專利名稱：新脂酶和其產(chǎn)生方法以及產(chǎn)生這種脂酶的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂酶、產(chǎn)生該脂酶的方法以及產(chǎn)生該脂酶的微生物，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種在高溫下顯示出高活性的由屬于青枯伯克氏菌(Pseudomonas solanacearum)的細(xì)菌產(chǎn)生的新耐熱脂酶、產(chǎn)生該酯酶的微生物以及產(chǎn)生該脂酶的方法。
背景技術(shù)：
脂酶是一種酶的普通種類，它水解甘油三酯，以前曾通過(guò)動(dòng)物內(nèi)部器官的提取，或者是用微生物來(lái)產(chǎn)生。
脂酶作為一種酶，廣泛地用于食品加工調(diào)味奶制品產(chǎn)物、用作助消化的藥物、用于血脂測(cè)定診斷，同時(shí)在工業(yè)上也用于脂肪和油脂的水解和改進(jìn)。要求脂酶具有適于這些應(yīng)用的各種性質(zhì)，并且在各種領(lǐng)域應(yīng)用耐熱脂酶，并要求其有多種使用。
在食品加工中，從食品衛(wèi)生的觀點(diǎn)看，要求在高溫下進(jìn)行酶反應(yīng)，其具有低的細(xì)菌污染。在脂肪和油脂的分解中，已考慮到應(yīng)用脂酶。脂肪和油脂水解是產(chǎn)生脂肪酸的和甘油的方法，脂肪酸和甘油是石化產(chǎn)品諸如除垢劑、化妝品和表面活性劑的原料。目前，主要應(yīng)用Colgate-emery法，這種方法使脂肪和油脂在250-260℃和50-55大氣壓與蒸汽接觸，然而，這種方法需要大型設(shè)備，并不適合中、小規(guī)模肥皂生產(chǎn)。因此，研究了脂酶對(duì)脂肪和油脂的分解。
然而，組成各種脂肪和油脂的硬酯酸(熔點(diǎn)為67-70℃)和棕櫚酸(熔點(diǎn)為63-64℃)在常溫下為固體。因此，脂肪和油脂的反應(yīng)必須在熔點(diǎn)以上的溫度才能發(fā)生。所以，用于脂肪和油脂分解的脂酶必須有高的耐熱性，同時(shí)在高溫下具有高反應(yīng)性。
而且，在最近幾年，脂酶已用于解決造紙工業(yè)樹脂問(wèn)題(日本審查過(guò)的專利出版物平4-29794)。常規(guī)上適合解決樹脂問(wèn)題的酶反應(yīng)最適溫度是35-55℃。由于常規(guī)酶在70℃以上失活，造紙過(guò)程中酶反應(yīng)的溫度受到限制，因此使用脂酶的整個(gè)造紙過(guò)程中必須控制溫度。而且，酶不耐熱，這是限制酶在研磨處理部分用于解決樹脂問(wèn)題的原因之一。
目前，市場(chǎng)上大多數(shù)的公知的用于作為耐熱脂酶之酶的熱穩(wěn)定性不夠，也很不實(shí)用。因此日本一個(gè)未審查的專利出版物昭62-79782提出了一種耐熱脂酶。然而，酶的最適溫度是60-70℃，而且它的耐熱性也不夠，因?yàn)樵?0℃處理15分鐘后剩余活性低于10％。此外，由于這種酶很難作用于三醋精和丁酸甘油酯，它的用途限于食品加工。已經(jīng)公開(kāi)了一種來(lái)源于根霉屬的耐熱脂酶(日本未檢查專利出版物昭59-156282)，但是這種酶的最適溫度是60℃，在高溫下的反應(yīng)性不夠。而且，有一些關(guān)于由臭味假單胞菌lipolytica變種產(chǎn)生的脂酶的報(bào)道，其最適溫度為70℃，在60℃熱處理4小時(shí)后失活(日本審查過(guò)的專利出版物昭50-25553)；而由莓實(shí)假單胞菌產(chǎn)生的脂酶，最適溫度為75-80℃，經(jīng)過(guò)70℃20分鐘的熱處理以后，仍保持95％的活性(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)41，1353-1358(1977))。然而，這些酶最適溫度不超過(guò)80℃?？紤]到耐熱性，在經(jīng)過(guò)80℃熱處理1小時(shí)后，其活性在一定程度上減少。因此，它們?cè)谀蜔嵝苑矫娌皇鞘至钊藵M意的。
發(fā)明目的如上所述，公知的脂酶在高溫時(shí)的耐熱性和反應(yīng)性是不夠的，那么，在實(shí)踐上用脂酶的機(jī)會(huì)在一些領(lǐng)域(例如在食品加工、工業(yè)、造紙工藝)中就會(huì)很少，同時(shí)在應(yīng)用脂酶的過(guò)程中還存在受限制的溫度條件問(wèn)題。
因而，本發(fā)明的目的是提供中具有高的耐熱性的脂酶。同時(shí)，另一個(gè)目的是提供所述脂酶的產(chǎn)生方法、具有極好耐熱性的脂酶和產(chǎn)生這種耐熱脂酶的細(xì)菌。
附圖簡(jiǎn)要描述

圖1是顯示反應(yīng)pH值和由SD709產(chǎn)生的脂酶的相對(duì)活性之間的關(guān)系的圖。
圖2是顯示由SD709產(chǎn)生的脂酶在變化的pH值、37℃保持1小時(shí)后的剩余活性的圖。
圖3是顯示反應(yīng)溫度和由SD709產(chǎn)生的脂酶的相對(duì)活性之間的關(guān)系的圖。
圖4是顯示由SD709產(chǎn)生的脂酶在pH值為7的條件下經(jīng)過(guò)在各種溫度處理1小時(shí)之后的剩余活性的圖。
圖5是顯示由SD709產(chǎn)生的脂酶在存在和不存在EDTA時(shí)反應(yīng)的溫度和脂酶的相對(duì)活度之間的關(guān)系的圖。
發(fā)明描述本發(fā)明發(fā)明人分離、培養(yǎng)、篩選大量微生物獲得了一種具有高耐熱性和在高溫下具有高的反應(yīng)性的脂酶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)由青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)代表的菌株(其是在日本的Chiba縣土壤中分離出來(lái)的)產(chǎn)生新的耐熱脂酶。迄今為止，人們熟知由大量菌株產(chǎn)生的脂酶，但是仍還不了解來(lái)源于青枯伯克氏菌的耐熱脂酶。本發(fā)明人確認(rèn)新的耐熱脂酶在高溫下對(duì)脂類的水解特別有效，因而完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了如下所給出的脂酶、其產(chǎn)生方法和產(chǎn)生這種脂酶的微生物。
1)一種脂酶，在30℃至100℃的溫度范圍內(nèi)以甘油三油酸酯乳液為底物測(cè)定時(shí)，其具有從30℃到100℃的活性溫度，從85℃到100℃的最適溫度。優(yōu)選的脂酶具有以下特性(1)活性pH值和最適pH值在pH值4-12范圍內(nèi)用甘油三油酸酯乳液作為底物測(cè)定時(shí)，活性pH值為4-12，最適pH值為6.5-9.5。
(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定時(shí)分子量為32,000±2,000。
2)一種脂酶，在30℃至100℃的溫度范圍內(nèi)在5mM EDTA存在下以甘油三油酸酯乳液為底物測(cè)定時(shí)，其具有從30℃到100℃的活性溫度，從85℃到90℃的最適溫度。優(yōu)選的脂酶具有以下特性(1)活性pH值和最適pH值在pH值4-12的范圍內(nèi)用甘油三油酸酯乳液作為底物測(cè)定時(shí)，活性pH值為4-12，最適pH值為6.5-9.5。
(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定時(shí)分子量為32,000±2,000。
3)在1〕或2〕中描述的脂酶，其是從屬于假單胞桿菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌培養(yǎng)物中獲得的，優(yōu)選地是，所說(shuō)的屬于假單胞桿菌屬的細(xì)菌是青枯伯克氏菌(Pseudomonas solanacearum)。
4)在1〕或2〕中描述的脂酶，其是從屬于青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)的培養(yǎng)物獲得的。
5)在1〕或2〕中描述的屬于假單胞桿菌屬的細(xì)菌，其產(chǎn)生了一種脂酶，優(yōu)選的所述細(xì)菌是青枯伯克氏菌，更優(yōu)選的是青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)，或者是其菌學(xué)(mycologically)上的等價(jià)物或者是它們的突變體。
6)一種產(chǎn)生脂酶的方法，其中包括培養(yǎng)5〕中所描述的細(xì)菌和從培養(yǎng)基獲得1〕或2〕中所描述的脂酶。[產(chǎn)生菌株]按照本發(fā)明，用于產(chǎn)生這種脂酶的微生物不是特別地受限制，只要這些細(xì)菌能產(chǎn)生具有如下描述的性質(zhì)的脂酶。這樣一種細(xì)菌可以從保存的菌株或者從自然界新近分離的微生物中選擇得到，優(yōu)選的細(xì)菌是一種屬于假單胞桿菌屬的細(xì)菌，一種更優(yōu)選的細(xì)菌屬于青枯伯克氏菌的細(xì)菌，進(jìn)一步優(yōu)選的是青枯伯克氏菌SD709和其菌學(xué)上的等價(jià)物。在本申請(qǐng)中，菌學(xué)上的等價(jià)物意味著具有幾乎相同的菌學(xué)性質(zhì)的菌株。等價(jià)物包括自然的或者是人工突變體，只要它們具有如下描述的性質(zhì)。
產(chǎn)生本發(fā)明新的脂酶菌株的例子是SD709，本發(fā)明發(fā)明人是在日本的Chiba縣土壤中分離出來(lái)的。
SD709菌株有如下性質(zhì)。
(1)形態(tài)學(xué) 桿狀(2)革蘭氏染色劑陰性(3)孢子(-)(4)游動(dòng)性 (+)(5)鞭毛極性多鞭毛(6)氧化酶 陽(yáng)性(7)過(guò)氧化氫酶 陽(yáng)性(8)OF檢驗(yàn) 0(9)熒光染色產(chǎn)物(-)(10)水溶性染色產(chǎn)物 (-)
(11)原兒茶酸裂解 正(12)精氨酸二水合酶 陰性(13)41℃生長(zhǎng) 不可能(14)反硝化作用 陽(yáng)性(15)明膠液化 陽(yáng)性(16)淀粉分解 陰性(17)PHB積累 (+)(18)同化葡萄糖 +D-木糖 -D-核糖 +L-鼠李糖-乙酰丙酸+檸檬酸鹽+中康酸鹽-福壽草醇-2，3-丁烯乙二醇 -間羥基苯甲酸-色胺-蔗糖+辛酸鹽 +L-(+)-酒石酸+(19)醌 Q-8將上述具有菌學(xué)分類性質(zhì)的細(xì)菌與Bergey細(xì)菌分類學(xué)手冊(cè)(1984)的其它菌株相比較，結(jié)果，該菌株被確定為青枯伯克氏菌。該菌株于1995年2月23日以P-14786保存在工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu)國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(1-1-3，Higashi，Tsuduba，Ibaragi，Japan)，并且依據(jù)布達(dá)佩斯條約，自1995年12月28 作為青枯伯克氏菌((Pseudomonas sp.)SD709(FERMBP-5358)轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。
具有以下描述特性的產(chǎn)生脂酶的突變體可以自發(fā)獲得或通過(guò)以上面的菌株作為親本菌株誘變獲得，并且這種突變體可用作產(chǎn)生脂酶的細(xì)菌，制備這種突變體的常規(guī)方法是，例如，一種包括用人工的方法(如紫外照射、用N-甲基-N-硝基-N-nitro soguanidine(NTG)處理等等)進(jìn)行誘變的方法。將親本菌株接種在含有油脂如橄欖油等的瓊脂培養(yǎng)基上，選擇在菌落周圍形成較大、界限清晰的菌落，用脂酶產(chǎn)生培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，選擇產(chǎn)率高的菌株。[脂酶的產(chǎn)生]按照本發(fā)明的脂酶，主要是在培養(yǎng)產(chǎn)生脂酶的細(xì)菌之培養(yǎng)物中獲得的。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成份是廣泛使用的。碳源可以使用可同化的碳化合物或含有它們的物質(zhì)，如葡萄糖、脂肪和油脂、玉米浸提物、Tween表面活性物質(zhì)等。氮源可以用可同化氮化合物或含有它們的物質(zhì)，如銨鹽、硝酸鹽、大豆粉、肉膏、玉米浸提物、pharmamedia。無(wú)機(jī)鹽如磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽適合使用。
培養(yǎng)條件因培養(yǎng)基成份不同而有所變化，但是選擇了用于生產(chǎn)所需脂酶的合適條件。通常，培養(yǎng)溫度是10-35℃，優(yōu)選的在20-30℃，培養(yǎng)時(shí)間大約是8-100小時(shí)，當(dāng)脂酶含量達(dá)到最大時(shí)，終止培養(yǎng)。用于生產(chǎn)這種脂酶的培養(yǎng)基優(yōu)選pH值是7-10。通過(guò)這樣的培養(yǎng)，脂酶在細(xì)胞外產(chǎn)生了所需的脂酶(在培養(yǎng)物中)。[分離和純化方法]回收培養(yǎng)基中以上述方式所得到的脂酶，可以用常規(guī)方法經(jīng)分離和純化回收脂酶。
也就是說(shuō)，通過(guò)用公知的合適方法(如過(guò)濾、離心)從培養(yǎng)物分離細(xì)菌細(xì)胞和固體培養(yǎng)基獲得上清液或?yàn)V過(guò)物，用一種或數(shù)種分離和純化方法處理濃縮或非濃縮的該分離液，從而得到脂酶。所述的分離活和純化方法例如鹽析法(通過(guò)加入可溶性鹽沉淀酶)、有機(jī)溶劑沉淀法(通過(guò)加入親水性有機(jī)溶劑沉淀酶或雜質(zhì))、吸附/解吸附法(使用離子交換樹脂、凝膠過(guò)濾)、加或不加脂酶的噴霧干燥、冷凍干燥。[酶活性測(cè)定法]以多聚甘油三油酸酯乳劑為底物(聚乙烯乙醇)(PVA)測(cè)定脂酶活性?；钚詼y(cè)定實(shí)施方案如下。
將含有0.1ml酶溶液、0.4ml 200mM Tris緩沖液和甘油三油酸酯乳液的混合溶液放入具有密閉塞子的試管中加熱至37℃反應(yīng)10分鐘，加入0.2ml鹽酸使反應(yīng)停止。制備甘油三油酸酯乳液，將2.5g甘油三油酸酯加入到10ml 2％PVA水溶液中(Poval PVA117(商標(biāo)，Kuraray Co. Ltd.)PovalPVA205(商標(biāo)，Kuraray Co. Ltd.)＝9∶1)，18000rpm低溫離心10分鐘使其均勻混合；反應(yīng)停止后加入2ml N-己烷，2ml異丙醇和1ml蒸餾水，用力震蕩后靜置，用TLC-FID方法(Minagawa et al.，Lipids，18，732，1983)測(cè)定己烷層中樣品的油酸含量?；钚詥挝?U)為每分鐘產(chǎn)生1毫摩爾油酸的脂酶量。[酶特性]作為本發(fā)明這種脂酶的一個(gè)例子，由以上所述的青枯伯克氏菌SD709產(chǎn)生的脂酶其特性如下。(1)作用其作用于甘油酯并水解其酯。(2)底物特異性它廣泛地水解各種甘油酯、酯等。相對(duì)活性以每一種甘油酯-PVA乳液作為甘油酯底物由上述的酶活性測(cè)定方法來(lái)測(cè)定。對(duì)甘油酯的分解能力為100，將所得的值與之比較得到其相對(duì)活性。丁酸甘油酯的相對(duì)活性為180，橄欖油為75，豆油為90，棉籽油為74。
酯的分解能力是通過(guò)以對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯為底物在pH值為8.0，溫度30℃時(shí)水解產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚(0D405)的比色法測(cè)定。
而相對(duì)活性則是以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸鹽(pNPP)的分解能力為100，與之相比較對(duì)硝基苯酚戊酸鹽(PNPL)為170，對(duì)硝基苯酚月桂酸鹽(pNPV)為60。(3)活性pH值和最適pH值用甘油三油酸酯乳液作為底物以上述的脂酶活性測(cè)定方法確定pH值。在4-12范圍內(nèi)確定了反應(yīng)pH值，混合緩沖液由100mMe-氨基己酸、100mM雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥乙基)甲烷(bistris)、100mM N-三(羥乙基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)組成，在使用前用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH值。反應(yīng)的pH值與相對(duì)活性的關(guān)系如圖1所示。在4-12范圍內(nèi)測(cè)定活性pH值為4-12，最適宜的pH值為6.5-9.5。(4)pH穩(wěn)定性用上述的酶活性測(cè)定方法測(cè)定在pH值4-12范圍內(nèi)以變化的pH值、37℃處理1小時(shí)后的剩余活性，pH值與剩余活性的關(guān)系如圖2所示。在pH值4-11范圍內(nèi)，其剩余活性不低于50％。測(cè)定所用的緩沖液由以下溶液組成；pH4-5醋酸/醋酸鈉、pH6-7磷酸、pH8-9tris/鹽酸、pH10-12甘氨酸/氫氧化鈉。(5)活性溫度和最適溫度用同樣方法測(cè)定，所不同的是以甘油三油酸酯乳液為底物，反應(yīng)溫度在30-100℃范圍內(nèi)變化。反應(yīng)溫度與反應(yīng)活性的關(guān)系如圖3所示。在30-100℃內(nèi)確定的活性溫度為30-100℃，最適溫度為85-100℃。
用上述同樣的酶活性分析法測(cè)定活性溫度和最適溫度，所不同的是以甘油三油酸酸乳液為底物，在5mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及反應(yīng)溫度在30-100℃范圍內(nèi)變化。反應(yīng)溫度與相對(duì)活性的關(guān)系如圖5所示。在30-100℃溫度范圍內(nèi)確定的活性溫度為30-100℃，最適溫度為80-90℃。(6)溫度穩(wěn)定性用上述酶活性測(cè)定方法測(cè)定pH7時(shí)，溫度變化范圍為30-100℃處理1小時(shí)后的剩余活性。處理溫度與剩余活性的關(guān)系如圖4所示。處理溫度為80℃時(shí)，其剩余活性為100％。(7)分子量由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到的分子量為32,000±2,000。(8)等電點(diǎn)由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法得到等電點(diǎn)是8.8±0.5。
實(shí)施本發(fā)明的最好方式現(xiàn)在，舉出下列例子說(shuō)明本發(fā)明，但這些例子不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。除非有其它說(shuō)明，下列實(shí)施例中的％均為重量百分比。
實(shí)例1培養(yǎng)產(chǎn)生脂酶的細(xì)菌(SD709)將包含豆粉(2％)、葡萄糖(1％)、磷酸氫二銨(0.1％)、磷酸氫二鉀(0.5％)、硫酸鎂七水合物(0.1％)和碳酸鈉(0.3％)液體培養(yǎng)基(2ml)放入直徑18mm試管中，用高壓滅菌器121℃下滅菌20分鐘，接種一鉑環(huán)量的青枯伯克氏菌SD709，并于30℃、130rpm培養(yǎng)24小時(shí)。然后離心分離去掉細(xì)菌細(xì)胞，獲得脂酶溶液。該溶液脂酶活性為5U/ml。
實(shí)例2培養(yǎng)產(chǎn)生脂酶細(xì)菌(SD709)和回收脂酶將包含豆劑(2％)、磷酸氫二銨(0.1％)、磷酸氫二鉀(0.5％)、硫酸鎂heptahydrate(0.1％)和碳酸鈉(0.3％)和Tween85(1％)液體培養(yǎng)基(2升)放入5升的培養(yǎng)罐中，120℃在高壓滅菌器中滅菌20分鐘，接種青枯伯克氏菌SD709，并于30℃、1000rpm換氣振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。然后離心分離去掉細(xì)菌細(xì)胞，獲得脂酶溶液。該溶液脂酶活性為20U/ml。
上述脂酶溶液用硫酸銨沉淀得到20％-30％的沉淀組分，沉淀用常規(guī)方法脫鹽和冷結(jié)干燥得到粗脂酶粉劑。
實(shí)例3純化脂酶將實(shí)例2中獲得的脂酶粗粉劑溶解在10mM Tris/鹽酸緩沖液(pH7)中，在含有10％飽和硫酸銨的10mM Tris/鹽酸緩沖液(pH7)中進(jìn)行透析，然后用Butyl-Toyopearl 650M(商標(biāo)，Tosoh公司)疏水性色譜法得到活性組分?；钚越M分經(jīng)過(guò)含有0.3mM次氯酸鈣的10mM Tris/鹽酸緩沖液(pH8)透析和DEAE-Cellulofine 800(商標(biāo)，Seikagaku Corporation)吸附(離子交換層析樹脂)，用同樣的緩沖液平衡，最后用氯化鈉溶液洗脫得到活性組分?；钚越M分經(jīng)脫鹽和冷結(jié)干燥得到純化的酶。
該凍結(jié)干燥產(chǎn)物的純度由聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)確定。
實(shí)例4在乙二胺四乙酸存在時(shí)的高溫活性在實(shí)例2中所獲得的酯酶的粗粉劑的活性在30-100℃范圍變化的溫度下、以甘油三油酸乳液為底物、在含有或不含乙二胺四乙酸(EDTA)情況下測(cè)定。以上面描述的相同的酶活性分析方法完成不含EDTA的測(cè)定，除了反應(yīng)溫度在在30-100℃范圍變化。除了加入EDTA外，以不含EDTA的相同的測(cè)定方法進(jìn)行存在EDTA時(shí)的測(cè)定。相對(duì)活性(與80℃、無(wú)EDTA時(shí)的100活性比較)與反應(yīng)溫度的關(guān)系如圖5所示。由圖5可見(jiàn)，本發(fā)明脂酶活性溫度范圍為30-100℃，即使有EDTA(無(wú)鈣離子)存在時(shí)其最適溫度為80-90℃。這表明，該脂酶在高溫下有足夠的活性。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的脂酶有很高的耐熱性，并且這種活性表現(xiàn)在可在高溫下水解脂類，因此這種脂酶可以廣泛地用于各個(gè)領(lǐng)域如醫(yī)藥，食品加工，化裝品制備、洗滌劑，廢水處理，脂肪和油的分解，樹脂控制。
本發(fā)明的青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)或其菌學(xué)上的等價(jià)菌株，或它們的變體在有效地產(chǎn)生這種脂酶的本發(fā)明的制備方法中是有用的。
權(quán)利要求
1.一種脂酶，在30℃至100℃的溫度范圍內(nèi)以甘油三油酸酯乳液為底物測(cè)定時(shí)，其具有從30℃到100℃的活性溫度，從85℃到100℃的最適溫度。
2.一種脂酶，在30℃至100℃的溫度范圍內(nèi)在5mM EDTA存在下以甘油三油酸酯乳液為底物測(cè)定時(shí)，其具有從30℃到100℃的活性溫度，從85℃到90℃的最適溫度。
3.一種權(quán)利要求1所要求的脂酶，其具有以下特性(1)活性pH值和最適pH值在pH值4-12范圍內(nèi)用甘油三油酸酯乳液作為底物測(cè)定時(shí)，活性pH值為4-12，最適pH值為6.5-9.5。(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定時(shí)分子量為32,000±2,000。
4.一種權(quán)利要求2所要求的脂酶，其具有以下特性(1)活性pH值和最適pH值在pH值4-12的范圍內(nèi)用甘油三油酸酯乳液作為底物測(cè)定時(shí)，活性pH值為4-12，最適pH值為6.5-9.5。(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定時(shí)分子量為32,000±2,000。
5.一種權(quán)利要求1-4之任一所要求的脂酶，其是從屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌培養(yǎng)物獲得的。
6.一種權(quán)利要求5所要求的脂酶，其中所說(shuō)的屬于假單胞菌屬的細(xì)菌是青枯伯克氏菌(Pseudomonas solanacearum)。
7.一種權(quán)利要求1-4之任一所要求的脂酶，其是從青枯伯克氏菌SD709(FERM-14786)的培養(yǎng)物獲得的。
8.一種屬于假單胞菌屬的細(xì)菌，其產(chǎn)生權(quán)利要求第1-4之任一所要求的脂酶。
9.一種權(quán)利要求8所要求的細(xì)菌，其中所說(shuō)的屬于假單胞菌屬的細(xì)菌是青枯伯克氏菌。
10.一種權(quán)利要求8所要求的細(xì)菌，其中所說(shuō)的屬于假單胞菌屬的細(xì)菌是青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)或者其菌學(xué)上的等價(jià)菌株，或者是它們的突變體。
11.一種產(chǎn)生脂酶的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求8-10之任一所要求的細(xì)菌，并從培養(yǎng)基中回收權(quán)利要求1-4之任一所要求的脂酶。
全文摘要
一種在高溫下顯示出高活性而不依賴于EDTA的存在的新脂酶。它具有在高溫下水解脂質(zhì)的足夠活性,因此可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品加工、化妝品制造、洗滌劑、污水處理、脂肪分解等工業(yè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N9/20GK1177979SQ96192388
公開(kāi)日1998年4月1日 申請(qǐng)日期1996年2月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月27日 公開(kāi)號(hào)96192388.發(fā)明者小隆司, 田中計(jì)實(shí), 崎元和范 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司