專利名稱：凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法。
固定化酶是制備生物傳感器的關(guān)鍵步驟。迄今為止，應(yīng)用最普遍的固定化技術(shù)是采用凝膠/聚合物包埋。它能將酶分子或細(xì)胞包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。B.A.Gregg，A.Heller，J.Phys.Chem，1991，95，5976公開了一種在電極表面用長鏈雙環(huán)氧交聯(lián)聚4-乙烯基吡啶并同時(shí)固定化酶的方法，所得的含酶水凝膠能牢固粘附于電極表面并有較快的響應(yīng)，但純疏水的4-乙烯基吡啶載體骨架不利于酶的生物相容性和生物穩(wěn)定性，且雙環(huán)氧化學(xué)交聯(lián)過程會造成少量酶失活。Tongyin Yu，Haiying Liu，Jiaqi Deng and Yongcheng Liu，在J.of Appl.Polym.Sci.，1995，58，973中報(bào)道了一種用再生蠶絲包埋酶來制備生物傳感器的方法，其最大的優(yōu)點(diǎn)是固定化酶過程中避免了化學(xué)交聯(lián)或自由基聚合等容易導(dǎo)致酶失活的操作，但由蠶絲本身的性質(zhì)所決定，此法制得的膠膜在干燥或長時(shí)間暴露于空氣中時(shí)會變脆，進(jìn)而影響生物傳感器的性能。
本發(fā)明的目的是提供一種凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法，即將酶溶于聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶的水溶液或二甲基亞砜/水混合液后，將所得混和液直接滴涂于電極表面，低溫放置一段時(shí)間，使聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶自身物理交聯(lián)成膠并同時(shí)包埋酶，得到酶膜牢固粘附于電極表面的生物傳感器，這樣制備出的生物傳感器平衡時(shí)間短，響應(yīng)快，重現(xiàn)性好，使用壽命長。
聚乙烯醇是一種人工合成的多羥基聚合物，具有良好的生物相容性和生物穩(wěn)定性，能在水或二甲基亞砜/水混合液中通過自身物理交聯(lián)成膠并同時(shí)包埋酶，且所得含酶膠膜穩(wěn)定性和耐用性較好，因而被廣泛地用作生物傳感器和生物反應(yīng)器中的固定化酶載體。本發(fā)明選用聚乙烯醇的4-乙烯基吡啶接枝物作為固定化酶載體，在保留了聚乙烯醇所有優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，極大地增加了酶膜在電極表面的粘附力，同時(shí)，固定化酶的效果也更好。
本發(fā)明將聚乙烯醇的4-乙烯基吡啶接枝物配成濃度為2～5％的水溶液或二甲基亞砜/水混合液，再將0.5～3.0毫克的酶，包括葡葡糖氧化酶，辣根過氧化物酶，多酚氧化酶等加入150～300微升該溶液中，也可以將1×10-2mol·L-1的媒介體，如鐵氰化鉀等同時(shí)加入其中，混合均勻后，將5～15微升該混合液滴涂到基底電極表面，-20℃～+4℃自然放置16～24小時(shí)，即得所需的生物傳感器。該方法也可用于醇氧化酶，膽固醇氧化酶，醇脫氫酶，漆酶，膽堿脂酶，膽堿氧化酶，膽紅素氧化酶，脂肪酶等酶的固定。
本發(fā)明所述生物傳感器的制備方法選用了一種新型固定化酶載體聚乙烯醇的4-乙烯基吡啶接枝物，它具有良好的生物相容性和生物穩(wěn)定性，并能與電極表面牢固結(jié)合；通過載體自身物理交聯(lián)成膠并同時(shí)包埋酶，可避免化學(xué)交聯(lián)劑或自由基等造成的酶活損失；可根據(jù)檢測體系的需要制成水凝膠或二甲基亞砜/水混合液有機(jī)凝膠，分別用于水相和有機(jī)相中的檢測；制備方法簡單易行，重現(xiàn)性好；制得的生物傳感器適用范圍廣，平衡時(shí)間短，響應(yīng)快，穩(wěn)定性好，使用壽命長。
本發(fā)明提供的實(shí)施例如下實(shí)施例1葡萄糖氧化酶電極。將3毫克葡萄糖氧化酶溶解在150微升2％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶水溶液中，攪拌均勻后，用微量注射器移取6微升此溶液滴涂于鉑電極表面，+4℃冰箱放置24小時(shí)，即制得葡萄糖氧化酶電極。該電極可用于水相中檢測葡萄糖，電極平衡時(shí)間1～2分鐘；響應(yīng)時(shí)間5～8秒；線性范圍5×10-6～5×10-3mol·L-1；檢測限2×10-6mol·L-1；穩(wěn)定性，2個(gè)月后響應(yīng)值為初始值的85％左右。
實(shí)施例2辣根過氧化物酶電極。將0.6毫克辣根過氧化物酶溶解在200微升5％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶水溶液中，攪拌均勻后，用微量注射器移取10微升此溶液滴涂于石墨電極表面，0℃冰箱放置20小時(shí)，即制得辣根過氧化物酶電極。該電極可用于水相中過氧化氫、酚、胺等物質(zhì)的檢測，電極平衡時(shí)間3分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間10～15秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
實(shí)施例3多酚氧化酶電極。將0.5毫克多酚氧化酶溶解在300微升5％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶水溶液中，攪拌均勻后，用微量注射器移取8微升此溶液滴涂于玻碳電極表面，-10℃冰箱放置18小時(shí)，即制得多酚氧化酶電極。該電極可在水相中測定苯酚、兒茶酚等物質(zhì)。電極平衡時(shí)間3分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間20～25秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
實(shí)施例4有機(jī)相辣根過氧化物酶電極。將0.8毫克辣根過氧化物酶溶解在200微升4％的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶的二甲基亞砜/水混合液中，其中二甲基亞砜占總體積的40％，再加入亞鐵氰化鉀并使其最終濃度為1×10-2mol·L-1，攪拌均勻后，用微量注射器移取12微升此溶液滴涂于玻碳電極表面，-20℃冰箱放置16小時(shí)，即制得有機(jī)相辣根過氧化物酶電極。該電極可用于氯仿等有機(jī)溶劑中測定過氧化氫、有機(jī)過氧化物及酚、胺等物質(zhì)的檢測，電極平衡時(shí)間10分鐘以內(nèi)；響應(yīng)時(shí)間60～90秒；穩(wěn)定性，2個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種凝膠包埋制備生物傳感器的方法，其特征在于將聚乙烯醇的4-乙烯基吡啶接枝物配成濃度為2～5％的水溶液或二甲基亞砜/水混合液，再將0.5～3.0毫克的酶，包括葡萄糖氧化酶，辣根過氧化物酶，多酚氧化酶等加入150～300微升該溶液中，也可以將1×10-2mol·L-1的媒介體，如鐵氰化鉀等同時(shí)加入其中，混合均勻后，將5～15微升該混合液滴涂到基底電極表面，-20℃～+4℃自然放置16～24小時(shí)，即得所需的生物傳感器。
全文摘要
本發(fā)明屬于凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法。本發(fā)明的目的是提供一種凝膠包埋酶制備生物傳感器的方法,即將酶溶于聚乙烯醇接枝4－乙烯基吡啶的水溶液或二甲基亞砜/水混合液后,將所得混和液直接滴涂于電極表面,低溫放置一段時(shí)間,得到酶膜牢固粘附于電極表面的生物傳感器,這樣制備出的生物傳感器平衡時(shí)間短,響應(yīng)快,重現(xiàn)性好,使用壽命長。
文檔編號C12M1/40GK1186115SQ96123528
公開日1998年7月1日 申請日期1996年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月25日
發(fā)明者董紹俊, 程廣金, 李彬, 寇文朋, 張敬忠 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所