專利名稱：：來自逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)蛋白的無毒免疫原、抗體、其制備方法和含有它們的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)蛋白的新逆轉(zhuǎn)錄病毒免疫原，所述調(diào)節(jié)蛋白的基本生物特性已預(yù)先滅活而保留或提高其免疫原性；其制備方法和含有它們的藥物組合物。這些新的“無活性”免疫原用于在人體誘導(dǎo)主動(dòng)免疫，以預(yù)防或校正作為該免疫原來源之天然蛋白可產(chǎn)生的失調(diào)。同樣，本發(fā)明還涉及通過使用這些“無活性”免疫原而獲得的新抗體，其制備方法和含有它們的用于被動(dòng)免疫的藥物組合物。Tat分子是一種在病毒顆粒中找不到而由HIV-1基因組編碼的HIV調(diào)節(jié)蛋白。在感染細(xì)胞內(nèi)，這種由原病毒DNA編碼的蛋白起病毒或細(xì)胞基因的反式激活蛋白的作用。但這種基因調(diào)節(jié)蛋白也可以存在于細(xì)胞外循環(huán)介質(zhì)中，死亡細(xì)胞碎片中排泄的原始狀態(tài)的蛋白或片段，或者由分泌過程中排出。其在循環(huán)介質(zhì)中的存在解釋了某些陽(yáng)性血清主體中可檢測(cè)到抗Tat抗體的存在。這種Tat處于細(xì)胞外的情況下，該分子帶有細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白可識(shí)別的RGD殘基的C-末端片段和堿性區(qū)域(45-70殘基)將使其象細(xì)菌毒素造成的那樣作用于許多組織的非感染細(xì)胞。這樣，作為真正病毒毒素的循環(huán)Tat蛋白可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性，與生長(zhǎng)因子BFGF結(jié)合參與卡波濟(jì)肉瘤的新血管生成，后者構(gòu)成艾滋病的特征。循環(huán)Tat蛋白還可以加重免疫抑制(其在艾滋病中逐步發(fā)展)，這是通過對(duì)T細(xì)胞的直接免疫抑制作用或使抗原遞呈細(xì)胞(稱為APC)(巨噬細(xì)胞或樹枝狀細(xì)胞)生產(chǎn)α干擾素失調(diào)而產(chǎn)生的。獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)在臨床上定義為由免疫抑制產(chǎn)生的機(jī)會(huì)性疾病或卡波濟(jì)肉瘤。獲得性免疫缺陷在HIV感染過程中逐步發(fā)展，其生物學(xué)表現(xiàn)為T細(xì)胞在先用應(yīng)答抗原、再用同種抗原、最后用促細(xì)胞分裂原(PHA)刺激后免疫反應(yīng)活性的喪失(白細(xì)胞郁滯和IL-2產(chǎn)量降低)。這種免疫抑制與α和γ干擾素的過量產(chǎn)生有關(guān)。導(dǎo)致免疫抑制的細(xì)胞致病機(jī)制很復(fù)雜，涉及許多病毒來源的因子，它們直接作用于免疫細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和APC，或通過細(xì)胞因子網(wǎng)間接作用。例如HIV-1顆粒攜帶的gp120包膜蛋白(其在細(xì)胞外的存在通過血清病毒數(shù)量測(cè)定)所直接引起CD4表型T細(xì)胞的無應(yīng)性。以循環(huán)病毒毒素的細(xì)胞外形式存在的HIV調(diào)節(jié)蛋白(特別是Tat)，似乎也引起T細(xì)胞的直接免疫抑制或其他致病作用，因?yàn)槔缭隗w外被應(yīng)答抗原或被抗CD3抗體激活的T細(xì)胞在Tat分子存在下不再增殖。另外，循環(huán)Tat蛋白似有助于APC過量產(chǎn)生可加重艾滋病中見到的免疫抑制和編程性細(xì)胞死亡的α干擾素、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制性細(xì)胞因子和apoptogene。實(shí)際上，在Tat存在下α干擾素的分泌似不再被反向調(diào)節(jié)(返饋)中止，該反向調(diào)節(jié)正常狀態(tài)下控制α干擾素的產(chǎn)生(耐受期)?？ú?jì)肉瘤的臨床表現(xiàn)是出現(xiàn)血管結(jié)節(jié)，這代表從內(nèi)皮細(xì)胞形成的新血管生成。被產(chǎn)生細(xì)胞因子(γ干擾素，IL1和IL6)的炎性過程所激活的細(xì)胞產(chǎn)生BFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)并增殖。激活的內(nèi)皮細(xì)胞體外在Tat蛋白培養(yǎng)基中增殖加快。抗Tat抗體體外阻滯Tat蛋白的增殖作用。Tat與粘附表面帶有整聯(lián)蛋白家族的內(nèi)皮細(xì)胞的作用，通過這些分子識(shí)別的RGD序列的存在得以說明。新血管形成是體內(nèi)卡波濟(jì)肉瘤形成的基礎(chǔ)，細(xì)胞外形式的Tat調(diào)節(jié)蛋白應(yīng)對(duì)其形成有利，而Tat由于其含RGD序列的C末端片段而可被皮內(nèi)細(xì)胞的整聯(lián)蛋白所識(shí)別。另外，Tat還可以通過其富K和R殘基的堿性區(qū)作用，從而易于與細(xì)胞外基質(zhì)的硫酸肝素相結(jié)合，這使生長(zhǎng)激素BFGF的濃度升高。因而這些生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖在Tat存在下加快，并引起新血管生成。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的這種影響在體外被抗Tat抗體的作用所減小。因此希望阻滯真正病毒毒素-細(xì)胞外介質(zhì)(血液、淋巴、間隙液)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)蛋白，特別是循環(huán)Tat的有害活性。關(guān)于HIV病毒，迄今人們已進(jìn)行了利用這些病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或其片段免疫接種的努力，但從來沒有用過這些病毒的調(diào)節(jié)蛋白或調(diào)節(jié)蛋白片段。但現(xiàn)令人驚異地發(fā)現(xiàn)，就象細(xì)菌毒素(破傷風(fēng)、白喉或肉毒桿菌毒素)的毒性被特異抗體中和一樣，病毒調(diào)節(jié)蛋白特別是Tat(細(xì)胞外形式的HIV真正毒素)的有害作用(它們引起T細(xì)胞免疫抑制、APC生成α干擾素的失調(diào)或作為卡波濟(jì)肉瘤基礎(chǔ)的新血管生成)，如在下述實(shí)驗(yàn)部分將看到的，在抗Tat特異抗體存在下被消除。病毒如HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2的其他調(diào)節(jié)蛋白情況相同。因而為了治療和預(yù)防目的希望擁有可用于人體的能夠產(chǎn)生這種抗體的免疫原以及擁有這種抗體。實(shí)際上，用作免疫原的現(xiàn)有枝術(shù)化合物可能對(duì)人體有毒(見例如WO-A-9118454)，特別是帶有堿性區(qū)域的那些。這主要涉及“天然”Tat、Nef或Rev的未修飾片段，相反，本發(fā)明基于這些蛋白或蛋白片段的滅活。因而本發(fā)明的目標(biāo)是無毒可用于人體的免疫原性化合物，其特征在于它們是經(jīng)諸如醛的偶聯(lián)劑，或經(jīng)一種醛(優(yōu)選甲醛或戊二醛)預(yù)處理而活化的載體蛋白進(jìn)行化學(xué)處理從HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的調(diào)節(jié)蛋白衍生而來，使其能被針對(duì)所述調(diào)節(jié)蛋白的抗體所識(shí)別并保留足以激發(fā)中和或封阻所述天然蛋白的抗體的免疫原性，而喪失了所述天然蛋白的至少50％、特別是至少80％、尤其是95％以上的毒性生物特性。與諸如破傷風(fēng)類毒素的細(xì)菌毒素類似，這些化合物以下將被稱為“類毒素”。實(shí)際上，就象經(jīng)典細(xì)菌類毒素一樣，它們失去了特有的毒性，但在給予主體時(shí)卻能夠刺激免疫。以下的化學(xué)處理可以輔以一種物理處理，例如照射，特別是紫外照射，以降低本發(fā)明免疫原性化合物的殘余毒性。上述類毒素例如可以從一種其序列與一種調(diào)節(jié)蛋白(如Tat)的肽序列相同或相似的肽制備，可以通過例如樹脂上的常規(guī)肽合成或通過基因工程而獲得。所有這些方法都是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的。為了證實(shí)按本發(fā)明修飾的調(diào)節(jié)蛋白或其修飾片段確實(shí)能被針對(duì)所述天然調(diào)節(jié)蛋白的抗體所識(shí)別，如下文實(shí)驗(yàn)部分將看到的，可以通過ELISA檢測(cè)特異抗體存在下抗原-抗體復(fù)合物的形成。為了確實(shí)是否保留了足以刺激中和天然蛋白的抗體的調(diào)節(jié)蛋白免疫原性，例如可以用本發(fā)明的免疫原性化合物免疫哺乳動(dòng)物(兔、大鼠、小鼠)并驗(yàn)證所產(chǎn)生的抗體中和調(diào)節(jié)蛋白的毒性，正如在實(shí)驗(yàn)部分將看到的Tat的情形。為了證實(shí)修飾的調(diào)節(jié)蛋白是否已喪失了其至少50％的毒性生物特性，例如可以研究滅活調(diào)節(jié)蛋白如Tat對(duì)T細(xì)胞免疫抑制的作用、或?qū)钚酝庵苎袉魏思?xì)胞產(chǎn)生α干擾素的作用，或?qū)φ{(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)的新血管生成的作用。Tat調(diào)節(jié)蛋白的滅活例如通過“Tat援救試驗(yàn)”來驗(yàn)證，用Tat缺陷型非感染性HIV變體在HLM-1細(xì)胞系上培養(yǎng)，其復(fù)制依賴于外源天然Tat的存在。該免疫原性化合物可衍生自病毒HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2的任何調(diào)節(jié)蛋白，特別是病毒HIV-1和HIV-2的Vif、Rev、Nef和Tat；特別是Rev、Nef和Tat，更特別是Rev和Tat，優(yōu)選Tat。還可以指出HTLV-1或HTLV-2的Tax蛋白。還可以具體提及堿性區(qū)以外的Tat和Rev區(qū)域，即Tat中49-57區(qū)之外的和Rev中35-50區(qū)之外的，或與這些區(qū)域至多4個(gè)氨基酸(優(yōu)選至多2個(gè)氨基酸)重疊的區(qū)域，特別是肽HQVSLSKQPTSQPRGD。從病毒HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2的調(diào)節(jié)蛋白“衍生”，應(yīng)理解為免疫原性化合物可由調(diào)節(jié)蛋白的全部或一個(gè)片段構(gòu)成，并且該蛋白或片段的氨基酸中可有一個(gè)或多個(gè)修飾如缺失、取代、插入，或官能化如氨基酸的?；灰@些修飾保持在如上指明的范疇內(nèi)(無毒性，免疫特征)。例如，一般用異亮氨酸殘基取代亮氨酸殘基不會(huì)改變這些性質(zhì)；在至少8個(gè)氨基酸(尤其是至少12個(gè)氨基酸)的調(diào)節(jié)蛋白同源鏈節(jié)上，這些修飾一般應(yīng)涉及30％以下的氨基酸，優(yōu)選20％以下，尤其是10％以下。一個(gè)片段可含例如8-60個(gè)氨基酸，優(yōu)選12-40個(gè)氨基酸，特別是25-40個(gè)氨基酸。例如可提及HIV-1Tat(末端的65-80殘基的片段。在優(yōu)選條件下，本發(fā)明的免疫原性化合物含有整個(gè)調(diào)節(jié)蛋白的至少50％，優(yōu)選至少70％，特別是至少90％，尤其是所述蛋白的全部或幾乎全部。一般而言，關(guān)于修飾，修飾后的免疫原與天然蛋白或蛋白片段間的同源性或相似性，以及免疫原性化合物的長(zhǎng)度，還有使用模式、本發(fā)明免疫原性化合物與諸如破傷風(fēng)類毒素的免疫原性蛋白的偶聯(lián)方法，都可參見WO-A-86/06414，EP-A-0220273或PCT/US86/00831(等價(jià))，其中內(nèi)容引入此處作為參考。本發(fā)明的免疫原性化合物可以如下使用通過例如皮下或肌內(nèi)途徑給予需要治療的主體以治療有效量的本發(fā)明的免疫原性化合物。給藥劑量可為例如皮下100-1000μg，每月一次共三個(gè)月，然后根據(jù)所誘發(fā)的血清抗體率周期性給藥，例如2-6個(gè)月一次。本發(fā)明的組合物可經(jīng)常規(guī)用于疫苗領(lǐng)域的任何途徑給藥，特別是皮下、肌肉、靜脈內(nèi)或口服途徑?？梢砸詥我粍┝拷o藥，或在一定時(shí)間間隔后重復(fù)一次或多次。因此，本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防性組合物，其特征在于其含有作為活性成分的如上定義的免疫原性化合物。這種免疫原性化合物可單獨(dú)使用或與藥物可接受的賦形劑如佐劑混合使用。本發(fā)明還涉及藥物，其特征在于它們由如上定義的免疫原性化合物所組成，即上述免疫原性化合物用于治療人體或動(dòng)物的方法中；以及這種免疫原性化合物在制備用于治療或預(yù)防上述調(diào)節(jié)蛋白(尤其是Tat)有害作用的治療或預(yù)防性藥物中的用途。實(shí)際上，本發(fā)明的化合物已失去其毒性，因而可用于人體，如將在實(shí)驗(yàn)部分所見。給予本發(fā)明的免疫原性化合物相當(dāng)于主動(dòng)免疫治療。同樣有意義的是進(jìn)行被動(dòng)免疫治療，即直接向病人提供其所需抗體，以中和HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的有害作用。這些抗調(diào)節(jié)蛋白的抗體可以按常規(guī)方法獲得，例如用上述定義的免疫原性化合物接種哺乳動(dòng)物(人或動(dòng)物)，通過被F-B病毒轉(zhuǎn)化的人B淋巴細(xì)胞的克隆，然后收獲所述轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞分泌的目標(biāo)抗體，或通過從噬菌體文庫(kù)開始的基因重組。因此，本申請(qǐng)還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白抗體(特別是抗Tat類毒素的抗體)的制備方法，尤其是制備上述抗體的方法，其特征在于用如上所定義的免疫原性化合物接種哺乳動(dòng)物。本發(fā)明還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的抗體，特別是通過實(shí)施上述方法從免疫接種的人或哺乳動(dòng)物主體獲得的多克隆或單克隆抗體。這些特異抗體可以來自1.主體自身，通過用生物失活但有免疫原性的調(diào)節(jié)蛋白(特別是Tat)主動(dòng)免疫(接種)而誘生。這種免疫原性化合物，如Tat的情況，類似于細(xì)菌類毒素，稱為Tat類毒素。2.或者同種或異種的其他生物體，通過被動(dòng)免疫(血清治療)給予主體。同種抗體(對(duì)人體)可通過用免疫原性蛋白或本發(fā)明的衍生物、特別是Tat(本發(fā)明的Tat-類毒素或Tat肽片段)主動(dòng)免疫(接種)未感染的自愿主體后產(chǎn)生。這些或同種(人的)或異種(動(dòng)物的)的被動(dòng)給予的抗體可以是完整單克隆或多克隆抗體或抗體的F(ah’)2或Fab片段?！翱拐{(diào)節(jié)蛋白的抗體”應(yīng)理解為單克隆或多克隆抗體或這些抗體的F(ab’)2或Fab片段，或從噬菌體文庫(kù)基因構(gòu)建而獲得的抗調(diào)節(jié)蛋白的抗體。源自人的同種抗體為-多克隆的，可以在用本發(fā)明免疫原性化合物、特別是Tat類毒素或Tat肽片段免疫的血清陰性自愿?jìng)€(gè)體中獲得；-或者單克隆的，來自免疫個(gè)體的EB病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞特異克隆(特異EBV-B細(xì)胞系)。異種抗體來自用本發(fā)明免疫原性化合物、特別是Tat或其衍生物(本發(fā)明的無毒性Tat類毒素，Tat肽處段)超免疫的動(dòng)物，并且是來自超免疫動(dòng)物的多克隆抗體，-或者單克隆抗體，按Kohler和Milstein的技術(shù)將脾細(xì)胞或腺細(xì)胞與x63型(特別是x63AG3型)細(xì)胞系雜交后獲得。此處優(yōu)選馬抗體或兔抗體。本申請(qǐng)還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白抗體的制備方法，其特征在于用如上所定義的免疫原性化合物免疫一種哺乳動(dòng)物(人或動(dòng)物)。本發(fā)明還涉及抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征在于使用來自用本發(fā)明免疫原性化合物免疫個(gè)體的B細(xì)胞，所述B細(xì)胞已用EB病毒轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的特異抗體?？膳囵B(yǎng)上述EBV+細(xì)胞以產(chǎn)生所需抗體。如人們所見，這些細(xì)胞尤其來自被天然調(diào)節(jié)蛋白或被本發(fā)明免疫原性化合物免疫的病人。本申請(qǐng)還涉及抗滅活或未滅活HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的本發(fā)明單克隆抗體的制備方法，其特征在于按現(xiàn)有技術(shù)中熟知的方法(Kohler和Milstein)用特別是被天然調(diào)節(jié)蛋白或本發(fā)明免疫原性化合物免疫之小鼠的脾細(xì)胞或腺細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(優(yōu)選x63細(xì)胞系)制備哺乳動(dòng)物(特別是小鼠)的雜交瘤。本申請(qǐng)還涉及通過基因重組技術(shù)獲得抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白抗體的方法，其特征在于使用如上定義的免疫原性化合物作為免疫原。本申請(qǐng)還涉及所述抗體的F(ab’)2或Fab片段，它們可通過例如酶消化而獲得。本發(fā)明還涉及被動(dòng)免疫HIV病毒感染主體的方法，其中使用抗HIV病毒復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白、更具體為抗Tat的、中和或阻滯該蛋白細(xì)胞外形式之有害作用的、如上所述制備的特異抗體，或這些抗體的F(ab’)2或F(ab)片段。本申請(qǐng)還涉及抗HIV或艾滋病的主動(dòng)免疫方法，其中使用如上所述的免疫原性化合物，結(jié)合HIV病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白，特別是gp120或gp160包膜糖蛋白或其修飾或未修飾的肽片段，或滅活的HIV病毒，或例如通過堿水解基因組RNA被耗竭的HIV病毒。本發(fā)明還涉及抗HIV或艾滋病的主動(dòng)免疫方法，其中使用如上所述的免疫原性化合物，結(jié)合基于滅活細(xì)胞因子(更精確地講為α干擾素、βTGF或TNF)的一種或多種免疫原。實(shí)際上，如在實(shí)驗(yàn)部分將看到的，本發(fā)明抗調(diào)節(jié)蛋白抗體和抗特別是α-干擾素抗體之效果的結(jié)合，可完全恢復(fù)HIV誘導(dǎo)的免疫抑制。因而本發(fā)明還涉及一種含兩種免疫原性化合物的組合物，即如上所述的免疫原性化合物和能夠誘導(dǎo)抗細(xì)胞因子(如α干擾素或TNF)抗體的免疫原性化合物(如WO-A-9118454中所述)，以及含有抗細(xì)胞因子(特別是α-干擾素)的抗體及以上抗調(diào)節(jié)蛋白抗體的組合物。本申請(qǐng)還涉及一種主動(dòng)免疫方法，其特征在于用與無機(jī)、油性或合成的免疫佐劑結(jié)合的如上所定義的免疫原性化合物作為免疫原，或與一種提高其免疫原性的蛋白偶聯(lián)或結(jié)合的如上所述免疫原性化合物作為免疫原。這種免疫可用于治療或預(yù)防目的。用于上述或下述方法中的免疫原，優(yōu)選使用Tat蛋白的衍生物。本發(fā)明還涉及HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2血清陰性或血清陽(yáng)性主體的超免疫方法，其特征在于使用如上所定義的免疫原產(chǎn)生超免疫人血清，后者特別可用于被動(dòng)血清治療，給予純化的特異抗體或其F(ab’)2或Fab片段。另外，本發(fā)明還涉及含有如上所定義的或按上述方法獲得的至少一種抗病毒調(diào)節(jié)蛋白抗體作為治療或預(yù)防活性成分的藥物組合物。本發(fā)明最后涉及上述免疫原性化合物或抗體在制備用于治療HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白有害作用的藥物中的用途。綜上所述，本發(fā)明涉及特異抗體在ARC/艾滋病血清陽(yáng)性主體或患者上的預(yù)防或治療作用，以阻滯HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白(特別是循環(huán)Tat)的有害作用。這些特異抗體可來自1.主體自身，通過用生物滅活但有免疫原性的Tat(類似于細(xì)菌類毒素，稱為Tat類毒素)主動(dòng)免疫(接種)而誘導(dǎo)產(chǎn)生，或2.同種或異種的其他生物體，給予主體進(jìn)行被動(dòng)免疫(血清治療)。同種抗體(對(duì)人體)可用調(diào)節(jié)蛋白如Tat或其衍生物(本發(fā)明的Tat類毒素或Tat肽片段)主動(dòng)免疫(接種)后在未感染自愿?jìng)€(gè)體中產(chǎn)生。這些同種(人的)或異種(動(dòng)物的)的被動(dòng)給予的抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，或抗體的F(ab’)2或Fab片段。如上文所指出的那樣，Tat類毒素應(yīng)理解為用化學(xué)試劑處理過的Tat肽或蛋白。這種處理已使該分子喪失循環(huán)Tat的毒性生物特性(T細(xì)胞的免疫抑制；誘導(dǎo)產(chǎn)干擾素的細(xì)胞產(chǎn)生α-干擾素；內(nèi)皮細(xì)胞的新血管生成；阻礙干擾素對(duì)巨噬細(xì)胞的抗病毒作用)，但保留了當(dāng)以適當(dāng)方式遞呈和制備、與“載體”偶聯(lián)或不偶聯(lián)、聚合或不聚合、存在或不存在佐劑時(shí)能夠誘導(dǎo)抗體生成的特性。已將Tat類毒素這一術(shù)語(yǔ)擴(kuò)展到Tat免疫原性肽片段，即當(dāng)以適當(dāng)方式遞呈、與載體偶聯(lián)或否、佐劑存在或否時(shí)能夠誘導(dǎo)抗Tat抗體生成的Tat肽序列。本發(fā)明還涉及藥物組合物。a)一種含有本發(fā)明病毒類毒素或調(diào)節(jié)蛋白(特別是Tat)的片段或類似物作為預(yù)防或治療成分的藥物組合物。b)一種含有按本發(fā)明從Tat蛋白或其(Fab’)2或Fab片段免疫的生物體產(chǎn)生的抗Tat抗體作為預(yù)防或治療成分的藥物組合物。另外，本發(fā)明還提供含有一種疫苗藥物組合物的試劑盒，其中除活性成分(Tat類毒素或其衍生物或抗Tat抗體)外還可含有佐劑和/或另一具有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒特性的免疫原。最后，本發(fā)明提供一種常規(guī)制劑形式的藥物組合物。特別是將治療有效量的本發(fā)明活性成分與藥物可接受的稀釋劑或載體結(jié)合。實(shí)驗(yàn)1循環(huán)Tat蛋白的致病作用Tat存在下T細(xì)胞的免疫抑制研究了Tat對(duì)外周血活化的T淋巴細(xì)胞的作用。用免疫磁分離法分離的單核細(xì)胞(PMBC)和T淋巴細(xì)胞(HLA35DR-)在有或無Tat分子存在下用抗CD3抗體活化。培養(yǎng)5天后，通過攝入的3H胸苷測(cè)定了細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示Tat抑制HLADR-T細(xì)胞的增殖(1.5μg/ml濃度下抑制85％)。在抗Tat特異抗體(Intracel，英國(guó))存在下這種抑制消失。實(shí)驗(yàn)2循環(huán)Tat蛋白的致病作用Tat存在下對(duì)干擾素對(duì)巨噬細(xì)胞作用的抑制用VSV病毒在MDBK細(xì)胞中的細(xì)胞致病能力按常規(guī)生物試驗(yàn)測(cè)定了Tat對(duì)α干擾素抗病毒作用的影響。Tat對(duì)外源干擾素的影響從低濃度開始遞增劑量的Tat按Tat濃度1-20μg/ml間的劑量效應(yīng)曲線抑制外源干擾素的抗病毒能力。在一代表性的實(shí)驗(yàn)中，α干擾素直至1/4800稀釋度的顯著保護(hù)作用(相當(dāng)于150U.I)在10μg/mlTat濃度下被降至1/300稀釋度。因此在10μg/mlTat濃度和4800外源干擾素稀釋度下，VSV的滴度從103.8(無Tat干擾素樣品)升至105.5(有Tat的干擾素樣品)。這些實(shí)驗(yàn)中，Tat分子對(duì)α干擾素抗病毒作用的抑制在抗Tat特異抗體(Intracel，英國(guó))存在下被消除，同樣被我們制備的馬抗體(見以下實(shí)施例)消除。實(shí)驗(yàn)3在HIV-1感染主體中體現(xiàn)Tat蛋白的細(xì)胞外形式血清陽(yáng)性病人血清中抗Tat抗體的存在a)在50個(gè)血清陽(yáng)性和15個(gè)血清陰性主體中用天然Tat分子作為抗原進(jìn)行血清抗Tat抗體的ELISA研究。所有血清陰性主體血清和20個(gè)血清陽(yáng)性血清沒有顯示抗Tat抗體的存在，光密度小于閾值(O.D.＝0.250)。30個(gè)HIV感染主體的血清超過了閾值，其中6個(gè)O.D大于0.500。在抗Tat抗體的存在與臨床狀態(tài)及每毫升血中CD4細(xì)胞的數(shù)目間沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著相關(guān)性。b)在HIV感染不同階段的血清陽(yáng)性主體(無癥狀主體)，具有艾滋病前(ARC)臨床癥狀的病人和患艾滋病病人中，用各種Tat肽作為抗原進(jìn)行血清抗Tat抗體的ELISA研究。該研究的結(jié)果如下1)Tat的肽序列MEPVDPRLEPWKHPG(N末端1-15殘基)HQVSLSKQPTSQPRGD(C末端65-80殘基)被大部分血清陽(yáng)性血清而不被任何血清陰性的血清(對(duì)照)所識(shí)別。這些反應(yīng)為強(qiáng)陽(yáng)性，但沒能顯示與主體HIV感染的發(fā)展和CD4數(shù)目的任何相關(guān)性。2)所研究的其他序列不被無論是血清陽(yáng)性或?qū)φ諅€(gè)體的血清顯著識(shí)別(見表1)。每個(gè)序列只有極個(gè)別血清顯示大于閾值(對(duì)照血清平均值的2倍)的光密度。表1*HIV感染主體的感染階段各異無癥狀主體、ARC患者和艾滋病患者。**當(dāng)光密度為血清陰性平均值的2倍以上時(shí)認(rèn)為反應(yīng)為陽(yáng)性。3)有趣的是注意到最強(qiáng)反應(yīng)性序列(AA65-80)是含有被整聯(lián)蛋白識(shí)別的RGD殘基的序列。實(shí)施例1免疫原性Tat蛋白(Tat類毒素)的制備Tat蛋白在甲醛存在下的滅活向70mM磷酸氫二鈉(pH8.0)中的Tat溶液(1mg/ml)中加入終濃度為33mM的甲醛。將混合物37℃溫育1、3、5、7和9天。在每一溫育期未取樣，加入終濃度為100mM的甘氯酸終止與甲醛的反應(yīng)。每個(gè)樣品對(duì)100倍體積的PBS(磷酸鹽水緩沖液)4℃透析一夜。實(shí)施例2免疫原性Tat蛋白(Tat類毒素)的制備Tat蛋白在戊二醛存在下的滅活向70mM磷酸氨二鈉(pH8.2)中的Tat溶液(1mg/ml)中加入終濃度為0.026M或0.0026M的戊二醛。讓與戊二醛的反應(yīng)持續(xù)1分鐘到3小時(shí)的不同時(shí)間。在所選反應(yīng)時(shí)間后，在實(shí)驗(yàn)室溫度下，加入終濃度100mM的甘氨酸終止該反應(yīng)。各個(gè)樣品對(duì)100倍體積的PBS4℃透析16小時(shí)。實(shí)施例3免疫原性Tat蛋白(Tat類毒素)的制備Tat滅活同時(shí)與破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)向70mM-100mM磷酸鹽緩沖液(pH在6.8-8.2之間)中的破傷風(fēng)毒素與Tat的摩爾比1-15的混合物中，加入終濃度為0.0026M-0.026M的戊二醛，讓該滅活及偶聯(lián)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行不同的時(shí)間(3-15分鐘)。加入終濃度為100mM的甘氨酸終止反應(yīng)，各個(gè)樣品對(duì)100倍體積的PBS4℃透析16小時(shí)。實(shí)施例4Tat類毒素的致免疫能力和抗原性小鼠中的免疫原性Tat類毒素ELISA測(cè)定抗體在小鼠體內(nèi)測(cè)定了不同滅活Tat制劑的致免疫能力甲醛滅活(Tat類毒素)、戊二醛滅活(Tat-polan)、或與破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)后(Tat-TT偶聯(lián)物)，即實(shí)施例1-3的免疫原性化合物。皮下注射配有福氏完全佐劑的實(shí)施例1、2和3的免疫原2次，免疫18-20g的瑞士小鼠，第二次注射在第1次之后3周進(jìn)行，注射存在福氏不完全佐劑的20μg乳液制劑。加強(qiáng)注射后15天，通過心內(nèi)途徑采取血樣。用ELISA方法測(cè)定血清中抗-Tat的抗體。490nm測(cè)定光密度。結(jié)果列于表2中，其表明除用戊二醛短時(shí)間(3分鐘)處理的Tat-破傷風(fēng)毒素偶聯(lián)物外，所有Tat制劑具有不同程度的免疫原性，前者顯示毒性，在24小時(shí)內(nèi)毒死小鼠(破作風(fēng)毒素滅活太弱)。應(yīng)指明的是未免疫小鼠的血清對(duì)天然Tat和對(duì)Tat類毒素的應(yīng)答低于0.200(O.D.)。另外，這些結(jié)果表明，天然Tat以與類毒素同樣的方式被抗體識(shí)別，這證實(shí)了它們的抗原性等價(jià)，也證明了可以用Tat類毒素進(jìn)行免疫。表2</tables>實(shí)施例5急性毒性通過給18-20g的瑞士小鼠皮下注射，測(cè)定了Tat類毒素和Tat-polan制劑的毒性。Tat-類毒素(7天)和Tat-polan(15分鐘；0.026M)制劑以100μg劑量給予小鼠。觀察動(dòng)物7天。沒有觀察到任何明顯的毒性跡象。動(dòng)物體積繼續(xù)增長(zhǎng)。尸解后的器官經(jīng)放大鏡檢查沒發(fā)現(xiàn)異常。實(shí)施例6抗Tat抗體按如下制備抗Tat抗體在G蛋白柱上以Tat-polan免疫的小鼠血清分離了IgG成分。還通過胃蛋白酶消化從分離的IgG成分制備了F(ab’)2片段。這些成分的免疫反應(yīng)性已用ELISA進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)施例7Tat類毒素的生物失活在依賴于HIV-1“長(zhǎng)末端重復(fù)序列”(LTR)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)道基因的表達(dá)活性實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了滅活1、3、5和9天的實(shí)施例1中不同的Tat類毒素。該實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)如下將帶有HIVLTR控制下之CAT基因的Hela細(xì)胞與天然Tat或類毒素接觸6小時(shí)。培養(yǎng)24小時(shí)后，裂解細(xì)胞，用CAT活性實(shí)驗(yàn)測(cè)定了所產(chǎn)CAT的量，其中測(cè)定連結(jié)于氯霉素上的乙酰輔酶A的百分比。如果Tat分子是活性的，將有很高百分比的乙?；让顾?，否則該百分率將低。按標(biāo)準(zhǔn)方法在含10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些粘附細(xì)胞。效應(yīng)劑量曲線中，所加Tat的濃度為每ml上清液1-10μg。此處所示結(jié)果表明Tat類毒素在3天后完全失活，在第一天有弱的殘余活性。</tables>實(shí)施例8Tat類毒素致病作用喪失a)Tat類毒素存在下無T細(xì)胞的免疫抑制(與實(shí)驗(yàn)1和2相反)。研究了Tat類毒素(5天)對(duì)外周血激活的T淋巴細(xì)胞的作用。用免疫磁分離方法分離的單核細(xì)胞(PMBC)和T淋巴細(xì)胞(HLA35DR-)在有或無實(shí)施例1的免疫原性化合物存在下用抗CD3抗體活化。培養(yǎng)5天后，按3H胸苷的攝入測(cè)定了細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，與天然Tat不同，Tat類毒素不抑制HLADR-T細(xì)胞的增殖。例如，Tat類毒素在培養(yǎng)液中以5μg/ml劑量存在下，細(xì)胞增殖與對(duì)照細(xì)胞相同。b)Tat類毒素存在下不抑制α干擾素對(duì)巨噬細(xì)胞的作用用VSV病毒在MDBK細(xì)胞中的細(xì)胞致病能力按常規(guī)生物試驗(yàn)測(cè)定了Tat類毒素對(duì)α干擾素抗病毒作用的影響。Tat類毒素對(duì)外源干擾素的影響與天然Tat不同，相當(dāng)劑量的實(shí)施例1Tat類毒素沒有抑制外源干擾素的抗病毒能力。在一代表性的實(shí)驗(yàn)中，α干擾素直至1/4800稀釋度(相當(dāng)于150U.I)的顯著保護(hù)作用在50μgTat類毒素存在下仍保持，而被天然Tat降至1/300。在4800外源干擾素稀釋度下，VSV滴度保持在103.8的對(duì)照水平(用Tat類毒素的干擾素樣品)，而不是升至105.5(存在Tat的干擾素樣品)。實(shí)施例9抗Tat-類毒素抗體針對(duì)天然Tat作用的保護(hù)作用在超免疫的馬中制備了抗實(shí)施例1的Tat類毒素(甲醛處理3天)的抗體。按實(shí)施例6描述的方法，還從這些抗體制備了F(ab’)2片段。這些抗體及F(ab’)2片段在不同的試驗(yàn)中抑制天然Tat的各種生物活性HIVLTR的反式激活(CAT試驗(yàn))(見實(shí)施例7)，免疫抑制(見實(shí)驗(yàn)1)，對(duì)外源α干擾素對(duì)培養(yǎng)物作用的抑制(見實(shí)驗(yàn)2)。以40μg抗體/1μg天然Tat的劑量，天然Tat與抗體或F(ab’)2片段37℃預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)或否，用天然Tat重復(fù)實(shí)驗(yàn)1、2和實(shí)施例7。結(jié)果顯示這些抗體抑制天然Tat的作用。實(shí)施例10由于抗Tat抗體和抗α-干擾素抗體的結(jié)合，細(xì)胞增殖系統(tǒng)恢復(fù)抗Tat抗體與抗α干擾素抗體的協(xié)同作用。觀察到健康主體的PBL(外周血單核細(xì)胞)在體外用HIV-1感染并培養(yǎng)6天后發(fā)揮免疫抑制活性。實(shí)際上如果向葡萄球菌外毒素B蛋白(SEB)活化的自體細(xì)胞中以1比5的比例加入這種感染6天的細(xì)胞或非感染/照射細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在第4天末自體細(xì)胞的增殖與對(duì)照(未感染細(xì)胞)相比降低80％。在此模型中，如果體外向感染細(xì)胞培養(yǎng)物中加入抗α干擾素抗體，在50％主體中這些細(xì)胞喪失其抑制作用。20％的主體中，抑制性細(xì)胞喪失其60％的抑制作用，30％的主體中，這種抑制作用顯著保持。如果向抗α干擾素抗體中加入抗Tat抗體(實(shí)驗(yàn)1中描述的單克隆抗體，或?qū)嵤├?的馬的多克隆抗體)，則100％的體外感染細(xì)胞喪失其抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)證明Tat和α干擾素在HIV-1誘發(fā)的免疫抑制中的聯(lián)合毒性作用，而抗干擾素抗體和抗Tat抗體結(jié)合可恢復(fù)正常的免疫。實(shí)施例11HIV-1感染病人的免疫接種CD4淋巴細(xì)胞率為250-500的6名志愿病人用實(shí)施例2制備的Tat-polan(15分鐘)免疫。為此，他們以一月的間隔接受3次肌內(nèi)起始注射Tat類毒素(400μg/次)，第6個(gè)月加強(qiáng)注射一次。用于這些注射的佐劑為磷酸鈣。表中列出了接種前后個(gè)體中觀察到的應(yīng)答(第一次注射后7個(gè)月)。這些結(jié)果表明，由于用實(shí)施例1的Tat類毒素接種，抗天然Tat的抗體應(yīng)答明顯提高，CD4淋巴細(xì)胞率在此期間保持穩(wěn)定。該1期試驗(yàn)表明用Tat類毒素接種的無毒特性，并證實(shí)了其免疫原性。特別是，病人的生物常數(shù)特別是CD4表型保持穩(wěn)定。實(shí)施例12制備免疫原性Nef蛋白(Nef類毒素)Nef蛋白在甲醛存在下的滅活向70mM磷酸氫二鈉(pH8.0)中的Nef溶液(1g/ml)中加入終濃度為33mM的甲醛。將混合物37℃溫育1、3、5、7和9天。在每一溫育期末取樣，加入終濃度為100mM的甘氨酸終止與甲醛的反應(yīng)。每個(gè)樣品對(duì)100倍體積的PBS(磷酸鹽水緩沖液)4℃透析一夜，并分離Nef類毒素。實(shí)施例13免疫原性Nef蛋白(Nefpolan)的制備Nef蛋白在戊二醛存在下的滅活向70mM磷酸氫二鈉(pH8.2)中的Nef溶液(1mg/ml)中加入終濃度為0.026M或0.0026M的戊二醛。讓與戊二醛的反應(yīng)持續(xù)1分鐘到3小時(shí)的不同時(shí)間。在所述反應(yīng)時(shí)間后、在實(shí)驗(yàn)室溫度下，加入終濃度100mM的甘氨酸終止該反應(yīng)。各個(gè)樣品對(duì)100倍體積的PBS4℃透析16小時(shí)，分離Nef-polan。實(shí)施例14Nef類毒素的致免疫能力和抗原性小鼠中的免疫原性Nef類毒素ELISA測(cè)定抗體在小鼠體內(nèi)測(cè)定了不同滅活Nef制劑的致免疫能力甲醛滅活(Nef類毒素)或戊二醛滅活(Nef-polan)，即實(shí)施例12和13的免疫原性化合物。皮下注射配有福氏完全佐劑的實(shí)施例12和13的免疫原2次，免疫18-20g的瑞士小鼠，第二次注射在第1次之后3周進(jìn)行，注射存在福氏不完全佐劑的20μg乳液制劑。加強(qiáng)注射后15天，通過心內(nèi)途徑采取血樣。用ELISA方法測(cè)定血清中抗Nef的抗體。在490nm測(cè)定光密度。結(jié)果列于下表中，其表明所有Nef制劑具有不同程度的免疫原性。應(yīng)指明的是未免疫小鼠的血清在ELISA試驗(yàn)中的應(yīng)答低于0.2(O.D.)。這些結(jié)果表明，天然Nef以與類毒素同樣的方式被抗體識(shí)別，這證實(shí)了它們的抗原性等價(jià)，也證明了可以用Nef類毒素進(jìn)行免疫。>序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱NEOVACS(B)街道VieilleduTemple大街117號(hào)(C)城市巴黎(E)國(guó)家法國(guó)(F)郵編75003(ii)發(fā)明名稱新免疫原、新抗體、其制備方法和含有它們的藥物組合物(iii)序列數(shù)1(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)載體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，#1.25版(EPO)(2)SEQIDNo.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNo.1HisGlnValSerLeuSerLysGlnProThrSerGlnProArgGlyAsp15101權(quán)利要求1.一種無毒可用于人體的免疫原性化合物，其特征在于它是經(jīng)諸如醛的偶聯(lián)劑，或經(jīng)一種醛預(yù)處理而活化的載體蛋白進(jìn)行化學(xué)處理從HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的調(diào)節(jié)蛋白衍生而來，使其能被針對(duì)所述調(diào)節(jié)蛋白的抗體所識(shí)別并保留足以激發(fā)能中和或封阻所述天然蛋白的抗體的免疫原性，而喪失了所述天然蛋白的至少50％的毒性生物特性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性化合物，其特征在于它衍生自HIV-1或HIV-2病毒的下列調(diào)節(jié)蛋白Ner、Tat、Vif或Rev。3.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫原性化合物，其特征在于它衍生自Tat蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫原性化合物，其特征在于它衍生自HTLV-1或HTLV-2病毒的Tax蛋白。5.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權(quán)利要求1-4之一所定義的免疫原性化合物。6.如權(quán)利要求1-4之一所定義的免疫原性化合物用于人或動(dòng)物體的治療方法中。7.如權(quán)利要求1-4中之一所定義的免疫原性化合物的制備方法，其特征在于將HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的一種調(diào)節(jié)蛋白用一種醛進(jìn)行化學(xué)處理，篩選，然后純化目標(biāo)化合物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，其特征在于化學(xué)處理包括用一種醛處理，然后與一種載體蛋白偶聯(lián)。9.抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白之抗體的制備方法，其特征在于用如權(quán)利要求1-4之一定義的免疫原性化合物免疫哺乳動(dòng)物。10.抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白之抗體的制備方法，其特征在于進(jìn)行EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞的克隆，然后收獲從所述轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞分泌的目標(biāo)抗體。11.抗HIV-1或HIV-2病毒Tat蛋白之抗體的制備方法，其特征在于進(jìn)行EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞的克隆，然后收獲從所述轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞分泌的目標(biāo)抗體。12.抗HTLV-1或HTLV-2病毒Tax蛋白之抗體的制備方法，其特征在于進(jìn)行EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞的克隆，然后收獲從所述轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞分泌的目標(biāo)抗體。13.抗HIV-1、HIV-2、HTIV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白之抗體的制備方法，其特征在于從一種噬菌體文庫(kù)經(jīng)基因重組制備所述抗體。14.如權(quán)利要求9-13之一制備的一種抗體的F(ab’)2或F(ab)片段的制備方法，其特征在于對(duì)這種抗體進(jìn)行酶消化。15.用如權(quán)利要求1-4之一定義的免疫原性化合物免疫哺乳動(dòng)物所獲得的抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的抗體。16.權(quán)利要求15所定義抗體的F(ab’)2或F(ab)片段。17.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權(quán)利要求15或16定義的抗體。18.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權(quán)利要求1-5之一定義的免疫原性化合物，并結(jié)合有HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒的Gag、Pol或Env蛋白。19.一種藥物組合物，其特征在于它含有如權(quán)利要求1-5之一定義的免疫原性化合物，并結(jié)合有天然的或經(jīng)物理、化學(xué)、遺傳或免疫處理滅活的gp120/gp160蛋白，或該蛋白的修飾或未修飾的肽片段。20.具有下式HQVSLSKQPTSQPRGD或MEPVDPRLEPWKHPG或相應(yīng)于用醛滅活后HIV-1或HIV-2的天然Tat的免疫原性化合物。21.含有下列成分的疫苗組合物-如權(quán)利要求1-4之一定義的免疫原性化合物，-一種如下免疫原性化合物不同與其天然形式且失活的細(xì)胞因子，或細(xì)胞因子的無活性類似物、或無活性或失活的片段。22.含有下列成分的組合物-抗HIV-1、HIV-2、HTLV-1或HTLV-2病毒調(diào)節(jié)蛋白的抗體，-諸如抗人α干擾素抗體的一種抗細(xì)胞因子抗體。全文摘要一種無毒可用于人體的免疫原性化合物,其特征在于它是經(jīng)諸如醛的偶聯(lián)劑,或經(jīng)一種醛預(yù)處理而活化的載體蛋白進(jìn)行化學(xué)處理從HIV－1、HIV－2、HTLV－1或HTLV－2病毒的調(diào)節(jié)蛋白衍生而來,使其能被針對(duì)所述調(diào)節(jié)蛋白的抗體所識(shí)別并保留足以激發(fā)中和或封阻所述天然蛋白之抗體的免疫原性,而喪失了所述天然蛋白的至少50%的毒性生物特性。文檔編號(hào)C12N15/09GK1181020SQ9619319公開日1998年5月6日申請(qǐng)日期1996年3月7日優(yōu)先權(quán)日1995年3月8日發(fā)明者J·F·薩古里,B·比茲尼,D·薩古里申請(qǐng)人:新疫苗公司