專利名稱：利用異源啟動(dòng)子在鏈霉菌中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類能在鏈霉菌中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla haemoglobin，VHb)的質(zhì)粒，屬于生物工程領(lǐng)域。
鏈霉菌及相近的菌用來生產(chǎn)許多種抗生素，如四環(huán)素、紅霉素等。高密度鏈霉菌發(fā)酵物的高粘度特性使抗生素生產(chǎn)過程中的供氧成為一個(gè)主要問題。作為次生代謝物，抗生素的合成通常對氧氣的供給又十分敏感。以前主要通過反應(yīng)器的優(yōu)化、通富氧空氣和添加某些氧氣助溶劑來滿足微生物的氧耗。
1988年，由原核的透明顫菌(Vitreoscilla spp.)克隆到透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla haemoglobin gene，vgb)，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，研究了其低氧誘導(dǎo)的特性。在大腸桿菌和真菌系統(tǒng)中證明導(dǎo)入vgb基因可在細(xì)胞水平改善供氧和提高產(chǎn)生ATP的效率。Magnolo等在天藍(lán)鏈霉菌及變青鏈霉菌中表達(dá)了VHb，結(jié)果表明將vgb引入好氧的工業(yè)微生物中能起到更有效地利用氧，降低能耗，促進(jìn)生長，增加產(chǎn)品產(chǎn)量的有益作用。但是Magnolo等構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pWLD5和pWLD10不能確切地說明vgb表達(dá)的關(guān)鍵問題vgb基因啟動(dòng)子在鏈霉菌中能否起作用，VHb的表達(dá)不能通過誘導(dǎo)達(dá)到更高的水平，質(zhì)粒上含過多的非必要異源基因片段也降低了其實(shí)用性。本發(fā)明中以質(zhì)粒pIJ4083-pro(本發(fā)明構(gòu)建)證明了vgb天然的啟動(dòng)子在變青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24中不起作用。
本發(fā)明旨在提供一種能夠在鏈霉菌中高水平表達(dá)血紅蛋白的基因工程質(zhì)粒。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將vgb基因(D.A.Webster博士惠贈(zèng))的天然啟動(dòng)子去掉，插入異源啟動(dòng)子下游后得到能有效表達(dá)VHb的質(zhì)粒。具體地說是將去掉天然啟動(dòng)子的vgb基因克隆到質(zhì)粒pIJ702(焦瑞身先生惠贈(zèng))上ORF438(開放閱讀框架438)內(nèi)的Sph I-Bg1II位點(diǎn)，與ORF438同向，得到pIJ702-vgb′。Sph I位點(diǎn)內(nèi)的ATG正好是ORF438的翻譯啟始密碼，進(jìn)一步去掉ORF438啟動(dòng)子與vgb ORF(血紅蛋白基因開放閱讀框架)之間含ATG的DNA片段，將二者連成嵌合基因，得到質(zhì)粒pFW2。再將此嵌合基因克隆至鏈霉菌質(zhì)粒pIJ699(焦瑞身先生惠贈(zèng))得到質(zhì)粒pFW201。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒pFW201上，pIJ699所帶的終止子消除了質(zhì)粒上其他基因片段對ORF438啟動(dòng)子表達(dá)的影響。此啟動(dòng)子可用胰蛋白胨誘導(dǎo)，pFW201應(yīng)可在需要時(shí)達(dá)到更高的VHb表達(dá)水平。這幾個(gè)VHb表達(dá)質(zhì)粒均不含除vgb之外的非鏈霉菌DNA片段，同時(shí)去掉了vgb 5′和3′端的多余片段，從而降低了被宿主菌限制的可能性。將該質(zhì)粒引入用于抗生素生產(chǎn)的鏈霉菌，能較大幅度提高抗生素產(chǎn)量，降低能耗。
在以下實(shí)施例中對發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述

圖1是質(zhì)粒pIJ4083-pro的構(gòu)建示意圖。
圖2是質(zhì)粒pOK12-vgb′的構(gòu)建示意圖。
圖3是質(zhì)粒pFW201的構(gòu)建示意圖。
圖4是變青鏈霉菌TK24中表達(dá)VHb活力圖。其中a.TK24/pIJ702作為陰性對照，b.TK24/pFW201圖中Amp為氨芐青霉素抗性基因，tsr為硫鏈絲菌素抗性基因，xylE為鄰苯二酚2，3-雙加氧酶基因，Km為卡那霉素抗性基因，mel為酪氨酸酶基因，PORF438為開放閱讀框架438啟動(dòng)子，ter為終止子，Aat II、Afl II、BamH I、Bcl I、Bgl II、EcoR I、EcoR V、Hind III、Sph I等為限制性內(nèi)切酶，OD為光密度，nm為納米。
實(shí)施例1，質(zhì)粒pIJ4083-pro的構(gòu)建。
參見圖1。pUC21-vgb(本實(shí)驗(yàn)室保存)上含vgb基因的透明顫菌DNA片段長約1.4kb，方向?yàn)镠ind III到BamH I，Hind III與Afl II之間為啟動(dòng)子，Afl II與Aat II之間為ORF。將pUC21-vgb上1.4kb的Hind III-BamH I片段切下，與同樣酶切的起動(dòng)子探針質(zhì)粒pIJ4083(鄧子新先生惠贈(zèng))用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌TK24(朱寶泉先生惠贈(zèng))后得到pIJ4083-vgb，BamH I和Afl II雙酶切pIJ4083-vgb，Klenow酶補(bǔ)平，凍融法回收大片段，T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化TK24得到pIJ4083-pro。
實(shí)施例2，vgb啟動(dòng)子在TK24中無功能。
向TK24/pIJ4083-pro在R2YE平板上長出的菌落滴加0.2mol/L鄰苯二酚不顯黃色，即無xylE基因編碼的鄰苯二酚2，3-雙加氧酶活力；培養(yǎng)TK24/pIJ4083-pro至對數(shù)中期后以保鮮膜封口實(shí)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)，12小時(shí)后真空抽濾收集菌體，懸浮于100mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液中，于4℃超聲破碎，10,000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后取上清。收集菌體制成無細(xì)胞抽提液。取3ml無細(xì)胞抽提液，加入5μl 0.2mol/L鄰苯二酚溶液，避光于30℃保溫10分鐘，測定375nm處的光吸收，未能測到鄰苯二酚2，3-雙加氧酶酶活，表明vgb啟動(dòng)子在TK24中不能帶動(dòng)xylE基因的轉(zhuǎn)錄，即無功能。
實(shí)施例3，質(zhì)粒pOK12-vgb′的構(gòu)建。
參見圖2。以Afl II酶切pUC21-vgb，Klenow酶補(bǔ)平，再以BamH I酶切，凍融回收1.3kb的vgb′(去掉天然起動(dòng)子的vgb基因稱為vgb′)，與經(jīng)BamH I和EcoR V雙酶切的pWSK129(本實(shí)驗(yàn)室保存)以T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(本實(shí)驗(yàn)室保存)后得到pWSK129-vgb′。Hind III和Aat II雙酶切pWSK129-vgb′，凍融回收800bp的vgb′，與經(jīng)Hind III和Aat II雙酶切的pOK12(本實(shí)驗(yàn)室保存)以T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后得到pOK12-vgb′。
實(shí)施例4，質(zhì)粒pFW201的構(gòu)建。
參見圖3。Sph I和BamH I雙酶切pOK12-vgb′，凍融回收800bp的vgb′片段并與SphI和Bgl II雙酶切的pIJ702以T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化TK24后得到pIJ702-vgb′，HindIII和Sph I雙酶切pIJ702-vgb′，T4 DNA多聚酶切平與補(bǔ)平大片段兩端，T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化TK24得到pFW2，Bcl I酶切pFW2，凍融回收2.19kb的含ORF438啟動(dòng)子和vgb′的片段，EcoR I和Bgl II雙酶切pIJ699，凍融回收5kb的Bgl II-Bgl II片斷，將二者以T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化TK24后得到pFW201。(S.lividans TK24/pFW201，存放標(biāo)記為CCTCC M 96007中國·武漢·武漢大學(xué)校內(nèi)·中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。
實(shí)施例5，含血紅蛋白表達(dá)質(zhì)粒的TK24中VHb活力的測定。
參見圖4。同前制無細(xì)胞抽提液，以差分光譜法測定菌體中VHb的活力，經(jīng)光譜掃描在420nm處有特征吸收峰者為有VHb表達(dá)。可見TK24/pFW201在420nm附近有吸收峰，即能檢測到VHb活力，對照TK24/pIJ702沒有。
權(quán)利要求
1.一類能在鏈霉菌中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白(VHb)的質(zhì)粒，其特征在于將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)插入鏈霉菌啟動(dòng)子下游。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于插入鏈霉菌啟動(dòng)子下游的是去掉天然啟動(dòng)子的透明顫菌血紅蛋白基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于所述的鏈霉菌啟動(dòng)子是ORF438啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的質(zhì)粒，其特征在于去掉了異源的ORF438啟動(dòng)子與透明顫菌血紅蛋白基因ORF之間含ATG的DNA片段，將兩者連成嵌合基因，得到質(zhì)粒pFW2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于所述的嵌合基因克隆到鏈霉菌質(zhì)粒pIJ699中，得到質(zhì)粒pFW201。
全文摘要
本發(fā)明在證明透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)啟動(dòng)子在鏈霉菌中無作用后,構(gòu)建了一個(gè)能在鏈霉菌中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白(VHb)的質(zhì)粒pFW201,將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)啟動(dòng)子去掉后插入鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702上ORF438啟動(dòng)子下游,去掉ORF438啟動(dòng)子和透明顫菌血紅蛋白基因之間含ATG的DNA片段,再將這一嵌合基因克隆至pIJ699,得到能有效表達(dá)透明顫菌血紅蛋白,并能經(jīng)胰蛋白胨誘導(dǎo)的質(zhì)粒pFW201。
文檔編號(hào)C12N15/74GK1171444SQ9611643
公開日1998年1月28日 申請日期1996年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月19日
發(fā)明者崔鳳文, 楊勝利 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心