專(zhuān)利名稱(chēng)：：新的酵母基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用冷藏生面團(tuán)制作面包的方法和制造乙醇的方法。面包制作業(yè)正在普及用冷藏生面團(tuán)制作面包的方法，其目的是使制作過(guò)程省力和滿(mǎn)足各種各樣消費(fèi)者的需要。用冷藏生面團(tuán)制作面包的方法是將使一部分發(fā)酵了的生面團(tuán)放入冷藏庫(kù)等地方低溫貯藏后，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、烘制、烤制而制作面包的方法。用冷藏生面團(tuán)制作面包方法中，使用了一種具有生面團(tuán)于低溫貯藏期間發(fā)酵被抑制、而在發(fā)酵和烘制的溫度區(qū)正常發(fā)酵使生面團(tuán)膨脹的能力的酵母，即所謂的耐冷藏酵母。作為耐冷藏酵母的育種方法，已知有對(duì)野生型酵母進(jìn)行突變處理后，賦予該酵母發(fā)酵能力表現(xiàn)出低溫敏感性的變異的方法〔例如特公平7-71474、特開(kāi)平7-213277、特開(kāi)平7-79767、App1.Environ.Microbiol，61，639-642(1995)〕。被賦予了發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異的酵母被用作耐冷藏酵母，或被用作進(jìn)行耐冷藏酵母育種的親本株。然而，突變處理中，由于變異是隨機(jī)發(fā)生的，所以實(shí)施處理時(shí)，不僅賦予了酵母低溫敏感性變異，而且也有可能賦予了與面包生面團(tuán)膨脹能力等發(fā)酵的基本特性有關(guān)的變異。另外，已知通過(guò)使用基因操作技術(shù)可以賦予面包酵母或釀造用酵母以凝集性〔23rdEuropranBrewryConv.，Proc.，297-304(1991)〕、產(chǎn)生香味〔Curr.Genet.，20，453-456(1991)〕等有用的性質(zhì)。然而，人們還不知道與發(fā)酵能力的低溫敏感性有關(guān)的基因和使用基因操作技術(shù)進(jìn)行耐冷藏酵母的育種方法。乙醇是使用作為碳源的廢糖密等糖原料或玉米、土豆等淀粉原料通過(guò)發(fā)酵方法制造的。發(fā)酵通常是在30～43℃進(jìn)行的，但由于發(fā)酵溫度的上升會(huì)引起酵母死亡、增殖不良或發(fā)酵能力低下，所以通常將溫度維持在30-35℃。然而在夏季等氣溫上升時(shí)期，冷卻不充分，乙醇發(fā)酵過(guò)程中有時(shí)培養(yǎng)溫度會(huì)上升至35～38℃。為了抑制發(fā)酵熱引起的溫度上升通常要在乙醇發(fā)酵中進(jìn)行冷卻，而為了削減冷卻上的花費(fèi)，人們?cè)趯ふ揖哂心蜏囟刃缘慕湍?。作為具有耐溫度性的酵母的育種方法有導(dǎo)入與耐溫有關(guān)的線(xiàn)粒體的方法(JuanJimenez等人；Curr.Genet.，13，461-469(1988))、有使熱休克蛋白HSP104高效表達(dá)的方法(SusanLindquist等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，5301-5306(1996)，但有關(guān)在乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用還沒(méi)有研究。人們還已知若是在酵母不致死溫度下對(duì)酵母進(jìn)行熱處理會(huì)使它的耐熱性提高(B.G.HallJ.Bacteriol.，156，1363(1983))，但其效果短暫，在乙醇發(fā)酵的應(yīng)用上是困難的。本發(fā)明涉及由序列號(hào)1給出的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或在序列號(hào)1給出的氨基酸序列中添加、缺失或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸后的氨基酸序列組成的、而且對(duì)表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性的變異互補(bǔ)的蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的基因，還涉及由序列號(hào)1給出的堿基序列組成的DNA、或是由在序列號(hào)1給出的堿基序列中添加、缺失或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)DNA的、而且對(duì)表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性的變異互補(bǔ)的DNA組成的基因。本發(fā)明還涉及屬于酵母(Saccharomyces)屬的發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的酵母，其特征是染色體上的上述基因被失活；以及含有該酵母的生面團(tuán)；面包的制作方法，其特征是將該酵母添加到生面團(tuán)中；以及乙醇的制作方法，其特征是將該酵母在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使乙醇在培養(yǎng)物中蓄積，然后從該培養(yǎng)物中獲取乙醇。本發(fā)明中，所謂的發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性是指在低溫貯藏的溫度區(qū)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的發(fā)酵能力，而在低溫貯藏后，在發(fā)酵或烘制的溫度區(qū)內(nèi)又表現(xiàn)出正常發(fā)酵能力的性質(zhì)。例如，在面包酵母的情況下，是指在5℃下不具有使面團(tuán)膨脹的能力，并且在5℃下冷藏貯藏1-7天后，在20-40℃下具有正常的膨脹能力；在乙醇酵母的情況下，是指在5℃下不具有乙醇發(fā)酵能力，并且在5℃下冷藏貯藏1-7天后，在20-40℃下具有正常的乙醇發(fā)酵能力。而有關(guān)分離對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的基因，確定該基因序列，使該基因失活所用的基因工程或生物工程的基本操作可以按著以下市售的實(shí)驗(yàn)書(shū)記載的方法進(jìn)行。例如，《基因手冊(cè)》(講談社、高木康敬編)、“基因操作實(shí)驗(yàn)方法”(講談社)、MolecularCloning(ColdspringHarborLaboratory(1982))、MolecularCloning，第二版(ColdspringHarborLaboratory，1989)、MethodsinEnzymology，(194(1991))、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊(cè).酵母的基因?qū)嶒?yàn)方法(羊土社(1994))等記載的方法。本發(fā)明的對(duì)發(fā)酵的能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的基因(以下稱(chēng)為低溫敏感性互補(bǔ)基因)例如可以作為特開(kāi)平5-336872號(hào)公報(bào)記載的啤酒酵母RZT-3(FERMBP-3871)株(以下稱(chēng)RZT-3株)具有的發(fā)酵能力顯示低溫敏感性的基因分離出來(lái)。即，用帶有低溫敏感性互補(bǔ)基因的酵母DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化RZT-3株，通過(guò)從對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性變異的互補(bǔ)的菌株中獲得DNA，可以分離出低溫敏感性互補(bǔ)基因。帶有低溫敏感性互補(bǔ)基因的酵母DNA文庫(kù)可以通過(guò)用限制酶切帶有野生型基因的酵母、例如啤酒酵母X2180-1B株(以下稱(chēng)X2180-1B株)的染色體DNA，將得到的DNA片段與酵母中能夠容納的載體連接后制得。用作切染色體DNA的限制酶只要是能切染色體DNA的無(wú)論哪種都可以用，但理想的是使用使20Kbp以下DNA片段生成的限制酶。而染色體DNA無(wú)論是被限制酶完全切斷，還是部分切斷都沒(méi)關(guān)系。作為酵母中能夠容納的載體，可使用YCp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YIp型載體和YAC(酵母人工染色體)載體等。DNA文庫(kù)向RZT-3株的轉(zhuǎn)化按照基因工程乃至生物工程領(lǐng)域內(nèi)慣用的方法進(jìn)行，如原生質(zhì)體法〔如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929-1933(1978)〕、乙酸鋰法〔如J.Bacteriol，153，163-168(1983)〕、電穿孔法〔例如MethodsinEnzymology，194，182-187(1991)〕等方法。對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性變異已經(jīng)互補(bǔ)可以通過(guò)調(diào)查使轉(zhuǎn)化的酵母于低溫下增殖或低溫下的發(fā)酵整能力來(lái)確認(rèn)〔Appl.Euviron.Microbiol.，61，639-642(1995)〕。為了調(diào)查低溫下的發(fā)酵能力，可以使用如下所示的色素瓊脂疊層法。將想要評(píng)價(jià)的菌株于YPG瓊脂培養(yǎng)基(1％酵母提取液、2％蛋白胨、3％甘油、2％瓊脂)于30℃下培養(yǎng)后使其形成菌落；然后再于培養(yǎng)基上鋪上色素瓊脂(0.5％酵母提取液、1％量的胨、10％蔗糖、0.02％溴用酚紫、1％瓊脂、PH7.5)，保持在低溫下如5℃。溴甲酚紫是PH指示劑，剛鋪上時(shí)顯示紫色，但若一發(fā)酵，菌落周?chē)呐囵B(yǎng)基的PH降低，菌落周?chē)念伾凕S。因此疊層瓊脂的板保持在低溫期間，可以選擇在這期間菌落周?chē)伾兂牲S色菌株作為低溫下表現(xiàn)出發(fā)酵性的菌株。從酵母中回收質(zhì)粒以及用回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法可以使用基因工程領(lǐng)域內(nèi)慣用的方法。從酵母中回收質(zhì)粒的方法有例如“實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)例冊(cè)·來(lái)自酵母的基因的實(shí)驗(yàn)方法”(羊土社(1994))中記載的方法，而用回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法例如有MolecularCloning第二版(ColdSpringHarborlaboratory(1989))中記載的方法。低溫敏感性互補(bǔ)基因的堿基序列可以通過(guò)Maxam-Gilbert法、雙脫氧法等基因工程領(lǐng)域內(nèi)慣用的方法來(lái)確定。低溫敏感性互補(bǔ)基因編碼的多肽若利用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)知識(shí)可以很容易地找出。如有必要，使用各種計(jì)算機(jī)的解析也是可能的〔如細(xì)胞工學(xué)，14，577-588(1995)〕。低溫敏感性互補(bǔ)基因所編碼的多肽作為在發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的酵母中抑制發(fā)酵能力的低溫敏感性的物質(zhì)來(lái)利用是有可能的。本發(fā)明中通過(guò)弄清低溫敏感性互補(bǔ)堿基序列和該基因編碼的多肽的氨基酸序列，可以利用MethodsinEnzymology，194，594-597(1991)記載的方法進(jìn)行低溫敏感性互補(bǔ)基因的破壞，由于啟動(dòng)子改變而引起的低溫敏感性互補(bǔ)表達(dá)調(diào)控或表達(dá)量的改變，以及利用低溫敏感性互補(bǔ)基因的啟動(dòng)子的各種基因的表達(dá)，和低溫敏感性互補(bǔ)基因與各種基因融合后的基因以及融合多肽的制作等工作。有關(guān)在酵母內(nèi)使低溫敏感性互補(bǔ)基因失活的方法以下予以說(shuō)明。本發(fā)明中所謂基因的失活是指基因的破壞〔例如MethodsinEnzymology，194，28l-301(1991))，向基因中導(dǎo)入轉(zhuǎn)移因子〔例如，MethodsinEnzymology，194，342-361(1991)〕、基因的反意義基因的導(dǎo)入和表達(dá)〔如特公平7-40943、23rdEuropeanBreweryConv.Proc.，297-304(1991)〕，向基因附近導(dǎo)入與沉默有關(guān)的DNA〔如Cell，75，531-541(1993)〕，對(duì)基因編碼的多肽的抗體的處理〔如EuropeanJ.Biochem.，231，329-336(1995)〕等，使用基因工程的手法或生物工程的手法使基因或基因編碼的多肽本來(lái)具有的功能降低或使其失活。在低溫敏感性互補(bǔ)基因的失活中使用的酵母只要是屬于酵母屬的酵母即可，理想的是屬于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母，無(wú)論用面包酵母、清酒酵母、葡萄酒酵母、啤酒酵母、豆醬.醬油酵母、乙醇生產(chǎn)酵母等哪種都可以。所謂的低溫敏感性互補(bǔ)基因的破壞是指雖然具有與低溫敏感性互補(bǔ)基因相同的堿基序列，但在發(fā)生添加、缺失、替換等變異之后將作為低溫敏感性互補(bǔ)基因不起作用的DNA導(dǎo)入到酵母細(xì)胞中使其發(fā)生同樣的重組，使這一變異引入到基因組上的基因中?；蚱茐闹胁捎玫腄NA制作方法可以使用例如利用限制酶將低溫敏感性互補(bǔ)基因切割后，再進(jìn)行DNA的添加、缺失、替換等方法或者是使用使低溫敏感性互補(bǔ)基因在細(xì)胞外變異(體外變異)等方法。作為添加、替換DNA的方法使用插入標(biāo)記基因等方法也可以。要破壞低溫敏感性互補(bǔ)基因，可以破壞它的啟動(dòng)子部分、操縱子的前導(dǎo)框架部分、終端部分等任一部位，也可以將各部位一塊破壞掉。還可通過(guò)使基因的整體缺失來(lái)破壞該基因。要破壞低溫敏感性互補(bǔ)基因，例如可以將能使該基因破壞的質(zhì)?；蛸|(zhì)粒片段轉(zhuǎn)化入酵母中，含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或質(zhì)粒片段的DNA與酵母的基因組上的基因發(fā)生同源重組來(lái)進(jìn)行。作為引起同源重組的DNA片段只要是該質(zhì)?；蛟撡|(zhì)粒片段與酵母基因組上的低溫敏感性互補(bǔ)基因在引起同源重組的程度上具有相同性就可以。是否是引起同源重組的DNA片段可以通過(guò)將該DNA片段導(dǎo)入酵母里，看看能否分離出引起同源重組的菌株，即能否分離出發(fā)酵能力表現(xiàn)出低溫敏感性的菌株來(lái)檢查。制作破壞低溫敏感性互補(bǔ)基因的質(zhì)粒所用的載體除了可以使用在酵母中能容納的載體外，也可以使用能容納在大腸桿菌的載體，如pUC19、pBR322、BluscriptIISK+等任一種。作為標(biāo)記基因，只要在酵母中可以使用的標(biāo)記基因，例如URA3、TRP1、LEU2、HIS3等帶有營(yíng)養(yǎng)缺陷性變異互補(bǔ)的基因。對(duì)G418、勻霉素B、媒染培酸綠、仲氯苯丙氨酸等化學(xué)物質(zhì)有抗性的基因〔例如，J.Ferment.Bioeng.，76，60-63(1993)、EnzymeandMicrob.Technol.，15，874-876(1993)〕等中的任一種。酵母基因組上的低溫敏感性互補(bǔ)基因的破壞可以通過(guò)用破壞該基因用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母來(lái)進(jìn)行。酵母的轉(zhuǎn)化可以通過(guò)基因工程乃至生物工程領(lǐng)域內(nèi)慣用的方法，例如原生質(zhì)體法、乙酸鋰法、電穿孔法進(jìn)行。通過(guò)予先向破壞低溫敏感性互補(bǔ)基因用的質(zhì)粒中導(dǎo)入標(biāo)記基因，以該標(biāo)記作為指標(biāo)，可以很容易分離轉(zhuǎn)化體。低溫敏感性互補(bǔ)基因被破壞的菌株的低溫敏感性的確認(rèn)可以通過(guò)研究該酵母在低溫下的增殖或發(fā)酵能力來(lái)進(jìn)行。利用上述方法制備的低溫敏感性互補(bǔ)基因被失活的、發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的酵母，例如有啤酒酵母YHK1243株(以下稱(chēng)YHK1243株)。該菌株根據(jù)布達(dá)佩斯條約于平成7年12月7日以FERMBP-5327保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)技術(shù)研究所(茨城縣筑波市1丁目1番3號(hào))。以下給出了YHK1243株表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性降低的試驗(yàn)例。試驗(yàn)例1發(fā)酵能力的低溫敏感性試驗(yàn)向裝有5mlYPD培養(yǎng)基(1％酵母提取液、2％蛋白胨、2％葡萄糖)的試管中接種1鉑制小勺的YHK1243菌株，于30℃下培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)后，再將1ml該培養(yǎng)液接種于裝有50ml的YPD的300ml三角燒瓶中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離收集菌體，用去離子水洗2次后，將得到的濕菌體0.61g懸浮于裝有50ml發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基〔YeastnitrogenbaseW/O氨基酸(Difco社制)0.67％、蔗糖2％、琥珀酸鈉1％(用濃鹽酸調(diào)PH為4.5)〕的內(nèi)徑為22mm、高為200mm的試管內(nèi)，然后用帶有硅膠管的栓封住試管口，于5℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)中產(chǎn)生的氣體通過(guò)硅膠管收集在飽和食鹽水中，測(cè)定氣體的體積，算出每1g菌體的二氧化碳的生成量。對(duì)于YOY655株也用與YHK1243株同樣的方法算出每1g菌體的二氧化碳的生成量。結(jié)果如表1所示。表1</tables>*以含27％干重的菌體換算得到?？梢钥闯鯵HK1243株在5℃下的CO2生成量約為YOY655株的CO2生成量的1/9。試驗(yàn)例2發(fā)酵能力的低溫敏感性試驗(yàn)(2)將1鉑制小勺YHK1243菌株接種于裝有30ml的YPD培養(yǎng)基的300ml的三角燒瓶中，于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，將該培養(yǎng)液全部加入到裝了270ml的糖蜜培養(yǎng)基(糖蜜3％、尿素0.193％、磷酸二氫鉀0.046％、消泡劑2滴)的2升的帶有折流板的三角燒瓶里，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心收集菌體，用去離子水洗2次后，除去吸收板上的水分，獲得菌體。對(duì)于YOY655菌株也使用與YHK1243株同樣的方法獲得菌體。使用這些菌體，按著以下給出的原料組成和過(guò)程制備分別含有YOY655株和YHK1243株的面團(tuán)。面團(tuán)組成(重量g)強(qiáng)力粉100砂糖5食鹽2酵母菌體(YHK1243株或YOY655株)3水62過(guò)程攪拌(使用松下完全攪拌器(NationalCompleteMixer)100rpm攪拌2分鐘)↓分割(每塊為總生面團(tuán)重量的1/5；34.4g)↓冷藏保存(5℃的冷藏庫(kù)中7天)↓解冷(30℃相對(duì)濕度85％下進(jìn)行30分鐘)↓使用Pharmograph(Atto社制)測(cè)定30℃下2小時(shí)內(nèi)CO2的生成量得到的生面團(tuán)冷藏保存后，測(cè)定于30℃下的CO2生成量，進(jìn)行耐冷藏特性的評(píng)價(jià)。結(jié)果表示在表2內(nèi)。表2</tables>含有YHK1243株的面團(tuán)與含有YOY655株的相比，冷藏后，30℃下的CO2生成量變高了。同時(shí)在冷藏保存期間，雖然能觀察到含有YOY655株的面團(tuán)的膨脹，但在含有YHK1243株的生面團(tuán)中卻沒(méi)有實(shí)質(zhì)性地觀察到膨脹現(xiàn)象。以下就含有屬于酵母屬以低溫敏感性互補(bǔ)基因被失活為特征的表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性的酵母(以下稱(chēng)為本發(fā)明酵母)的生面團(tuán)進(jìn)行說(shuō)明。所謂含有本發(fā)明的酵母的生面團(tuán)是指在小麥粉、黑麥粉中加入本發(fā)明酵母、食鹽、水、根據(jù)需要再加上油脂、砂糖、油酥、黃油、脫脂乳粉、酵母菌營(yíng)養(yǎng)源、雞蛋等副原料后揉好的生面團(tuán)。作為冷藏含有本發(fā)明酵母的生面團(tuán)的條件，為-5～10℃、理想的是0-5℃，保存1-10天，理想的是1～7天。以下就含有本發(fā)明酵母的生面團(tuán)的制作方法以及面包的制作方法進(jìn)行說(shuō)明，其特征是將本發(fā)明酵母添加到生面團(tuán)中。通過(guò)將本發(fā)明酵母于含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)物、氨基酸、維生素等通常的培養(yǎng)基中，好氧條件下，溫度調(diào)節(jié)在27～32℃進(jìn)行培養(yǎng)，回收菌體，洗凈后可以獲得適于面包制作的酵母菌體。作為培養(yǎng)基中的碳源可以使用葡萄糖、蔗糖、淀粉水解產(chǎn)物、糖蜜等，但廢糖蜜最適合。作為氮源使用氨、氯化銨、硫酸銨、碳酸銨、醋酸銨、尿素、酵母提取物、玉米漿等。作為無(wú)機(jī)物可以使用磷酸鎂、磷酸鉀等，而作為氨基酸可以使用谷氨酸等，作為維生素可以使用硫酸、硫胺素等。培養(yǎng)方式以流加培養(yǎng)為好。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離回收本發(fā)明酵母菌體，將它與食鹽、水，根據(jù)需要，還有油脂、砂糖、起酥油、黃油、脫脂乳粉、乳酵母培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)源、雞蛋一起加到小麥粉、黑麥粉里，再通過(guò)混合得到含有本發(fā)明酵母的面團(tuán)。使用得到的生面團(tuán)，按照通常的制作面包的方法，就可以制作面包。代表性的不加甜味的面包和點(diǎn)心面包等面包制作方法中有直揉法和中種法，前者是從一開(kāi)始就將所有原料混在一塊的方法，后者是首先將一部分小麥粉中加上酵母和水制造中種，發(fā)酵后再將剩下的原料加入的方法。直揉法中，在將所有原料混揉后，于25～30℃發(fā)酵，然后進(jìn)行分塊、揉面、成型。經(jīng)過(guò)烘制(35-42℃)后、再烤制(200-240℃)。而中種法中，向整個(gè)小麥粉的大約70％、酵母、酵母培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)液等加入水混揉，于25～35℃使其發(fā)酵3-5小時(shí)后，再加入其余的原料(小麥粉、食鹽、水等)，混揉(本揉)、分塊、揉面、進(jìn)行成型、造型。經(jīng)烘制(35～42℃)后，再進(jìn)行烤制(200-240℃)。在制作丹麥面制膏餅、羊角面包等面包時(shí)，例如可如下制作。將小麥粉、食鹽、本發(fā)明酵母、砂糖、起酥油、雞蛋、脫脂乳粉、和水混勻后制成生面團(tuán)。然后將黃油和人造黃油等油脂混在生面團(tuán)里，重復(fù)搟壓、折疊，制作成多層的生面團(tuán)和油脂。在制備生面團(tuán)時(shí)，將油脂疊入的作業(yè)稱(chēng)之為作層。作層有2種方法，即將原料溫度降到15℃后揉和，直至需要的層數(shù)為止不進(jìn)行冷卻制作的方法以及疊入作業(yè)中在冷藏庫(kù)或冷凍庫(kù)內(nèi)進(jìn)行數(shù)次冷卻的方法，所謂的延緩制作法。將得到的生面團(tuán)搟壓延展、分塊、成型后進(jìn)行造型。經(jīng)烘制(30-39℃)后進(jìn)行烤制(190-210℃)。以下就乙醇的制造方法予以說(shuō)明，其特征是將本發(fā)明酵母于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使乙醇在培養(yǎng)物中蓄積，再?gòu)脑撆囵B(yǎng)物中取得乙醇。通過(guò)本發(fā)明酵母制造乙醇是利用通常酵母培養(yǎng)常用的方法進(jìn)行的?，F(xiàn)在，也可以將本發(fā)明中使用的微生物固定于凝膠狀載體、例如瓊脂、藻酸鈉、聚丙烯酰胺或角叉菜膠上再使用。本發(fā)明中制造乙醇用的培養(yǎng)基只要是含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)物和根據(jù)需要含有其它的營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基，無(wú)論是合成培養(yǎng)基還是天然的，哪種都可以。作為碳源要用至少含有蔗糖的發(fā)酵原料，除此之外也可以用本發(fā)明所用微生物能利用的碳源、例如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖等任一種糖類(lèi)。作為含有蔗糖的發(fā)酵原料，只要是含有蔗糖，無(wú)論是合成的還是天然的都可以，例如可以使用甘蔗的榨汁、甜菜的榨汁，或使用在制糖過(guò)程中用這些榨汗使砂糖析出后得到的廢糖蜜。作為氮源可以使用尿素、氨、硫酸銨、硝酸銨等有機(jī)或天然的氮源，以及玉米漿、蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等天然的氮源。作為無(wú)機(jī)鹽，可以使用磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、氯化鉀、氯化鈉等鹽類(lèi)。作為其它營(yíng)養(yǎng)素，可以使用維生素B1鹽酸鹽、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、肌醇等維生素等。培養(yǎng)是在通常的振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行的。溫度為25-50℃，理想的是30-43℃，培養(yǎng)的PH為3～7，理想的是保持在4～6，通常培養(yǎng)1～10天結(jié)束。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)從培養(yǎng)液中蒸餾等常用方法回收乙醇。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1是含有CSF1基因的DNA片段的限制酶切位點(diǎn)圖，以及表示與為了CSF1基因功能區(qū)限定所進(jìn)行的亞克隆和互補(bǔ)性試驗(yàn)的結(jié)果圖。圖2表示破壞CSF1基因用的質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程。實(shí)施例1低溫敏感性互補(bǔ)基因的克?、儋x予RZT-3株的ura3變異作為向發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的酵母RZT-3株導(dǎo)入質(zhì)粒的標(biāo)記，按照Boeke等人的方法〔Mol，Gen.Genet.，197，345-346(1984)〕，賦予了ura3變異。即，將1鉑制小勺的RZT-3株接種于YPD培養(yǎng)基，于30℃振蕩培養(yǎng)一夜。將得到的培養(yǎng)液100ml涂布于FOA板〔0.67％yeastnitrogenbaseW/O氨基酸〔Difco社制)、0.1％5-氟乳清酸、0.005％尿嘧啶、2％葡萄糖、2％瓊脂〕，30℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，生成菌落中雖然是尿嘧啶缺陷性的，但用URA3作為標(biāo)記的質(zhì)粒YCp50轉(zhuǎn)化時(shí)，尿嘧啶缺陷性被互補(bǔ)了，選擇表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性的1個(gè)菌株，作為啤酒酵母RZT3u株(以下稱(chēng)為RZT-3u株)。②克隆將用Sau3AI部分分解的X2180-1B株(從YeastGeneticStockCenter得到)的染色體DNA的DNA片段插入到質(zhì)粒YCp50的BamH1部位，制作基因文庫(kù)。用基因文庫(kù)轉(zhuǎn)化RZT-3u株，根據(jù)尿嘧啶非缺陷性選擇轉(zhuǎn)化體。將得到的轉(zhuǎn)化體于YPG瓊脂培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)，形成菌落后，鋪上色素瓊脂，5℃培養(yǎng)1-3天。5℃培養(yǎng)期間，將菌落周?chē)念伾兂牲S色的菌株，即在5℃時(shí)能觀察到發(fā)酵的菌株作為表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性的變異被互補(bǔ)了的菌株分離，從該菌株提取重組的質(zhì)粒pHK162。另外，將質(zhì)粒pHK162導(dǎo)入E.ColiJM109株，制備E.ColiEHK162株。本菌株按照布達(dá)佩斯條約于平成7年12月7日以FERMBP-5328保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所。③互補(bǔ)性實(shí)驗(yàn)向質(zhì)粒pHK162插入Sau3AI/BamHI～BamHI的大約12Kbp的DNA片段。用各種限制酶切質(zhì)粒pHK162，通過(guò)電泳分離得到的DNA片段，測(cè)定其分子量，象圖1給出的那樣，制作限制酶酶切圖。按著這個(gè)圖，用sphI、BamHI、MluI和ClaI切Sau3AI/BamHI～BamHI的大約12Kbp，將得到的DNA片段插入質(zhì)粒YCp50制備重組質(zhì)粒。用各種各樣的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化RZT-3u株。研究得到的轉(zhuǎn)化體是否表現(xiàn)出發(fā)酵能力的低溫敏感性的變異已互補(bǔ)。其結(jié)果如圖1所示那樣，用質(zhì)粒pHK162轉(zhuǎn)化RZT-3u株時(shí)，顯示發(fā)酵能力的低溫敏感性的變異被互補(bǔ)了。但用其它的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化RZT-3u株時(shí)，這種變異卻沒(méi)有被互補(bǔ)。從以上事實(shí)表明，為了互補(bǔ)使RZT-3u株顯示出發(fā)酵能力的低溫敏感性的變異需要在圖1的BamHI(A)(序列號(hào)1的堿基序列的第1291～1296)～SphI(B)(序列號(hào)1的堿基序列的第7675～7680)的大約6.5Kbp的DNA片段的5′末端的上游區(qū)和3′末端的下游區(qū)帶上更長(zhǎng)的序列的DNA片段。④堿基序列的確定利用雙脫氧法和DNA序列儀(PharmaciaLKB社制，ALFDNA序列儀II)確定插入質(zhì)粒pHK162的12Kbp的DNA片段的堿基序列。其結(jié)果可以看到如圖1所示的包含在操縱子前導(dǎo)框架內(nèi)的BamHI(A)和SphI(B)切后的大約6.5Kbp的基因。該基因被命名為CSF1基因。就象序列號(hào)1給出的氨基酸序列那樣，從已確定的堿基序列推測(cè)出的CSF1基因編碼的多肽有2958個(gè)氨基的堿基，分子量為338kDa。與其它基因的DNA同源性調(diào)查結(jié)果表明，含有CSF1基因的操縱子前導(dǎo)框架的N末端的大約140氨基酸的CSF1基因的上游一側(cè)與以啤酒酵母的GAA1基因〔Hamburger，etal.，J.Cell.Biol.，129，629-639(1995)〕的堿基序列報(bào)道的序列的上游一側(cè)(GAA1基因編碼的區(qū)域的外側(cè))一致。然而Hamburger等人的報(bào)道是有關(guān)GAA1基因的內(nèi)容，有關(guān)在GAA1基因的上游一側(cè)存在其它基因(CSF1基因)的描述還未看到。另外，他們報(bào)道的堿基序列是在序列號(hào)1的堿基序列的第198號(hào)T和199號(hào)的G之間插入了一個(gè)堿基，CSF1基因編碼的多肽不能從他們報(bào)道的序列推斷出。實(shí)施例2顯示發(fā)酵能力的低溫敏感性的酵母的制備①破壞基因用的質(zhì)粒的制備將大約5μg質(zhì)粒pHK162溶解于20μlH編沖液〔50mMTris鹽酸緩沖液(PH7.5)，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇、100mMNaCl2〕，加入10單位的限制內(nèi)切酶BamHI，于30℃反應(yīng)3小時(shí)。通過(guò)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)生成物，切出圖1中的BamHI(A)～BamHI(C)的大約8kb的DNA片段，用GENCLEANII試劑盒(Bio101社制)提取取化。另外除了將大約5μg的pHK162換成大約5μg的質(zhì)粒pUC19以外，使用同樣的方法提取純化大約2.8Kb的DNA片段。將來(lái)自質(zhì)粒pHK162的大約8kb的DNA片段1μg與取自質(zhì)粒pUC的大約2.8kb的DNA片段0.1μg用LigationKit(日本基因社制)于16℃下連接一夜。反應(yīng)結(jié)束后，用2μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E·ColiJM109株(東洋紡社制)。將得到的轉(zhuǎn)化體涂布于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(以下稱(chēng)X-gal)氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)基，于37℃下進(jìn)行20小時(shí)的培養(yǎng)。而X-gal氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)基是向含有50μg/ml的氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)基〔1％Bactotripton(Difco社制)、0.5％酵母提取液、1％NaCl2、1.5％瓊脂〕上滴入50μl的4％X-gal和25μl的異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷，用涂膠器鋪開(kāi)，使其稍干燥后制備的。培養(yǎng)結(jié)束后，分離生成的白色菌落，培養(yǎng)，提取純化得到的質(zhì)粒DNA，制備出質(zhì)粒pHK179。將大約5μg的質(zhì)粒pHK179溶解于20μl的H緩沖液里，加入10單位的限制內(nèi)切酶MluI和10單位的SpeI，于37℃反應(yīng)3小時(shí)。使用DNA平端化試劑盒(寶酒造社制)對(duì)反應(yīng)生成物進(jìn)行平滑末端處理。利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離處理物后，切出除去圖1中MluI(序列號(hào)1的堿基序列的第4388～4393)～SpeI(序列號(hào)1的堿基序列的第5029～5032)的大約0.6kb的DNA片段后的大約10Kbp片段，使用GENCLEANII試劑盒提取純化。另外將在HindIII-HindIII內(nèi)含有的尿嘧啶需求變異的標(biāo)記基因URA3的載體-質(zhì)粒YEp24大約5μg溶解于20μl的M緩沖液〔10mMTris鹽酸緩沖液(PH7.5)、10mMMgCl2、1mM二硫蘇糖醇、50mMNaCl〕，加入10單位的限制內(nèi)切酶HindIII，于37℃反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)生成物用DNA平端化試劑盒(寶灑造社制)進(jìn)行平滑末端處理。利用瓊脂糖凝膠電解分離處理物，切出含有URA3的大約1.1kb的片段，用GENCLEANII試劑盒提取純化。將取自質(zhì)粒pHK179的大約10kb的DNA片段0.5μg和來(lái)自YEp24的大約1.1kb的DNA片段0.5μg用LigationPack于16℃連接一夜。反應(yīng)結(jié)束后，用2μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.ColiJM109株。將得到的轉(zhuǎn)化體涂布于含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，分離出生成的白色菌落，進(jìn)行培養(yǎng)，提取純化出質(zhì)粒DNA，制備破壞CSF1基因用的質(zhì)粒pHK188。質(zhì)粒pHK188是目的質(zhì)粒的確認(rèn)是通過(guò)將用限制酶切的或未切的質(zhì)粒通過(guò)0.8％瓊脂糖電泳分離，測(cè)定其分子量來(lái)進(jìn)行的。破壞CSF1基因用的質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程的梗概如圖2所示。②CSF1基因的破壞使用質(zhì)粒pHK188進(jìn)行作為啤酒酵母單倍體株YOY655u株帶有的CSF基因的破壞。YOY655u株是在啤酒酵母單倍體株YOY655株導(dǎo)入了尿嘧啶(ura3)需求性變異的菌株，其發(fā)酵能力等性質(zhì)與YOY655株相同。將YOY655u接種于裝了100mlYPD培養(yǎng)基的三角燒瓶中，于30℃振蕩培養(yǎng)至2～4×107。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離(2500rpm，5分鐘)收集菌體，使得到的菌體通過(guò)醋酸鋰法接觸pHK188。為了促進(jìn)CSF1基因與質(zhì)粒pHK188的同源重組，在轉(zhuǎn)化前就用BamHI將質(zhì)粒pHK188完全切開(kāi)使其呈線(xiàn)性化后再用。將接觸于質(zhì)粒pHK188的YOY655u株接種于SG1u瓊脂培養(yǎng)基上(0.67％yeastnitrogenbaseW/O氨基酸、2％葡萄糖、2％瓊脂)，30℃培養(yǎng)2-5天。培養(yǎng)結(jié)束后，從生成的菌落中選一個(gè)作為YOY655u株的尿嘧啶缺陷性被互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化株，就得到了YHK1243株。將YHK1243株、YOY655u株和RZT-3株接種于YPG瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)1-2天，形成菌落后，再在培養(yǎng)基上鋪上色素瓊脂，于5℃下培養(yǎng)3天。YHK1243株和RZT-3株的菌落的周?chē)念伾谂囵B(yǎng)期間，沒(méi)有看到變化，但YOY655u株其菌落周?chē)念伾谂囵B(yǎng)的第一天就變成了黃色。實(shí)施例3用冷藏生面團(tuán)制作面包的方法①面包酵母的培養(yǎng)將YOY655株和YHK1243株各一鉑制小勺分別接種于裝有30mlYPD培養(yǎng)基的300ml的三角燒瓶里，于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，將所有的培養(yǎng)液移入裝了270ml糖蜜的培養(yǎng)基(糖蜜3％、尿素0.193％、磷酸二氫鉀0.046％、消泡劑2滴)的2升的帶有栓的三角燒瓶里，于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)離心分離，收集菌體，用去離子水洗2次后在素?zé)砂迳铣ニ值玫骄w。該菌體用于制作面包。②制作面包利用以下給出的原料和制作過(guò)程可作成面包。原料組成(重量g)強(qiáng)力粉100砂糖5食鹽2酵母菌體2水62過(guò)程混合(100rpm、2分鐘)分塊(34.4g)貯藏(5℃、7天)烘制(40℃、90％RH、75分鐘)烤制(220℃、25分鐘)結(jié)果，使用YHK1243株作為酵母菌體制得的面包與用YOY655株制得的面包相比，其體積更大。實(shí)施例4乙醇發(fā)酵酵母的培養(yǎng)和乙醇發(fā)酵將1鉑制小勺的YOY655株和YHK1243株分別接種于裝了5mlYPD培養(yǎng)基的試管內(nèi)。于30℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液2ml移入加有20ml糖蜜培養(yǎng)基(糖蜜25％、硫酸銨0.28％)的粗試管里，于37℃下培養(yǎng)。在培養(yǎng)16小時(shí)和40小時(shí)后各取0.5ml培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液中的乙醇濃度。結(jié)果如表3所示。表3*可能有5％的人為誤差就象表3給出的那樣，用YHK1243時(shí)比用YOY655株時(shí)在37℃下乙醇產(chǎn)量高。本發(fā)明可以提供對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的蛋白質(zhì)或基因，使該基因失活后得到的耐冷藏酵母，并可提供使用該酵母制造面包和乙醇的方法。序列表序列號(hào)1序列長(zhǎng)度8874序列類(lèi)型核酸鏈數(shù)二條鏈拓?fù)湫椭辨溞蛄蟹N類(lèi)GenomicDNA起源生物名啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)株名X2180-1B序列特征表示特征的記號(hào)CDS存在位置1..8874確定特征的方法E序列特征表示特征的記號(hào)cleavage-site存在位置1291..1296確定特征的方法S序列特征表示特征的記號(hào)cleavage-site存在位置4388..4393確定特征的方法S序列特征表示特征的記號(hào)cleavage-site存在位置5027..5032確定特征的方法S序列特征表示特征的記號(hào)cleavage-site存在位置7675..7680確定特征的方法S序列ATGGAAGCTATTTCACAATTACGTGGTGTTCCATTGACACACCAAAAG48MetGluAlaIleSerGlnLeuArgGlyValProLeuThrHisGlnLys151015GACTTTAGCTGGGTCTTTTTAGTAGATTGGATTCTCACGGTAGTAGTA96AspPheSerTrpValPheLeuValAspTrpIleLeuThrValValVal202530TGTTTGACAATGATATTCTACATGGGAAGAATCTATGCATACCTTGTA144CysLeuThrMetIlePheTyrMetGlyArgIleTyrAlaTyrLeuVal354045AGTTTTATATTAGAATGGCTACTATGGAAACGAGCGAAAATCAAGATA192SerPheIleLeuGluTrpLeuLeuTrpLysArgAlaLysIleLysIle505560AATGTTGAGACACTTCGTGTCTCCTTACTAGGTGGTCGAATACATTTT240AsnValGluThrLeuArgValSerLeuLeuGlyGlyArgIleHisPhe65707580AAAAACCTTTCCGTAATACACAAAGATTATACAATTTCGGTATTAGAG288LysAsnLeuSerValIleHisLysAspTyrThrIleSerValLeuGlu859095GGTAGTTTAACATGGAAATACTGGCTTTTAAATTGCAGAAAAGCAGAA336GlySerLeuThrTrpLysTyrTrpLeuLeuAsnCysArgLysAlaGlu100105110TTGATAGAGAATAACAAGTCTTCTTCTGGCAAAAAAGCAAAGCTTCCC384LeuIleGluAsnAsnLysSerSerSerGlyLysLysAlaLysLeuPro115120125TGTAAAATTTCCGTAGAATGTGAAGGTCTAGAAATTTTTATTTACAAC432CysLysIleSerValGluCysGluGlyLeuGluIlePheIleTyrAsn130135140AGAACAGTGGCGTACGATAATGTTATAAACTTACTATCAAAAGATGAA480ArgThrValAlaTyrAspAsnValIleAsnLeuLeuSerLysAspGlu145150155160CGCGATAAATTTGAAAAATACCTTAATGAGCATTCTTTTCCTGAACCT528ArgAspLysPheGluLysTyrLeuAsnGluHisSerPheProGluPro165170175TTTAGCGATGGAAGTAGTGCTGATAAATTAGATGAAGATCTAAGCGAA576PheSerAspGlySerSerAlaAspLysLeuAspGluAspLeuSerGlu180185190TCTGCATACACAACGAACTCTGATGCATCAATTGTTAATGACAGGGAC624SerAlaTyrThrThrAsnSerAspAlaSerIleValAsnAspArgAsp195200205TACCAAGAAACAGATATCGGCAAACATCCAAAGCTACTGATGTTTTTA672TyrGlnGluThrAspIleGlyLysHisProLysLeuLeuMetPheLeu210215220CCAATTGAGCTTAAATTTAGCCGCGGTTCCCTACTGTTAGGAAACAAA720ProIleGluLeuLysPheSerArgGlySerLeuLeuLeuGlyAsnLys225230235240TTCACGCCATCTGTTATGATTCTAAGTTATGAAAGTGGAAAAGGCATA768PheThrProSerValMetIleLeuSerTyrGluSerGlyLysGlyIle245250255ATAGATGTTTTACCTCCAAAAGAGCGATTAGATTTATACAGAAATAAA816IleAspValLeuProProLysGluArgLeuAspLeuTyrArgAsnLys260265270ACACAGATGGAATTCAAAAACTTCGAAATTTCTATCAAACAAAATATT864ThrGlnMetGluPheLysAsnPheGluIleSerIleLysGlnAsnIle275280285GGTTACGATGATGCTATTGGATTGAAGTTTAAAATAGATAGAGGGAAA912GlyTyrAspAspAlaIleGlyLeuLysPheLysIleAspArgGlyLys290295300GTGTCAAAGTTATGGAAAACGTTTGTACGAGTCTTTCAGATAGTAACC960ValSerLysLeuTrpLysThrPheValArgValPheGlnIleValThr305310315320AAGCCTGTTGTACCGAAAAAGACTAAAAAAAGCGCAGGCACATCAGAT1008LysProValValProLysLysThrLysLysSerAlaGlyThrSerAsp325330335GACAATTTCTATCATAAATGGAAAGGTTTATCTCTTTATAAGGCTTCT1056AspAsnPheTyrHisLysTrpLysGlyLeuSerLeuTyrLysAlaSer340345350GCGGGCGACGCTAAAGCAAGTGATTTAGATGATGTTGAGTTCGATTTG1104AlaGlyAspAlaLysAlaSerAspLeuAspAspValGluPheAspLeu355360365ACGAACCATGAATATGCTAAATTTACATCAATTTTAAAATGCCCAAAG1152ThrAsnHisGluTyrAlaLysPheThrSerIleLeuLysCysProLys370375380GTCACAATTGCATATGACGTGGATGTTCCGGGCGTTGTGCCACATGGT1200ValThrIleAlaTyrAspValAspValProGlyValValProHisGly385390395400GCACATCCGACAATACCTGATATTGATGGACCAGATGTGGGCAATAAC1248AlaHisProThrIleProAspIleAspGlyProAspValGlyAsnAsn405410415GGAGCACCTCCAGATTTTGCTTTAGATGTTCAAATTCACGGAGGATCC1296GlyAlaProProAspPheAlaLeuAspValGlnIleHisGlyGlySer420425430ATCTGTTACGGACCTTGGGCTCAAAGACAAGTCAGTCATCTACAAAGA1344IleCysTyrGlyProTrpAlaGlnArgGlnValSerHisLeuGlnArg435440445GTTCTATCACCGGTAGTTTCAAGGACAGCCAAACCTATAAAAAAACTC1392ValLeuSerProValValSerArgThrAlaLysProIleLysLysLeu450455460CCGCCAGGTTCTAGAAGAATATATACACTTTTCAGGATGAATATATCA1440ProProGlySerArgArgIleTyrThrLeuPheArgMetAsnIleSer465470475480ATAATGGAAGATACTACTTGGCGTATACCGACGAGGGAAAGTAGCAAA1488IleMetGluAspThrThrTrpArgIleProThrArgGluSerSerLys485490495GACCCCGAATTTTTGAAACACTACAAAGAAACTAATGAAGAATATAGG1536AspProGluPheLeuLysHisTyrLysGluThrAsnGluGluTyrArg500505510CCATTTGGATGGATGGATCTCCGATTTTGTAAGGACACCTATGCAAAT1584ProPheGlyTrpMetAspLeuArgPheCysLysAspThrTyrAlaAsn515520525TTCAATATAAGTGTTTGTCCTACAGTGCAAGGTTTTCAGAATAATTTC1632PheAsnIleSerValCysProThrValGlnGlyPheGlnAsnAsnPhe530535540CATGTTCATTTCCTGGAAACCGAAATTAGGTCAAGTGTTAATCACGAT1680HisValHisPheLeuGluThrGluIleArgSerSerValAsnHisAsp545550555560ATTTTGTTAAAAAGCAAGGTATTCGATATTGATGGGGATATTGGATAT1728IleLeuLeuLysSerLysValPheAspIleAspGlyAspIleGlyTyr565570575CCATTGGGTTGGAATAGCAAAGCTATATGGATAATTAACATGAAGTCA1776ProLeuGlyTrpAsnSerLysAlaIleTrpIleIleAsnMetLysSer580585590GAACAATTAGAGGCGTTTCTGCTACGTGAGCATATAACTTTAGTTGCA1824GluGlnLeuGluAlaPheLeuLeuArgGluHisIleThrLeuValAla595600605GATACGCTTTCAGACTTTTCCGCTGGTGATCCTACGCCTTACGAACTT1872AspThrLeuSerAspPheSerAlaGlyAspProThrProTyrGluLeu610615620TTTAGACCATTCGTATACAAAGTCAATTGGGAAATGGAAGGATATTCC1920PheArgProPheValTyrLysValAsnTrpGluMetGluGlyTyrSer625630635640ATTTACTTAAACGTCAATGATCACAATATTGTTAACAATCCGTTAGAT1968IleTyrLeuAsnValAsnAspHisAsnIleValAsnAsnProLeuAsp645650655TTTAACGAAAACTGTTATTTATCCCTTCATGGTGATAAGCTTTCAATT2016PheAsnGluAsnCysTyrLeuSerLeuHisGlyAspLysLeuSerIle660665670GATGTCACGGTACCCCGTGAGAGTATTTTGGGGACATACACAGATATG2064AspValThrValProArgGluSerIleLeuGlyThrTyrThrAspMet675680685TCCTACGAGATCTCAACTCCAATGTTCAGAATGATGTTAAATACCCCC2112SerTyrGluIleSerThrProMetPheArgMetMetLeuAsnThrPro690695700CCTTGGAATACATTGAACGAATTCATGAAACATAAAGAAGTGGGGAGA2160ProTrpAsnThrLeuAsnGluPheMetLysHisLysGluValGlyArg705710715720GCATACGACTTTACAATTAAAGGTTCTTACCTTCTCTATTCCGAGTTA2208AlaTyrAspPheThrIleLysGlySerTyrLeuLeuTyrSerGluLeu725730735GATATTGATAATGTCGATACGCTAGTCATAGAGTGTAACAGCAAGAGT2256AspIleAspAsnValAspThrLeuValIleGluCysAsnSerLysSer740745750ACAGTACTTCACTGCTATGGGTTTGTCATGAGGTATTTAACAAACGTA2304ThrValLeuHisCysTyrGlyPheValMetArgTyrLeuThrAsnVal755760765AAGATGAATTACTTCGGTGAATTTTTTAATTTTGTGACGTCAGAAGAG2352LysMetAsnTyrPheGlyGluPhePheAsnPheValThrSerGluGlu770775780TACACAGGTGTCCTTGGCGCTAGGGAAGTCGGAGATGTCACTACGAAA2400TyrThrGlyValLeuGlyAlaArgGluValGlyAspValThrThrLys785790795800AGCTCGGTGGCAGATTTGGCATCTACTGTAGATTCAGGGTACCAAAAT2448SerSerValAlaAspLeuAlaSerThrValAspSerGlyTyrGlnAsn805810815AGCAGTCTAAAGAACGAATCTGAGGATAAAGGTCCTATGAAAAGGTCA2496SerSerLeuLysAsnGluSerGluAspLysGlyProMetLysArgSer820825830GATTTGAAAAGGACTACCAACGAAACTGATATTTGGTTCACATTTTCG2544AspLeuLysArgThrThrAsnGluThrAspIleTrpPheThrPheSer835840845GTTTGGGATGGTGCTCTGATATTACCAGAAACGATTTACAGTTTTGAT2592ValTrpAspGlyAlaLeuIleLeuProGluThrIleTyrSerPheAsp850855860CCATGCATTGCACTACATTTTGCCGAACTTGTAGTGGATTTCAGAAGT2640ProCysIleAlaLeuHisPheAlaGluLeuValValAspPheArgSer865870875880TGTAATTATTATATGGACATAATGGCGGTTCTCAACGGGACTTCAATA2688CysAsnTyrTyrMetAspIleMetAlaValLeuAsnGlyThrSerIle885890895AAGCGGCACGTTTCAAAACAAATAAATGAAGTATTTGATTTTATACGT2736LysArgHisValSerLysGlnIleAsnGluValPheAspPheIleArg900905910CGTAATAACGGAGCTGATGAGCAAGAGCACGGATTGCTTTCGGACCTC2784ArgAsnAsnGlyAlaAspGluGlnGluHisGlyLeuLeuSerAspLeu915920925ACCATTCATGGACATAGAATGTATGGATTACCACCCACAGAACCTACC2832ThrIleHisGlyHisArgMetTyrGlyLeuProProThrGluProThr930935940TACTTTTGTCAATGGGATATCAATCTCGGAGATTTATGCATTGATTCA2880TyrPheCysGlnTrpAspIleAsnLeuGlyAspLeuCysIleAspSer945950955960GATATTGAATTTATAAAGGGATTCTTTAATTCCTTTTATAAGATAGGT2928AspIleGluPheIleLysGlyPhePheAsnSerPheTyrLysIleGly965970975TTTGGCTACAATGACTTGGAAAATATATTATTATATGACACTGAGACC2976PheGlyTyrAsnAspLeuGluAsnIleLeuLeuTyrAspThrGluThr980985990ATTAATGATATGACCTCGCTAACCGTGCACGTTGAAAAAATAAGAATA3024IleAsnAspMetThrSerLeuThrValHisValGluLysIleArgIle99510001005GGCCTTAAAGATCCGGTGATGAAATCTCAATCAGTTATTAGTGCTGAA3072GlyLeuLysAspProValMetLysSerGlnSerValIleSerAlaGlu101010151020TCGATATTGTTTACTTTGATCGACTTTGAAAACGAAAAATATTCACAA3120SerIleLeuPheThrLeuIleAspPheGluAsnGluLysTyrSerGln1025103010351040AGAATAGACGTGAAAATTCCAAAATTGACAATTTCGTTAAATTGCGTG3168ArgIleAspValLysIleProLysLeuThrIleSerLeuAsnCysVal104510501055ATGGGCGATGGCGTAGACACATCATTTCTCAAATTCGAAACAAAATTA3216MetGlyAspGlyValAspThrSerPheLeuLysPheGluThrLysLeu106010651070AGATTTACAAACTTTGAGCAATACAAGGATATCGATAAAAAAAGATCA3264ArgPheThrAsnPheGluGlnTyrLysAspIleAspLysLysArgSer107510801085GAACAACGCAGATATATAACAATACACGATTCACCCTATCATAGGTGT3312GluGlnArgArgTyrIleThrIleHisAspSerProTyrHisArgCys109010951100CCTTTTCTTCTTCCGCTGTTCTATCAGGATTCGGATACATACCAAAAC3360ProPheLeuLeuProLeuPheTyrGlnAspSerAspThrTyrGlnAsn1105111011151120CTGTACGGGGCTATAGCACCATCTTCGTCTATCCCAACTTTACCTCTT3408LeuTyrGlyAlaIleAlaProSerSerSerIleProThrLeuProLeu112511301135CCCACTTTGCCTGATACTATAGATTATATCATTGAAGATATTGTGGGC3456ProThrLeuProAspThrIleAspTyrIleIleGluAspIleValGly114011451150GAGTATGCTACCCTTCTGGAGACCACAAATCCATTCAAGAACATATTC3504GluTyrAlaThrLeuLeuGluThrThrAsnProPheLysAsnIlePhe115511601165GCAGAAACTCCATCAACTATGGAGCCTTCAAGAGCCAGCTTCAGTGAA3552AlaGluThrProSerThrMetGluProSerArgAlaSerPheSerGlu117011751180GATGATAATGACGAAGAAGCGGACCCTTCAAGCTTCAAACCTGTCGCT3600AspAspAsnAspGluGluAlaAspProSerSerPheLysProValAla1185119011951200TTTACAGAAGACAGAAACCACGAAAGGGATAACTATGTTGTTGATGTT3648PheThrGluAspArgAsnHisGluArgAspAsnTyrValValAspVal120512101215TCATATATTCTGTTGGATGTCGACCCGTTGCTTTTTATTTTCGCTAAG3696SerTyrIleLeuLeuAspValAspProLeuLeuPheIlePheAlaLys122012251230AGTTTATTAGAACAGCTTTACTCTGAAAACATGGTACAAGTCTTAGAC3744SerLeuLeuGluGlnLeuTyrSerGluAsnMetValGlnValLeuAsp123512401245GATATTGAAATTGGGATTGTGAAACGATTAAGCAACCTTCAAGAAGGG3792AspIleGluIleGlyIleValLysArgLeuSerAsnLeuGlnGluGly125012551260ATCACTTCTATTTCAAACATTGATATCCATATTGCTTATCTAAATTTA3840IleThrSerIleSerAsnIleAspIleHisIleAlaTyrLeuAsnLeu1265127012751280ATCTGGCAAGAGACAGGTGAGGAAGGTTTTGAGCTCTATTTAGATCGT3888IleTrpGlnGluThrGlyGluGluGlyPheGluLeuTyrLeuAspArg128512901295ATTGATTATCAAATGAGTGAAAAGTCTCTAGAGAAGAACCGAACAAAT3936IleAspTyrGlnMetSerGluLysSerLeuGluLysAsnArgThrAsn130013051310AAATTATTAGAAGTAGCAGCTTTAGCAAAGGTAAAAACTGTCAGAGTG3984LysLeuLeuGluValAlaAlaLeuAlaLysValLysThrValArgVal131513201325ACTGTTAACCAGAAGAAAAATCCAGACTTGTCTGAAGATCGTCCCCCT4032ThrValAsnGlnLysLysAsnProAspLeuSerGluAspArgProPro133013351340GCACTGTCGCTAGGGATTGAGGGTTTCGAAGTATGGTCTTCTACAGAA4080AlaLeuSerLeuGlyIleGluGlyPheGluValTrpSerSerThrGlu1345135013551360GATAGACAAGTTAACTCATTAAACTTAACGTCATCAGATATTACCATA4128AspArgGlnValAsnSerLeuAsnLeuThrSerSerAspIleThrIle136513701375GACGAATCTCAAATGGAATGGCTGTTTGAGTACTGTAGTGACCAGGGA4176AspGluSerGlnMetGluTrpLeuPheGluTyrCysSerAspGlnGly138013851390AATCTTATTCAAGAGGTTTGCACTTCTTTTAATTCTATTCAGAACACC4224AsnLeuIleGlnGluValCysThrSerPheAsnSerIleGlnAsnThr139514001405AGAAGTAATTCAAAGACAGAACTCATTTCAAAGCTCACAGCCGCAAGC4272ArgSerAsnSerLysThrGluLeuIleSerLysLeuThrAlaAlaSer141014151420GAATATTATCAAATTAGTCATGATCCTTACGTCATAACAAAACCTGCT4320GluTyrTyrGlnIleSerHisAspProTyrValIleThrLysProAla1425143014351440TTTATTATGAGACTTTCCAAAGGGCATGTGCGTGAGAATCGTAGTTGG4368PheIleMetArgLeuSerLysGlyHisValArgGluAsnArgSerTrp144514501455AAAATTATTACGCGTCTGAGACACATTTTAACGTACCTTCCTGATGAT4416LysIleIleThrArgLeuArgHisIleLeuThrTyrLeuProAspAsp146014651470TGGCAAAGCAACATCGACGAAGTGCTAAAAGAAAAGAAATATACCTCT4464TrpGlnSerAsnIleAspGluValLeuLysGluLysLysTyrThrSer147514801485GCTAAAGATGCAAAAAATATCTTCATGTCTGTGTTTTCGACTTGGAGA4512AlaLysAspAlaLysAsnIlePheMetSerValPheSerThrTrpArg149014951500AATTGGGAGTTCTCAGATGTTGCAAGGTCGTATATATACGGCAAATTA4560AsnTrpGluPheSerAspValAlaArgSerTyrIleTyrGlyLysLeu1505151015151520TTCACGGCAGAAAATGAGAAACATAAACAAAATTTGATTAAAAAATTG4608PheThrAlaGluAsnGluLysHisLysGlnAsnLeuIleLysLysLeu152515301535TTGAAGTGTACCATGGGATCATTTTACCTTACTGTTTATGGTGAGGGA4656LeuLysCysThrMetGlySerPheTyrLeuThrValTyrGlyGluGly154015451550TATGAGGTTGAGCATAATTTTGTTGTTGCGGATGCCAATCTGGTAGTG4704TyrGluValGluHisAsnPheValValAlaAspAlaAsnLeuValVal155515601565GATTTGACGCCTCCGGTGACAAGCTTACCTTCAAATCGAGAAGAAACT4752AspLeuThrProProValThrSerLeuProSerAsnArgGluGluThr157015751580ATTGAAATTACGGGAAGAGTAGGCTCAGTAAAAGGAAAATTCAGTGAT4800IleGluIleThrGlyArgValGlySerValLysGlyLysPheSerAsp1585159015951600AGGTTACTTAAATTGCAAGATCTTATTCCACTCATTGCAGCAGTGGGC4848ArgLeuLeuLysLeuGlnAspLeuIleProLeuIleAlaAlaValGly160516101615GAAGATGACAAAAGTGATCCAAAAAAGGAGTTATCAAAGCAATTCAAA4896GluAspAspLysSerAspProLysLysGluLeuSerLysGlnPheLys162016251630ATGAACACCGTTTTATTAGTGGATAAAAGTGAACTGCAACTGGTCATG4944MetAsnThrValLeuLeuValAspLysSerGluLeuGlnLeuValMet163516401645GACCAAACGAAGCTGATGAGTAGAACAGTTGGGGGTAGAGTTAGTTTA4992AspGlnThrLysLeuMetSerArgThrValGlyGlyArgValSerLeu165016551660CTATGGGAAAATCTAAAAGATTCAACTAGTCAAGCGGGTTCATTGGTT5040LeuTrpGluAsnLeuLysAspSerThrSerGlnAlaGlySerLeuVal1665167016751680ATATTTTCCCAGAAATCGGAAGTGTGGTTAAAACACACATCTGTCATT5088IlePheSerGlnLysSerGluValTrpLeuLysHisThrSerValIle168516901695TTGGGAGAAGCTCAACTGCGCGACTTTTCAGTTTTAGCGACTACTGAG5136LeuGlyGluAlaGlnLeuArgAspPheSerValLeuAlaThrThrGlu170017051710GCATGGTCACACAAGCCTACGATTCTGATAAACAACCAGTGCGCAGAT5184AlaTrpSerHisLysProThrIleLeuIleAsnAsnGlnCysAlaAsp171517201725CTTCATTTTAGAGCAATGAGTTCAACTGAGCAATTAGTAACCGCTATT5232LeuHisPheArgAlaMetSerSerThrGluGlnLeuValThrAlaIle173017351740ACTGAAATTAGGGAAAGTCTGATGATGATTAAAGAGCGCATAAAGTTT5280ThrGluIleArgGluSerLeuMetMetIleLysGluArgIleLysPhe1745175017551760AAACCTAAATCAAAGAAAAAGTCCCAATTTGTCGACCAGAAAATTAAT5328LysProLysSerLysLysLysSerGlnPheValAspGlnLysIleAsn176517701775ACAGTCTTGTCATGTTATTTTTCAAACGTTAGTTCTGAAGTTATGCCG5376ThrValLeuSerCysTyrPheSerAsnValSerSerGluValMetPro178017851790CTCTCGCCATTTTATATTCGTCACGAAGCCAAGCAGCTTGATATATAT5424LeuSerProPheTyrIleArgHisGluAlaLysGlnLeuAspIleTyr179518001805TTTAACAAATTCGGTTCAAATGAGATTTTGTTAAGCATATGGGATACT5472PheAsnLysPheGlySerAsnGluIleLeuLeuSerIleTrpAspThr181018151820GATTTTTTCATGACATCGCACCAGACAAAGGAGCAATACCTAAGGTTT5520AspPhePheMetThrSerHisGlnThrLysGluGlnTyrLeuArgPhe1825183018351840TCATTTGGCGATATTGAAATTAAAGGAGGAATTTCTAGAGAAGGCTAT5568SerPheGlyAspIleGluIleLysGlyGlyIleSerArgGluGlyTyr184518501855TCGTTGATAAACGTTGACATCTCAATATCTATGATTAAGTTAACCTTT5616SerLeuIleAsnValAspIleSerIleSerMetIleLysLeuThrPhe186018651870TCGGAGCCGCGCCGTATTGTAAACAGTTTTTTACAAGATGAAAAGCTT5664SerGluProArgArgIleValAsnSerPheLeuGlnAspGluLysLeu187518801885GCTTCTCAGGGTATCAATCTGTTATATTCCCTGAAGCCTTTATTCTTT5712AlaSerGlnGlyIleAsnLeuLeuTyrSerLeuLysProLeuPhePhe189018951900AGTTCAAATCTACCAAAAAAAGAGAAGCAGGCACCCTCGATAATGATA5760SerSerAsnLeuProLysLysGluLysGlnAlaProSerIleMetIle1905191019151920AATTGGACATTAGATACTAGCATTACTTATTTTGGTGTTCTTGTGCCA5808AsnTrpThrLeuAspThrSerIleThrTyrPheGlyValLeuValPro192519301935GTGGCTTCCACGTATTTCGTGTTTGAATTACATATGCTGCTACTTTCT5856ValAlaSerThrTyrPheValPheGluLeuHisMetLeuLeuLeuSer194019451950CTGACCAATACGAATAACGGTATGTTACCAGAAGAAACCAAGGTGACG5904LeuThrAsnThrAsnAsnGlyMetLeuProGluGluThrLysValThr195519601965GGACAGTTTTCCATCGAAAACATCCTATTTCTAATAAAGGAGCGGTCA5952GlyGlnPheSerIleGluAsnIleLeuPheLeuIleLysGluArgSer197019751980CTACCCATTGGTCTTTCCAAATTACTCGACTTTTCCATAAAAGTATCA6000LeuProIleGlyLeuSerLysLeuLeuAspPheSerIleLysValSer1985199019952000ACCCTACAAAGAACGGTTGATACGGAGCAGTCATTCCAAGTGGAAAGT6048ThrLeuGlnArgThrValAspThrGluGlnSerPheGlnValGluSer200520102015TCTCATTTCAGGGTCTGCTTATCTCCTGATTCTCTATTAAGATTAATG6096SerHisPheArgValCysLeuSerProAspSerLeuLeuArgLeuMet202020252030TGGGGCGCGCATAAATTGCTAGACTTGAGCCATTACTATTCAAGACGC6144TrpGlyAlaHisLysLeuLeuAspLeuSerHisTyrTyrSerArgArg203520402045CATGCCCCTAATATTTGGAACACTAAGATGTTCACCGGTAAAAGTGAT6192HisAlaProAsnIleTrpAsnThrLysMetPheThrGlyLysSerAsp205020552060AAGTCAAAAGAAATGCCCATAAATTTCCGTTCAATACACATCCTGTCC6240LysSerLysGluMetProIleAsnPheArgSerIleHisIleLeuSer2065207020752080TATAAATTTTGTATTGGGTGGATATTCCAGTATGGAGCAGGCTCCAAT6288TyrLysPheCysIleGlyTrpIlePheGlnTyrGlyAlaGlySerAsn208520902095CCTGGGTTAATGTTAGGTTATAACAGATTGTTTTCAGCATATGAAAAG6336ProGlyLeuMetLeuGlyTyrAsnArgLeuPheSerAlaTyrGluLys210021052110GATTTTGGGAAATTCACAGTTGTGGACGCTTTTTTCTCTGTTGCGAAT6384AspPheGlyLysPheThrValValAspAlaPhePheSerValAlaAsn211521202125GGTAATACCTCAAGCACTTTTTTCTCTGAAGGAAACGAGAAAGACAAA6432GlyAsnThrSerSerThrPhePheSerGluGlyAsnGluLysAspLys213021352140TATAATAGAAGTTTCTTGCCAAACATGCAAATATCCTACTGGTTCAAA6480TyrAsnArgSerPheLeuProAsnMetGlnIleSerTyrTrpPheLys2145215021552160AGATGTGGTGAGTTGAAAGATTGGTTTTTTAGATTTCATGGTGAAGCA6528ArgCysGlyGluLeuLysAspTrpPhePheArgPheHisGlyGluAla216521702175CTGGATGTAAACTTTGTCCCGTCATTCATGGATGTCATTGAGTCTACT6576LeuAspValAsnPheValProSerPheMetAspValIleGluSerThr218021852190TTACAATCCATGCGAGCATTTCAAGAGCTGAAAAAGAACATTCTGGAT6624LeuGlnSerMetArgAlaPheGlnGluLeuLysLysAsnIleLeuAsp219522002205GTGTCCGAGAGTTTGCGTGCGGAAAATGATAATTCTTATGCTAGTACC6672ValSerGluSerLeuArgAlaGluAsnAspAsnSerTyrAlaSerThr221022152220AGTGTCGAAAGTGCTTCGAGTAGTTTGGCTCCCTTTCTCGATAACATT6720SerValGluSerAlaSerSerSerLeuAlaProPheLeuAspAsnIle2225223022352240AGATCTGTTAACTCAAATTTCAAGTATGACGGTGGTGTATTTAGGGTT6768ArgSerValAsnSerAsnPheLysTyrAspGlyGlyValPheArgVal224522502255TACACGTACGAAGATATTGAAACCAAGAGTGAGCCATCTTTTGAAATA6816TyrThrTyrGluAspIleGluThrLysSerGluProSerPheGluIle226022652270AAAAGTCCAGTAGTCACTATAAACTGTACATATAAACATGATGAAGAT6864LysSerProValValThrIleAsnCysThrTyrLysHisAspGluAsp227522802285AAAGTTAAGCCACATAAATTCAGAACATTAATCACTGTCGACCCAACG6912LysValLysProHisLysPheArgThrLeuIleThrValAspProThr229022952300CATAATACTTTGTATGCGGGATGTGCTCCTTTATTAATGGAATTTTCT6960HisAsnThrLeuTyrAlaGlyCysAlaProLeuLeuMetGluPheSer2305231023152320GAAAGTCTGCAAAAGATGATAAAGAAACATAGCACCGACGAAAAACCA7008GluSerLeuGlnLysMetIleLysLysHisSerThrAspGluLysPro232523302335AACTTTACAAAACCTTCTTCACAGAATGTTGATTATAAGCGACTTTTG7056AsnPheThrLysProSerSerGlnAsnValAspTyrLysArgLeuLeu234023452350GATCAATTTGATGTGGCTGTAAAACTAACATCAGCCAAGCAACAGCTA7104AspGlnPheAspValAlaValLysLeuThrSerAlaLysGlnGlnLeu235523602365AGTTTGAGCTGTGAACCAAAAGCTAAGGTTCAGGCAGATGTTGGATTT7152SerLeuSerCysGluProLysAlaLysValGlnAlaAspValGlyPhe237023752380GAATCGTTTTTGTTCAGTATGGCTACCAATGAGTTCGACTCTGAACAG7200GluSerPheLeuPheSerMetAlaThrAsnGluPheAspSerGluGln2385239023952400CCTTTGGAGTTTTCTTTAACTCTAGAACACACAAAAGCGTCCATTAAG7248ProLeuGluPheSerLeuThrLeuGluHisThrLysAlaSerIleLys240524102415CACATATTTTCAAGAGAAGTAAGTACGTCCTTTGAAGTTGGTTTCATG7296HisIlePheSerArgGluValSerThrSerPheGluValGlyPheMet242024252430GACTTGACGCTTTTATTTACACATCCTGATGTAATCAGTATGTATGGA7344AspLeuThrLeuLeuPheThrHisProAspValIleSerMetTyrGly243524402445ACGGGGTTGGTTTCTGATCTAAGCGTCTTCTTCAATGTAAAGCAGCTC7392ThrGlyLeuValSerAspLeuSerValPhePheAsnValLysGlnLeu245024552460CAGAACCTGTATTTATTCTTGGACATATGGAGGTTCAGTAGCATTTTA7440GlnAsnLeuTyrLeuPheLeuAspIleTrpArgPheSerSerIleLeu2465247024752480CACACACGGCCAGTGCAAAGAACTGTTAATAAGGAAATTGAAATGAGT7488HisThrArgProValGlnArgThrValAsnLysGluIleGluMetSer248524902495TCATTAACATCAACCAACTATGCCGATGCAGGTACGGAAATACCCTGG7536SerLeuThrSerThrAsnTyrAlaAspAlaGlyThrGluIleProTrp250025052510TGCTTTACATTAATTTTTACAAATGTTAGCGGAGACGTTGATTTGGGT7584CysPheThrLeuIlePheThrAsnValSerGlyAspValAspLeuGly251525202525CCTTCTCTCGGTATGATTTCATTAAGGACACAAAGAACATGGCTGGCC7632ProSerLeuGlyMetIleSerLeuArgThrGlnArgThrTrpLeuAla253025352540ACAGATCATTATAACGAGAAGCGGCAGTTACTGCATGCTTTCACTGAC7680ThrAspHisTyrAsnGluLysArgGlnLeuLeuHisAlaPheThrAsp2545255025552560GGTATTAGCTTGACATCAGAAGGTAGACTGAGTGGTTTATTTGAAGTT7728GlyIleSerLeuThrSerGluGlyArgLeuSerGlyLeuPheGluVal256525702575GCGAATGCAAGTTGGTTATCAGAAGTAAAATGGCCACCTGAAAAAAGC7776AlaAsnAlaSerTrpLeuSerGluValLysTrpProProGluLysSer258025852590AAAAATACTCATCCATTAGTTTCCACCTCCCTGAATATTGATGATATA7824LysAsnThrHisProLeuValSerThrSerLeuAsnIleAspAspIle259526002605GCGGTAAAGGCTGCTTTTGATTATCATATGTTCTTAATCGGCACTATA7872AlaValLysAlaAlaPheAspTyrHisMetPheLeuIleGlyThrIle261026152620AGTAACATACACTTCCATCTTCATAATGAAAAGGATGCCAAGGGGGTT7920SerAsnIleHisPheHisLeuHisAsnGluLysAspAlaLysGlyVal2625263026352640CTACCTGATTTGCTGCAGGTCTCTTTTTCATCAGATGAAATTATCCTC7968LeuProAspLeuLeuGlnValSerPheSerSerAspGluIleIleLeu264526502655AGCTCTACTGCATTAGTTGTAGCAAATATACTGGATATCTACAACACC8016SerSerThrAlaLeuValValAlaAsnIleLeuAspIleTyrAsnThr266026652670ATTGTACGTATGAGGCAGGATAATAAAATATCGTATATGGAGACGTTG8064IleValArgMetArgGlnAspAsnLysIleSerTyrMetGluThrLeu267526802685AGAGATTCCAATCCTGGTGAATCTAGGCAACCAATATTATACAAAGAC8112ArgAspSerAsnProGlyGluSerArgGlnProIleLeuTyrLysAsp269026952700ATTTTAAGATCGCTGAAATTACTCAGAACTGATCTCTCGGTGAATATC8160IleLeuArgSerLeuLysLeuLeuArgThrAspLeuSerValAsnIle2705271027152720TCCTCTTCAAAGGTCCAGATTTCGCCAATATCTTTATTCGATGTGGAA8208SerSerSerLysValGlnIleSerProIleSerLeuPheAspValGlu272527302735GTGTTAGTAATAAGAATTGACAAAGTCTCTATACGTTCCGAAACACAT8256ValLeuValIleArgIleAspLysValSerIleArgSerGluThrHis274027452750TCGGGGAAAAAATTAAAGACAGATTTGCAACTACAAGTTTTAGATGTT8304SerGlyLysLysLeuLysThrAspLeuGlnLeuGlnValLeuAspVal275527602765TCTGCAGCGCTTTCTACTTCCAAAGAAGAATTAGATGAGGAAGTTGGA8352SerAlaAlaLeuSerThrSerLysGluGluLeuAspGluGluValGly277027752780GCTTCCATTGCTATTGATGATTACATGCATTATGCTTCCAAGATTGTC8400AlaSerIleAlaIleAspAspTyrMetHisTyrAlaSerLysIleVal2785279027952800GGTGGTACTATCATTGATATTCCAAAACTTGCTGTTCATATGACAACT8448GlyGlyThrIleIleAspIleProLysLeuAlaValHisMetThrThr280528102815TTACAAGAAGAAAAGACAAATAATTTAGAATATCTATTTGCTTGCTCT8496LeuGlnGluGluLysThrAsnAsnLeuGluTyrLeuPheAlaCysSer282028252830TTTTCAGACAAAATATCTGTAAGGTGGAATCTAGGGCCTGTAGACTTC8544PheSerAspLysIleSerValArgTrpAsnLeuGlyProValAspPhe283528402845ATAAAGGAAATGTGGACTACACATGTCAAAGCACTGGCAGTTCGTCGA8592IleLysGluMetTrpThrThrHisValLysAlaLeuAlaValArgArg285028552860TCCCAGGTAGCAAATATTTCCTTTGGACAAACTGAGGAAGAACTTGAA8640SerGlnValAlaAsnIleSerPheGlyGlnThrGluGluGluLeuGlu2865287028752880GAATCAATTAAAAAGGAAGAAGCCGCTTCAAAGTTTAATTATATTGCA8688GluSerIleLysLysGluGluAlaAlaSerLysPheAsnTyrIleAla288528902895CTAGAAGAACCGCAGATCGAAGTGCCTCAGATAAGAGATCTGGGAGAC8736LeuGluGluProGlnIleGluValProGlnIleArgAspLeuGlyAsp290029052910GCCACTCCACCTATGGAATGGTTTGGTGTCAATAGAAAAAAATTTCCG8784AlaThrProProMetGluTrpPheGlyValAsnArgLysLysPhePro291529202925AAATTCACTCACCAAACCGCAGTTATCCCCGTCCAAAAGCTTGTTTAT8832LysPheThrHisGlnThrAlaValIleProValGlnLysLeuValTyr293029352940CTTGCAGAAAAGCAGTATGTCAAGATACTAGATGATACGCAT8874LeuAlaGluLysGlnTyrValLysIleLeuAspAspThrHis29452950295權(quán)利要求1.一種編碼由序列號(hào)1給出的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或者編碼由在序列號(hào)1給出的氨基酸序列中添加、缺失或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸后的氨基酸序列組成的、而且對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的蛋白質(zhì)的基因。2.一種由序列號(hào)1給出的堿基序列組成的DNA、或是由在序列號(hào)1給出的氨基酸序列中添加、缺失或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)DNA、而且對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的DNA組成的基因。3.一種由序列號(hào)1給出的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或是由在序列號(hào)1給出的氨基酸序列中添加、缺失、或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸后的氨基酸序列組成的、而且對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的蛋白質(zhì)。4.屬于酵母屬的發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的酵母，其特征是包含在染色體中的權(quán)利要求1或2記載的基因被失活。5.權(quán)利要求4記載的酵母，屬于啤酒酵母。6.權(quán)利要求4或5記載的酵母，其特征是序列號(hào)1給出的堿基序列的4388～7885基因被破壞。7.啤酒酵母YHK1243(FERMBP～5327)株。8.含有權(quán)利要求4～7任一項(xiàng)記載的酵母的生面團(tuán)。9.面包制作方法，其特征是將權(quán)利要求4～7中任一項(xiàng)記載的酵母加到生面團(tuán)中。10.乙醇的制造方法，其特征是將權(quán)利要求4～7中任一項(xiàng)記載的酵母在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使乙醇在培養(yǎng)物中蓄積，然后再?gòu)脑撆囵B(yǎng)物中獲取乙醇。全文摘要本發(fā)明涉及由序列號(hào)1給出的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì),或者是由在該序列號(hào)1給出的氨基酸序列中添加、缺失、或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸后的氨基酸序列組成的、而且對(duì)發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的蛋白質(zhì)以及編碼該蛋白質(zhì)的基因,還有由序列號(hào)1給出的堿基序列組成的DNA,或是由在該序列號(hào)1給出的堿基序列中添加、缺失、或替換1個(gè)或數(shù)個(gè)DNA的、而且對(duì)發(fā)酵能力表現(xiàn)出低溫敏感性的變異互補(bǔ)的DNA組成的基因。本發(fā)明還涉及屬于酵母屬的發(fā)酵能力顯示出低溫敏感性的酵母,其特征是染色體上的上述基因被失活;含有該酵母的生面團(tuán);以及面包的制作方法,其特征是在面包生面團(tuán)中加入上述的酵母;還有乙醇的制造方法,其特征是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述酵母,使乙醇在培養(yǎng)物中蓄積,再?gòu)脑撆囵B(yǎng)物中獲取乙醇。文檔編號(hào)A21D8/04GK1176660SQ96192213公開(kāi)日1998年3月18日申請(qǐng)日期1996年12月27日優(yōu)先權(quán)日1995年12月28日發(fā)明者川崎秀紀(jì),渡海雅也,菊池泰弘,大內(nèi)弘造申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社