專利名稱：細(xì)胞轉(zhuǎn)染的制作方法
基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已成為人們極為關(guān)注的一個領(lǐng)域。把一外源基因?qū)爰?xì)胞中(即轉(zhuǎn)染)在科學(xué)及醫(yī)學(xué)上具有許多重要應(yīng)用，范圍包括從基因調(diào)控及重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)到基因治療。
病毒已演化得能繞過各種細(xì)胞障礙達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的，其實際上已成為轉(zhuǎn)染的選擇性載體。目前人們已對多種病毒〔包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或皰疹病毒〕進(jìn)行工程處理以攜帶治療基因，用于基因治療中的人類臨床嘗試。不過，這方面存在著感染及免疫反應(yīng)上的危險，而病毒的大規(guī)模生產(chǎn)既困難又耗時。
由于這些原因，人們便開發(fā)出了非病毒性系統(tǒng)來把DNA攜帶入細(xì)胞中，例如依據(jù)陽離子脂質(zhì)(二油酰氧基三甲銨)的轉(zhuǎn)染技術(shù)(Felgner等人，Proc.Natl.，Acad.Sci，USA，84，7413-7417，1987)，商用形式為LipofectinTM。由于發(fā)現(xiàn)了這種轉(zhuǎn)染技術(shù)，已經(jīng)合成出多種陽離子脂質(zhì)，其中一些已做為可商購轉(zhuǎn)染試劑用于實驗室DOGS(Trans-fectamTM)、DOSPA(LipofectamineTM)、DOTAP(DOTAPTM)。
盡管如此，雖然在建立非病毒性基因送遞系統(tǒng)方面取得了重要的進(jìn)展，但仍然存在著對更有效技術(shù)的需求，因為合成系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率通常要低于病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。另外，在活體應(yīng)用方面也存在著許多問題，而生物液體中非病毒系統(tǒng)穩(wěn)定性差也無法保證活體轉(zhuǎn)染的高、可再現(xiàn)水平。
根據(jù)本發(fā)明我們發(fā)現(xiàn)，與脂肪酸部分相偶聯(lián)的寡肽可以結(jié)合核酸、并可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
因此，一方面，本發(fā)明涉及到具下述分子式I的化合物或其衍生物作為用聚核苷酸或任何其它陰離子大分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體的應(yīng)用R1-NH-A I其中，R1為C12-40脂族羧酸的?；糠郑鳤是缺少一個氨基的寡肽的殘基。
術(shù)語“C12-40”指從12-40個碳原子。?；糠諶1可以是直鏈或支鏈、 飽和或非飽和部分。酰基部分R1優(yōu)選含12-20個碳原子。這類基團(tuán)的實例有月桂酰、棕櫚酰、硬脂酰、油酰以及(CH3(CH2)n)2CHCO-，其中n為3-19的整數(shù)。最優(yōu)選者為棕櫚酰以及油酰。術(shù)語“寡肽”指含氨基酸殘基達(dá)20個(至少含一個堿性氨基酸)的肽，優(yōu)選達(dá)10個，更優(yōu)選達(dá)2-6個氨基酸殘基。術(shù)語“衍生物”指寡肽，其中末端羧基被酯化，尤其是形成了低級烷基酯(如甲酯及乙酯)；或者轉(zhuǎn)化為酰胺、低級烷基酰胺或雙低級烷基酰胺或酰肼。酰肼為優(yōu)選衍生物。術(shù)語“低級”是指含1-6碳原子的基團(tuán)。術(shù)語“堿性氨基酸”是指所含堿性基團(tuán)(如氨基、脒基或胍基)比羧基多的氨基酸。這類堿性氨基酸的實例有天然及非天然性的二氨基一元羧酸，如α，β-二氨基丙酸、α，γ-二氨基丁酸，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸和對氨基苯丙氨酸。氨基酸可屬于L-或D-系列的，也可以是外消旋的，α，γ-二氨基丁酸、賴氨酸及鳥氨酸為具分子式I的化合物的優(yōu)選氨基酸組分。聚核苷酸的實例為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。除聚核苷酸之外的陰離子大分子實例為蛋白質(zhì)如核糖核蛋白及用于免疫作用的蛋白質(zhì)(例如病毒蛋白)。
本發(fā)明中所使用的DNA實例為質(zhì)粒及基因，特別是那些基因治療方案中已利用的DNA，如囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)基因(CFTR)、腺苷脫氨酶(ADA)、腺苷激酶(tk)及HLA B7；還有報告基因，如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、氯霉素轉(zhuǎn)移酶以及α-1抗胰蛋白酶。
DNA的其它實例為寡脫氧核苷酸及其用做反義、aptamer或“三螺旋”試劑的類似物。RNA的實例為核酶或寡核糖核苷酸反義分子。
本發(fā)明中使用的具分子式I的化合物實例有Nα-棕櫚酰-L-賴氨酰-L-賴氨酸及其甲酯及乙酯；Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼；以及Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼。人們已熟知具分子式I的化合物，參見Helv.Chim.Acta.47(1964)P.526-543。
要進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的特性并非要求十分嚴(yán)格。細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞、哺乳動物或植物細(xì)胞。
依據(jù)本發(fā)明來轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如用DNA或RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染)時，具分子式I的化合物與DNA或RNA之間的比率優(yōu)選為具分子式I的正電荷性化合物與負(fù)電荷性的DNA或RNA之間的+/-電荷之比的范圍為0.1-10，更優(yōu)選為0.5-5。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，轉(zhuǎn)染是在存在協(xié)助脂質(zhì)及/或短鏈磷脂及/或其它已知轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子的條件下進(jìn)行的。協(xié)助脂質(zhì)的實例為磷脂，如卵磷脂或腦磷脂或其混合物。優(yōu)選的協(xié)助脂質(zhì)是腦磷脂，如二油酰腦磷脂。短鏈磷脂的實例是卵磷脂，其攜帶著兩個C6-12脂肪酸殘基。優(yōu)選的短鏈磷脂為二辛基及二辛酰基卵磷脂。協(xié)助脂質(zhì)及/或短鏈磷脂的適宜形式為脂質(zhì)體、混合性微團(tuán)、有機溶液或水分散體。
轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子的實例包括陽離子脂質(zhì)，如J.B.Behr在Bioconiugate Chem.5382-389(1994)及X.Gao和L.Huang在GeneTher.2710-722(1995)中所述；聚陽離子，如A.V.Kabanov及V.A.Kabanov在Bioconjugate Chem.67-20(1995)中所述；膚及聚合物及其它非病毒基因送遞體系，如F.D.Ledley在Human Gene Therapy61129-1144(1995)中所述。
另一方面，本發(fā)明涉及含上述分子式I化合物、聚核苷酸或任何其它陰離子大分子、以及可選擇的協(xié)助脂質(zhì)和/或短鏈磷脂及/或如上所述的其它已知轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子的組合物。在其另一方面，本發(fā)明還涉及含上述分子式I化合物、以及協(xié)助脂質(zhì)及/或短鏈磷脂的組合物。
在本發(fā)明的實施中，將適宜量的分子式I化合物加入溶于適當(dāng)?shù)乃芤褐械囊D(zhuǎn)染的分子(例如質(zhì)粒DNA)中。加入?yún)f(xié)助脂質(zhì)，如需要的話，加入短鏈磷脂及/或其它已知轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子，可以是脂質(zhì)體、混合性微團(tuán)形式，也可以是有機溶液或水分散體形式。另外，向含分子式I化合物、協(xié)助脂質(zhì)及如需要的話，短鏈磷脂及/或其它已知轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子的組合物中，加入所要轉(zhuǎn)染的分子。該組合物可以是固態(tài)、液態(tài)、半固態(tài)或氣溶膠形式的，適宜的形式為脂質(zhì)體、混合性微團(tuán)或為有機溶液或水分散體形式。
組分(即分子式I的化合物、轉(zhuǎn)染分子、及可選擇的附加成份)之間的最適比例要依所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而定。化合物I及所轉(zhuǎn)染的分子之間的最適+/-電荷比在0.1-10間變化，優(yōu)選為0.5-5。分子式I的化合物與協(xié)助脂質(zhì)之間的最適摩爾比為0.1-50，優(yōu)選為1-10。協(xié)助脂質(zhì)與短鏈磷脂之間的最適摩爾比為2-20。分子式I的化合物與附加性轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子之間的最適摩爾比為0.1-10。
對轉(zhuǎn)染而言，把含有上述分子式I化合物、聚核苷酸或任何其它陰離子大分子及可選擇的協(xié)助脂質(zhì)及/或短鏈磷脂及/或上述其它已知轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子的組合物加入細(xì)胞中。對病獸或患者的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，組合物的施用途徑可以為口服、腸胃外服用(i.v.，i.m.，s.c.，i.d.，i.p.)、跨皮膚施用、肺部、鼻道、直腸、眼部、心室、血管(導(dǎo)管)及腫瘤內(nèi)使用。另外，該組合物還可以通過高速嵌塞在皮膚表面使用。轉(zhuǎn)染的進(jìn)展可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的適宜測試方案進(jìn)行檢測。
下述非限制性實施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實施例1利用真空下干燥氯仿中的脂質(zhì)溶液，而后再利用30mM Tris Cl(pH8.5)來再水化，以此來制備出二油酰腦磷脂(DOPE，Avanti Polar Lipid公司)。脂質(zhì)的終濃度為2mM。而后在聲波浴(Elgasonic，50kHz)中對脂質(zhì)分散液進(jìn)行聲波處理10-15分鐘。
用260μl的無菌蒸餾水，在聚苯乙烯無菌試管中對20μg質(zhì)粒DNA進(jìn)行稀釋。而后，加入56nmo1(35.2μg)的Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼，使得Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼與DNA之間的+/-電荷比為2∶1。而后緩慢逐滴加入140μl的DOPE脂質(zhì)體，使DOPE與Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼之間的摩爾比為5∶1。謹(jǐn)慎混合復(fù)合體。將制備液放置室溫下大約5分鐘，然后加入到在96小格平板上生長的COS-1細(xì)胞中。
對于其它分子式I化合物使用類似的制備程序。
各種化合物的轉(zhuǎn)染效率如表1所示。
表1實施例1中分子式I的化合物在COS-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
用β-半乳糖苷酶編碼質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時對β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表述為每轉(zhuǎn)染格的β-半乳糖苷酶μ單位
實施例2通過真空下干燥脂質(zhì)、再用1ml的30mM Tris Cl緩沖液(pH8.5)對脂質(zhì)膜進(jìn)行再水化來制備出DOPE(2μmol)和二己酰基卵磷脂(15μmol)的混合性微團(tuán)。用260μl的蒸餾水在聚苯乙烯無菌試管中將20μg的質(zhì)粒pCH110稀釋。而后，加入56nmol(35.2μg)的Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼，使得Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼與DNA的+/-電荷比為2∶1。然后緩慢加入140μl的DOPE/二己?；鵓C混合微團(tuán)，使得DOPE與Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼之間的摩爾比為5∶1。謹(jǐn)慎混合復(fù)合體。把制備液在室溫下放置約5分鐘，而后加入到96小格平板上生長的COS-1細(xì)胞中。
COS-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(以β-半乳糖苷酶活性表示)，每格0.2μg及1μg DNA時分別是7280和6375μ單位/格。
實施例3將56nmol(35.2μg)的Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼與5摩爾過量的DOPE脂質(zhì)體(280nmol，如實施例1所制備)相混合。將混合物加入到260μl蒸餾水中的20μg質(zhì)粒DNA中，使得Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼與質(zhì)粒DNA的+/-電荷比為2∶1。謹(jǐn)慎混合復(fù)合體。將制備物在室溫下放置約5分鐘，而后加入到96小格平板上生長的COS-1細(xì)胞中。
COS-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(以β-半乳糖苷酶活性表示)在每格為0.2μg及1μg DNA時分別為4205及7880μ單位/格。
實施例4如實施例1所述，制備出含Nγ-棕櫚酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼(化合物A)的轉(zhuǎn)染復(fù)合體。依照廠家說明來制備Lipofectamine復(fù)合體。利用熒光素酶編碼載體在各種細(xì)胞系中對二者系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較。
結(jié)果見表2。
表2
利用熒光素酶編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時后對熒光素酶活性進(jìn)行檢測。結(jié)果表述為相對光單位。
權(quán)利要求
1.式I的化合物或其衍生物作為用聚核苷酸或任何其它陰離子大分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體的應(yīng)用，R1-NH-AI其中R1為C12-40脂族羧酸的?；糠?，而A是缺少一個氨基的寡肽的殘基。
2.如權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中附加有協(xié)助脂質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中協(xié)助脂質(zhì)為卵磷脂或腦磷脂或其混合物。
4.如權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中協(xié)助脂質(zhì)為二油酰腦磷脂。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項的應(yīng)用，其中在分子式I化合物中的寡肽含有達(dá)10個氨基酸殘基。
6.如權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中在分子式I化合物中的寡肽殘基含2-6個氨基酸殘基。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項的應(yīng)用，其中寡肽至少含有一個α，γ-二氨基丁酸、鳥氨酸或賴氨酸殘基。
8.如權(quán)利要求1-7的應(yīng)用，其中寡肽的末端羧基被轉(zhuǎn)變?yōu)轷ｋ隆?br> 9.如權(quán)利要求1-8中任一項的應(yīng)用，其中分子式I的化合物中R1為棕櫚?；蛴王；?。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項的應(yīng)用，其中至少存在著一個轉(zhuǎn)染感受態(tài)分子。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項的應(yīng)用，其中附加有短鏈磷脂。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項的應(yīng)用，其中短鏈磷脂為二辛基或二辛酰基卵磷脂。
13.一種組合物，它含有如權(quán)利要求1中定義的分子式I的至少一種化合物、聚核苷酸或任何其它陰離子大分子，以及可選擇的協(xié)助脂質(zhì)及/或短鏈磷脂。
14.一種組合物，它含有一種如權(quán)利要求1所定義的分子式I的化合物和一種協(xié)助脂質(zhì)。
15.如權(quán)利要求14中的一種組合物，其中協(xié)助脂質(zhì)為卵磷脂或腦磷脂。
16.如權(quán)利要求14或15的一種組合物，其中各組分的形式為脂質(zhì)體、混合性微團(tuán)、有機溶液或水分散體。
17.如權(quán)利要求13-16的一種組合物，其中組合物形式為固體、液體、半固體或氣溶膠。
全文摘要
分子式R
文檔編號C12N15/87GK1158898SQ9612173
公開日1997年9月10日 申請日期1996年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月22日
發(fā)明者J-Y·萊根卓, A·蘇泊薩斯克, A·特澤西克 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司