專利名稱：編碼神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶之多肽的DNA(神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶適用于在糖鏈工程改造中對糖脂進行結構、功能及其它分析)，或編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽的DNA。本發(fā)明還涉及使用重組摻入具有插入之DNA的重組質(zhì)粒、工業(yè)生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽的方法。
神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶(EC3.2.1.123)最初是從放線菌類的紅球菌屬菌株中分離的[The Journal of Biological Chemistry，Vol.261，PP.14278-14282(1986)]。它水解神經(jīng)鞘糖脂中糖鏈和神經(jīng)酰胺之間的糖苷鍵以釋放完整形式的糖鏈和神經(jīng)酰胺。已知紅球菌屬菌珠產(chǎn)生具有不同底物特異性的3種不同類型的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶(I，II，III)[The Journal of BiologicalChemistry.Vol.264.No.16 PP.9510-9519(1989)]。神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶的其他已知類型包括來自水蛭的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶(神經(jīng)酰胺聚糖酶)[Biochemical and Biophysical Researchcommunications，Vol.141，pp.346-352(1986)]。盡管這些酶在各種表面活化劑存在的條件下能有效地分散糖脂，但在缺乏表面活化劑時它們對糖脂的分解作用非常低。
另一方面，產(chǎn)生神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶的紅球菌屬菌株產(chǎn)生兩種蛋白質(zhì)激活物(激活物I，激活物II)。它們激活具有分子特異性的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶，使神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶即使在缺乏表面活性劑的條件下也能分解糖脂，同時伴隨有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶的產(chǎn)生。激活物I激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶I，而激活物II激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II。然而，一個已知的事實是激活物II激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II比神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶I更有效，盡管它也激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶I，且激活物II也能激活來自水蛭的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶(神經(jīng)酰胺聚糖酶)[The Journal of Biological Chemistry。Vol.266.No.12，pp.7919-7926(1991)]。
另外，已顯示分子量為69.2KDa的激活物II經(jīng)用胰蛋白酶完全消化而分解為27.9K Da，同時保留其在完整狀態(tài)下的活性(TheJournal of BioChemistry.Vol.110，PP.328-332(1991)]。在激活物II存在，神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II的最適PH向中性側(cè)移動，從而即使在pH7.5時神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II也有可能分解糖脂。這些事實表明使用激活物II可以使神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II在生理條件(接近中性pH，缺乏表面活性劑)下在活細胞中發(fā)揮其作用，否則在該條件下該酶的作用則受到損害。換句話說，已證實使用激活物II便能夠利用神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II來分析糖脂的細胞內(nèi)功能。
然而應注意的是，神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II對活細胞的作用需要大量的高純度神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II和神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。使用紅球菌屬生產(chǎn)菌株生產(chǎn)神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II需要長時間培養(yǎng)和許多純化步驟；獲得大量高純度的激活物II非常困難。因此，需要有一種以低成本和高純度生產(chǎn)該酶的方法。
另外，由于尚不知道神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的氨基酸序列和基因結構，所以難以用基因工程技術生產(chǎn)神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽的DNA。本發(fā)明的另一目的是提供以基因工程技術生產(chǎn)神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進行了深入的研究，努力分離出編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽的DNA，以闡明其堿基序列。結果，本發(fā)明人最終成功地分離了編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽的DNA并闡明了活性相關之基因結構的堿基序列。另外，他們成功地在導入了攜帶該DNA之質(zhì)粒載體的生物體中表達了該DNA。基于這些事實完成了本發(fā)明。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的序列的分離的DNA。具體地說，該分離的DNA包含選自(a)至(d)組中的DNA序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的DNA序列，或其片段；(b)編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的氨基酸序列的DNA序列或其片段；(c)編碼在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的氨基酸序列中缺失、加入、插入或取代一個或多個氨基酸所得之氨基酸序列的DNA序列，或其片段；(d)能夠與上面(a)至(c)中的任何一個雜交的DNA序列。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA，它包含本發(fā)明的分離的DNA，還涉及包含該重組DNA的載體和用該載體轉(zhuǎn)化的原核或真核細胞。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等同變異體的方法，該方法包含下列步驟(a)培養(yǎng)本發(fā)明的細胞；(b)從步驟(a)獲得的培養(yǎng)物中回收具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等同變異體。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等同變異體，它們是由本發(fā)明的方法生產(chǎn)或由本發(fā)明分離的DNA編碼的。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及與本發(fā)明分離的DNA特異性地雜交的合成的寡核苷酸探針或引物。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及特異性地結合本發(fā)明之多肽的抗體或其片段。
本發(fā)明首先確定了與神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性有關的氨基酸序列和其堿基序列，從而提供了神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的基因和以基因工程技術生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽的工業(yè)上有優(yōu)勢的方法。
使用編碼本發(fā)明神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的DNA序列，有可能探測與本發(fā)明的序列不同但可能編碼具有與本發(fā)明功能等同活性之多肽的DNA。另外，與編碼本發(fā)明神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的DNA序列相對應的氨基酸序列對于制備抗本發(fā)明的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的抗體也是有用的。


圖1圖解顯示了編碼神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的結構基因和ACTHI和ACTNH的探針序列。
圖2是質(zhì)粒pTAC2的構建圖解。
圖3是質(zhì)粒pEAC001的構建圖解。
圖4是質(zhì)粒pEAC101的構建圖解。
圖5是質(zhì)粒pEAC002的構建圖解。
圖6是質(zhì)粒pEAC201的構建圖解。
本文提到的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物是指在缺乏表面活性劑的條件下激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)。
可按下述方法檢測本文提到的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II活性該活性可按The Journal of Biological Chemistry.Vol.266，No.12，pp.7919-7926(1991)所述的方法，使用重組大腸桿菌細胞提取物測定。具體地說，在預先用0.85％NaCl調(diào)成等滲的40μl 20mmol乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中將40nmol脫唾液酸GM1、5μg牛血清白蛋白、0.3毫單位純化的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶與適當量的粗提物(神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物蛋白質(zhì))混和以產(chǎn)生標準試驗混合物。然后按The Journal of BiologicalChemictry.Vol.264，pp.9510-9519(1989)中所述的方法測定酶活性。37℃保溫60分鐘后，加入250μl碳酸氰溶液(pH11)以終止反應；按Park和Johnson[The Journal of BiologicalChemistry，Vol.181，pp.149-151(1949)]所述的方法估測還原活性。為進行對照實驗，單獨保溫底物和粗提物(神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物蛋白質(zhì))或底物和神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶。從上面的實際樣品值中減去兩個對照值之和。1單位神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物蛋白質(zhì)定義為在上述標準實驗條件下每分鐘增加1μmol脫唾液酸GM1的水解所需的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II蛋白質(zhì)量。
本說明書中所用的術語“具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽”不僅包括那些具有天然神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶的氨基酸序列的多肽，而且還包括在能激活神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶的前提下經(jīng)過諸如氨基酸的缺失，取代，插入或加入等氨基酸序列修飾所得的其變異體。本文所用的術語“天然神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物”包括但不限于紅球菌菌株產(chǎn)生的那些激活物。另外還包括來自其它微生物，如其它放線菌類，細菌，酵母，真菌，子囊菌類和擔子菌類的激活物和那些來自植物，動物，昆蟲和其它活體的激活物。
本文中所用的術語“功能等同變異體”定義如下由于在體內(nèi)或純化期間蛋白質(zhì)本身的修飾等或由于編碼蛋白質(zhì)之基因的多態(tài)性及變異，天然存在之蛋白質(zhì)可在其氨基的序列上發(fā)生氨基酸缺失，插入，增加，取代及其它變異。有一些在生理和生物活性上基本上等同于無變異蛋白質(zhì)的這類多肽是人們熟知的事實。結構上不同于相應的蛋白質(zhì)但與該蛋白質(zhì)沒有明顯的功能差異的多肽稱作功能等同變異體。
相同術語也適用于在一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列中人工導入這類變異而制成的多肽。盡管這樣可獲得更多不同形式的變異體，但所得的變異體解釋為功能等同變異體的前提是其生理活性基本上等同于原始無變異蛋白質(zhì)的活性。
例如，常報道大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)N端甲硫氨酸殘基受甲硫氨酸氨基肽酶的作用而被去掉，但一些這樣表達的蛋白質(zhì)具有甲硫氨酸殘基而其它的則沒有。然而甲硫氨酸殘基存在鈾否在大多數(shù)情況下不影響蛋白質(zhì)的活性。還已知在人白細胞介素2(IL-2)的氨基酸序列中用絲氨酸代替特定的半胱氨酸殘基所得的多肽保留其IL-2活性[Science，224，1431(1984)]。
另外，在基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)中，所需的蛋白質(zhì)常作為融合蛋白質(zhì)表達。例如，將來自另一蛋白質(zhì)的N端肽鏈加到所需蛋白質(zhì)的N端以增加所需蛋白質(zhì)的表達，或者經(jīng)過向所需蛋白質(zhì)的N或C端加入合適的肽鏈，表達該蛋白質(zhì)并使用對所加肽鏈表現(xiàn)出親和力的載體來幫助純化所需的蛋白質(zhì)。
另外，就測定基因上特定氨基酸的密碼子(三聯(lián)體堿基組合)而言，已知每種氨基酸存在1到6個密碼子。因此盡管依賴于氨基酸序列，但仍有許多編碼一種氨基酸的基因。在自然界中，基因是不穩(wěn)定的，常常發(fā)行核酸變異?；虻淖儺惪赡懿挥绊懰幋a的氨基酸序列(沉默變異)；在這種情況下，可以說產(chǎn)生了編碼相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使當分離了編碼特定氨基酸序列的基因，伴隨含有該基因之微生物的傳代而產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的多種基因的可能性是不可忽略的。
而且，以各種基因工程技術的方法人工產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的各種基因并不困難。
例如，當用于編碼所需蛋白質(zhì)的天然基因的密碼子在用于以基因工程技術產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主中的可利用性較低時，所表達的蛋白質(zhì)量有時不夠。在這種情況下，經(jīng)過人工將密碼子轉(zhuǎn)變成在該宿主中可利用性高的另一密碼子而不改變所編碼的氨基酸序列，即可增強所需蛋白質(zhì)的表達。當然，人工產(chǎn)生編碼特定氨基酸序列的各種基因也是可能的。因此，這種人工產(chǎn)生的不同多核苷酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它能編碼本文公開的氨基酸序列即可。
另外，由至少一種改變(如所需蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸殘基的缺失、加入、插入或取代)所得的多肽一般具有有功能上等同于所述蛋白質(zhì)的活性；編碼這類多肽的基因也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不管它是從天然來源分離還是人工產(chǎn)生的。
一般來說，功能等同變異體彼此間在編碼它們的基因方面通常是同源的。因此，能與本發(fā)明的基因雜交和編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II活性之多肽的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
下文詳細描述與神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II有關的本發(fā)明之DNA的分離和測序。
首先，獲得關于純化的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之部分氨基酸序列的資料。具體地說，對例如按照The Journal ofBiochemistry.Vol.110，pp.328-332(1991)中描述的方法純化的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II直接進行Edman降解[The Journalof Biological Chemistry，Vol.256，pp.7990-799)(1981)]，以使用常規(guī)方法測定氨基酸序列?；蛘撸山?jīng)過特異性的蛋白水解酶的作用部分水解所說的激活物，分離所得的肽片段，純化并進行氨基酸測定以測定其內(nèi)部部分氨基酸序列。
根據(jù)如此獲得的部分氨基酸序列資料，克隆神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因。為達到這一目的可使用通常使用的PCR或雜交方法。
接著，根據(jù)部分氨基酸序列資料，設計合成的寡核苷酸用作Southern雜交探針。用包括MluI、SalI PstI和BamHI在內(nèi)的適合的限制性酶完全消化紅球菌菌種M-777的基因組DNA并進行瓊脂糖凝膠電泳分離[Chapter 6，page 3 to 20 of theMolecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al.，cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)]，并以常規(guī)方法將分離的片段轉(zhuǎn)印跡到尼龍膜上[Chapter9.page 34 of the Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1989)]。
可在通常使用的條件下進行雜交。例如，在含6xSSC(將8.77gNacl和4.41g檸檬酸鈉溶于1升水中制成1xSSC)、0.5％SDS、5xDanhardt′s溶液和100μg/ml鮭精子DNA的預雜交溶液中在65℃下封閉尼龍膜，分別加入32P標記的合成寡核苷酸，然后在65℃下保溫過夜。將尼龍膜在含0.1％SDS的2X SSC中55℃洗滌30分鐘后，進行放射自顯影以檢測與合成寡核苷酸探針雜交的DNA片段。提取相應于所檢測帶的DNA片段并從凝膠中純化后，以常用方法將DNA片段插入到質(zhì)粒載體中。有用的質(zhì)粒載體包括但不限于可以從市場上買到的pUC18、pUC19、pUC119和pTV118N(都是Takara Shuzo的產(chǎn)品)。
然后，將由此獲得的重組質(zhì)粒導入宿主中以轉(zhuǎn)化該宿主。有用的宿主細胞包括細菌(例如大腸桿菌)和放線菌類的原核細胞和及酵母，動物，植物等的真核細胞。
當宿主是大腸桿菌時，它可以是野生型菌株或變異菌株，只要它能被轉(zhuǎn)化并表達基因即可。這一質(zhì)粒導入可用常用方法實現(xiàn)，如在Molecular Cloning，A Laboratory Manual 2nd.ed.，T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第250頁中描述的方法。
接著，選擇含有所需DNA片段的轉(zhuǎn)化體。為達到這一目的，可利用質(zhì)粒載體的特征。例如，對于pUC19，可以在含氨芐青霉素的平板上選擇氨芐青霉素抗性菌落或在含氨芐青霉素，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的平板上選擇氨芐青霉素抗性白色菌落，以選擇其中導入了外來基因的菌落。
接著，從上述群體中挑選攜帶含所述DNA片段之載體的菌落。根據(jù)載體類型適當選用菌落雜交法[Chapter 1，pages 90-104The Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et a1.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，(1989)]或噬斑雜交法[Chaptor 2，Pages 108-117，theMolecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al.，Cold Spring Hanbor Laboratory Press，(1989)]來實現(xiàn)這一挑選也可使用PCR方法[Chapter 14，Page 15-19，The Molecular Colning，A Laboratory Manual，2nd ed.，T.Maniatis et al，Cald Sping Harbor Laboratory Press，(1989)]。
一旦選出含有所需DNA片段的載體，即可用常規(guī)方法，如雙脫氧鏈終止法[Chapter 13，page 3-10，TheMolecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd et.，T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)]來測定插入該載體中之所得DNA片段的堿基序列。將如此測定的堿基序列與神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的N端序列、部分氨基酸序列、分子量等進行比較以了解神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的基因結構和全部氨基酸序列。當獲得的DNA片段不含全長度神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因時，則可用其他限制性酶消化紅球菌菌種M-777的基因組DNA，使用上面獲得的部分DNA片段作為探針經(jīng)雜交等方法從消化產(chǎn)物中獲得缺失部分，然后連接缺失部分即可獲得全長度神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因。
將上面獲得的全部或部分神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因插入到合適的質(zhì)粒載體中，然后轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)。將如此獲得的轉(zhuǎn)化體在常用條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II活性的多肽。
例如，當分別用大腸桿菌和pET236[由Novagen生產(chǎn)]作為宿主細胞和質(zhì)粒載體時，將所說的轉(zhuǎn)化體在含100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基(0.1％胰蛋白胨，0.05％酵母提取物，0.1％NaCl，pH7.2)中37℃培養(yǎng)過夜；當600nm吸光率達到大約0.5時，加入IPTG，再一次在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)完成后，回收細胞，經(jīng)超聲處理等破碎細胞并離心之。按下述常規(guī)方法純化所得的上清液以產(chǎn)生高度純化的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。也可能以包含體的形式產(chǎn)生被表達的多肽。
可經(jīng)測定神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II活性來證實基因產(chǎn)物的表達。例如，當重組體是大腸桿菌時，使用重組大腸桿菌提取物作為酶溶液以Journal of Biological Chemistry，Vol.266，No12，PP.7919-7929(1991)中描述的方法測定活性。具體地說，由于神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II需要表面活性劑(如Triton X-100)以表達其活性，所以可測定在缺乏表面活性劑的條件下因加入粗提物所引起的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II活性的增加，以估測神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的活性。
具體地說，將40nmol脫唾液酸-GM1(由IATRON產(chǎn)生)、5μg牛血清白蛋白、0.3毫單位純化的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II和合適量的粗提物(神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II蛋白質(zhì))在40μl預先用0.85％NaCl調(diào)成等滲的20mmol乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中混合，以產(chǎn)生標準試驗混合物。然后用Journal of Biological Chemistry，Vol.264，pp 9510-9519(1989)中描述的方法測定酶活性。37℃保溫60分鐘后，經(jīng)加入250μl碳酸氰溶液(pH11)終止反應；按Park和Johnson[The Journal of Biological Chemistry，Vol.181，pp.149-151(1949)]所述的方法估測還原活性。為進行對照實驗，分別保溫底物和粗提物(神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II蛋白質(zhì))或底物和神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶。從上述實際樣品值中減去兩對照值的總和。一單位神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II蛋白質(zhì)定義為在上述標準實驗條件下每分鐘增加1μmol的脫唾液酸GM1的水解的所用的蛋白質(zhì)量。
也可使用以純化的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II免疫大鼠獲得的抗血清來從免疫學上證實表達。
當記錄到神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的所需表達時，選定神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II表達的最適條件。
可用常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物中純化神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。亦即，離心收集轉(zhuǎn)化細胞，經(jīng)超聲處理或類似方法破碎細胞，然后經(jīng)離心等產(chǎn)生無細胞提取物，并可用常規(guī)蛋白質(zhì)純化方法，如鹽析和包括離子交換、凝膠過濾、疏水相互作用及親和層折在內(nèi)的多種層析法純化之。依據(jù)所使用的宿主-載體系統(tǒng)的不同，。表達產(chǎn)物可由轉(zhuǎn)化體向細胞外分泌出來；在這種情況下，可從培養(yǎng)物上清中以上面所述相同的方式純化產(chǎn)物。當宿主是大腸桿菌時，表達產(chǎn)物有時以不溶性包含體的形式生成。在這種情況下，可在培養(yǎng)后離心收集細胞，經(jīng)超聲處理或類似方法破碎細胞，然后進行離心等以分離含有包含體的不溶性部分。洗滌后，用常用的蛋白質(zhì)溶劑，如尿素或鹽酸胍裂解包含體，再用各種層析法，如離子交換，凝膠過濾、疏水相互作用和親和層析純化之，如有必要，此后可經(jīng)透析或稀釋進行重折疊處理以產(chǎn)生保留其活性的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的制品。這種制品可用各種層析法純化，以產(chǎn)生高純度的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II制品。
使用本發(fā)明的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物基因，可從不同于上述基因來源的DNA或cDNA以雜交方法獲得編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之所需多肽或其功能等同變異體的基因。為以雜交法獲得編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的所需基因，例如可使用下述方法。
首先，將從所需基因來源獲得的染色體DNA或借助逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA制備的cDNA連接到質(zhì)粒或噬菌體載體上，并導入宿主以便用常規(guī)方法產(chǎn)生文庫。然后在平板上培養(yǎng)文庫；將所得菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或尼龍膜上并進行變性處理以便將DNA固定在膜上。在含有用32P或類似物標記之探針(所用的探針可以是編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中所示氨基酸序列的任何基因或其部分；例如，可使用SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中所示的基因或其部分)的溶液中保溫該膜，以使膜上的DNA與探針之間形成雜交體。例如，使其上固定有DNA的膜在含6X SSC、1％十二烷基磺酸鈉、100μg/ml鮭精子DNA和5X Denhardt′s溶液(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)的溶液中65℃與探針雜交20小時。雜交后，洗掉非特異性吸附部分，然后經(jīng)放射自顯影等方法鑒定與探針形成雜交體的克隆。重復這一程序直到只有單個克隆形成雜交體。如此獲得的克隆帶有插入其中的編碼所需蛋白質(zhì)的基因。
然后例如按下述方法測定獲得的基因的堿基序列，以證實所得的基因是否與編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的所需基因相同。
當重組體是大腸桿菌時，經(jīng)過在試管或類似容器中培養(yǎng)大腸桿菌，以常規(guī)方法提取質(zhì)粒、用限制性酶消化提取的質(zhì)粒、分離插入序列并將其亞克隆到M13噬菌體載體或類似載體中，并以雙脫氧法測定堿基序列來實現(xiàn)對雜交獲得的克隆的堿基測序。當重組體是噬菌體時，使用與上面所用者基本相同的程序測定堿基序列。從培養(yǎng)到堿基測序的基本實驗技術可參見Molecular Cloning，A Laboratory Manual，T.Maniatis et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1982)。
為了證實獲得的基因與編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的所需基因的相同性，將測定的堿基序列與本發(fā)明的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物基因的堿基序列和序列表中SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的編序列相比較。
如果所得的基因不含編碼具有神經(jīng)酰胺內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的全部區(qū)域，可從所獲得的基因制備合成的DNA引物，并經(jīng)PCR擴增缺失區(qū)域或使用獲得的基因片段作為探針篩選DNA文庫或cDNA文庫來測定與本發(fā)明的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物基因雜交的，編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體全部區(qū)域的堿基序列。
具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等同變異體可經(jīng)過如下的基因工程技術獲得首先，用常規(guī)方法將獲得的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物基因或編碼具有功能上同等活性之多肽的另一基因連接到能在合適的宿主細胞，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母、動物細胞，昆蟲細胞或植物細胞中表達該基因的表達載體中，然后導入宿主細胞以產(chǎn)生重組體。經(jīng)過培養(yǎng)該重組體，可產(chǎn)生具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽。另外，可使用無糖鏈生物合成能力的細胞作為宿主，例如原核生物，如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌?；蚴褂靡咽テ涮擎溕锖铣赡芰Φ淖儺惖慕湍?、動物、昆蟲或植物細胞來表達無糖鏈的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物多肽。
在某些表達系統(tǒng)中，所獲得的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物基因或編碼神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物之功能等同變異體的基因包括編碼細胞分泌的信號肽區(qū)域，導致所需的多肽在培養(yǎng)基中的細胞外分泌和積聚。在這種情況下，可從培養(yǎng)基中回收所需的多肽。當所需的多肽積聚在重組體中時，可破碎細胞以從培養(yǎng)的細胞中回收之。另外，當表達的多肽在重組體中以不溶物(包含體)的形式積累時，可回收該不溶物，然后在溫和條件下(例如用尿素)溶解之，然后去掉變性劑以恢復其原始活性?？砂瓷鲜龇椒y定神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性來證實表達。
可用常規(guī)層析技術從重組體中純化具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽。例如，當所需多肽從重組體細胞外分泌時，可對培養(yǎng)物上清液進行層析，如疏水相互作用、離子交換、或凝膠過濾層析以獲得表達的所需多肽。當所需多肽在重組體中積聚時，可破碎培養(yǎng)的細胞。如果所需多肽以溶解形式存在，可對上清液進行層析(如疏水相互作用、離子交換或凝膠過濾層析)以獲得所需的被表達的多肽。當表達產(chǎn)物作為不溶性物質(zhì)積聚時，可破碎細胞，然后回收沉淀物并用變性劑(如尿素)溶解之。然后去掉變性劑，并按上述方法使之重新折疊并進行層析處理以得到具有所需活性的多肽。
本發(fā)明提供了神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的一級結構及其基因結構。本發(fā)明實現(xiàn)的對基因結構的闡明允許以基因工程技術生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽。本方法使用基因工程技術可以低花費生產(chǎn)高純度的具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽制品。
實施例下述實施例是為了解釋本發(fā)明而不是以任何方式限制本發(fā)明。實施例1.神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II結構基因的克隆(1)基因組DNA的提取和純化將紅球菌種M-777(一種神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II生產(chǎn)菌)接種到30ml含1.5％真菌胨(由0XOID生產(chǎn))、0.2％NaCl和0.1％酵母提取物的培養(yǎng)基(pH7.0)中并在28℃下振動培養(yǎng)3天。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到900ml相同培養(yǎng)基中并在28℃下振動培養(yǎng)3天。培養(yǎng)完成后，離心培養(yǎng)液，收集細胞并懸浮于4.5ml緩沖液(50mM Tris-HCl，50mMEDTA，pH8.0)中，然后冷凍并融解。向該細胞懸液中加入2.5ml含4mg/ml溶菌酶的緩沖液(50mM Tris-HCl，50mM EDTA，pH8.0)，然后于30℃下培養(yǎng)16小時。向該混合物中加入10ml提取緩沖液(50mM Tris-HCl，1％SDS，0.4mg/ml蛋白酶K，pH7.5)，并在50℃下保溫16小時，然后加入10ml另一提取緩沖液(50mM Tris-HCl，0.5％SDS，0.2mg/ml蛋白酶K，pH7.5)，并保溫8小時。將保溫混合物冷卻到室溫后，加入等體積的預先用TE緩沖液(10mM Trir-HCl，1mM EDTA，pH8.0)飽和的酚/氯仿溶液，輕微旋轉(zhuǎn)振蕩16小時，然后在3.500rpm下離心30分鐘，接著回收上清液。將該溶液在緩沖液(10mM Tmis-HCl，5mM EDTA，pH8.0)中4℃透析以產(chǎn)生基因組DNA溶液。(2)神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的部分氨基酸測序首先按The Journal of Biochemistry，Vol.110，pp.328-332(1991)中描述的方法純化神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的27.9KDa胰酶消化產(chǎn)物。然后用Edman降解法測定純化之27.9KDa神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II胰酶消化產(chǎn)物的N端序列。結果測定了N端氨基酸序列(SEQ ID NO5)并命名為ACTN。
然后按下述方法測定其內(nèi)部氨基酸序列向含4μl吡啶，1μl 4-乙烯基吡啶，1μl三丁基膦和5μl蒸餾水的試管中插入一個裝純化樣品的較小的樣品試管；將外面的試管真空密封。然后在100℃下加熱5分鐘使樣品中的半脫氨酸殘基在氣相條件下吡啶乙基化。
將1nmol由此得到的S-吡啶乙基化的樣品溶于50μl含4M尿素的20mM Tris緩沖液(pH9.0)中；加入8pmol賴氨酰內(nèi)肽酶(由Pierce生產(chǎn))，接著在37℃下消化16小時。然后以含0.065％三氟乙酸(TFA)的蒸餾水到含0.05％TFA的乙腈的密度梯度，使用SMART系統(tǒng)(由Pharmacia生產(chǎn))通過μRPC C2/C18 SC2.1/10柱(由Pharmacia生產(chǎn))反相層析純化該肽片段。使用477型氣相肽測序儀(由Applied Biosystems生產(chǎn))以Edman降解法分析如此純化的肽片段。結果測定了內(nèi)部氨基酸序列(SEQ ID NO6)并命名為ACTI。(3)含神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因之DNA片段的克隆將25μg在實施例1(1)中制備的基因組DNA用各100U限制性酶BamHI，PstI和SalI(均由Takara Shuzo生產(chǎn))在37℃下消化6小時；再加入100U的各酶后，繼續(xù)反應16小時。對相當于5μg DNA量的反應混合物進行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，然后以Southern印跡法(Idenshi Kenkyuhou II，pp.218-221，published by TokyoDagaku Dojin)將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N+，由Amersham生產(chǎn))上。該濾膜以一式兩份提供。
使用的雜交探針是根據(jù)實施例1(2)測定之N端氨基酸序列ACTN(SEQ ID NO5)和內(nèi)部氨基酸序列ACTI(SEQ ID NO6)設計和合成的寡核苷酸ACTNH(SEQ ID NO7)及ACTIH(SEQ ID NO8)。這些寡核苷酸序列是根據(jù)對編碼紅球菌屬各種蛋白質(zhì)之已知堿基序列測定結果，在宿主中有可利用性高的密碼子設計的。
使用MEGARABELTM(由Takara Shuzo生產(chǎn))，用32P標記這些合成的寡核苷酸各10pmol。
將上面制備的每對濾膜在含6XSSC(1XSSC是將8.77g NaCl和4.41g檸檬酸鈉溶于1升水中的水溶液)、0.5％SDS、100μg/ml鯡魚精子DNA和5X Danharlt′S(含牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll各0.1％)的溶液中65℃預雜交3小時，然后以0.5pmol/ml的濃度加入各標記的探針，并在55℃下雜交過夜。然后將各濾膜在6XSSC中室溫下洗滌10分鐘，在2XSSC和0.1％SDS中室溫洗滌10分鐘，并在0.2XSSC和0.1％SDS中55℃洗滌30分鐘，隨后去掉多余的水；將每片濾膜暴露于影象板(由Fuji Photo Film生產(chǎn))上3小時，并使用BAS2000影象分析儀(由Fuji Photo Film生產(chǎn))檢測影象。
結果，與寡核苷酸ACTNH雜交的帶出現(xiàn)在相當于BamHI消化產(chǎn)物之大約10kbp，PstI消化物之大約2.3kbp、SalI消化物之大約450bp的位置。另外，與寡核苷酸ACTIH雜交的帶出現(xiàn)相當于BamHI消化物之大約10kbp，PstI消化物之大約2.3kbp和SalI消化物之大約1kbp的位置。在隨后的實驗中使用PstI消化產(chǎn)物，因為它易于處理。
對20μg用限制性酶PstI消化的基因組DNA進行0.7％瓊脂糖凝膠電泳；切下與出現(xiàn)于上述雜交中的帶相對應的部分并使用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo生產(chǎn))提取和純化之；將所得的DNA片段插入pUC19(由Takara Shuzo)生產(chǎn))的PstI位點中。
用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后在5個直徑為8.5cm的圓培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，直到每個培養(yǎng)皿形成200到1000個菌落。從這些平皿上選擇300個菌落并轉(zhuǎn)移到放在平板培養(yǎng)基上的尼龍膜(Hybond-N+，由Amersham生產(chǎn))上。37℃培養(yǎng)3小時后，將尼龍膜在浸入含0.5M NaOH和1.5M NaCl之溶液的濾紙上放置5分鐘(變性)，并在浸入含0.5M Tris-HCl緩沖液(pH7.0)和3M NaCl之溶液的濾紙上放置5分鐘(中和)，接著用2XSSC漂洗。使用該尼龍膜和作為探針的寡核苷酸ACTNH(SEQ ID NO7)，在上述相同條件下進行雜交；獲得3個陽性菌落。
這些大腸桿菌JM109轉(zhuǎn)化體分別被命名為P23、P54和P62。對這些轉(zhuǎn)化體進行堿溶菌以制備其攜帶所得克隆的質(zhì)粒DNA，它們分別被命名為pACTP23，pACTP54和pACTP62。經(jīng)用幾種限制性酶消化和凝膠電泳分析這些質(zhì)粒，結果發(fā)現(xiàn)這些質(zhì)粒具有相同的插入序列?；谶@一發(fā)現(xiàn)，將pACTP54用于下面的實驗。
用限制性酶SalI消化pACTP54得到大約1kbp的片段、大約450bp的片段，大約300bp的片段和大約150bp的片段，它們分別被命名為S1，S2，S3和S4。對這此片段進行瓊脂糖凝膠電泳，然后從凝膠中提取和純化之，并亞克隆到pUC19(由Takara Shuzo生產(chǎn))的SalI位點中；所得的質(zhì)粒分別被命名為pACTS1，pACTS2，pACTS3和pACTS4。用合適的限制性酶(SmaI，BalI，NaeI等)進一步消化這些質(zhì)粒并使用DNA連接試劑盒(由TaKara Shuzo生產(chǎn))進行自身連接以獲得各種缺失變異體。以雙脫氧法從其末端測定這些缺失變異體和pACTP54的堿基序列。
結果顯示，編碼N端氨基酸序列ACTN的序列，即與ACTNH(用作探針的寡核苷酸)雜交的序列存在于pACTS2上，編碼內(nèi)部氨基酸序列ACTI的序列，即與ACTIH(用作探針的寡核苷酸)雜交的序列存在于pACTS1上，并顯示4個SalI片段在pACTP54上以S3，S2，S1和S4的順序排列(圖1)。
這些堿基序列翻譯成氨基酸序列證明神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II氨基酸序列上游存在信號樣序列，從而得以推導起始密碼子。在該閱讀框下游未發(fā)現(xiàn)終止密碼子；發(fā)現(xiàn)這些序列編碼純化之27.9KDa神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II胰酶消化產(chǎn)物的N端開始的417個氨基酸殘基(SEQ ID NO9)。這417個殘基的氨基酸序列相等于分子量為42KDa。編碼這417個殘基氨基酸序列的堿基序列示于序列表的SEQ ID NO10中。因此證明pACTP54含有編碼神經(jīng)酰膠糖內(nèi)切酶激活物II之N端部分的序列，它包括神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的27.9KDa部分，即其活性所需的最小基本單位。(4)克隆含有編碼神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物IIN端區(qū)域之基因的DNA片段為了覆蓋神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因的全長，按實施例1(3)所述相同方式，以Southern雜交法篩選編碼靠近c端區(qū)域(PACTP54缺乏的區(qū)域)的DNA片段。使用的探針是用SmaI/PstI消化pACTP54獲得的大約0.4kbp片段，它含有在實施例(3)獲得的序列中最靠近C端的DNA序列。具體地說，用限制性酶SmaI和PstI(兩者都由Takara Shuzo生產(chǎn))消化pACTP54并進行1％瓊脂糖凝膠電泳，切下所得的大約0.4kbp DNA片段。
使用SpinBindTMSeries II(由Takara Shuzo生產(chǎn))提取和純化該DNA片段；使用BcaBESTTM標記試劑盒(由Takara Shuzo生產(chǎn))以32P標記所得的純化之DNA片段。50μg實施例1(1)中制備的基因組DNA用各180U限制性酶MluI，SacII，ApaI和Eco52I(都由Takara Shuzo生產(chǎn))在37℃下消化6小時。從這一反應混合物中以相當于10μg DNA的量按實施例1(3)所述相同方式制備濾膜。每1個濾膜在含6XSSC(1XSSC是8.77g NaCl和4.41g檸檬酸鈉溶于1升水中的水溶液)、0.5％SDS、100μg/ml鯡魚精子DNA和5XDenharlt′s(含濃度各為0.1％的牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)的溶液中68℃下預雜交3小時，隨后各以0.1pmol/ml的濃度加入標記的探針，并在68℃下雜交過夜。
然后將每片濾膜在6XSSC中室溫下洗滌10分鐘，在2XSSC和0.1％SDS中室溫下洗滌10分鐘，并在0.2XSSC和0.1％SDS中70℃下洗滌30分鐘。去掉多余的水；將每片濾膜暴露于影象板(由FujiPhotoFilm生產(chǎn))10分鐘并使用BAS2000影象分析儀(由FujiPhoto Film生產(chǎn))檢測影象。
結果，與探針雜交的帶出現(xiàn)在相當于MluI消化產(chǎn)物之大約4Kbp，SacII消化產(chǎn)物之大約1.3kbp，ApaI消化產(chǎn)物之大約1kbp，Eco52I消化產(chǎn)物之大約0.6kbp的位置。從其大小判斷，認定Eco52I消化產(chǎn)物未能完全覆蓋靠近pACTPA54缺失的C端區(qū)域。鑒于這一發(fā)現(xiàn)，將限制性酶MluI，SacII和ApaI消化產(chǎn)物用于下面的實驗。
對20μg用限制性酶MluI，SacII或ApaI消化的基因組DNA進行0.7％瓊脂糖凝膠電泳；切下與上述雜交中檢測的帶相對應的部分并使用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo生產(chǎn))進行提取和純化；將所得的MluI片段插入pUC 19M[通過將磷酸化的MluI接頭(由TakaraShuzo生產(chǎn))插入并連接到用限制性酶HincII(由Takara Shuzo生產(chǎn))消化的pUC19(由Takara Shuzo生產(chǎn))上為pUC19提供一個MluI位點而制得的質(zhì)粒]的MluI位點；將SacII片段插入pBluescriptIISK(-)(由Stratagene生產(chǎn))的SacII位點；并將ApaI片段插入pBluescript IISK(-)的ApaI位點。
用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，其后在加有含100μg/ml氨芐青霉素之L-瓊脂培養(yǎng)基的直徑為8.5cm的10個圓培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，直到每個培養(yǎng)皿形成200到500個菌落。從這些培養(yǎng)皿中選出1,000個菌落并轉(zhuǎn)移到置于有相同培養(yǎng)基之平板上的尼龍膜(Hybond-N+，由Amersham生產(chǎn))上。37℃培養(yǎng)10小時后，將尼龍膜在浸于含0.5MNaOH和1.5M NaCl之溶液的濾紙上放置5分鐘(變性)并在浸于含0.5M Tris-HCl緩沖液(pH7.0)和3M NaCl之溶液中的濾紙上放置5分鐘(中和)，然后用2XSSC漂洗。使用該尼龍膜和以上述相同的方式用SmaI/pstI消化pACTP54制得的約0.4kbp DNA片段，在上述條件下進行雜交。從含ApaI片段的菌落中獲得了2個陽性信號，但從含MluI或SaclI片段的菌落中獲得陽性信號。
以堿溶菌法從兩個陽性菌落中制備質(zhì)粒DNA，分別命名為pBAp42和pBAp69。用某些限制性酶(ApaI，PstI，Sal I.Eco52I，BamHI，KpnI，SacI，Eco109I，NaeI，XhoI，SacII，MluI，EcoRI，和HindIII)消化這些DNA并進行凝膠電泳分析。結果，發(fā)現(xiàn)pBAp42和pBAp69具有相同的插入片段。鑒于這一發(fā)現(xiàn)，將pBAp42用于下面的實驗。
以雙脫氧法從其末端測定這些亞克隆和pBAp42的堿基序列，隨后使用根據(jù)測定的堿基序列合成的合成DNA引物進行氨基酸測序。結果，發(fā)現(xiàn)其序列與用SmaI/PstI消化pACTP54獲得的約0.4Kbp片段相同。
另外，在跨越pACTP54插入片段中之PstI片段和pBAp42插入片段中之ApaI片段之間的區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個1,740bp的開架閱讀框(ORF)，并在實施例1(3)中測定了其序列。發(fā)現(xiàn)該ORF從起始密碼子ATG開始并在終止密碼子TGA處終止；在翻譯的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)一個對應于實施例1(2)獲得之氨基酸序列ACTN和ACTI的氨基酸序列。
根據(jù)上面結果，確定了神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因的全部堿基序列和一級結構。結果在圖1中給出，其中顯示了pACTP54和pBAp42插入片段的限制性酶切圖及這些插入片段和神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因的位置。
神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之ORF的堿基序列示于序列表的SEQ ID NO2。神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切激活物II的全部氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO1中。實施例2.用于表達神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之質(zhì)粒的構建從實施例1獲得的pACTP54和pBAp42分離神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II結構基因(其中結構基因片段單獨存在)，將該基因連接到適于其在大腸桿菌中表達的質(zhì)粒上并將其導入大腸桿菌細胞中來構建在大腸桿菌中表達神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的質(zhì)粒。(1)表達神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之N端區(qū)域活性多肽的質(zhì)粒的構建用限制性酶SacII消化實施例1中制得的pACTP54并進行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo生產(chǎn))提取和純化大約670bp的片段。使用DNA鈍端化試劑盒(由Takara Shuzo生產(chǎn))將其末端修成平頭后，用限制性酶MluI進一步消化該片段并進行瓊脂糖凝膠電泳，然后提取并純化一個約450bp的DNA片段以產(chǎn)生SacII-MluI片段。
再用限制性酶EcoRI和MluI消化pACTP54并進行瓊脂糖凝膠電脈，經(jīng)提取和純化以產(chǎn)生一個約820bp MluI-EcoRI片段。
使用DNA連接試劑盒(由Takara Shuzo生產(chǎn))將這兩個片段插入pTV119N(由Takara Shuzo生產(chǎn))的HincII-EcoRI位點。所得的質(zhì)粒(命名為pTAC1)用限制性酶XbaI消化，然后將其末端修成平頭，并插入一個終止接頭(SEQ ID NO11)。將所得質(zhì)粒命名為pTAC2(圖2)。
由于該pTAC2在編碼神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的基因上游含有包括lac Za衍生肽的編碼13個氨基酸殘基的序列，所以可望使用SD序列和lacZ的起始密碼子，誘導以與LacZa之融合復合物的形式表達神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。將該pTAC2導入大腸桿菌JM109菌株；使用堿溶菌法從所得的重組體制備質(zhì)粒DNA后，鑒定插入序列的堿基序列。將摻入了pTAC2的大腸桿菌JM109稱作大腸桿菌JM109/pTAC2。
用限制性酶HindIII和BamHI消化pTAC1，然后將其末端修成平頭并進行瓊脂糖凝膠電泳，并提取和純化大約1.3kbp的DNA片段。在pET23b(由Novagen生產(chǎn))的HincII位點和修成平頭的NotI位點之間插入該純化的片段。這一質(zhì)粒被命名為pEAC001(圖3)。
由于這一pEAC001在編碼神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之基因上游含有T7·TaqTM序列(編碼噬菌體T7基因10蛋白質(zhì)的前11個殘基的氨基酸序列，由Novagen生產(chǎn))和編碼來自神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II基因下游克隆位點14個氨基酸殘基的序列，連同His·TaqTM序列(編碼6個組氨酸殘基序列，由Novagen生產(chǎn))，所以可預期連同以成熟神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之N端417殘基與上述蛋白質(zhì)的融合復合物的形式誘導表達神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。將該質(zhì)粒導入大腸桿菌JM109菌株，用堿溶菌法從所得的重組體制備質(zhì)粒DNA，然后鑒定該插入序列的堿基序列。將證明已正確構建的質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。摻入pEAC001的大腸桿菌BL21(DE3)稱為大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC001。
用限制性酶BamHI和SphI消化pEAC001，然后將其末端修成平頭并使之自身連接。所得的質(zhì)粒被命名為pEAC101。
預期該質(zhì)粒可誘導地表達作為融合復合物的神經(jīng)酰胺內(nèi)切酶激活物II，所說的復合物具有比pEACOOI短9個衍生于克隆位點的序列中編碼的氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)部分。將該質(zhì)粒導入大腸桿菌JM109菌株中；用堿溶菌法從所得的重組體制備質(zhì)粒DNA，然后鑒定插入序列的堿基序列。將證實已正確構建的質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21(DE3)進行表達。摻入了pEAC101的大腸桿菌BL21(DE3)被稱為大腸桿菌BL21(DE31/pEAC101[以保藏號FERM BP-5531保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agent of Industrial Science and Technology；該菌株首先以大腸桿菌BL2(DE3)/pEAC101的名稱進行了保藏(登記證明)，但在1995年6月15日發(fā)行的微生物保藏證書中將該錯誤的命名更正如上]。
用限制性酶XhoI消化pEAC001，將其末端修成平頭，用SmaI消化并自身連接以產(chǎn)生缺失編碼143殘基的序列和保留編碼pEAC001成熟神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II之274個N端殘基序列的質(zhì)粒。所得的質(zhì)粒被命名為pEAC002(圖5)。將這一質(zhì)粒導入大腸桿菌JM109菌株；以堿溶菌法制備質(zhì)粒DNA，然后鑒定插入序列的堿基序列。將已證明正確構建的質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。摻入了pEAC002的大腸桿菌BL21(DE3)被稱為大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC002。(2)用于表達無信號序列之神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II多肽的質(zhì)粒的構建用限制性酶ApaI消化pBAp42并進行瓊脂糖凝膠電泳，然后從凝膠中提取和純化以產(chǎn)生大約1,000bp的BAp42-ApaI片段。用限制性酶XhoI消化實施例2獲得的pEAC101，接著使用DNA修平頭試劑盒(由Takara Shuzo生產(chǎn))將其末端修成平頭；向該片段中插入并連接一磷酸化的ApaI接頭(由Takara Shuzo生產(chǎn))以提供含有ApaI位點的pEAC101。用限制性酶ApaI消化該質(zhì)粒并用來自大腸桿菌的堿性磷酸酶脫磷酸化，然后連接BAp42-ApaI片段以產(chǎn)生pEAC201(圖6)。
將該質(zhì)粒導入大腸桿菌JM109菌株；以堿溶菌法從所得的重組體制備質(zhì)粒DNA，然后鑒定插入片段的堿基序列。將已證明正確構建的質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。含有pEAC201的大腸桿菌BL21(DE3)被定名為大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC201。實施例3.重組神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II在大腸桿菌中的表達(1)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II活性之多肽在大腸桿菌中的表達將實施例2獲得的大腸桿菌JM109/pTAC2、大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC001、大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101、大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC002和大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC201分別接種到5ml含100μl/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中并在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜；進一步將0.2％的培養(yǎng)液接種到5ml相同培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)期間當濃度(660nm吸光率)達到大約0.5時，加入IPIG至終濃度為1mM，然后振蕩培養(yǎng)16小時。完成培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)液，收集細胞，懸浮于0.5ml 20mMTris-HCl緩沖液(pH7.9)中，經(jīng)超聲處理破碎細胞，離心分成兩個部分作為上清液的大腸桿菌細胞提取物和沉淀。對提取物和沉淀進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并用考馬斯亮藍染色。
結果，對于大腸桿菌JM109/pTAC2檢測不到神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II，另一方面，在大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC001、大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101和大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC201的提取物和沉淀中，以及大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC002的沉淀中則檢測到由神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II形成的帶；由此證實了神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的表達。大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC001在可溶性部分中產(chǎn)生高濃度的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II。另外，大腸桿菌BL2(DE3)/pEAC201表達產(chǎn)物提供的帶的位置幾乎與紅球菌菌種M-777產(chǎn)生之天然神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的帶位置相同。
接著，按Journal of Biochemistry，Vol.110.pp.328-332(1991)中描述的方法用胰蛋白酶消化大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC001、大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101和大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC201的細胞提取物。對各消化產(chǎn)物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)印跡到PVDF膜上。使用以27.9KDa的來自紅球菌菌種M-777的純化之神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的胰蛋白酶消化產(chǎn)物免疫大鼠獲得的抗血清對該膜進行特異性免疫染色。結果，檢測到由神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物的胰酶消化產(chǎn)物形成的大約28KDa的帶。
這一事實表明，由大腸桿菌BL21(DE3)p/EAC001、大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101和大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC201產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II作為天然和非天然空間結構的混合物出現(xiàn)在其可溶性部分中。(2)可溶性表達產(chǎn)物的純化將大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101接種到5ml含100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16小時；進一步將0.6ml培養(yǎng)液接種到300ml相同的培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)。當培養(yǎng)液濃度(660nm吸光率)達到大約0.5時，加入IPTG至終濃度為1mM，然后在37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。
完成培養(yǎng)后，經(jīng)離心收集細胞，懸浮于10ml 20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.9)中，經(jīng)超聲處理破碎細胞，從沉淀中離心分離上清液。向上清液中加入10ml含10mM咪唑和1M NaCl的40mM Tris-HCl緩沖液(pH7.9)以產(chǎn)生樣品溶液。
對該樣品溶液進行親和層析以純化可溶部分的表達產(chǎn)物。具體地說，將預先固相化的Ni2+的His·Bind金屬螯合樹脂(由Novagen生產(chǎn))柱用含5mM咪唑和0.5M NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.9)平衡。向該柱上加入樣品溶液后，用含60mM咪唑和0.5MNaCl的20mm Tris-HCl緩沖液(pH7.9)洗該柱，然后用含1M咪唑和0.5M NaCl的20mm Tris-HCl緩沖液(pH7.9)洗脫，以得到10ml純化的可溶性表達產(chǎn)物。(3)重組27.9KDa神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的重新折疊和生產(chǎn)在攪拌條件下將10毫升實施例3(2)中獲得的大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101的純化的可溶性表達產(chǎn)物逐滴加入990ml 20mMTris-HCl緩沖液(pH7.9)中；將所得的稀釋液在5℃下攪拌4天以實現(xiàn)重新折疊。
將該溶液加至His·Bind金屬螯合樹脂柱上，按上述相同方式洗滌和洗脫以實現(xiàn)濃縮。使用Hi-Trap脫鹽柱(由Pharmacia生產(chǎn))，用含2mm CaCl2的25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)取代用于該洗脫的緩沖液。用2mg胰蛋白酶37℃消化4小時后，加入另外2mg胰蛋白酶，接著在37℃下消化16小時以實現(xiàn)向27.9KDa神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的轉(zhuǎn)變。使該消化產(chǎn)物通過預先用50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.9)平衡的陰離子交換樹脂Q套筒(由Bio-Rad生產(chǎn))并進一步通過親和柱ProtrapTM(由Takara Shuzo生產(chǎn))以去掉胰蛋白酶，經(jīng)超濾后獲得45μl濃縮物。
經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析揭示了相當于分子量約28,000的單一帶。使用BCATM蛋白質(zhì)檢測試劑(由Pierce生產(chǎn))進行定量測定，表明蛋白質(zhì)含量為11μg/μl(轉(zhuǎn)變?yōu)榕Ｑ灏椎鞍?。
按Journal of Biochemistry.Vol.110，pp.328-332(1991)中描述的方法測定神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II激活活性；結果證實了神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶II激活活性。換句話說，證實了大約1.7mg重組的27.9KDa神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II是從1升含有本發(fā)明之基因的大腸桿菌BL21(DE3)/pEAC101的培養(yǎng)液中獲得的。該27.9KDa的神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物II的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NO3中，其堿基序列在序列表的SEQ ID NO4中給出。
對本領域技術人員而言，對本發(fā)明上述實施方案的其它修改顯然包括在下文權利要求書限定的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般資料(iii)序列表11(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度580氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Ser Ser Lys Leu Tyr Arg Tyr Leu Ala Pro Val Ala Val Gly1 5 10 15Ala Thr Val Val Ala Gly Ala Gly Val Leu Gly Val Gly Ala Ala20 25 30Ser Ala Ala Thr Thr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Cys Gln Ala35 40 45Thr Pro Ser Ser Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gln Thr Gln Val Gln50 55 60Ala Ala Ser Val Thr Val Asp Ale Pro Glu Thr Val Ala Pro Gly65 70 75Glu Glu Phe Val Val Thr Ile Ser Pro Pro Pro Ile Ser Vel Pro80 85 90Asn Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ser Leu Ser Asn Ile Ser Arg Leu95 100 105Lys Ile Asp Val Ala Met Pro Glu Asn Ala Gln Phe Ile Gly Ala110 115 120Glu Val Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ala Pro125 130 135Asn Val Ile Val Val Asn Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala Asn Gly140 145 150Ser Ile Ile Arg Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Ile Gly Asn Gly155 160 165Pro Lys Ser Ser Lys Ser Ser Glu Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ala170 175 180Sar Gly Sar Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Gln Val Lys Ala Thr185 190 195Leu Lys Ala Gly Ala Ala Gly Glu Ile Ser Met Lys Leu Arg Thr200 205 210Ala Gly Asn Ala Gly Gln Phe Gly Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr215 220 225Phe Leu Pro Arg Ala Ser Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Trp Ala230 235 240Pro Thr Gln Cys Ser Pro Arg Asp Thr Ala Ala Gly Pro Leu Asn245 250 255Ala Gly Ala Gly Pro Leu Ala Thr Ile Gln Ile Leu Arg Gln Ala260 265 270Val Ala Thr Val Ser Tyr Leu Asp Gly Pro Ser Ala Val Thr Asn275 280 285Gly Gly Glu Phe Thr Leu Asn Ala Thr Val Val Pro Thr Pro Asp290 295 300Ser Gly Gln Val Gln Phe Thr Arg Asp Gly Glu Asp Val Gly Ala305 310 315Pro Val Asp Leu Val Asn Gly Lys Ala Ser Leu Thr Gln Ser Leu320 325 330Asp Thr Asp Gly Asp Tyr Ala Tyr Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ala335 340 345Glu Phe Phe Asn Pro Ser Ser Ala Ala Lys Thr Val Thr Val Thr350 355 360Ser Gln Asp Ile Gln Thr Thr Thr Ser Val Thr Gly Pro Asp His365 370 375Asp Ala Tyr Arg Asp Gln Pro Val Asn Leu Thr Ala Lys Val Glu380 385 390Pro Gly Val Ser Gly Gly Thr Val Ala Phe Glu Val Asp Gly Thr395 400 405Pro Val Gly Thr Ala Asp Val Met Asp Asp Gly Ala Ala Val Leu410 415 420Pro His Thr Phe Thr Thr Asn Gly Thr His Arg Val Ile Ala Arg425 430 435Tyr Ser Gly Ala Glu Gly Ile Ser Pro Ser Val Ser Leu Gln Tyr440 445 450Pro Val Ser Val Thr Glu Ala Pro Ala Ala Asp Val Ala Thr Thr455 460 465Ile Thr Val Asp Pro Ile Ala Ser Thr Ala Lys Gly Ser Pro Val470 475 480Thr Leu Thr Ala Arg Leu Asp Pro Ala Asp Ala Arg Gly Thr Val485 490 495Gln Phe Lys Leu Gly Asp Val Leu Leu Gly Gly Pro Val Arg Val500 505 510Asp Ala Asn Gly Val Ala Thr Leu Thr Thr Phe Phe Gln Asn Pro515 520 525Gly Glu Phe Val Val Thr Ala Gln Phe Thr Ala Asp Ala Gly Phe530 535 540Ile Asp Ser Ala Ala Ser Pro Val Asn Leu Thr Val Thr Gly Asp545 550 555Pro Asp Thr Ile Pro Asn Pro Glu Gly Gly Gly Ser Leu Ala Gly560 565 570Leu Ser Gly Leu Phe Gly Ser Leu Gly Gly575 580(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度1740堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型基因組DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2ATGAGTTCCA AGCTGTACCG CTACCTCGCG CCGGTCGCCG TGGGCGCGAC GGTGGTCGCC60GGTGCCGGAG TTCTGGGTGT GGGGGCCGCT TCCGCGGCGA CGACGATCAC GCCGTTCAAC 120AACGCATGTC AGGCGACGCC GTCGTCGAGC CTGGCCGGTG GGCCACAGAC TCAGGTGCAG 180GCGGCGTCGG TGACGGTCGA CGCACCGGAG ACCGTCGCTC CCGGTGAGGA GTTCGTGGTG 240ACGATCTCGC CGCCGCCGAT CTCGGTGCCC AACGATCTGG GTTCCGGCGC GAGCCTGTCG 300AACATCTCGC GGCTCAAGAT CGACGTCGCG ATGCCGGAGA ACGCGCAGTT CATCGGCGCC 360GAGGTGGTGG CCGGAACGTC AGCGGGCATC ACGGGTGTCG CGCCCAACGT CATCGTCGTC 420AACGAGAGTG GTAGTCCGGA CGCGAACGGC TCGATCATCC GGCTGTCCGG AAACAACGAG 480ACGATCGGCA ACGGACCGAA GTCCTCGAAG AGTTCCGAGG GCGGTATCAA GGCGAACGCG 540TCGGGCAGCA CCACGTCCTT CCAGTTGCCG CAGGTCAAGG CCACCCTCAA GGCGGGCGCG 600GCCGGCGAGA TCTCGATGAA GCTGCGCACC GCAGGAAACG CCGGGCAGTT CGGCAACGAC 660GCGAACTTCC TCACGTTCCT GCCCCGCGCC AGCGCACCGA TCGTCGGCAC GGTCTGGGCC 720CCCACCCAGT GCTCGCCGCG TGACACCGCG GCCGGCCCGC TCAACGCGGG AGCCGGTCCG 780CTGGCCACGA TCCAGATCCT GCGGCAGGCG GTCGCCACCG TCAGCTACCT GGACGGTCCG 840AGCGCGGTGA CCAACGGCGG CGAGTTCACG CTCAACGCCA CGGTCGTGCC CACCCCGGAC 900AGCGGTCAGG TCCAGTTCAC CCGGGACGGT GAGGACGTCG GCGCGCCGGT CGATCTGGTG 960AACGGCAAGG CGTCGCTGAC GCAGTCGCTC GACACCGACG GCGACTACGC CTACGAGGCG 1020AAGTTCCTGG GCGCGGAGTT CTTCAATCCG TCGTCCGCCG CGAAGACGGT CACGGTGACC 1080TCGCAGGACA TCCAGACCAC CACGTCGGTC ACCGGACCTG ACCACGACGC CTACCGCGAC 1140CAGCCGGTGA ACCTCACCGC GAAGGTCGAG CCGGGCGTCT CGGGCGGCAC GGTGGCTTTC 1200GAGGTCGACG GAACCCCGGT CGGCACCGCC GATGTGATGG ATGACGGCGC GGCGGTGCTC 1260CCGCACACCT TCACCACCAA CGGCACGCAC CGCGTGATCG CCCGCTACTC GGGTGCCGAG 1320GGGATCTCCC CGTCGGTCTC GCTGCAGTAC CCGGTCAGCG TCACCGAGGC GCCGGCCGCC 1380GACGTGGCCA CCACGATCAC GGTCGATCCG ATCGCGTCGA CTGCCAAGGG CTCGCCGGTG 1440ACCCTCACCG CGCGTCTCGA TCCGGCCGAC GCCCGGGGCA CGGTGCAGTT CAAGCTCGGC 1500GACGTCCTGC TCGGCGGACC GGTGCGGGTG GATGCGAACG GTGTCGCGAC ACTGACGACG 1560TTCTTCCAGA ACCCCGGCGA GTTCGTCGTC ACGGCCCAGT TCACCGCCGA CGCCGGTTTC 1620ATCGACTCGG CAGCGAGCCC GGTTAACCTC ACGGTGACCG GTGATCCGGA CACCATTCCG 1680AATCCGGAGG GCGGCGGAAG CCTCGCAGGC CTTTCGGGAC TGTTCGGTAG CTTGGGCGGC 1740(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度237氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Ser Ala Thr Thr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Cys Gln Ala Thr1 5 10 15Pro Ser Ser Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gln Thr Gln Val Gln Ala20 25 30Ala Ser Val Thr Val Asp Ala Pro Glu Thr Val Ala Pro Gly Glu35 40 45Glu Phe Val Val Thr Ile Ser Pro Pro Pro Ile Ser Val Pro Asn50 55 60Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ser Leu Ser Asn Ile Ser Arg Leu Lys65 70 75Ile Asp Val Ala Met Pro Glu Asn Ala Gln Phe Ile Gly Ala Glu80 85 90Val Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ala Pro Asn95 100 105Val Ile Val Val Asn Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala Asn Gly Ser110 115 120Ile Ile Arg Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Ile Gly Asn Gly Pro125 130 135Lys Ser Ser Lys Ser Ser Glu Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ala Ser140 145 150Gly Ser Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Gln Val Lys Ala Thr Leu155 160 165Lys Ala Gly Ala Ala Gly Glu Ile Ser Met Lys Leu Arg Thr Ala170 175 180Gly Asn Ala Gly Gln Phe Gly Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr Phe185 190 195Leu Pro Arg Ala Ser Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Trp Ala Pro200 205 210Thr Gln Cys Ser Pro Arg Asp Thr Ala Ala Gly Pro Leu Asn Ala215 220 225Gly Ala Gly Pro Leu Ala Thr Ile Gln Ile Leu Arg230 235(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度711堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型基因組DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4TCGGCGACGA CGATCACGCC GTTCAACAAC GCATGTCAGG CGACGCCGTC GTCGAGCCTG 60GCCGGTGGGC CACAGACTCA GGTGCAGGCG GCGTCGGTGA CGGTCGACGC ACCGGAGACC120GTCGCTCCCG GTGAGGAGTT CGTGGTGACG ATCTCGCCGC CGCCGATCTC GGTGCCCAAC180GATCTGGGTT CCGGCGCGAG CCTGTCGAAC ATCTCGCGGC TCAAGATCGA CGTCGCGATG240CCGGAGAACG CGCAGTTCAT CGGCGCCGAG GTGGTGGCCG GAACGTCAGC GGGCATCACG300GGTGTCGCGC CCAACGTCAT CGTCGTCAAC GAGAGTGGTA GTCCGGACGC GAACGGCTCG360ATCATCCGGC TGTCCGGAAA CAACGAGACG ATCGGCAACG GACCGAAGTC CTCGAAGAGT420TCCGAGGGCG GTATCAAGGC GAACGCGTCG GGCAGCACCA CGTCCTTCCA GTTGCCGCAG480GTCAAGGCCA CCCTCAAGGC GGGCGCGGCC GGCGAGATCT CGATGAAGCT GCGCACCGCA540GGAAACGCCG GGCAGTTCGG CAACGACGCG AACTTCCTCA CGTTCCTGCC CCGCGCCAGC600GCACCGATCG TCGGCACGGT CTGGGCCCCC ACCCAGTGCT CGCCGCGTGA CACCGCGGCC660GGCCCGCTCA ACGCGGGAGC CGGTCCGCTG GCCACGATCC AGATCCTGCG G 711(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型肽(v)片段類型N端片段(xi)序列描述SEQ ID NO5Ala Hhr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Xaa Gln1 5 10Ala Thr Pro Ser Ser Xaa Leu Ala Gly Gly Pro Gln15 20Thr25(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型
(ii)分子類型肽(v)片段類型內(nèi)部片段(xi)序列描述SEQ ID NO6Leu Arg Thr Ala Gly Asn Ala Gly Gln Phe Gly1 5Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr Phe Leu Pro Arg15 20Ala Ser(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型其他核酸(合成DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO7GCCACCACCA TCACSCCSTT CAACAACGCV CCSCAGGCSA CCCC 44(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長度56個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型其它核酸(合成DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO8ACCGCCGGCA ACGCVGGYCA GTTCGGYAAC GAYGCVAACT TCCTSACCTT CCTSCC56(2)SEQ ID NO9資料(i)序列特征(A)長度417個堿基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Thr Thr Ile Thr Pro Phe Asn Asn Ala Cys Gln Ala Thr Pro1 5 10 15Ser Ser Ser Leu Ala Gly Gly Pro Gln Thr Gln Val Gln Ala Ala20 25 30Ser Val Thr Val Asp Ala Pro Glu Thr Val Ala Pro Gly Glu Glu35 40 45Phe Val Val Thr Ile Ser Pro Pro Pro Ile Ser Val Pro Asn Asp50 55 60Leu Gly Ser Gly Ala Ser Leu Ser Asn Ile Ser Arg Leu Lys Ile65 70 75Asp Val Ala Met Pro Glu Asn Ala Gln Phe Ile Gly Ala Glu Val80 85 90Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ala Pro Asn Val95 100 105Ile Val Val Asn Glu Ser Gly Ser Pro Asp Ala Asn Gly Ser Ile110 115 120Ile Arg Leu Ser Gly Asn Asn Glu Thr Ile Gly Asn Gly Pro Lys125 130 135Ser Ser Lys Ser Ser Glu Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ala Ser Gly140 145 150Ser Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Gln Val Lys Ala Thr Leu Lys155 160 165Ala Gly Ala Ala Gly Glu Ile Ser Met Lys Leu Arg Thr Ala Gly170 175 180Asn Ala Gly Gln Phe Gly Asn Asp Ala Asn Phe Leu Thr Phe Leu185 190 195Pro Arg Ala Ser Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Trp Ala Pro Thr200 205 210Gln Cys Ser Pro Arg Asp Thr Ala Ala Gly Pro Leu Asn Ala Gly215 220 225Ala Gly Pro Leu Ala Thr Ile Gln Ile Leu Arg Gln Ala Val Ala230 235 240Thr Val Ser Tyr Leu Asp Gly Pro Ser Ala Val Thr Asn Gly Gly245 250 255Glu Phe Thr Leu Asn Ala Thr Val Val Pro Thr Pro Asp Ser Gly260 265 270Gln Val Gln Phe Thr Arg Asp Gly Glu Asp Val Gly Ala Pro Val275 280 285Asp Leu Val Asn Gly Lys Ala Ser Leu Thr Gln Ser Leu Asp Thr290 295 300Asp Gly Asp Tyr Ala Tyr Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ala Glu Phe305 310 315Phe Asn Pro Ser Ser Ala Ala Lys Thr Val Thr Val Thr Ser Gln320 325 330Asp Ile Gln Thr Thr Thr Ser Val Thr Gly Pro Asp His Asp Ala335 340 345Tyr Arg Asp Gln Pro Val Asn Leu Thr Ala Lys Val Glu Pro Gly350 355 360Val Ser Gly Gly Thr Val Ala Phe Glu Val Asp Gly Thr Pro Val365 370 375Gly Thr Ala Asp Val Met Asp Asp Gly Ala Ala Val Leu Pro His380 385 390Thr Phe Thr Thr Asn Gly Thr His Arg Val IIe Ala Arg Tyr Ser395 400 405Gly Ala Glu Gly Ile Ser Pro Ser Val Ser Leu Gln410 415(2)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長度1251個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)雙鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型基因組DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GCGACGACGA TCACGCCGTT CAACAACGCA TGTCAGGCGA CGCCGTCGTC GAGCCTGGCC60GGTGGGCCAC AGACTCAGGT GCAGGCGGcG TCGGTGACGG TCGACGCACC GGAGACCGTC 120GCTCCCGGTG AGGAGTTCGT GGTGACGATC TCGCCGCCGC CGATCTCGGT GCCCAACGAT 180CTGGGTTCCG GCGCGAGCCT GTCGAACATC TCGCGGCTCA AGATCGACGT CGCGATGCCG 240GAGAACGCGC AGTTCATCGG CGCCGAGGTG GTGGCCGGAA CGTCAGCGGG CATCACGGGT 300GTCGCGCCCA ACGTCATCGT CGTCAACGAG AGTGGTAGTC CGGACGCGAA CGGCTCGATC 360ATCCGGCTGT CCGGAAACAA CGAGACGATC GGCAACGGAC CGAAGTCCTC GAAGAGTTCC 420GAGGGCGGTA TCAAGGCGAA CGCGTCGGGC AGCACCACGT CCTTCCAGTT GCCGCAGGTC 480AAGGCCACCC TCAAGGCGGG CGCGGCCGGC GAGATCTCGA TGAAGCTGCG CACCGCAGGA 540AACGCCGGGC AGTTCGGCAA CGACGCGAAC TTCCTCACGT TCCTGCCCCG CGCCAGCGCA 600CCGATCGTCG GCACGGTCTG GGCCCCCACC CAGTGCTCGC CGCGTGACAC CGCGGCCGGC 660CCGCTCAACG CGGGAGCCGG TCCGCTGGCC ACGATCCAGA TCCTGCGGCA GGCGGTCGCC 720ACCGTCAGCT ACCTGGACGG TCCGAGCGCG GTGACCAACG GCGGCGAGTT CACGCTCAAC 780GCCACGGTCG TGCCCACCCC GGACAGCGGT CAGGTCCAGT TCACCCGGGA CGGTGAGGAC 840GTCGGCGCGC CGGTCGATCT GGTGAACGGC AAGGCGTCGC TGACGCAGTC GCTCGACACC 900GACGGCGACT ACGCCTACGA GGCGAAGTTC CTGGGCGCGG AGTTCTTCAA TCCGTCGTCC 960GCCGCGAAGA CGGTCACGGT GACCTCGCAG GACATCCAGA CCACCACGTC GGTCACCGGA 1020CCTGACCACG ACGCCTACCG CGACCAGCCG GTGAACCTCA CCGCGAAGGT CGAGCCGGGC 1080GTCTCGGGCG GCACGGTGGC TTTCGAGGTC GACGGAACCC CGGTCGGCAC CGCCGATGTG 1140ATGGATGACG GCGCGGCGGT GCTCCCGCAC ACCTTCACCA CCAACGGCAC GCACCGCGTG 1200ATCGCCCGCT ACTCGGGTGC CGAGGGGATC TCCCCGTCGG TCTCGCTGCA G 1251(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)拓樸學線型(ii)分子類型其他核酸(合成DNA)(xi)序列描述SEQ ID NO1權利要求
1.分離的DNA，其包含編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等同變異體的序列。
2.根據(jù)權利要求1的分離的DNA，其中分離的DNA包含選自(a)到(d)組成的組中的DNA序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的DNA序列或其片段；(b)編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO3之氨基酸序列的DNA序列或其片段；(c)編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示氨基酸序列中缺失、加入、插入或取代1個或多個氨基酸所得到之氨基酸的DNA序列或其片段；(d)能夠與上面(a)到(c)中任意一個雜交的DNA序列。
3.根據(jù)權利要求1或2的分離的DNA，其中的多肽來自紅球菌屬菌株。
4.根據(jù)權利要求3的分離的DNA，其中的多肽來自紅球菌菌種M-777。
5.重組DNA，其包含權利要求中1到4中任意一項的分離的DNA。
6.包含權利要求5的重組DNA的載體。
7.根據(jù)權利要求6的載體，其中的重組DNA可操作地連接到啟動子上。
8.用權利要求6或7的載體轉(zhuǎn)化的原核或真核細胞。
9.生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的方法，其包括下列步驟(a)培養(yǎng)權利要求8的細胞；(b)從步驟(a)獲得的培養(yǎng)物中回收具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等同變異體。
10.由權利要求9的方法生產(chǎn)的或由權利要求1到4中任意一項的分離的DNA編碼的具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性的多肽或其功能等變異體。
11.與權利要求1到4中任意一項的分離的DNA特異性雜交的合成的寡核苷酸探針引物。
12.與權利要求10的多肽特異性地結合的抗體或其片段。
全文摘要
帶有編碼具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的序列的分離的DNA，和以基因重組技術生產(chǎn)具有神經(jīng)酰胺糖內(nèi)切酶激活物活性之多肽或其功能等同變異體的方法。
文檔編號C12N15/31GK1145952SQ9611106
公開日1997年3月26日 申請日期1996年6月29日 優(yōu)先權日1995年6月29日
發(fā)明者黑目洋子, 伊豆博幸, 泉可也, 佐野睦, 加藤郁之進, 伊東信 申請人:寶酒造株式會社