專利名稱：新的混合菌組合生產(chǎn)維生素c前體－2－酮基－l－古龍酸(2－klg)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的混合菌組合，使用該混合微生物可從L-山梨糖發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體-2-酮基-L-古龍酸(簡(jiǎn)稱2-KLG)。
2-酮基-L-古龍酸(簡(jiǎn)稱2-KLG)是生產(chǎn)維生素C(又稱L-抗壞血酸)的重要前體，目前主要用兩種方法生產(chǎn)。
1933年，德國(guó)化學(xué)家reichstein等用化學(xué)合成法(通常被稱為“萊氏法”)制取維生素C獲得成功，國(guó)外目前大多采用改良的“萊氏法”生產(chǎn)維生素C(

圖1)?！叭R氏法”合成維生素C反應(yīng)途徑主要包括葡萄糖高壓加氫變成山梨醇，山梨醇發(fā)酵生成L-山梨糖，山梨糖經(jīng)過(guò)酮化，氧化成2-KLG，再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化生成維生素C。萊氏法工藝成熟，總轉(zhuǎn)化率50％左右，但是該法需消耗大量有毒、易燃易爆化學(xué)品，生產(chǎn)工廠需要相對(duì)較高的投資，從生態(tài)與經(jīng)濟(jì)角度上看均不利。
我國(guó)在七十年代初期發(fā)明了“二步發(fā)酵法”制備維生素C新工藝，歐洲專利號(hào)NO0278447，是在“萊氏法”的基礎(chǔ)上予以改進(jìn)的(圖2、圖3)，這個(gè)技術(shù)主要是采用一株氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和一株巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)組成的混合菌組合，將山梨醇發(fā)酵產(chǎn)生的L-山梨糖發(fā)酵成為維生素C前體2-KLG，代替了化學(xué)氧化，產(chǎn)酸50-60g/L，但是該工藝仍不能完全令人滿意，因?yàn)榈孜餄舛群娃D(zhuǎn)化率未能進(jìn)一步提高，發(fā)酵過(guò)程中亦容易發(fā)生染菌，提取及后處理工藝也有待改善。
本發(fā)明旨在尋找新的混合菌組合利用L-山梨糖發(fā)酵生成2-KLG，能耐受和利用更高濃度的底物山梨糖，比現(xiàn)有技術(shù)更高效率地產(chǎn)生2-KLG，有效地解決生產(chǎn)中易染菌的問(wèn)題。
本發(fā)明主要是通過(guò)誘變育種技術(shù)篩選得到一株產(chǎn)酸能力強(qiáng)且穩(wěn)定的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)，通過(guò)與另一株蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)自然搭配混合發(fā)酵，在底物L(fēng)-山梨糖濃度為80-140g/l左右時(shí)，能有效地轉(zhuǎn)化生成2-KLG 70-130g/l，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到86％，新的發(fā)酵組合具有很強(qiáng)的抗染菌能力。
為了使本發(fā)明更好地被理解，下面對(duì)此進(jìn)行一些細(xì)節(jié)描述氧化葡萄糖酸桿菌的誘變過(guò)程如下，將出發(fā)菌株1.945(氧化葡萄糖酸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保存)單菌落增殖后，紫外處理30分鐘，避光培養(yǎng)過(guò)夜，平板分離與蘇云金芽孢桿菌搭配通過(guò)發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)挑選產(chǎn)酸能力強(qiáng)且性狀穩(wěn)定的單菌落，其中一株具有代表性的菌株編號(hào)SCB329，其形態(tài)特征和生理生化特性與1.945均有顯著差別。
利用本發(fā)明轉(zhuǎn)化L-山梨糖產(chǎn)生2-KLG的特點(diǎn)在于所采用的是包含有氧化葡萄糖酸桿菌和蘇云金芽孢桿菌或者它們的變異株所組成的混合菌株，其中效果最佳的是采用了氧化葡萄糖酸桿菌SCB329和蘇云金芽孢桿菌SCB933的混合菌組合(存放標(biāo)記為CCTCC M96012，中國(guó)·武漢·武漢大學(xué)校內(nèi)·中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。
把該混合菌體系培養(yǎng)在含有L-山梨糖以及適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在通氣條件下，微生物適宜于在液體培養(yǎng)。
發(fā)酵可以在搖瓶及5L、15L、147L罐中進(jìn)行，甚至更大規(guī)模地實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。
發(fā)酵過(guò)程pH可以在5到8之間進(jìn)行，最佳為6.8到7.0之間。
發(fā)酵過(guò)程合適溫度在25到35℃之間，最好為28到32℃。
發(fā)酵周期取決于pH、溫度和山梨糖濃度等，可以有所變化，一般為1.5到3天。
發(fā)酵中用作原料的L-山梨糖底物濃度可以在大約20g/l到200g/l之間變動(dòng)，最適為80g/l到140g/l。山梨糖濃度在最初培養(yǎng)基中可以較低，而在發(fā)酵中間流加含一定量輔料的山梨糖溶液，因此2-KLG濃度可達(dá)130g/l或更高。
按本發(fā)明所得到的2-KLG可直接由發(fā)酵液中分離提取，并能通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)變成L-抗壞血酸(維生素C)。
本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1.新的混合菌發(fā)酵技術(shù)采用產(chǎn)酸能力強(qiáng)且性狀穩(wěn)定的氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans SCB329)的菌株以及另一株蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis SCB933)自然搭配，混合發(fā)酵生成2-KLG，轉(zhuǎn)化率大大提高，可達(dá)到86％。
2.可以耐受較高的糖濃度，在底物濃度高達(dá)80-140g/l左右時(shí)，能有效地轉(zhuǎn)化生成2-KLG達(dá)70-130g/l以上。
3.新的發(fā)酵體系搭配有蘇云金芽孢桿菌，因而具有很強(qiáng)的抗染菌能力。
本發(fā)明可用下面的例子詳細(xì)說(shuō)明圖1為萊氏法工藝流程示意圖。圖2為二步發(fā)酵法工藝流程示意圖。圖3為二步發(fā)酵法中L-山梨糖氧化反應(yīng)原理圖。圖4為5L罐分批發(fā)酵殘?zhí)呛彤a(chǎn)酸變化曲線圖。其中
表示L-山梨糖殘留量(g/l)
表示2-KLG生成量(g/l)圖5為147L罐流加發(fā)酵殘?zhí)呛彤a(chǎn)酸變化曲線圖。其中
表示溶氧水平(％)
表示L-山梨糖殘留量(g/l)
表示2-KLG生成量(g/l)實(shí)施例1、搖瓶發(fā)酵將氧化葡萄糖酸桿菌SCB329劃線于種子固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，再在此培養(yǎng)物上直接接種蘇云金芽孢桿菌SCB933，28℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以無(wú)菌水將菌苔洗下得到菌懸液，接入種子搖瓶(裝量25ml/250ml)，28℃下250rpm振蕩培養(yǎng)12-14小時(shí)，產(chǎn)酸4-7g/l，以5％接種量接入發(fā)酵搖瓶(裝量50ml/500ml)，28℃下250rpm振蕩培養(yǎng)3天，所得發(fā)酵液產(chǎn)生2-KLG 70.5g/l。
種子培養(yǎng)基成分山梨糖(1.5％)，玉米漿(0.3％)，CaCO3(0.3％)，蛋白胨(1.0％)，酵母粉(0.5％)，尿素(0.4％)，KH2PO4(0.5％)，MgSO4.7H2O(0.02％)。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分山梨糖(8％)，玉米漿(1％)，CaCO3(0.4％)。實(shí)施例2、5L罐分批發(fā)酵參見(jiàn)圖4，SCB329于種子固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，再劃線接上SCB933繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以無(wú)菌水洗下，得到菌懸液接入種子搖瓶(裝量80ml/500ml)，28℃培養(yǎng)12小時(shí)，產(chǎn)酸4-5g/l，以5％接種量接入5L發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度28-30℃，pH6.8-7.0，發(fā)酵周期30小時(shí)，產(chǎn)生2-KLG 71.35g/l，摩爾轉(zhuǎn)化率89.99％。
罐發(fā)酵培養(yǎng)基成分山梨糖(8％)，玉米漿(2％)，CaCO3(0.2％)，尿素(0.05％)，KH2PO4(0.05％)，MgSO4.7H2O(0.01％)。實(shí)施例3、147L罐流加發(fā)酵參見(jiàn)圖5，SCB329于種子固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，再劃線接上SCB933繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，以無(wú)菌水洗下，得到菌懸液接入種子搖瓶(裝量80ml/500ml)，28℃培養(yǎng)12小時(shí)，產(chǎn)酸4-5g/l，以5％接種量接入15L種子罐，培養(yǎng)溫度28-30℃，pH6.8-7.0，經(jīng)12小時(shí)后產(chǎn)酸達(dá)4-5g/l，以5％接種量接入147L發(fā)酵罐，初始培養(yǎng)基中山梨糖濃度4.52％，發(fā)酵溫度28-30℃，pH6.8-7.0，發(fā)酵至16小時(shí)開(kāi)始流加67.1％山梨糖溶液，使之終濃度達(dá)13.86％，38小時(shí)后流加結(jié)束并繼續(xù)發(fā)酵4-8小時(shí)，產(chǎn)生2-KLG 130g/l，摩爾轉(zhuǎn)化率87.04％。
權(quán)利要求
1.以L-山梨糖為底物，采用混合菌組合發(fā)酵制備維生素C前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)，其特征在于使用了以氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)或者它們的變異株所組成的混合菌組合。
2.按權(quán)項(xiàng)要求1所述的混合菌組合，其特征在于所述的氧化葡萄糖酸桿菌為SCB329。
3.按權(quán)項(xiàng)要求1所述的混合菌組合，其特征在于所述的蘇云金芽孢桿菌為SCB933。
4.按權(quán)項(xiàng)要求1所述的采用混合菌組合發(fā)酵制備2-KLG的方法，其特征在于發(fā)酵中L-山梨糖底物濃度可從20-200g/l，最宜為80-140g/l。
5.按權(quán)項(xiàng)要求1，4中所述的方法，其特征在于發(fā)酵溫度為25-35℃，最好為28-32℃。
6.按權(quán)項(xiàng)要求1，4中所述的方法，其特征在于發(fā)酵過(guò)程中pH為5.0-8.0，最適pH為6.8-7.0。
7.按權(quán)項(xiàng)要求1，4中所述的方法，其特征在于發(fā)酵周期為1.5-3天。
全文摘要
本發(fā)明采用一株產(chǎn)酸能力強(qiáng)且穩(wěn)定的氧化葡萄糖酸桿菌與另一株蘇云金芽孢桿菌搭配,以L－山梨糖為底物進(jìn)行混合發(fā)酵,在底物濃度高達(dá)8—14%左右時(shí),能有效地轉(zhuǎn)化生成2－KLG達(dá)70—130g/l,轉(zhuǎn)化率86%以上。新的發(fā)酵組合體系具有很強(qiáng)的抗染菌能力。
文檔編號(hào)C12P17/04GK1174237SQ9611646
公開(kāi)日1998年2月25日 申請(qǐng)日期1996年8月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月15日
發(fā)明者尹光琳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心