái)的，與PH4-8的水性介質(zhì)混合，其中至少加一種蛋白酶，將混合物在10-60℃保溫5分鐘至20小時(shí)以得到蛋白質(zhì)和肽的水解產(chǎn)物，但較合適的是每克干物質(zhì)至少得到10μmol的疏水氨基酸和/或與原先存在于可可豆中的水解產(chǎn)物相比，水解產(chǎn)物(肽和氨基酸)至少多1.4倍，較為合適的PH值的范圍應(yīng)是能使可可蛋白內(nèi)切酶和工業(yè)蛋白酶都具有活性。
最后在本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案中，至少?gòu)挠赊D(zhuǎn)化酶、糖苷酶、纖維素酶、果膠酶和氧化酶組成的一組酶中選出一種酶添加至反應(yīng)混合物中。上述酶中的一種的較為合適的添加量是工業(yè)酶制劑的0.01-5％，或是每克混合物1-100單位。反應(yīng)混合物應(yīng)理解為上述被保溫一定時(shí)間的混合物中的一種(含有工業(yè)酶或是其他酶)。
特別的是，工業(yè)酶和/或可可蛋白質(zhì)內(nèi)切酶處理與一種工業(yè)轉(zhuǎn)化酶結(jié)合使用。這種處理可有利于產(chǎn)生疏水氨基酸和其他水解產(chǎn)物，在隨后的焙炒過(guò)程中疏水氨基酸和其他水解產(chǎn)物與葡萄糖和果糖結(jié)合產(chǎn)生一種更加濃郁的巧克力風(fēng)味(帶來(lái)了多種濃厚的味道)。出人意料的是，可可蛋白質(zhì)內(nèi)切酶、工業(yè)轉(zhuǎn)化酶和蛋白酶能在單一步驟中使用(本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案)，但是要正確選擇PH范圍，使所存酶(蛋白質(zhì)內(nèi)切酶、工業(yè)蛋白酶和轉(zhuǎn)化酶)都具有活性。
如果不利用轉(zhuǎn)化酶，也可在焙炒之前向最終混合物中至少添加0.1％的還原糖，比如添加0.1-5％的葡萄糖和/或果糖。
最后，可以用諸如加熱(80-120℃加熱1-60分鐘)或加高流體靜壓力的方法對(duì)酶進(jìn)行鈍化處理，以此來(lái)保護(hù)經(jīng)發(fā)明的方法處理的混合物。也可以用冷凍干燥法、噴霧干燥法、真空抽吸法或者在對(duì)混合物進(jìn)行微微加熱的過(guò)程中用蒸發(fā)水分的方法使混合物干燥。當(dāng)混合物干燥至水分含量低于10％，特別是低于5％時(shí)為止。還可以如EP0,226,727介紹的那樣對(duì)混合物進(jìn)行傳統(tǒng)的焙炒和/或堿化處理。
更為理想的是，在實(shí)施本發(fā)明方法后，將混合物PH調(diào)至5-6，然后干燥、焙炒。
本發(fā)明還涉及一種含有用發(fā)酵1-15天的可可豆制得的可可豆肉或可可汁、一種工業(yè)蛋白酶和/或一種工業(yè)轉(zhuǎn)化酶的組合物。如果酶仍有活性，每克組合物至少具有一個(gè)酶活性單位。即使在這些酶無(wú)活性的情況下，如組合物在進(jìn)行了熱變性處理后，借助合適的抗體，仍能將其識(shí)別出來(lái)，以此表明原來(lái)用過(guò)這種酶。
因此，這些組合物可含有由各種發(fā)酵階段的可可豆的混合物制得的和/或來(lái)自各種基因型可可樹(shù)的可可豆的混合物制得的可可豆肉或可可汁。這些組合物可以是前面所介紹的在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)的組合物中的一種。因此，本發(fā)明也涉及干燥了的組合物，包括添加有葡萄糖和/或果糖的，特別是含有經(jīng)焙炒上述組合物得到的可可(粉、豆肉、汁等等)。這些組合物尤其與現(xiàn)有技術(shù)中的不同，因?yàn)樗鼈兪怯珊懈鞣N發(fā)酵階段的可可豆和/或采自各種基因型可可樹(shù)的可可豆，和活性或無(wú)活性的工業(yè)蛋白酶和/或轉(zhuǎn)化酶的混合物獲得的。
下面將用實(shí)施例進(jìn)一步詳述本發(fā)明。在介紹實(shí)施例之前是各種測(cè)試說(shuō)明及圖的詳細(xì)說(shuō)明。不言而喻，這些實(shí)施例是以介紹發(fā)明的主題的方式給出的，并不構(gòu)成任何方式的限制。氨基酸分析將根據(jù)本發(fā)明鈍化了的混合物置于超聲槽內(nèi)10分鐘，在轉(zhuǎn)速9600rpm下均質(zhì)兩次，每次1分鐘，以10,000克的力將混合物離心10分鐘，得到上層液，將其過(guò)濾，然后用ACCQTagkit(Waters，USA)分析其氨基酸含量。
為分析氨基酸，將20μl的樣品和標(biāo)準(zhǔn)物與140μl的硼酸鹽緩沖劑混合，并添加40μl含有6-氨基喹啉基-N-羥基丁二酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)的試劑，將混合物渦流旋轉(zhuǎn)，室溫靜置1分鐘，在55℃加熱7分鐘，將其注入C18反相高效液相色譜(HPLC)柱中(Novapak C18，4μm；USA)，在36.5℃得到的氨基酸以1ml/min的流速洗脫，洗脫梯度是100％溶劑A 10分鐘，98％溶劑A 10.5分鐘，93％溶劑A 26分鐘，90％溶劑A 30分鐘，67％溶劑A 43分鐘，30％溶劑A 53分鐘，100％水54分鐘，100％的乙腈/水溶劑(65％/35％)60分鐘(溶劑A＝Waters提供的磷酸鹽緩沖液)。
獲得的經(jīng)洗脫的氨基酸用Applied Biosystem公司的980型檢測(cè)器395nm處進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)混合物中的氨基酸以每克干混合物中氨基酸的μmol量進(jìn)行定量，并同在相同條件下獲得的和經(jīng)洗脫的標(biāo)準(zhǔn)樣相比。水解產(chǎn)物分析向根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行鈍化的混和物中添加甲醇至甲醇濃度達(dá)70％，添加1.5ml 70％甲醇和100mg聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，室溫下將混合物緩緩攪動(dòng)1小時(shí)，以20,000g力離心兩次，每次10分鐘，得到上層液，真空抽吸除去甲醇，在丸粒中加0.35ml水，在20,000g力下使溶液離心5分鐘，將溶液過(guò)濾然后其水解產(chǎn)物的含量可用在C18反相高效液相色譜(HPLC)柱上洗提分析，用含0.1％三氟乙酸和2％的乙腈的水溶液以1ml/min的流速洗脫10分鐘，然后用線性梯度的含有0.1％三氟乙酸和2-52.7％乙腈洗脫液洗提50分鐘。洗提出的水解產(chǎn)物在215和280nm處進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明的方法范圍中，用本發(fā)明方法處理過(guò)的混合物中水解產(chǎn)物(肽和氨基酸)的量比未處理過(guò)的混合物中的水解產(chǎn)物的量增多了，其增加程度是通過(guò)比較保留時(shí)間為9，17，24，29.5分鐘的四種水解產(chǎn)物的洗脫峰的面積來(lái)確定的。這些面積通常可以在對(duì)采自Theobroma cacao Trinitario，Criollo和Forastero等可可樹(shù)的可可豆進(jìn)行傳統(tǒng)發(fā)酵的過(guò)程中見(jiàn)到。但是，不能排除的是，對(duì)采自一些特殊基因型的可可樹(shù)的可可豆進(jìn)行傳統(tǒng)發(fā)酵時(shí)也會(huì)出現(xiàn)其他的水解產(chǎn)物。糖分析對(duì)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行鈍化的混合物在60℃攪拌保溫30分鐘，在室溫下靜置15-30分鐘，以20,000g力離心兩次，每次5分鐘，上層液用C18 Waters Sep-Pak萃取柱柱體進(jìn)行過(guò)濾，再用SartoriusMinisart過(guò)濾器(SRP15，No.1755K)過(guò)濾濾液，借助Boehringer-Mannheim No.124028裝置(德國(guó))，用″God-Perid″分光光度法或是用HPLC法確定混合物中葡萄糖的含量。感官分析根據(jù)本發(fā)明方法制得的水解可可汁或可可豆肉經(jīng)加熱鈍化，PH調(diào)至5-6，真空微熱(＜60℃)蒸發(fā)水分或水分含量低于10％，然后在130℃烘箱中焙炒15分鐘，經(jīng)焙烤產(chǎn)生的風(fēng)味由風(fēng)味評(píng)嘗專家進(jìn)行評(píng)價(jià)。
將所有的風(fēng)味與那些在相同條件只經(jīng)簡(jiǎn)單干燥和焙炒的可可豆碎?；蚩煽芍a(chǎn)生的風(fēng)味相比較，這些可可豆碎粒和可可汁是用來(lái)充分發(fā)酵的Sanchez和Sulawesi可可豆及充分發(fā)酵過(guò)的Ghana可可豆制得的(本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的可可豆)。
每個(gè)樣品作以下感官評(píng)價(jià)″可可風(fēng)味″(得自Ghana豆)，″酸味″(大多數(shù)酸的稀水溶液產(chǎn)生的基本味覺(jué))，″苦味″(由奎寧之類(lèi)的各種各樣物質(zhì)的稀溶液產(chǎn)生的，在舌面及上顎后部感覺(jué)到的基底味覺(jué))，″澀味″(比名詞含義現(xiàn)已擴(kuò)大到多酚所具有的全部作用，它可引起多種物理感覺(jué)，即從抑制油滑感到醫(yī)療意義上的收斂性，包括組織的收斂感和/或收縮感)；″果味″(屬于花香的味感，使人想起蘋(píng)果、香蕉、梨等達(dá)到成熟階段的水果)；″花味″(相應(yīng)于使人聯(lián)想到玟瑰、茉莉花、眉豆、丁香等花的那種嗅覺(jué)感)；″煙味″(薰火腿的味道與氣味；一般是用木炭烘燒方法將發(fā)酵后的可可豆進(jìn)行干燥時(shí)感到的味道)；″霉味″和″生味″(未充分烘炒的、風(fēng)味未充分形成的可可特有的味道；與澀味及酸味有關(guān)；這種味道令人想起落花生)。對(duì)比例1采自Theobroma cacao Trinitario ICS-95的青可可豆肉經(jīng)傳統(tǒng)方法制備而得，在合適的時(shí)候，上述可可豆肉100mg，與多酚形成復(fù)合物的100mg PVPP和1ml PH 4的200mM檸檬酸緩沖液混合。將混合物在50℃保溫2小時(shí)，用1ml PH 7的200mM檸檬酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)PH值，在適當(dāng)時(shí)候添加40μl苯氧基肽酶A(0.06單位/μl，Sigma)，然后在25℃保溫1小時(shí)，然后在95℃對(duì)混合物加熱5分鐘，停止反應(yīng)。
用上述方法確定處理過(guò)的可可豆肉中的自由氨基酸含量和最初的可可豆肉及處理過(guò)的可可豆肉中的四種水解產(chǎn)物的洗脫峰面積，以此來(lái)分析可可蛋白質(zhì)的水解程度(與自然發(fā)酵可可豆有關(guān)的產(chǎn)物、氨基酸和肽)。
表1所示結(jié)果表明與原來(lái)存在于青可可豆中的風(fēng)味前體相比，在PH 4和PH 7條件下可可豆肉的自溶并不能造成風(fēng)味前體的顯著增加。另一方面，含有PVPP的可可豆肉在PH 4條件下的自溶，隨后在PH 7進(jìn)行蛋白質(zhì)酶促水解，則可使風(fēng)味前體顯著增加。因此青可可豆中的多酚確實(shí)有明顯的抑制作用。表1
(水解產(chǎn)物1-4的保留時(shí)間分別為9，17，24和29.5分鐘)對(duì)比例2可可豆肉是由采自Theobroma cacao trinitario ICS-95的可可豆經(jīng)1，2，3，4，5和7天的傳統(tǒng)發(fā)酵然后干燥制備的。用上述方法確定發(fā)酵了的可可豆肉中四種水解產(chǎn)物(水解產(chǎn)物與自然發(fā)酵的可可豆有關(guān))的洗脫峰面積，以此來(lái)分析可可豆肉蛋白質(zhì)的水解程度。分析結(jié)果如表2所示。
通過(guò)以聚丙烯酰胺凝膠為載體的SDS-PAGE色譜分析法進(jìn)行的可可豆肉蛋白質(zhì)分析表明，如果發(fā)酵至少3天的可可豆，31kD和47kD區(qū)帶的蛋白質(zhì)則高度降解。另一方面，如果是發(fā)酵1-7天的可可豆，21kD區(qū)帶的蛋白質(zhì)則不降解。
在烤爐中將各種可可豆肉在130℃下焙炒15分鐘。對(duì)可可豆肉產(chǎn)生的風(fēng)味進(jìn)行的感官分析表明，發(fā)酵3天的可可豆足以產(chǎn)生能被接受的可可風(fēng)味。實(shí)施例1采自Theobroma cacao trinitario ICS-95的可可豆經(jīng)1，2，3，4，5和7天的傳統(tǒng)發(fā)酵后干燥，經(jīng)傳統(tǒng)方法制成可可豆肉。1mlPH 4的200mM檸檬酸鹽緩沖劑與每一種可可豆肉100mg混合，將混合物在50℃保溫2小時(shí)，用1ml PH 7的200mM檸檬酸鹽緩沖劑調(diào)整PH值，加入40μl羧肽酶A(0.06單位/μl，Sigma)，25℃降溫1小時(shí)，然后通過(guò)95℃加熱5分鐘停止反應(yīng)。按照前述方法，通過(guò)確定自由氨基酸含量和可可豆肉的四種主要水解產(chǎn)物(與自然發(fā)酵可可豆有關(guān)的水解產(chǎn)物)的洗脫峰面積來(lái)分析可可蛋白質(zhì)的水解程度。
表2所示結(jié)果表明由發(fā)酵不足或發(fā)酵良好的可可豆制得的可可豆肉中的水解產(chǎn)物含量至少增加1.4倍。此外，所有經(jīng)處理了的可可豆肉中疏水氨基酸的含量和發(fā)酵3-7天的可可豆肉中疏水氨基酸的含量都高于每克干物質(zhì)10μmol。
表2
(四種水解產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為9，17，24，29.5分鐘)實(shí)施例2采自Theobroma cacao trinitario ICS-95的可可豆經(jīng)1，2，3，4，5和7天的傳統(tǒng)發(fā)酵并干燥，經(jīng)用傳統(tǒng)方法制成可可豆肉。100μlPH 4的200mM檸檬酸鹽緩沖劑與每一種可可豆肉100mg混合，將混合物在50℃保溫2小時(shí)，用100μl PH 7的200mM檸檬酸鹽緩沖劑調(diào)節(jié)PH值，添加40μl羧肽酶A(0.06單位/μl，Sigma)，25℃保溫1小時(shí)；然后通過(guò)95℃加熱5分鐘停止反應(yīng)。按照前述方法通過(guò)確定自由氨基酸含量和可可豆肉的四種主要水解產(chǎn)物(與自然發(fā)酵可可豆有關(guān)的水解產(chǎn)物)的洗脫峰面積來(lái)分析可可蛋白質(zhì)的水解程度。實(shí)施例3可可汁是由采自Theobroma cacao種的各種基因型的發(fā)酵不足的可可豆制備而得的。在聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE色譜分析中，這些可可豆的蛋白質(zhì)顯示出相當(dāng)于2lkD和31kD/47kD儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的三條可見(jiàn)區(qū)帶。
通過(guò)前述方法確定一部份可可汁的水解產(chǎn)物含量。1ml PH 4的200mM檸檬酸鹽緩沖劑與100mg可可汁混合，混合物50℃保溫2小時(shí)，以1ml PH 7的200mM檸檬酸緩沖劑調(diào)節(jié)PH值，加入40μl羧肽酶A(0.06單位/μl，Sigma)，25℃保溫1小時(shí)，然后95℃加熱5分鐘以停止反應(yīng)。最后，通過(guò)確定可可汁中水解產(chǎn)物含量的方法(如前所述)來(lái)分析蛋白質(zhì)的水解程度。
表3所示結(jié)果表明，用本發(fā)明的處理方法可顯著提高發(fā)酵不足可可豆混合物得到的可可汁中的風(fēng)味前體的含量。
表3
(四種水解產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為9，17，24，29.5分鐘)實(shí)施例4用實(shí)施例3的方法對(duì)采自Theobroma cacao的不同基因型可可樹(shù)的500g發(fā)酵不足的可可豆進(jìn)行酶處理。然后將失活了的混合物的PH值調(diào)至5-6，加入0.3％的葡萄糖和0.6％的果糖，以微熱(60℃)真空蒸發(fā)水分干燥混合物，直至其中水分含量低于5％，在一烤爐中130℃焙炒15分鐘，用前述的感官測(cè)試方法分析焙炒后的混合物產(chǎn)生的風(fēng)味。結(jié)果表明，按本發(fā)明的方法處理并焙炒，用發(fā)酵不足的可可豆制得的可可豆肉具有發(fā)酵良好并經(jīng)焙炒的可可豆所特有的那種濃郁的風(fēng)味。實(shí)施例5可可汁是由采自Theobroma cacao種的各種基因型的發(fā)酵過(guò)頭可可豆經(jīng)傳統(tǒng)方法制得的。在聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE色譜分析中，這些可可豆中的蛋白質(zhì)未顯示出任何相當(dāng)于21kD和31kD/47kD儲(chǔ)存蛋白質(zhì)的可見(jiàn)區(qū)帶。
通過(guò)前述方法確定(一份)可可汁中的水解產(chǎn)物含量。然后，將100mg可可汁中混入1ml PH 4的200mM檸檬酸鹽緩沖劑，混合物50℃保溫2小時(shí)，用1ml PH 7的200mH檸檬酸緩沖劑調(diào)節(jié)PH值，加入40μl羧肽酶A(0.06單位/μl，Sigma)，25℃保溫1小時(shí)，然后95℃加熱5分鐘停止反應(yīng)。最后，通過(guò)確定可可汁中水解產(chǎn)物含量(方法如前所述)來(lái)分析蛋白質(zhì)的水解程度。
表4所示結(jié)果表明按本發(fā)明的方法處理，可使發(fā)酵過(guò)頭的可可豆混合物制得的可可汁中的風(fēng)味前體含量顯著增加。
表4
(四種水解產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為9，17，24，29.5分鐘)實(shí)施例6采自Theobroma cacao的不同基因型可可樹(shù)的發(fā)酵過(guò)頭的可可豆500g，以實(shí)施例5的方法進(jìn)行酶處理。然后將失活了的混合物的PH值調(diào)至5-6，加入0.3％的葡萄糖和0.6％的果糖，以微熱(60℃)真空蒸發(fā)水分干燥混合物，直至其中水分含量低于5％，在一烤爐中130℃焙炒15分鐘，用前述的感官測(cè)試方法分析焙炒后的混合物產(chǎn)生的風(fēng)味。結(jié)果表明按本發(fā)明的方法處理并焙炒，用發(fā)酵過(guò)頭的可可豆制得的可可豆肉具有發(fā)酵良好并經(jīng)焙炒得到的可可豆所特有的那種濃郁的風(fēng)味。實(shí)施例7由傳統(tǒng)發(fā)酵1天的可可豆制備的幾種可可豆肉，將每種可可豆肉140g與含有各種活性單位的Maxinvert L10000轉(zhuǎn)化酶的水溶液混合，將混合物保溫30或120分鐘，在95℃下加熱1分鐘停止反應(yīng)，按前述方法確定每一混合物中葡萄糖的含量。圖1所示結(jié)果表明用單位1ml的轉(zhuǎn)化酶足以將80％以上的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。實(shí)施例8由發(fā)酵不足的Sanchez可可豆(175g)制得的可可汁，在用醋酸液調(diào)節(jié)PH至4.5的350ml水中50℃保溫2小時(shí)(蛋白質(zhì)內(nèi)切酶作用)，然后用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)PH至7，將混合物與MaxinvertL10000轉(zhuǎn)化酶(20單位/g)及羧肽酶A(0.06單位/ml)一起在50℃下保溫15分鐘，或者使混合物與20單位/g的Maxinvert L10000轉(zhuǎn)化酶及1％Corolase PP蛋白酶(Roehm，DE)一起在50℃下保溫15分鐘，或者使混合物與20單位/g的Maxinvert L10000轉(zhuǎn)化酶及1％Promod 192P蛋白酶(Biocatalyst，UK)或1％Promod 279P蛋白酶(Biocatalyst)一起在50℃下保溫60分鐘。在95℃下加熱混合物5分鐘停止反應(yīng)。最后，通過(guò)確定可可汁中水解產(chǎn)物含量(方法如前所述)來(lái)分析蛋白質(zhì)的水解程度。
反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)混合物PH值至5.2，干燥混合物，焙炒，按照前述方法進(jìn)行感官分析。
表5所示結(jié)果表明利用蛋白酶和轉(zhuǎn)化酶制劑形成了風(fēng)味前體。
表5
(三種水解產(chǎn)物的保溫時(shí)間分別為9，17，24分鐘)實(shí)施例9在相同條件下，如果用蛋白酶對(duì)發(fā)酵不足的IndonesianSulawesi可可豆進(jìn)行酶處理和在酶處理中用添加0.6％的果糖和0.3％的葡萄糖來(lái)替代轉(zhuǎn)化酶，將得到與實(shí)施例8相似的結(jié)果。實(shí)施例10用與實(shí)施例8相似的方法，讓用發(fā)酵不足的Sanchez可可豆制得的可可汁與20單位/g轉(zhuǎn)化酶和各種濃度的Promod 192蛋白酶一起保溫，使蛋白質(zhì)內(nèi)切酶和Promod 192蛋白酶在PH 4.5下同時(shí)或順次發(fā)生作用。將混合物在95℃下加熱5分鐘(除了測(cè)試5)停止反應(yīng)。通過(guò)確定可可汁中的水解產(chǎn)物含量(方法如前所述)來(lái)分析蛋白質(zhì)的水解程度。將混合物PH值調(diào)至5.2，干燥混合物，焙炒，按上述方法進(jìn)行感官分析。
反應(yīng)條件如表6所示。表7結(jié)果表明(1)可以降低酶濃度，(2)所有反應(yīng)可一步進(jìn)行，(3)將混合物在干燥之前可避免鈍化，(4)保溫時(shí)可減少水量。
表6
表7
(三種水解產(chǎn)物的保溫時(shí)間分別為9，17，24分鐘)反應(yīng)結(jié)束后，將混合物PH值調(diào)至5.2，然后干燥，焙炒，按照前述方法進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。結(jié)果表明發(fā)酵不足的可可豆所特有的那種不良風(fēng)味消失了。此外，處理后的混合物中生成的可可風(fēng)味與希望得到的風(fēng)味近似。以從測(cè)試5中獲得的樣品(水量降低的)為特別優(yōu)選。
權(quán)利要求
1.一種可可豆肉或可可汁的加工方法，其中可可豆肉或可可汁是由發(fā)酵1至15天的可可豆制備的，在PH3-8的水性介質(zhì)中至少它與一種工業(yè)蛋白酶混合，將該混合物在足夠的溫度下保溫一定時(shí)間以水解蛋白質(zhì)和肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將混合物在足夠的溫度下保溫一定時(shí)間使得每克干物質(zhì)至少得到10μmol的疏水氨基酸，并且獲得的水解產(chǎn)物與原先存在于可可豆中的相比至少多1.4倍。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中可可豆肉或可可汁是發(fā)酵1-15天的可可豆制備的，將其與PH3-6的水性介質(zhì)混合，該混合物在40-60℃范圍內(nèi)保溫10分鐘至20小時(shí)，將混合物PH值調(diào)至4-8，向其中至少添加一種工業(yè)蛋白酶，然后在10-60℃內(nèi)保溫5分鐘至20小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中可可豆肉或可可汁是由發(fā)酵1至15天的可可豆制備的，與PH4-8的水性介質(zhì)混合，至少向其中添加一種工業(yè)蛋白酶，在10-60℃下保溫5分鐘至20小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中可可豆肉或可可汁是由取自不同發(fā)酵階段和/或采自不同基因型的可可樹(shù)的可可豆的混合物制備的。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中混合物中含有10-80％的可可豆肉或可可汁，并且每克混合物中含1-100單位的工業(yè)蛋白酶。
7.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中還有，將從含有轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖酶、纖維素酶、果膠酶和氧化酶的一組酶中選出的至少一種工業(yè)酶添入混合物。
8.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中還有，至少將0.1％wt的還原糖添入混合物中。
9.一種組合物，含有用經(jīng)1-15天發(fā)酵的可可豆制備的可可豆肉或可可汁和一種工業(yè)蛋白酶和/或工業(yè)轉(zhuǎn)化酶。
10.一種可可，是對(duì)如權(quán)利要求9所述的組合物進(jìn)行焙炒得到的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可可豆肉或可可汁的酶促加工方法，其特征在于可可豆肉或可可汁是由發(fā)酵1-15天的可可豆制備的，在pH3-8的水性介質(zhì)中至少與一種工業(yè)蛋白酶混合，將混合物在足夠的溫度下保溫一定時(shí)間使得每克干物質(zhì)至少得到10μmol的疏水氨基酸，并且使獲得的水解產(chǎn)物與原先存在于可可豆中的相比至少多1.4倍；一種組合物，含有由發(fā)酵1-15天的可可豆制備的可可豆肉或可可汁和一種工業(yè)蛋白酶和/或一種工業(yè)轉(zhuǎn)化酶；一種由本發(fā)明所述的混合物經(jīng)焙炒而得的可可。
文檔編號(hào)A23G1/02GK1146862SQ9611100
公開(kāi)日1997年4月9日 申請(qǐng)日期1996年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月20日
發(fā)明者C·E·漢森, A·克呂佩爾, E·拉茨 申請(qǐng)人:雀巢制品公司